CN115960954A - Rna干扰载体及其在诱导双子叶植物基因沉默中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双子叶植物RNA干扰载体及其构建和应用，该RNA干扰载体以单子叶植物的pTCK303‑Ubi为基础载体，包含双子叶植物基因表达启动子及报告基因/筛选基因。本发明以单子叶植物常用载体pTCK303‑Ubi为基础，通过In‑Fusion无缝克隆技术将双子叶植物基因表达常用启动子CaMV35S以5’‑3’方向构建至pTCK303载体的Hind III和BamH I克隆位点处，构建适用于双子叶植物RNA干扰的pTCK303‑35S载体，具有广阔的理论和实用价值。

Description

RNA干扰载体及其在诱导双子叶植物基因沉默中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是一种诱导双子叶植物基因沉默的方法。

背景技术

RNAi技术是植物转基因中最为常用的一种转录后基因沉默技术。RNAi转基因植物是指基于RNAi技术，通过导入受体植物外源片段产生双链RNA(double strand RNA，dsRNA)并被加工成小RNA(small RNA，sRNA)，进而引发与之互补的特定靶基因表达下降或沉默，从而获得的可用于农业生产或农产品加工的植物及其产品^[1-2]。自从RNAi现象被发现以来，多种基因沉默技术，包括反义RNA、发卡RNA(hairpin RNA,hp RNA)、病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、人工miRNA(artificial miRNA,ami RNA)以及CRISPR/Cas9基因编辑技术，都已被广泛应用于植物分子生物学研究各领域，并成为植物基因功能研究的重要手段^[3-4]。在植物中，研究表明含有内含子作为间隔序列的发夹RNA(hpRNA)具有较高的沉默效率^[5]。其技术核心是用一个短的内含子连接两个反向互补的基因片段，从而转录出的RNA能够形成茎环结构(反向互补的基因序列形成dsRNA，内含子序列形成环)，茎环结构中的dsRNA被剪切从而产生siRNA，进而靶向切割植物体内的目的基因，实现基因的沉默^[6]。因此，hpRNA表达载体被广泛用于植物的基因沉默研究。

目前，对于RNA干扰载体构建方法有传统酶切酶连法、Gateway克隆法、重叠延伸PCR法、LIC克隆法以及无缝克隆法等。酶切酶连法操作相对比较繁琐，且Gateway法所需试剂相对较为昂贵，LR反应重组效率低等问题^[7-8]。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种双子叶植物RNA干扰载体、该载体的构建方法，以及其应用如诱导双子叶植物特定基因沉默表达。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种诱导双子叶植物基因沉默的方法，首先取pTCK303-Ubi载体，利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切单子叶植物的pTCK303-Ubi载体，凝胶电泳分离回收线性化pTCK303-Ubi载体；然后取pBI121载体，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物，从pBI121载体上克隆CaMV35S启动子，凝胶电泳分离回收CaMV35S启动子片段；然后采用无缝克隆法将回收的CaMV35S启动子片段与线性化的pTCK303-Ubi载体进行连接得到重组质粒，所得重组质粒经过后处理得到目标干扰载体pTCK303-35S；最后将需要沉默的双子叶植物内源基因作为目的基因，构建的pTCK303-35S载体CaMV35S启动子后含有一段Rice-intron序列，将目的基因的靶片段以相向方向分别连接到pTCK303-35S载体Rice-intron内含子两端，从而使转录的RNA形成茎环结构进而沉默目的基因，构建得到指向双子叶植物目的基因的RNAi载体，然后利用原位技术遗传转化体系对双子叶植物进行转化，经双重验证程序，确认得到目的基因表达下调的转基因植株。

作为本发明的一种优选技术方案，所述双重验证程序包括在所得双子叶植物的阳性转化植株中进行如下验证：验证遗传转化的T0代和T1代双子叶植株中均能够PCR扩增到HygR抗性筛选基因和GUS报告基因；验证目的基因的表达下调；经双重验证确认构建的pTCK303-35S载体的HygR抗性筛选基因和GUS报告基因表达元件正常表达同时能够有效沉默目的基因，表明pTCK303-35S载体适用于双子叶植物，能够利用In-Fusion无缝克隆体系和/或常用酶切-T4连接体系广泛、高效、快捷的对双子叶植物的基因表达进行操作。

