CN105177036A - 小RNA基因miR396b在提高作物产量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小RNA基因miR396b在提高作物产量中的应用，属于作物基因工程技术领域。小RNA基因miR396b的序列如SEQIDNO.1或2所示。将miR396b基因在水稻中干涉后，水稻穗长变长，二次枝梗数目显著增加，每穗粒数显著增加；而将miR396b基因过表达后，水稻株高降低，穗长变短，二次枝梗消失，每穗粒数显著减少，说明miR396b基因可控制水稻的穗粒数和产量。因此，miR396b基因或干涉miR396b基因可应用于提高作物产量中；miR396b基因为分子标记辅助育种及利用基因工程的方法提高水稻等农作物产量提供了有力的手段，具有巨大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及作物基因工程技术领域，特别涉及小RNA基因miR396b在提高作物产量中的应用。
背景技术
水稻是我国的主粮之一，提高水稻产量是一项长期的任务，影响水稻产量的一个关键因素是每穗粒数。农业科学工作者对每穗粒数进行了大量的研究，目前已经克隆了一些调控水稻幼穗发育的基因，对幼穗发育的分子机理取得了一定的进展，但将成果应用于农业生产的基因尚少。
水稻的产量因子包括有效穗、千粒重、结实率和穗粒数等性状。而一次枝梗数和二次枝梗数则直接决定了每穗的穗粒数，从而决定了单株产量。通过基因工程改良等手段增加每穗的一次枝梗数和二次枝梗数，则能够较大幅度提高每穗粒数，从而提高单株产量。
目前生产上应用的大部分高产品种具有的典型特征就是穗子大，穗粒数较多。穗粒数多的原因，主要是因为一次枝梗和二次枝梗数目的增加，籽粒着生密度加大。穗粒数的提高对高产品种的培育具有十分重要的意义。
Osa-miR396b为水稻中已知存在的基因，以前他人的研究只发现该基因影响植物叶片的发育和对逆境胁迫的影响，没有关于该基因影响水稻穗粒数和产量的报道。
水稻属于单子叶禾本科作物，高粱、玉米、小麦主粮等同属于禾本科，在穗的发育和产量调控方面与水稻有着相似的机制；而miR396b在双子叶和单子叶植物中基因序列、结构和表达模式及其功能非常保守。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小RNA基因(microRNA)miR396b在提高作物产量上的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明通过在水稻体内过表达和干涉表达水稻小RNA基因miR396b(其核苷酸序列为UUCCACAGCUUUCUUGAACUG)发现：在水稻体内过表达miR396b后，一次枝梗数目减少，二次枝梗数目和每穗粒数减少，说明miR396b基因可控制水稻的产量和穗型；当水稻体内miR396b受到干涉后，一次枝梗数目增加、二次枝梗数目和穗粒数增加。表明miR396b可应用于提高水稻产量。进一步在玉米、小麦体内干涉miR396b的表达，玉米、小麦的穗长和穗粒数也得到增加，表明水稻miR396b在其他作物中的功能与水稻相似，也可应用于提高其他作物产量。因为miR396b在双子叶和单子叶植物中基因序列、结构和表达模式及其功能非常保守，所以miR396b基因家族的其他成员也可应用于提高其他作物产量。
综上，miR396b基因可应用于提高作物产量，所述的提高作物产量包括一次枝梗数目增加、二次枝梗数目增加和穗粒数增加。所述的作物优选为单子叶植物，更优选的为水稻。
所述的miR396b基因包括miR396基因家族中与miR396b成熟序列一致的其他成员及其前体序列。miR396基因家族中与miR396b成熟序列一致的其他成员序列详见下表。
所述的miR396b基因包含下述任一基因：
(1)如SEQIDNO.1或2所示序列的RNA；
(2)所有能够在作物体内形成如SEQIDNO.1或2所示序列的RNA；
(3)与SEQIDNO.1或2所示序列有个别碱基差异且与其功能相同的RNA；
(4)所有能够在作物体内形成如SEQIDNO.1或2所示序列的反向互补核苷酸序列；
(5)与SEQIDNO.1或2所示序列反向互补，有个别碱基差异且与其功能相同的核苷酸序列。
基于miR396b基因的功能，干涉miR396b基因也可应用在提高作物产量中。所述的干涉miR396b基因为包含miR396结合、切割位点的DNA，优选为与SEQIDNO.1或2所示序列中第7～12位碱基发生变异的互补DNA。这些DNA在植物体内经过转录，产生可以与miR396b竞争性结合miR396b靶基因的人工microRNA，从而使miR396b减少或不能剪切植物体内的内源性靶基因，使miR396b的调控作用减弱或失去。
用于扩增上述miR396b基因或干涉miR396b基因的引物在提高作物产量中的应用。
含上述miR396b基因或干涉miR396b基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系和重组菌在提高作物产量中的应用。
可用现有的作物表达载体构建含有上述与作物产量相关基因的重组表达载体。所述作物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于作物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、Pcambia1300、Pbi121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN、pH7WG2D或其他衍生作物表达载体，如gateway作物表达载体。
使用miR396b基因或干涉miR396b基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前添加任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其他植物启动子结合使用。
