CN105779492A - 水稻miR396c的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了水稻miR396c在控制水稻籽粒粒长、粒宽的改良以及提高水稻产量中的应用。在本发明中，构建了过表达miR396c的水稻突变株，以及miR396c阻遏表达的水稻突变株。对该突变株进行详细的表型分析后发现，该过表达miR396c的水稻突变株的水稻籽粒长显著低于野生型籽粒粒，同时千粒重也显著低于野生型。而miR396c阻遏表达的水稻突变株较于野生型籽粒粒而言，显著增加水稻籽粒长和千粒重，从而提高产量。

Description

水稻miR396c的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程和植物育种，尤其涉及一种水稻miR396c在控制水稻籽粒粒长、粒宽、粒重以及水稻产量，以培育高产水稻中的应用。
背景技术
水稻作为重要的粮食作物，在我国的粮食安全保障中具有重要的作用，不断提高稻谷单位面积产量是关系国计民生的大事。粒型对胚乳结构、米粒外观、千粒重、结实率、穗粒数等性状均有巨大的影响，不仅是水稻品质的重要指标，同时也是产量增加的关键因素。伴随基因定位群体的不断发展，以及新型分子标记的进一步开发，陆续有更多的水稻关键性状基因被定位以及克隆。因此，不断寻找新的提高水稻产量基因，已成为农业进一步增产的重要基础研究，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。
MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21ˉ23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，广泛存在于动物和植物等多细胞生物。MicroRNAs可以通过与靶基因mRNA的特定位点结合，诱导该mRNA的降解或抑制该蛋白质的合成，在转录水平或转录后水平导致基因沉默。在不同的植物组织、器官和发育时期，miRNA的表达谱是不同的，并且部分miRNA在不同的外界环境下也有着不同的表达水平。因此，研究miRNA表达谱对miRNA生物功能的研究是非常重要的。
miRNA的调控广泛存在于植物发育及生长的各个生理过程，有趣的是，还有一些植物miRNA通过下调其靶基因而参与调控水稻产量。例如：水稻miR397通过切割其靶基因LAC，而影响了油菜素内酯的信号转导通路，过表达miR397可增加水稻穗分支，增大谷粒，显著提高水稻产量；miR167可以通过调控其靶基因ARF8，来调节生长素信号通路，并最终影响植物产量；miR159切割一类受赤霉素调控的MYB家族基因，组成型表达miR159会引起短日照情况下开花的推迟和花粉的不正常发育；水稻中miR156通过对下调其靶基因OsSPL14，显著降低水稻分蘖，穗分支及种子数量，直接负调控水稻产量。
虽然miRNA可以调节水稻产量，但是发现的此类miRNA并不多，所以miRNA调节水稻产量的研究成为新的研究有着广阔的发展空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻miR396c的应用，旨在通过全新的并且简单有效的方法构建过表达miR396c的水稻突变株，在确保食用安全的前提下，控制水稻籽粒粒长、粒宽的改良，达到提高水稻产量的目的。
本发明是这样实现的，水稻miR396c在控制水稻籽粒粒长、粒宽的改良以及提高水稻产量中的应用，水稻miR396c具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。更具体的，通过过表达miR396c或者阻塞miR396c功能从而调节水稻籽粒粒长、粒宽、粒重以及水稻产量。
进一步的，本发明提供了含有上述水稻miR396c的表达载体，以及水稻miR396c抗性靶标基因的表达载体。
在本发明水稻miR396c的表达载体中，水稻miR396c序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含水稻miR396c前体序列和合适的转录、翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中适当的启动子上，以指导水稻miR396c的合成。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用二氢叶酸还原酶、新霉素抗性及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