一种基于单子叶植物载体进行双子叶植物RNA干扰载体构建的方法，首先取pTCK303-Ubi载体，利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切pTCK303-Ubi载体，凝胶电泳分离回收线性化pTCK303-Ubi载体；然后取pBI121载体，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物，从pBI121载体上克隆CaMV35S启动子，凝胶电泳分离回收CaMV35S启动子片段；然后采用无缝克隆法将回收的CaMV35S启动子片段与线性化的pTCK303-Ubi载体进行连接得到重组质粒，经后处理得到目标干扰载体。

作为本发明的一种优选技术方案，所述后处理包括：利用热激法将重组质粒转化至大肠杆菌感受态DH5α中，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基中，恒温过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定；将鉴定的阳性单菌落扩繁培养，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，命名并进行测序验证。

一种基于单子叶植物载体构建的用于双子叶植物的RNA干扰载体，该RNA干扰载体以单子叶植物载体pTCK303-Ubi为基础载体，包含双子叶植物基因表达启动子CaMV35S或其他双子叶植物启动子，同时包含至少一组报告基因和/或筛选基因。

作为本发明的一种优选技术方案，该RNA干扰载体以单子叶植物载体pTCK303-Ubi为基础载体，包含双子叶植物基因表达启动子CaMV35S，同时包含GUS报告基因与潮霉素抗性筛选基因。

所述RNA干扰载体用于培育双子叶转基因植物的用途；在所培育的双子叶转基因植物当中，目的基因表达显著下调。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明以单子叶植物常用载体pTCK303-Ubi为基础，通过In-Fusion无缝克隆技术将双子叶植物基因表达常用启动子CaMV35S以5’-3’方向构建至pTCK303载体的Hind III和BamHI克隆位点处，构建适用于双子叶植物RNA干扰的pTCK303-35S载体。将已知功能番茄内源基因SlARR-9和黄瓜内源基因CsARR-9的靶片段以相向方向分别连接到pTCK303-35S载体Rice-intron内含子两端，以构建双子叶植物目的基因的RNAi载体。利用已建立的原位技术遗传转化体系对番茄和黄瓜进行转化，结果表明，在SlARR-9-RNAi和CsARR-9-RNAi遗传转化的T0代和T1代黄瓜和番茄植株中，均可PCR扩增到HygR抗性筛选基因和GUS报告基因，同时SlARR-9和CsARR-9基因显著下调表达。表明构建的pTCK303-35S载体能够有效沉默SlARR-9和CsARR-9基因，同时pTCK303-35S载体的HygR抗性筛选基因和GUS报告基因表达元件正常表达，表明新构建的pTCK303-35S载体可有效诱导双子叶植物基因沉默，同时适用于双子叶植物基因RNA干扰载体构建的pTCK303-35S可以利用In-Fusion无缝克隆体系或实验室常用的酶切-T4酶连接体系，具有技术体系适用范围广、简便、快速和高效特点，具有广阔的理论和实用价值。

附图说明

图1显示pTCK303-Ubi载体酶切及CaMV35S启动子序列获取。图中：泳道1：BamH I、HindⅢ双酶切pTCK303-Ubi载体，获得不含Ubi启动子的pTCK303线性化载体(12600bp)；泳道2：pTCK303-Ubi空质粒对照(14621bp)；泳道3：CaMV35S启动子(835bp)扩增；M:2000bpDNAmarker。

图2为pTCK303-Ubi载体图谱和pTCK303-35s载体图谱。图中：虚线框显示为，pTCK303-Ubi载体中Ubi启动子切下替换为CaMV35S启动子。