为了便于对转基因作物细胞或作物进行鉴定及筛选，可对所用作物表达载体进行加工，如加入在作物中表达可产生颜色变化的酶或者发光化合物的基因(如GUS基因、GFP基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(如氨苄青霉素标记物、卡那霉素标记物等)、生化代谢标记物(如木糖异构酶基因xylA)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。
所述重组表达载体具体可为在作物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点间插入或者通过gateway方法重组上述miR396b基因或干涉miR396b基因得到的重组表达载体。
携带有上述miR396b基因或干涉miR396b基因的作物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、作物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到作物细胞或组织中。被转化的作物宿主(目的作物)为单子叶禾本科作物，优选是水稻。
一种提高作物产量的方法为降低作物体内miR396b的表达量。将干涉miR396b基因通过表达载体导入作物体内使miR396b的表达量降低。
miR396b基因还可以作为分子标记用于作物育种中。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
本发明首次发现水稻miR396b的表达量对水稻幼穗发育有着十分显著的影响，尤其是一次枝梗和二次枝梗的数目及穗粒数，证了该基因具有控制水稻产量和穗型的功能。基于miR396b的功能，其可作为分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育高产水稻品种，从而进一步提高水稻产量提供了有力的手段，具有巨大的应用潜力和应用前景。本发明研究表明miR396b基因也能显著提高玉米、小麦、高粱等单子叶作物的产量。为高粱、玉米、小麦等禾本科作物通过基因工程提高产量提供了依据和参考。
附图说明
图1是不同植株的整株表型图，图中白色线条代表高度10cm；
图2是不同植株穗部形态图，图中白色线条代表高度3cm；
图3是不同植株穗长表型柱状图；
图4是不同植株二次枝梗数目柱状图；
图5是不同植株每穗粒数柱状图；
上述附图中，miR396b：转miR396b的T1代转基因植株，MIM396b：转MIM396b的T1代转基因植株，WT：粤泰B对照植株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中水稻是按照如下方法栽培得到的：(1)水稻材料的田间栽培：水稻种子在水中浸种2天后，移入37℃培养间催芽3天，然后将露白的种子播在苗床上进行育秧，到4叶期时将水稻秧苗移栽水田。
实施例1基因功能的发现
1、水稻基因组DNA的提取：采用CTAB方法从水稻叶片中提取基因组DNA。取100毫克水稻叶片，经液氮冷冻，研钵中磨成粉状，转移到1.5毫升离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于50毫升ddH2O中。
2、miR396b基因的扩增
在miR396b所在基因组位置上下游设计引物扩增含有miR396b的DNA片段(Os06：3,668,149——3,671,264)，并在所设计引物5’端添加attB重组接头(Invitrogen)，引物序列详见下表。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| miR396bF | CGGGATCCGCTACAAGTGTGTCAAGTAAAGA |
| miR396bR | CGGGATCCAAGACCTCAAGAGAAGGAAAGA |
扩增片段经BP、LR重组反应后插入表达载体pH7WG2D中，获得重组质粒miR396b。
将重组质粒miR396b通过电击转化的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中，筛选得到含有重组质粒miR396b的重组农杆菌菌株。
用含有重组质粒miR396b的重组农杆菌菌株侵染粤泰B愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，后移栽到水田中，获得的转基因植株为T0代。收获T0代植株的种子，按照上述田间栽培的方法进行栽培，并通过常规分子检测，获得转miR396b的T1代转基因植株。
按照获得转miR396b的T1代转基因植株的方法，将空载体pH7WG2D转化粤泰B，得到空载体对照植株。
3、通过RT-PCR检测miR396b基因的表达量
利用TRIZOL(购自Invitrogen公司)提取转基因植株和粤泰对照植株的作物总RNA，并利用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)进行反转录，得到cDNA。利用引物396b-F和Reverseprimer进行PCR检测miR396b的表达。利用引物UbiRTF和UbiRTR扩增的Ubi基因作为内标，结果显示转基因植株中miR396b表达量增加。上述引物序列见下表。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| 396b-F | gcccUCUCCACAGGCUUUCU |
| Reverse primer | GTGCAGGGTCCGAGGT |
| UbiRTF | CCCTCCACCTCGTCCTCAG |
| UbiRTR | AGATAACAACGGAAGCATAAAAGTC |
4、转基因植株的产量检测
