CN101864418B - 一种启动子BgIosP513、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种启动子，特别是一种单子叶植物例如水稻的启动子，以及所述启动子的制备方法及用途。本发明所述启动子具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的选自如下的变体：1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本发明还涉及所述启动子的制备方法以及所述启动子在调控单子叶植物中目的基因表达和水稻育种中的用途。

Description

一种启动子BgIosP513、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种启动子，特别是一种单子叶植物例如水稻的启动子，以及所述启动子的制备方法及用途。

背景技术

启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。

根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)中分离的。

人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果(Plant biotechnology，2002，19(1)：19-26)。

单子叶植物基因中常见的启动子有：Ubi启动子(Plant ubiquitinpromoter)、Actin启动子(Plant Actin promoter)和Adh-1启动子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。

Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的Ubi-1启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbB1启动子、烟草泛素Ubi.U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubi1-1启动子，大麦泛素Mub1启动子。玉米泛素Ubi-1启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。

Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现，属于强组成型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。

Adh-1启动子调控乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-1启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦和大麦，和少部分双子叶植物如烟草，基因的调控功能比花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子提高10-50倍。Adh-1启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调控效果都很有限。

单子叶植物是被子植物的主要类群，单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天南星等，是非常重要的农业作物。单子叶植物基因的强效启动子，能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因，对优良作物的分子育种研究意义重大。

在强效启动子相关研究领域，发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外，双子叶植物中的一些强效启动子如CsVMV启动子、番茄E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vst1启动子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。

尽管已经有上述已知的单子叶植物的启动子，本发明人通过对水稻基因组的深入研究，提供了一种新的单子叶植物启动子，所述启动子能够用于调控单子叶植物中目的基因表达，同时为研究单子叶植物中目的基因表达提供了一种新的工具和选择。

发明内容

本发明的一个方面，提供了一种具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的单子叶植物启动子。在本发明中，所述启动子的具体碱基序列长度为415个碱基，如SEQ ID NO：1所示：

TTGTACAAAGTATTCTTTCTAGTGGATTGTGCAAAGAAAAGAGAAGGTGAACAGGGAGGGAAGAAGAAAATATCTCGGAGGTAGGTTGTTTTCTTACTGCAACATCAACTGCATGCTGTCCTTTTTTGGCTGTGCCTGTTTTGCAATTTTGTAAGAATTGAGGTAAGATAAGTATGAAGAGATAGGGTAGAAATATCTTTACAAGAGTACAAAGATGCGGGGCATTGGGGGTGGGGCCCTGTAGCGAGCAAGCCAAATGGGAGAACACCACATATCAGCTGAATCTTATCCATAGAAAAGAGGGAATTGAAGGGGCAGGAAGGATATCCCGGCCTTGTGGCACACTTGACTGGAGATGTATAAAGAGAGGAGGATGTGAAGAAAGAAGATATCTACCACCAAGCTAATTAAGCAA(SEQ ID NO：1)

在本发明中，将SEQ ID NO：1所示的启动子序列称为启动子BgIosP513，或简称为P513启动子。

该启动子为组成型启动子，带有该启动子和GUS的水稻愈伤组织以及转基因水稻苗经GUS染色实验后，所述水稻愈伤组织和转基因水稻苗的根、茎、叶等都变蓝色。

本发明的又一方面，涉及具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列互补的序列的启动子。

本发明的又一方面，还涉及SEQ ID NO：1所示单子叶植物启动子的具有启动子功能的选自如下的变体：

1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，

2)对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和

3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQID NO：1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在SEQ IDNO：1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。

在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心(NCBI)为公众所获得。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

本发明中，所述的启动子来源于单子叶植物，具体地，所述单子叶植物为水稻，例如所述水稻为日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonicacv.Nipponbare)。

本发明的又一方面，还涉及一种含有本发明所述单子叶植物启动子的重组载体。所述重组载体可以通过将上述启动子插入到克隆载体或表达载体而得到。

适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如：pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19-T Simple Vecter等。

适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如：pBI121、p13W4、pGEM等。

在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为p8+P513重组载体。

本发明的又一方面，还涉及含有本发明所述单子叶植物启动子的所述重组载体的重组细胞。所述重组细胞可以通过将含有本发明所述单子叶植物启动子的所述重组载体转化至宿主细胞而得到。