图3上显示SlARR-9及CsARR-9基因RNA干扰靶片段扩增；其中：泳道1-2：SlARR-9-RNA1靶片段；泳道3-4：SlARR-9-RNA2靶片段；泳道5：CsARR-9-RNA1靶片段；泳道6：CsARR-9-RNA2靶片段；M：2000bp DNAmarker。图3下显示SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S和CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S表达载体菌落PCR鉴定；其中：泳道1-4：SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S菌落PCR鉴定；泳道5-8：CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S菌落PCR鉴定；M：2000bp DNA marker。

图4为SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S和CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S载体图谱。图中：A为SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S载体图谱，虚线框为SlARR-9基因靶片段在pTCK303-35S载体连接位置与方向；B为CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S载体图谱，虚线框为CsARR-9基因靶片段在pTCK303-35S载体中连接位置与方向。

图5显示潮霉素(760bp)鉴定转SlARR-9-RNAi基因番茄阳性DNA。图中：B1-B54:pTCK303-35S空载转基因植株；C1-C46:SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S转基因植株；CK:pTCK303-35S空载质粒阳性对照。

图6显示利用GUS染色法对番茄花染色鉴定遗传转化阳性。图中：A：WT番茄；B：pTCK303-35S空载对照；C：SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S。

图7为基因表达量分析图；其中：A:SlARR-9-RNAi-pTCK303-35s基因表达量分析；B:CsARR-9-RNAi-pTCK303-35s基因表达量分析。图中：以pTCK303-35S载体诱导的SlARR-9基因与CsARR-9基因的RNA沉默，以番茄和黄瓜的叶片进行qRT-PCR分析。每组生物学重复5次，技术重复3次，并以WT植物为对照比值表示，定义为1。每组之间永不同字母表示显著性差异(P≤0.05)。

图8显示潮霉素-B对T1代番茄萌发芽苗遗传转化阳性筛选。图中：A左为WT经潮霉素-B筛选，A右为WT未经潮霉素-B筛选；B为pTCK303-35s空载经潮霉素-B筛选，左边为非阳性单株，右边为阳性单株；C为SlARR-9-RNAi-pTCK303-35s经潮霉素筛选，上排为非阳性单株，下排为阳性单株。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。具体包括：

植物材料——番茄品种Mcico Tom，黄瓜品种新春四号。质粒及试剂——pTCK303-Ubi质粒，来自河南省粮食作物基因组编辑工程技术研究中心；GXL DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、氨苄青霉素(Ampicillin，AMP)、卡那霉素(Kanamycin)；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒；大肠杆菌(Escherichia coli)感受态DH5α、农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受态GV3101。

本发明所采用的现有方法、试剂、设备可见于公开文献，具体包括：

[1]Fire A et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.[J].Nature,1998,391(6669):806-11.

[2]黄春蒙,朱鹏宇,王智,等.基于RNAi技术的转基因植物研究进展[J].生物技术进展,2020,10(1):9.

[3]张晓辉,邹哲,张余洋,李汉霞,叶志彪.从反义RNA到人工miRNA的植物基因沉默技术革新[J].自然科学进展,2009,19(10):1029-1037.

[4]Wada Naoki et al.Precision genome editing in plants:state-of-the-art in CRISPR/Cas9-based genome engineering.[J].BMC plantbiology,2020,20(1):234.

[5]Wesley S.Varsha et al.Construct design for efficient,effective andhigh-throughput gene silencing inplants:Construct design forgene silencing[J].ThePlant Journal,2001,27(6):581-590.

[6]Castel Stephane E and Martienssen Robert A.RNA interference in thenucleus:roles for small RNAs in transcription,epigenetics and beyond.[J].Nature reviews.Genetics,2013,14(2):100-12.

[7]粟挺,刘爱玲,陈信波.RNA干扰载体构建方法的研究进展[J].湖南农业科学,2011(19):1-4.DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2011.19.001.

[8]Sang-Min Chung and Ellen L.Frankman and Tzvi Tzfira.A versatilevector system for multiple gene expression inplants[J].Trends inPlantScience,2005,10(8):357-361.