对转miR396b的T1代转基因植株、粤泰B对照植株和空载体对照植株进行产量统计，每种材料统计10个单株。结果如图1-5所示，转miR396b的T1代转基因植株与粤泰B对照植株及空载体对照植株相比，穗长减少(平均从16.2厘米减少到10.8厘米)，一次枝梗数目不变，二次枝梗数目显著减少(平均从22.9个减少为0个)，穗粒数大量减少(平均从118.3粒减少到101.4粒)。
实施例2
1、包含miR396b结合、切割位点DNA的合成(武汉艾瑞科)：包含miR396b结合、切割位点的寡核苷酸序列的串联排列。合成的寡核苷酸命名为amiR396b，amiR396b序列如下(序列表中为SEQIDNO.3)，插入到pMD18-T载体中。
ATGCAGTTCAAGAAAGCTGTGGAACCTCGAGGTCGACGGTATCGACAGTTCAAGAAAGCTGTGGAAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGTTCAAGAAAGCTGTGGAAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGTTCAAGAAAGCTGTGGAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTTGA(amiR396b)。
设计引物(引物序列见下表)，从上述含有目标序列的PMD18-T载体中扩增目标序列。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| MIM396b-F | CCTCGAGGTCGACGGTATCGA |
| MIM396b-R | AGCTGGAGCTCCACCGCGGT |
MIM396b-F引物的5’端加KpnI酶切位点，MIM396b-R引物的5’端加PstI酶切位点。
构建表达载体：将上述引物扩增的amiR396b插入载体pCAMBIA1300(购自Cambia公司)的KpnI和PstI酶切位点之间，得到重组表达载体MIM396b，酶切和测序证明载体构建正确。
将质粒MIM396b通过电击转化的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中，筛选得到含有重组质粒MIM396b的重组农杆菌菌株。
用含有重组质粒MIM396b的重组农杆菌菌株侵染粤泰B愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，后移栽到水田中，获得的转基因植株为T0代。收获T0代植株的种子，按照上述田间栽培的方法进行栽培，并通过常规分子检测，获得转MIM396b的T1代转基因植株。
按照获得转MIM396b的T1代转基因植株的方法，将空载体pCAMBIA1300转化粤泰B，得到空载体对照植株。
2、通过RT-PCR检测miR396b基因的表达量
利用TRIZOL(购自Invitrogen公司)提取转基因植株和对照粤泰植株的作物总RNA，并利用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)进行反转录，得到cDNA。利用引物MIM396b-F和MIM396b-R进行PCR检测上述amiR396b的表达。利用引物UbiRTF和UbiRTR扩增的Ubi基因作为内标。结果显示转基因植株中amiR396b表达量增加。上述引物序列见下表。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| MIM396b-F | CCTCGAGGTCGACGGTATCGA |
| MIM396b-R | AGCTGGAGCTCCACCGCGGT |
| UbiRTF | CCCTCCACCTCGTCCTCAG |
| UbiRTR | AGATAACAACGGAAGCATAAAAGTC |
3、转基因植株的产量检测
对转MIM396b的T1代转基因植株、粤泰B对照植株和空载体对照植株进行产量的统计，对每种材料统计10个单株。结果如图1-5所示，转MIM396b的T1代转基因植株与粤泰B对照植株及空载体对照植株相比，穗长平均从16.2厘米增加到19.8厘米，一次枝梗数目增加，二次枝梗数目平均从22.9个增加为49.9个，穗粒数平均从118.3粒增加到207.5粒。
实施例3
1、转基因植株的获得
将上述含有MIM396b重组质粒的农杆菌菌株侵染玉米H99愈伤组织，在黑暗处24℃培养1天后，在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株(M.PaulScott,Transgenicmaize:methodsandprotocols,2009)。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，后移栽到大田中，获得的转基因植株为T0代。收获T0代植株的种子，按照常规田间栽培的方法进行栽培，并通过常规分子检测，获得转MIM396b的T1代转基因植株。
按照获得转MIM396b的T1代转基因植株的方法，将空载体pCAMBIA1300转化玉米H99愈伤组织，得到空载体对照植株。
2、转基因植株的表达量检测
通过RT-PCR检测amiR396b基因的表达量
利用TRIZOL(购自Invitrogen公司)提取转基因植株和对照H99植株的作物总RNA，并利用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)进行反转录，得到cDNA。利用引物MIM396b-F和MIM396b-R进行PCR检测amiR396b基因的表达。利用引物UbiRTF和UbiRTR扩增的Ubi基因作为内标。结果显示转基因植株中amiR396b表达量增加。上述引物序列见下表。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| MIM396b-F | CCTCGAGGTCGACGGTATCGA |
| MIM396b-R | AGCTGGAGCTCCACCGCGGT |