适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101等。

在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-P513。

本发明的又一方面，还涉及一种单子叶植物愈伤组织，所述愈伤组织转化有本发明所述的启动子。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻。所述水稻包括但不限于，例如：中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101(上述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公司)等。在本发明的又一实施方案中，所述水稻为日本晴。

本发明的又一方面，还涉及一种制备本发明所述启动子的方法，包括如下步骤：

1)根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，

2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR扩增引物对进行PCR扩增。

本领域技术人员周知，可以根据待扩增的目的核苷酸序列按照碱基互补原则设计相应的PCR扩增引物对。在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增引物对如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明的又一方面，还涉及一种调控单子叶植物中目的基因表达的方法，所述方法包括用本发明所述单子叶植物启动子转化单子叶植物的愈伤组织的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明所述单子叶植物启动子的重组细胞。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了前述的重组农杆菌EHA105-P513。在本发明的一个具体实施方案中，所述单子叶植物的愈伤组织为水稻愈伤组织，具体地，所述水稻为日本晴。

在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

本发明中，可利用所述单子叶植物启动子调控目的基因表达的所述单子叶植物包括但不限于，例如：水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等。

本发明的又一方面，还涉及本发明所述单子叶植物启动子在单子叶植物中调控目的基因表达的应用。在本发明的一个实施方案中，利用本发明所述启动子调控的目的基因是GUS。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻，具体地所述水稻为日本睛。

为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。

本发明的又一方面，涉及本发明所述启动子在水稻育种中的用途。所述水稻为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。在本发明的一个实施方案中，所述水稻为日本晴。

本发明的启动子可成为一种新的启动子作为单子叶植物、尤其是水稻转基因的工具启动子，为开展低表达基因转化苗筛选、植物花器官败育等分子育种研究提供便利，从而极大的缩短优良品种的选育时间。本发明的启动子可广泛用于培育水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等单子叶植物。

发明的有益效果

为了寻找新的单子叶植物启动子，用于调控单子叶植物目的基因表达，同时为研究单子叶植物基因表达提供新的工具和选择，本发明人通过生物信息学研究获得，并采用生物学实验验证了所述启动子BgIosP513的功能。具体地，所述启动子能够在水稻中调控GUS基因表达。

附图说明

图1是启动子BgIosP513的PCR扩增检测结果，其中，泳道1：1kbDNA Ladder Marker，泳道2：PCR扩增产物，泳道3：100bp DNA LadderMarker，其右侧的数字500和400表示所指向的Ladder Marker的条带的大小，单位都是bp。

图2是用于构建p8质粒的pCAMBIA-1301质粒示意图。

图3是p8质粒示意图中多克隆位点和GUS序列部分的示意图。

图4是p8质粒示意图。

图5是经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P513序列的重组根癌农杆菌p8+P513转化的水稻愈伤组织(左)经GUS染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻愈伤组织(对照，右)经GUS染色后颜色未发生变化。

图6是经过转化的转基因水稻苗的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P513序列的重组根癌农杆菌p8+P513转化的水稻苗(左)经GUS染色后，其根、茎、叶呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8转化的水稻苗(对照，右)经GUS染色后其根、茎、叶的颜色未发生变化。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：P513启动子片段的PCR扩增和pMD18-T+P513重组载 体的构建

PCR扩增

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02)提取水稻日本睛(2009年12月18日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-P200910)的基因组DNA，根据该启动子在水稻日本睛gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1，加限制性酶切位点EcoR I和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点Pst I和保护碱基)。以上述提取的水稻日本睛的gDNA为模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。

表1基因启动子扩增的PCR体系

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7min。

其中，上游引物F1：CCGgaattcTTGTACAAAGTATTC TTTCTAG(SEQ IDNO：2)，其中小写字母代表EcoR I酶切位点。

下游引物Ri：GCctgcagTTGCTTAATTAGCTTGGTGGTA(SEQ ID NO：3)，其中小写字母代表Pst I酶切位点。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为434bp的条带(图1)，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)进行纯化回收。

pMD18-T+P513重组载体的构建

将如上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序(如SEQ ID NO：4所示)，证明准确。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系：          10μl