[9]Roger M.Benoit et al.An improved method for fast,robust,andseamless integration of DNAfragments intomultiple plasmids[J].ProteinExpression andPurification,2005,45(1):66-71.

[10]李玲玲,张伟,宋玲珍,胡新德,陈树林,赵善廷.In-fusion连接技术优化及其在大片段重组载体构建中的应用[J].动物医学进.

[11]汤婷,谢实龙,祝旋,徐俊锋,唐俊,汪小福.CaMV35S启动子及其在转基因作物中的应用和检测[J].浙江农业学报,2019,31(01):161-170.

[12]王颖,麦维军,梁承邺,张明永.高等植物启动子的研究进展[J].西北植物学报,2003(11):2039-2047.

[13]Hohn T,Richards K,Geneviève-Lebeurier.Cauliflower mosaic virus onits way to becoming a useful plant vector[J].Current Topics in Microbiology&Immunology,1982,96(1-3):194.

[14]安韶雅,虎娟,张虹,孙放,马霞,王晨,陈任.用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用[J].生命科学研究,2018,22(02):114-121.DOI:10.16605/j.cnki.1007-7847.2018.02.004.

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[16]Lipardi C and Wei Q and Paterson B M.RNAi as random degradativePCR:siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate newsiRNAs.[J].Cell,2001,107(3):297-307.

[17]杨传辉,卢荣锐,杨愈丰.无限制克隆技术研究进展及其应用[C]//.中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技术大会论文集.[出版者不详],2019:220-227.DOI:10.26914/c.cnkihy.2019.026832.

[18]Bryksin Anton V and Matsumura Ichiro.Overlap extension PCRcloning:a simple and reliable way to create recombinant plasmids.[J].BioTechniques,2010,48(6):463-5.

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[20]Pfeiffer P and Hohn T.Involvement of reverse transcription in thereplication of cauliflower mosaic virus:adetailedmodel andtest ofsomeaspects.[J].Cell,1983,33(3):781-9.

在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

实施例1、CaMV35S启动子序列引物设计

根据已有的CaMV35S启动子序列，采用In-Fusion无缝克隆法进行引物设计，见表1。

表1.引物序列

实施例2、构建双子叶植物基因RNA干扰载体pTCK303-35S

利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切pTCK303-Ubi载体，切掉的Ubi启动子长度为2021bp，凝胶电泳分离回收线性化pTCK303(12600bp)载体。同时用35S-pTCK303-F(Hind III)和35S-pTCK303-R(BamHI)引物，从pBI121载体上克隆CaMV35S启动子，凝胶电泳分离回收CaMV35S启动子片段(835bp)。采用In-Fusion无缝克隆法将回收的CaMV35S启动子片段与线性化的pTCK303-Ubi载体进行连接，利用热激法将重组质粒转化至大肠杆菌感受态DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基中，37℃恒温过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。将鉴定的阳性单菌落扩繁培养，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，命名为pTCK303-35S，并将其送至武汉金开瑞生物测序公司进行测序验证。

实施例3、SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S和CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S表达载体构建

为验证构建的pTCK303-35S载体能否作为适用于双子叶植物RNA干扰的合适载体，选择实验室已有番茄基因SlARR-9与黄瓜基因CsARR-9，根据其CDS序列全长分别设计引物获取RNAi靶片段(引物见表1)。构建的pTCK303-35S载体CaMV35S启动子后含有一段Rice-intron序列，可在Rice-intron序列两端连接两个反向互补配对的基因靶片段，从而使转录的RNA形成茎环结构进而沉默目的基因。因此，Rice-intron序列正向端采用限制性内切酶BamHⅠ对载体pTCK303-35S进行酶切，再利用In-Fusion无缝克隆体系将SlARR-9-RNA1靶片段与酶切后载体进行连接，并转化大肠感受态DH5α，挑取单克隆并PCR鉴定，将阳性单克隆命名为SlARR-9-RNA1-pTCK303-35S，并提取质粒。Rice-intron序列反向端采用限制性内切酶SacⅠ对载体SlARR-9-RNA1-pTCK303-35S进行酶切，同样利用In-Fusion无缝克隆体系将SlARR-9-RNA2靶片段与线性化后SlARR-9-RNA1-pTCK303-35S载体进行连接，并转化至大肠感受态DH5α，挑取单克隆进行PCR鉴定，阳性单克隆命名为SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S，提取质粒。同理，构建CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S载体。选择适量SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S与CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S质粒，利用热击法将其转化进农杆菌GV3101感受态细胞中，进行菌落PCR鉴定，将阳性菌液甘油保存于-80℃，待于植物转化使用。