本发明中水稻miR396c抗性靶标基因的所使用的表达载体与上述水稻miR396c的表达载体基本类似，区别点在于，将水稻miR396c替换为水稻miR396c抗性靶标基因。
进一步的，本发明还提供了含有上述表达载体，或上述水稻miR396c的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性的例子有：大肠杆菌，链霉菌属，农杆菌；真核细胞如酵母；植物细胞等。
本发明克服现有技术的不足，获得了过表达miR396c的水稻突变株，以及miR396c阻遏功能后的水稻突变株。对该突变株进行详细的表型分析后发现，该过表达miR396c的水稻突变株的水稻籽粒长显著低于野生型籽粒粒，同时千粒重也显著低于野生型。而miR396c阻遏功能后的水稻突变株较于野生型籽粒粒而言，显著增加水稻籽粒长和千粒重，从而提高产量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明发现过表达miR396c可以显著降低水稻籽粒长，从而导致千粒重显著下调；下调或者阻遏miR396c则可以显著增加水稻籽粒长和千粒重，从而提高产量。这一结果为培育高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用；
(2)本发明通过分子生物学技术去除转基因成分后，可以调控水稻的产量，而且不会对环境造成污染，食用安全。
附图说明
图1是本发明实施例中水稻miR396c过量表达植株籽粒表型，其中，bar＝1cm；
图2是本发明实施例中水稻miR396c表达量检测；
图3是本发明实施例中水稻miR396c的靶基因表达量检测水平；
图4是本发明实施例中水稻miR396c过量表达植株籽粒千粒重统计；
图5是本发明实施例中水稻miR396c过量表达植株籽粒粒长统计；
图6是本发明实施例中OsGRF4抗性靶标序列；
图7是本发明实施例中水稻mOsGRF4过量表达植株籽粒表型，bar＝1cm；
图8是本发明实施例中水稻OsGRF4表达量检测；
图9是本发明实施例中水稻mOsGRF4过量表达植株籽粒千粒重统计；
图10是本发明实施例中水稻mOsGRF4过量表达植株籽粒粒长统计；
图11是本发明实施例中水稻mOsGRF4过量表达植株籽粒粒宽统计；
**表示差异极显著(P<0.01)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)水稻miR396c过量表达载体构建
采用表达载体PHB(Mao等，2005，PNAS102:12270-12275，可商购)作为水稻转基因的载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kanr)、潮霉素抗性基因(Hygr)、除草剂抗性基因(Barr)、2×35S启动子、NOS基因终止信号序列以及用于连接目的片段的多克隆位点(MCS)。在限制性内切酶位点可插入水稻miR396c前体构建成转基因质粒。
以正常野生型日本晴的DNA为模板，用该miR396c前体序列(SEQIDNO.2)的5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物(SEQIDNO.3和SEQIDNO.4)，用高保真酶进行扩增，获得约384bp的miR396c前体扩增产物。将该扩增产物通过重组克隆方法重组进载体pHB中，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体称为pHB-miR396c。其中miR396c的表达由自身启动子驱动。
5’端的寡核苷酸序列3为(SEQIDNO.3)：
5’-gtctctctctcaagcttggatccGCCATAAAGCTCTTCGTCCT-3’
3’端的寡核苷酸序列4为(SEQIDNO.4)：
5’-tctagaggatcaattcgagctcTGCCTGTCTCATGGCATTGC-3’。
(2)miR396c抗性靶标基因的过表达载体构建
采用表达载体PHB(Mao等，2005，PNAS102:12270-12275，可商购)作为水稻转基因的载体。