pMD18-T                1μl

2*solution I           5μl

PCR扩增产物(回收插入片段)10ng～20ng，根据其浓度定

ddH₂O                  补齐至10μl

于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上，得到pMD18-T+P513重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：上海生工购得)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pMD18-T+P513重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl 4℃预冷的SOC培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，用剩下的150μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16h～24h。获得含有pMD18-T+P513克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-P513。深圳华大基因科技股份有限公司对pMD18-T+P513克隆载体中的P513进行测序，结果如下：CTCGAATTC TGGATTGTGCAAAGAAAAGAGAAGGTGAACAGGGAGGGAAGAAGAAAATATCTCGGAGGTAGGTTGTTTTCTTACTGCAACATCAACTGCATGCTGTCCTTTTTTGGCTGTGCCTGTTTTGCAATTTTGTAAGAATTGAGGTAAGATAAGTATGAAGAGATAGGGTAGAAATATCTCTACAAGAGTACAAAGATGCGGGGCATTGGGGGTGGGGCCCTGTAGCGAGCAAGCCAAATGGGAGAACACCACATATCAGCTGAATCTTATCCATAGAAAAGAGGGAATTGAAGGGGCAGGAAGGATATCCCGGCCTTGTGGCACACTTGACTGGAGATGTATAAAGAGAGGAGGATGTGAAGAAAGAAGATATC

CTGCAGGTC(SEQ ID NO：4)

上面的序列中，带下划线的为酶切位点，带方框的为引物序列。

测序结果表明，获得的pMD18-T+P513克隆载体中P513启动子序列正确。

实施例2：载体-p8+P513重组载体的构建

按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)的操作手册，从实施例1构建的转化有启动子P513的大肠杆菌DH5α-P513中提取带有本发明P513启动子序列的克隆载体pMD18-T+P513；纯化后用相应的限制性内切酶EcoR I(NEB，B0101S)和Pst I(NEB，R0140T)进行酶切，回收相应的启动子插入片段，并分别与p8质粒用相同的限制性内切酶酶切后回收的载体大片段进行连接。

将所得连接产物p8+P513重组载体转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞DH5α，37℃倒置培养16～24h，待转化子长出菌落后，挑取单克隆进行PCR检测和酶切鉴定。

p8质粒构建

本发明中所使用的p8质粒是由pCAMBIA-1301质粒(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，该公司的pCAMBIA-1301质粒的原始来源是The CAMBIABios(biological open source)Licensee，Australia)按照如下方式改造并构建的，具体说明如下：

用Kpn I/Nco I(NEB)双酶切质粒pCAMBIA-1301(参见图2)，回收大片段。根据所采用的限制性内切酶位点合成如下序列：GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCATGG(SEQ ID NO：5)(包含的酶切位点是Kpn I/Hind III/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sa II/Nco I)，用Kpn I/Nco I双酶切后回收，与上述所回收的大片段连接后转化top10细胞(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：北京索莱宝科技有限公司购得)。用引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT(SEQ ID NO：6)/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQID NO：7)筛选转化子，通过PCR检测方法，带有扩增片段为350bp的转化子即为含有需要构建的多克隆位点及GUS序列的p8质粒的转化子(参见图4)。

所述p8质粒中的多克隆位点和GUS序列的长度2353碱基，如SEQID NO：8所示(参见图3)：GTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTA ATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT

GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC

GAGCTC

AAGCTT GGATCC

(SEQ IDNO：8)

如上序列所示本发明中所构建的p8质粒，其多克隆位点中的EcoRI/Sac I/Kpn I/Hind III/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sa II/Nco I限制性酶切位点分别用加框和下划线表示，筛选转化子所用的引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(即SEQ ID NO：6和7)用双下划线表示，GUS序列用斜体表示，其内含子序列分别用斜体加底纹示出。

重组载体p8+P513的构建

根据限制性内切酶EcoR I(NEB，B0101S)和Pst I(NEB，R0140T)操作说明，按照如下条件处理实施例1中所得到的克隆载体pMD18-T+P513，以及如上所述构建的p8质粒。

其中，克隆载体pMD18-T+P513及p8质粒的酶切条件如下：

酶切体系：            50μl

无菌水                34.8μl

10*buffer H           5μl

EcoR I                0.1μl(10U)

Pst I                 0.1μl(10U)

克隆载体pMD18-T+P513或p 8质粒10μl(＜1000ng)

使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA  收试剂盒(目录号：DP209-03)分别回收经酶切的p8质粒，以及启动子P513插入片段，根据T4连接酶(TaKaRa，D2011A)操作说明，按照如下条件进行连接：