| UbiRTF | CCCTCCACCTCGTCCTCAG |
| UbiRTR | AGATAACAACGGAAGCATAAAAGTC |
3、转基因植株的产量检测
对转MIM396b的T1代转基因植株、H99对照植株和空载体对照植株进行产量的统计，对每种材料统计10个单株。结果显示，转MIM396b的T1代转基因植株与H99对照植株及空载体对照植株相比，穗长平均从14.1厘米增加到21.6厘米，每穗粒数平均从402.3粒增加到594.9粒。
实施例4
1、转基因植物的获得
用含有重组质粒MIM396b的重组农杆菌菌株侵染小麦品种鄂麦596(S)愈伤组织，在黑暗处24℃培养1天后，在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，后移栽到大田中，获得的转基因植株为T0代(MingChen,edGeneticTransformationofWheatMediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantPhysiol.1997115:971-980)。收获T0代植株的种子，按照常规田间栽培的方法进行栽培，并通过常规分子检测，获得转MIM396b的T1代转基因植株。
按照获得转MIM396b的T1代转基因植株的方法，将空载体pCAMBIA1300转化小麦品种鄂麦596(S)愈伤组织，得到空载体对照植株。
2、转基因植株的表达量检测
通过RT-PCR检测amiR396b的表达量
利用TRIZOL(购自Invitrogen公司)提取转基因植株和对照鄂麦596(S)植株的植物总RNA，并利用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)进行反转录，得到cDNA。利用引物MIM396b-F和MIM396b-R进行PCR检测amiR396b的表达。利用引物UbiRTF和UbiRTR扩增的Ubi基因作为内标。结果显示转基因植株中amiR396b的表达量增加。上述引物序列见下表。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| MIM396b-F | CCTCGAGGTCGACGGTATCGA |
| MIM396b-R | AGCTGGAGCTCCACCGCGGT |
| UbiRTF | CCCTCCACCTCGTCCTCAG |
| UbiRTR | AGATAACAACGGAAGCATAAAAGTC |
3、转基因植株的产量检测
对转MIM396b的T1代转基因植株、鄂麦596(S)对照植株和空载体对照植株进行产量统计，每种材料统计10个单株。结果显示，转MIM396b的T1代转基因植株与鄂麦596(S)对照植株及空载体对照植株相比，穗长平均从10.2厘米增加到15.4厘米，每穗粒数平均从37.3粒增加到58.1粒。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCELISTING
<110>武汉大学
<120>小RNA基因miR396b在提高作物产量中的应用
<130>1
<160>14
<170>PatentInversion3.5
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<212>RNA
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gtggaagtgcagggtccgaggtcagttcaagaaagctgtggaagtgcagggtccgaggtc120
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Claims (10)
1.一种miR396b基因或干涉miR396b基因在提高作物产量上的应用，其特征在于：所述的提高产量包括一次枝梗数目增加、二次枝梗数目增加和穗粒数增加。
2.根据权利要求1所述的miR396b基因或干涉miR396b基因在提高作物产量上的应用，其特征在于：所述的miR396b基因包含下述任一基因：
（1）如SEQIDNO.1或2所示序列的RNA；
（2）所有能够在作物体内形成如SEQIDNO.1或2所示序列的RNA；
（3）与SEQIDNO.1或2所示序列有个别碱基差异且与其功能相同的RNA；
（4）所有能够在作物体内形成如SEQIDNO.1或2所示序列的反向互补核苷酸序列；
（5）与SEQIDNO.1或2所示序列反向互补，有个别碱基差异且与其功能相同的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的miR396b基因或干涉miR396b基因在提高作物产量上的应用，其特征在于：所述的干涉miR396b基因为与SEQIDNO.1或2所示序列中第7～12位碱基发生变异的互补DNA。
4.根据权利要求1所述的miR396b基因或干涉miR396b基因在提高作物产量上的应用，其特征在于：所述的作物为单子叶植物。
5.根据权利要求4所述的miR396b基因或干涉miR396b基因在提高作物产量上的应用，其特征在于：所述的作物为水稻。
6.用于扩增权利要求1或2所述的miR396b基因或权利要求1或3所述的干涉miR396b基因的引物在提高作物产量上的应用。
7.含权利要求1或2所述的miR396b基因或权利要求1或3所述的干涉miR396b基因表达盒、重组表达载体、转基因细胞系和重组菌在提高作物产量上的应用。
8.一种提高作物产量的方法，其特征在于：降低作物体内miR396b的表达量。
9.根据权利要求8所述的提高作物产量的方法，其特征在于：将干涉miR396b基因通过表达载体导入作物体内使miR396b的表达量降低。
10.miR396b基因作为分子标记在作物育种中的应用。
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