OsGRF4是miR396c的靶基因，实验在不改变OsGRF4氨基酸序列的基础上，人为改变多个OsGRF4和miR396c绑定位点的碱基，创造一个与OsGRF4功能相同，但是抗miR396c的剪切的抗性靶基因mOsGRF4，通过阻塞miR396c的功能应能显著提高水稻粒重。本发明设计了两个抗性靶基因m1OsGRF4和m2OsGRF4，如图6所示，图6中mNIL绑定位点突变的近等基因系、m1为m1OsGRF4、m2为m2OsGRF4，OsGRF4抗性靶标序列，黑色字体为突变位点碱基；将其插入植物稳定表达载体pHB中，构建过表达载体pHB-mOsGRF4。
实施例2miR396c水稻转基因试验
将实施例1制备的过表达载体PHB-miR396c和pHB-mOsGRF4分别通过冻融法导入农杆菌EHA105。农杆菌EHA105平板(4℃保存)挑取单菌落于YEP液体培养基(Km和Rif各50mg/L)中，28℃振荡培养12～18h，然后取1～5mL菌液接到100mLYEP液体培养基(含乙酰丁香酮100μmol/L)中，振荡培养4h后测OD值稀至相应浓度(OD＝0.5)。将新鲜菌液于8000rpm、4℃、5min收集菌体，并重悬于三分之一提及的AAM培养基中。加入放有生长旺盛的胚性愈伤组织的灭菌三角瓶中浸泡25min，再吹干表面菌液，将愈伤组织转接于共培养基上，28℃暗培养2～3d。共培养愈伤组织经无菌水和含Cef500mg/L的无菌水漂洗后，在工作台上吹4h左右，转接于预培养基中28℃暗培养5～7d。将预培养的愈伤组织转接于含Hyg和Cef的筛选培养基上继续培养3～4周，再将抗性愈伤组织转接于仅含Hyg的筛选培养基上，筛选1～2次。取抗性愈伤组织转接于分化培养基上，28℃光照分化。分化小苗转接于生根培养基，28℃光照培养3～4周，开放培养炼苗7d左右，最后移栽到大田。
获得的再生植株移栽成活后用除草剂或潮霉素筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T1代调查育性表型，验证miR396c的功能。
实施例3miR396c功能分析
(1)将实施例2中转入表达载体PHB-miR396c后获得的水稻miR396c过量表达的转基因植株，分为5组，分别命名为396c-OE1-4、396c-OE4-1、396c-OE4-5、396c-OE5-2、396c-OE2-3以及control组，其中，control为野生对照组，其它为水稻miR396c过量表达的转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻籽粒表型。结果如图1-5所示，图1是本发明实施例中水稻miR396c过量表达植株籽粒表型，图2是本发明实施例中水稻miR396c表达量检测；图3是本发明实施例中水稻miR396c的靶基因表达量检测水平；图4是本发明实施例中水稻miR396c过量表达植株籽粒千粒重统计；图5是本发明实施例中水稻miR396c过量表达植株籽粒粒长统计。
由图可以看出，转miR396c过量表达基因的植株籽粒粒长和千粒重较对照有显著降低，表明miR396c过量表达会降低籽粒粒长，进而导致千粒重降低。
(2)将实施例2中转入表达载体pHB-mOsGRF4后获得的水稻miR396c阻遏功能后的的转基因植株，通过QRT-PCR方法筛选出mOsGRF4表达量上调阳性植株m1-5、m2-1、m2-2以及control组，其中，control为野生对照组。用转基因T1代植株观察水稻籽粒表型。如图7ˉ11所示，通过表型观察发现，筛选出的阳性植株籽粒大小较对照都有明显增大(图7)；通过统计分析得出，筛选出的阳性植株籽粒千粒重、粒长和粒宽较对照都有极显著的增加(图8ˉ10)。
研究表明阻塞miR396c功能后会增加籽粒粒长、千粒重，从而增加水稻产量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.水稻miR396c在控制水稻籽粒粒长、粒宽的改良以及提高水稻产量中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用通过筛选过表达miR396c的水稻或者阻遏miR396c功能后的水稻，从而调节水稻籽粒粒长、粒宽、粒重以及水稻产量。
3.含有权利要求1或2所述的水稻miR396c的过表达载体。
4.一种水稻miR396c抗性靶标基因的过表达载体。
5.含有权利要求3或4所述的载体，或权利要求1或2所述的水稻miR396c的宿主细胞。
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