连接体系：                   10μl

10*T4buffer                  1μl

酶切后的p8质粒               1μl(20ng)

回收的启动子P513插入片段10～20ng，根据其浓度确定

无菌水                 补齐至9.5μl

T4 ligase(TaKaRa，D2011A)    0.5μl

T4buffer冰上融化，酶切后的p 8质粒载体加入量约20ng，本发明中的P513片段加10ng。于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上。

将100μl氯化钙法制得的感受态细胞DH5α从超低温冰箱取出，冰上融化后，加入10μl上面的连接产物，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl 4℃预冷的SOC，37度220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(kan)，37℃倒置培养16～24h。得到重组载体p8+P513。

分别以F1(即SEQ ID NO：2)和R1(即SEQ ID NO：3)为引物对所得重组载体p8+P513进行PCR检测，以确证所得重组载体p8+P513中含有所需启动子P513。通过EcoR I/Pst I酶切筛选含有重组载体p8+P513转化子。

实施例3重组根癌农杆菌EHA105-P513细胞的制备

将如实施例2所述方法构建的p8+P513重组载体和作为对照的p8质粒分别转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌EHA105(2009年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 209315)的感受态细胞，具体方法如下：

将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，至于冰上解冻。融化后，分别加入5μl的p8+P513重组载体和p8质粒以及作为对照的p8空载体，轻轻混匀，冰浴10min，放入液氮中冷冻5min，37℃解冻5min，加入800μl常温的LB液体培养基，28℃160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下200μl吹匀，涂布于加有kan-rif(卡那霉素-利福平)双抗的YM培养基平板上(50mg/lKan，10mg/l Rif，具体配方参见表4)。28℃倒置培养2-3天。

以F1(即SEQ ID NO：2)和R1(即SEQ ID NO：3)为引物进行PCR检测和通过EcoR I/Pst I酶切筛选转化子。

PCR扩增出约434bp条带和酶切出约427bp条带的为重组载体p8+P513的重组根癌农杆菌。

本发明中，按照如上述方法得到的带有重组载体p8+P513的重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-P513。

按照本发明所述方法，得到的带有p8质粒的对照重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-p8。

实施例4：水稻愈伤组织的诱导和转化

按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组根癌农杆菌EHA105-P513和重组根癌农杆菌EHA105-p8转化所述愈伤组织。

1)将水稻日本晴种子去壳，70％乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5％的次氯酸钠消毒30min，期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于N6D培养基(具体配方参见表2)上，用封口膜封口；29.5℃光照培养3～4周；

2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径1～3mm)，在新N6D培养基上29.5℃光照培养3天；

3)分别挑取如实施例3所构建的重组根癌农杆菌单菌落(重组根癌农杆菌EHA105-P513或重组根癌农杆菌EHA105-p8)，于添加抗生素(50mg/l Kan，10mg/l Rif)的YM培养基(具体配方参见表3、表4)上划线培养3天，培养温度28℃；分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了30μl 100mM的AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM培养基(具体配方参见表5)中，温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞(重组根癌农杆菌EHA105-P513或重组根癌农杆菌EHA105-p8)；

4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将如步骤3制备的重组根癌农杆菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min；

5)倒掉重组根癌农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于N6-AS培养基(配方参见表6)上放一张灭菌滤纸，加1ml如上述含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，28℃暗培养48～60h；

6)将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含1mg/l潮霉素B(HmB)和50mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3～4周。

实施例5：水稻愈伤组织中的GUS的表达

为检测经过实施例4所述转化的水稻愈伤组织中目的基因GUS的表达情况，按照Chen SY等在Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(6)：742-751所述的方法，对分别用重组根癌农杆菌EHA105-P513或重组农杆菌EHA105-p8转化的水稻愈伤组织进行染色。

GUS染色液的配方(1ml)：610μl 0.2M Na₂HPO₄溶液(pH＝7.0)；390μl 0.2M NaH₂PO₄溶液和10μl 0.1M X-gluc。

将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P513或重组根癌农杆菌EHA105-p8转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，37℃保温至出现蓝色，拍照，结果如图5所示，经含有启动子的p8+P513重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图5左)经染色后呈现蓝色，经不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(作为对照，图5右)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明的P513启动子对GUS基因表达具有调控作用。