实施例4、已构建的RNA干扰载体在植物中的转化及应用

以培育的MT番茄品种及新春四号黄瓜品种为试验材料，分别将构建的SlARR-9-RNAi-pTCK303-35和CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S表达载体与空载对照质粒pTCK303-35S通过农杆菌侵染对其进行转化。待各自长出2片以上真叶为止，提取叶片DNA进行阳性苗鉴定，待植物开花期，对其花朵进行GUS染色化学分析。将筛选出的阳性苗在同一条件下单独种植，利用Trizon法提取阳性苗RNA进行qRT-PCR基因表达量分析。

实施例5结果与分析

5.1 CaMV35S启动子的扩增及适用于双子叶植物基因RNA干扰表达载体pTCK303-35S的构建

pTCK303-Ubi载体(图1)经限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，凝胶电泳分离回收线性化pTCK303载体(12600bp，图1A)。同时将从pBI121载体上克隆得到的CaMV35S启动子片段经凝胶电泳分离回收(835bp，图1B)。利用In-Fusion无缝克隆法将回收的CaMV35S启动子与线性化的pTCK303-Ubi载体进行连接，形成重组质粒pTCK303-35S；连接后的重组质粒转化至大肠杆菌，单菌落经PCR鉴定正确，提取质粒，将重组质粒pTCK303-35S进行测序，测序结果经比对分析后表明pTCK303-35S载体构建成功。

5.2番茄SlARR-9和黄瓜CsARR-9基因RNA干扰载体SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S和CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S的构建及鉴定

分别以番茄与黄瓜的cDNA为模板扩增到SlARR-9基因(463bp)与CsARR-9基因(420bp)的RNA1与RNA2靶片段(图3上，引物见表1)。

构建的pTCK303-35S载体CaMV35S启动子后带有一段Rice-intron序列，为验证构建的pTCK303-35S载体是否能在双子叶植物中正常表达，Rice-intron序列正向端采用BamHⅠ进行酶切，再利用In-Fusion无缝克隆技术将线性化的pTCK303-35S载体与SlARR-9-RNA1片段进行连接，转化大肠DH5α，挑取单克隆进行PCR鉴定，将阳性单克隆提取质粒，形成重组质粒SlARR-9-RNA1-pTCK303-35S。重组质粒SlARR-9-RNA1-pTCK303-35S的Rice-intron序列反向端采用SacⅠ进行酶切，同样利用In-Fusion无缝克隆技术将线性化的SlARR-9-RNA1-pTCK303-35S载体与SlARR-9-RNA2靶片段进行连接，转化大肠DH5α，挑取单克隆进行PCR鉴定，鉴定正确的即为最终目的载体SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S(图3下A)，提取质粒并转化至农杆感受态GV3101，挑取单克隆进行PCR鉴定，鉴定正确的单克隆置于-80℃甘油保存备用。

同理，成功构建CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S表达载体(单克隆PCR鉴定见图3下B,载体图谱见图4)，转化农杆并置于-80℃甘油保存备用。