实施例6：转基因水稻苗中GUS的表达

将实施例4中得到的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培养基(具体配方见表7)分化苗；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周；待幼苗长至3-4cm时转移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表8)进行生根筛选。

转基因水稻苗的GUS染色过程同实施例5中愈伤组织的染色过程。结果如图6所示，经含有启动子的p8+P513重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根、茎、叶(图6左)经染色后呈现蓝色，经不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根、茎、叶(作为对照，图6右)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明的P513启动子对GUS基因表达具有调控作用。

本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下：

以下有关培养基中所称的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌：121℃下蒸气灭菌20分钟。

表2N6D培养基

用1N氢氧化钾调节pH值到5.8，封口后按常规方法灭菌。

N₆macro母液(20X)：硝酸钾56.60g，磷酸二氢钾8.00g，硫酸铵9.26g，硫酸镁3.70g，氯化钙3.32g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

N₆micro母液(1000X)：碘化钾0.80g，硼酸1.60g，硫酸锰3.33g，硫酸锌1.50g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：将3.73g乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄.7H₂O分别溶解，混合并用。用蒸馏水定容至1000ml，70℃温浴2h，冷却后4℃保存不超过1个月。

N₆维生素贮存液(1000X)：维生素B₁0.10g，维生素B₆0.05g，烟酸0.05g，甘氨酸0.20g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

表3YM液体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)：

表4YM固体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)：

表5AAM培养基

加1N氢氧化钾调节pH值至5.2，常规灭菌。

AAM macro(10X)：2.5g七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，1.5g二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)，1.33g二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM micro(100X)：0.7g单水硫酸锰(MnSO₄·H₂O)，0.2g七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)，0.075g碘化钾(KI)，0.3g硼酸(H₃BO₃)，25mg二水钼酸钠(Na₂MoO₄.2H₂O)，2.5mg五水硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)，2.5mg六水氯化钴(CoCl₂.6H₂O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM有机(1000X)：0.75g甘氨酸(Glycine)，0.1g烟酸(Nicotinic acid)，0.1g VB₆(Pyridoxine)，1g VB₁(Thiamine)，蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

表6N6-AS共培养基

调pH至5.2。

N₆macro母液(20X)，N₆micro母液(1000X)，铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)，N₆维生素贮存液(1000X)：均见表2

表7MS-R分化培养基：

调PH值至5.8，常规方式灭菌。

MS macro(20X)：硝酸铵33.0g，硝酸钾38.0g，磷酸二氢钾3.4g，硫酸镁7.4g，氯化钙8.8g逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS micro(1000X)：硫酸锰16.90g，硫酸锌8.60g，硼酸6.20g，碘化钾0.83g，钼酸钠0.25g，硫酸铜0.025g，氯化钴0.025g，上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS维生素贮存液(1000X)：维生素B₁0.010g，维生素B₆0.050g，烟酸0.050g，甘氨酸0.200g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

表81/2MS生根培养基

调PH值至5.8。

MS macro(20X)见表7。

MS micro(1000X)MS维生素贮存液(1000X)见表7。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>深圳华大基因科技有限公司

<120>一种启动子BgIosP513、其制备方法及用途

<130>IDC090131

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>415

<212>DNA

<213>水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.)

<400>1

ttgtacaaag tattctttct agtggattgt gcaaagaaaa gagaaggtga acagggaggg  60

aagaagaaaa tatctcggag gtaggttgtt ttcttactgc aacatcaact gcatgctgtc  120

cttttttggc tgtgcctgtt ttgcaatttt gtaagaattg aggtaagata agtatgaaga  180

gatagggtag aaatatcttt acaagagtac aaagatgcgg ggcattgggg gtggggccct  240

gtagcgagca agccaaatgg gagaacacca catatcagct gaatcttatc catagaaaag  300

agggaattga aggggcagga aggatatccc ggccttgtgg cacacttgac tggagatgta  360

taaagagagg aggatgtgaa gaaagaagat atctaccacc aagctaatta agcaa       415

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccggaattct tgtacaaagt attctttcta g                                 31

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gcctgcagtt gcttaattag cttggtggta                                   30

<210>4

<211>433

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctcgaattct tgtacaaagt attctttcta gtggattgtg caaagaaaag agaaggtgaa  60

cagggaggga agaagaaaat atctcggagg taggttgttt tcttactgca acatcaactg  120

catgctgtcc ttttttggct gtgcctgttt tgcaattttg taagaattga ggtaagataa  180

gtatgaagag atagggtaga aatatctcta caagagtaca aagatgcggg gcattggggg    240

tggggccctg tagcgagcaa gccaaatggg agaacaccac atatcagctg aatcttatcc    300

atagaaaaga gggaattgaa ggggcaggaa ggatatcccg gccttgtggc acacttgact    360

ggagatgtat aaagagagga ggatgtgaag aaagaagata tctaccacca agctaattaa    420

gcaactgcag gtc                                                       433

<210>5

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggtaccaagc ttactagtcc tgcaggtcta gaggatccgt cgaccatgg                49

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcttccggct cgtatgttgt                                                20

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gagtcgtcgg ttctgtaac                                                 19

<210>8

<211>2353

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gttggcaagc tgctctagcc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat    60

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt    120

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt    180

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat    240

tacgaattcg agctcggtac caagcttact agtcctgcag gtctagagga tccgtcgacc    300

atggtagatc tgagggtaaa tttctagttt ttctccttca ttttcttggt taggaccctt    360

ttctcttttt atttttttga gctttgatct ttctttaaac tgatctattt tttaattgat    420

tggttatggt gtaaatatta catagcttta actgataatc tgattacttt atttcgtgtg    480

tctatgatga tgatgatagt tacagaaccg acgactcgtc cgtcctgtag aaaccccaac    540

ccgtgaaatc aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg    600

aattgatcag cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg    660

cagttttaac gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta    720

tcagcgcgaa gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga    780

tgcggtcact cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg    840

cggctatacg ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg    900

tatcaccgtt tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat    960

taccgacgaa aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg    1020

aatccatcgc agcgtaatgc tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt    1080

ggtgacgcat gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa    1140

tggtgatgtc agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg    1200

cactagcggg actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct    1260

ctatgaactc gaagtcacag ccaaaagcca gacagagtct gatatctacc cgcttcgcgt    1320

cggcatccgg tcagtggcag tgaagggcca acagttcctg attaaccaca aaccgttcta    1380

ctttactggc tttggtcgtc atgaagatgc ggacttacgt ggcaaaggat tcgataacgt    1440

gctgatggtg cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc    1500

gcattaccct tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat    1560

tgatgaaact gctgctgtcg gctttcagct gtctttaggc attggtttcg aagcgggcaa    1620

caagccgaaa gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt    1680

acaggcgatt aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag    1740

tattgccaac gaaccggata cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc    1800

ggaagcaacg cgtaaactcg acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg    1860

cgacgctcac accgatacca tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta    1920

cggatggtat gtccaaagcg gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact    1980

tctggcctgg caggagaaac tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac    2040

gttagccggg ctgcactcaa tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg    2100

gctggatatg tatcaccgcg tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg    2160

gaatttcgcc gattttgcga cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg    2220

gatcttcact cgcgaccgca aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac    2280

tggcatgaac ttcggtgaaa aaccgcagca gggaggcaaa caagctagcc accaccacca    2340

ccaccacgtg tga                                                       2353

Claims (15)

1.一种启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为SEQID NO：1所示核苷酸序列的互补序列。

2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的启动子。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其中，所述重组载体为p8+P513重组载体。

4.一种含有权利要求2或3所述重组载体的重组细胞。

5.权利要求4所述的重组细胞，其为重组农杆菌EHA105-P513。

6.一种制备权利要求1中所述的启动子的方法，包括如下步骤：

1)根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对；

2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR扩增引物对进行PCR扩增。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤1)中所述PCR扩增引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

8.一种调控单子叶植物中基因表达的方法，所述方法包括用权利要求1所述的启动子转化单子叶植物的愈伤组织的步骤，其中，所述单子叶植物为水稻，所述愈伤组织为水稻愈伤组织。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述水稻为日本晴。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了权利要求5所述的重组农杆菌EHA105-P513。

11.权利要求1所述的启动子在调控单子叶植物中目的基因表达的用途，其中所述目的基因为GUS，所述单子叶植物为水稻。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述水稻为日本晴。

13.权利要求1所述的启动子在水稻育种中的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述水稻选自日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。

15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述水稻为日本晴。

Images