5.3已构建番茄SlARR-9和黄瓜CsARR-9基因RNA干扰表达载体在植物基因转化中的应用

以MT番茄和新春四号黄瓜品种为转化材料，采用农杆菌侵染法分别对其进行遗传转化。

番茄生长期，提取叶片DNA，利用潮霉素引物对其进行PCR阳性鉴定(760bp，图5)，共获得番茄空载阳性单株16株与RNAi单株13株。

待生长至开花期时，对番茄花进行GUS染色化学分析。番茄花GUS染色分析可见，WT处理的番茄花无任何染色痕迹，pTCK303-35S空载对照番茄花包括花瓣、雌蕊的整朵花皆染色成蓝色，SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S的番茄雌蕊染色为蓝色，而花瓣未染色(图6)。

利用Trizon法提取番茄与黄瓜阳性植株叶片RNA进行qRT-PCR基因表达量分析。结果表明，SlARR-9基因和CsARR-9基因在WT和pTCK303-35S对照植株的叶片中表达差异不显著，SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S与CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S阳性单株中的SlARR-9基因和CsARR-9基因在叶片中的相对表达量分别为0.326和0.160，显著低于WT和pTCK303-35S对照植株(P<0.05)(图7)，表明RNAi诱导了SlARR-9基因与CsARR-9基因在番茄与黄瓜中发生沉默。

采用50mg/L潮霉素-B溶液对T1代番茄种子进行阳性筛选，根据结果显示，WT经潮霉素-B筛选，根尖明显发生褐化，不经潮霉素筛选，则正常生长；pTCK303-35S空载与SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S经潮霉素筛选，不抗潮霉素-B的非阳性种子的根尖发生褐化，抗潮霉素-B的阳性种子根尖正常生长(见图8)。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

综上实施例可见，本发明利用实验室已有的pTCK303-Ubi与pBI121两种载体质粒，构建了一个适用于双子叶植物RNA干扰表达转化的质粒载体pTCK303-35S。pTCK303-Ubi载体Ubiquitin启动子后含有一段Rice-intron序列，可在该序列两端连接两个反向互补的基因靶片段，进而转录的RNA能形成发卡结构实现基因的沉默。再则Rice-intron序列两端含有BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ、Spe Ⅰ、SacⅠ等多克隆位点，对于RNAi载体构建提供极大便利。但因pTCK303-Ubi载体Rice-intron序列前所含启动子为Ubiquitin启动子，该启动子适用于单子叶植物表达转化，对于双子叶植物的表达转化效果不太理想。CaMV35S启动子是20世纪80年代初，Chua和洛克菲勒大学的合作者在感染了花椰菜花叶病毒(CaMV)的植物中分离出了一种启动子，该启动子负责花椰菜花叶病毒(CaMV)的整个基因组的转录表达，且该启动子对于双子叶植物具有高转录水平等特点^[19-20]。我们利用BamH Ⅰ、HindⅢ两种限制性内切酶将pTCK303-Ubi载体上Ubiquitin启动子切下，再将从pBI121载体上克隆的CaMV35S启动子通过In-Fusion无缝克隆技术连接到无Ubiquitin启动子的线性化pTCK303载体上，成功构建了新的适用于双子叶植物RNA干扰表达转化的质粒载体pTCK303-35S。另外，该载体还包含独立表达的潮霉素HygR基因和GUS基因。对于转基因植株，两者对T0代阳性植株鉴定及T1代阳性植株筛选提供有利帮助。进一步的，本发明为了验证构建的pTCK303-35S载体在双子叶植物中RNA干扰能否正常表达，以番茄基因SlARR-9和黄瓜基因CsARR-9为基础，MT番茄及新春四号黄瓜品种为材料，通过In-Fusion无缝克隆体系构建了用于植物基因转化的表达载体SlARR-9-RNAi-pTCK303-35S和CsARR-9-RNAi-pTCK303-35S，并以野生型(WT)植株和pTCK303-35S空载体转化植株作为对照，经农杆菌转化侵染，DNA鉴定后获得阳性植株，对阳性植株提取RNA并进行qRT-PCR数据测定后显示番茄基因SlARR-9和黄瓜基因CsARR-9都显著降低了其表达量，表明构建的pTCK303-35S载体在双子叶植物中能够有效沉默基因的表达。且对后代阳性单株筛选时，只需在培养皿中添加潮霉素-B水溶液即可对植株进行阳性筛选。以上结果表明构建的pTCK303-35S载体能够作为一个在双子叶植物遗传转化中的合适载体，且该载体含有的多个克隆位点，可简单、方便、快速的构建双子叶植物RNA干扰载体。目前该载体已应用在实验平台多个基因上，RNA干扰都有不错的表达效果，对于实验筛选出的多个基因进行基因功能验证提供了极大便利。

以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种诱导双子叶植物基因沉默的方法，其特征在于：首先取pTCK303-Ubi载体，利用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切单子叶植物的pTCK303-Ubi载体，凝胶电泳分离回收线性化pTCK303-Ubi载体；然后取pBI121载体，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物，从pBI121载体上克隆CaMV35S启动子，凝胶电泳分离回收CaMV35S启动子片段；然后采用无缝克隆法将回收的CaMV35S启动子片段与线性化的pTCK303-Ubi载体进行连接得到重组质粒，所得重组质粒经过后处理得到目标干扰载体pTCK303-35S；最后将需要沉默的双子叶植物内源基因作为目的基因，构建的pTCK303-35S载体CaMV35S启动子后含有一段Rice-intron序列，将目的基因的靶片段以相向方向分别连接到pTCK303-35S载体Rice-intron内含子两端，从而使转录的RNA形成茎环结构进而沉默目的基因，构建得到指向双子叶植物目的基因的RNAi载体，然后利用原位技术遗传转化体系对双子叶植物进行转化，经双重验证程序，确认得到目的基因表达下调的转基因植株。

2.根据权利要求1所述的一种诱导双子叶植物基因沉默的方法，其特征在于：所述双重验证程序包括在所得双子叶植物的阳性转化植株中进行如下验证：验证遗传转化的T0代和T1代双子叶植株中均能够PCR扩增到HygR抗性筛选基因和GUS报告基因；验证目的基因的表达下调；经双重验证确认构建的pTCK303-35S载体的HygR抗性筛选基因和GUS报告基因表达元件正常表达同时能够有效沉默目的基因，表明pTCK303-35S载体适用于双子叶植物，能够利用In-Fusion无缝克隆体系和/或常用酶切-T4连接体系广泛、高效、快捷的对双子叶植物的基因表达进行操作。

3.一种基于单子叶植物载体进行双子叶植物RNA干扰载体构建的方法，其特征在于：首先取pTCK303-Ubi载体，利用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切pTCK303-Ubi载体，凝胶电泳分离回收线性化pTCK303-Ubi载体；然后取pBI121载体，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物，从pBI121载体上克隆CaMV35S启动子，凝胶电泳分离回收CaMV35S启动子片段；然后采用无缝克隆法将回收的CaMV35S启动子片段与线性化的pTCK303-Ubi载体进行连接得到重组质粒，经后处理得到目标干扰载体。

4.根据权利要求3所述的基于一种单子叶植物载体进行双子叶植物RNA干扰载体构建的方法，其特征在于：所述后处理包括：利用热激法将重组质粒转化至大肠杆菌感受态DH5α中，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基中，恒温过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定；将鉴定的阳性单菌落扩繁培养，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，命名并进行测序验证。

5.一种基于单子叶植物载体构建的用于双子叶植物的RNA干扰载体，其特征在于：该RNA干扰载体以单子叶植物载体pTCK303-Ubi为基础载体，包含双子叶植物基因表达启动子CaMV35S或其他双子叶植物启动子，同时包含至少一组报告基因和/或筛选基因。

6.根据权利要求5所述的一种基于单子叶植物载体构建的用于双子叶植物的RNA干扰载体，其特征在于：该RNA干扰载体以单子叶植物载体pTCK303-Ubi为基础载体，包含双子叶植物基因表达启动子CaMV35S，同时包含GUS报告基因与潮霉素抗性筛选基因。

7.权利要求5或6所述RNA干扰载体用于培育双子叶转基因植物的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，在所培育的双子叶转基因植物当中，目的基因表达显著下调。

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