CN106676106B - 调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用。揭示了miR396与禾本科植物的种子性状、抗虫性、耐盐性及花青素含量密切相关，下调miR396可增加种子粒长、促进植物抗虫性和耐盐性，以及增加植物花青素含量。因此，miR396或调节miR396的物质和方法可应用于实现植物品种的改良。

Description

调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用

技术领域

本发明属于植物学和基因技术领域，更具体地，本发明涉及调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用。

背景技术

随着全球耕地面积的逐年减少，农作物的产量难以维持人类的发展。虽然粮食作物的亩产在增加，但总产量难以维持增势。根据联合国粮农组织发布的报告，全球面临较大的粮食危机。一些主要粮食作物、油料作物的品种改良显得极为迫切。

禾本科植物，特别是水稻，是世界主要粮食作物，稻米也是中国居民的主要食粮和重要的出口农产品。随着人民生活水平的提高和稻米市场的开放，我国稻米的品质问题显得日益突出。稻米品质关系到食品安全、粮食出口量和人民生活水平的提高，改良我国稻米品质已经成为一项意义重大且十分紧迫的任务。因此，从分子角度研究稻米品质形成的机制和遗传特性，有利于为水稻优质品种选育提供理论和实践指导。稻米的品质与粒形紧密关联，品质的改变会影响到粒形，反之亦然。因此，对水稻粒形的研究和品质研究往往密不可分。

褐飞虱是以水稻和普通野生稻为食的单食性昆虫，危害严重时，可造成颗粒无收，是中国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫。因此，发掘抗褐飞虱的基因，开发抗褐飞虱的水稻品种，对于水稻抗虫研究具有重要意义和实践价值。

随着全球环境的不断恶化，土壤的盐碱化问题已日益威胁着人类赖以生存的有限的土壤资源。土壤中的过高盐分严重影响农作物的正常生长以及人类的健康。研究具有耐盐性的基因，对于实践中开发能适应高盐环境的优良抗盐品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种改良禾本科植物的性状的方法，所述方法包括：下调禾本科植物中miR396或其前体的表达。

在一个优选例中，所述的改良禾本科植物的性状包括：

促进种子的粒长增加；

促进种子的长/宽比增加；

提高植物的抗虫性；

提高植物的耐盐性；

提高植物中的花青素含量；和/或

提高植物的产量。

在另一优选例中，所述的下调禾本科植物中miR396或其前体的表达包括：利用干扰分子特异性下调miR396或其前体的表达，或利用基于target mimicry技术的miR396沉默体下调miR396或其前体的表达。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以miR396或其前体抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，所述利用基于target mimicry技术的miR396沉默体下调miR396表达的方法包括：

(1)将mimicry miR396序列置于ips基因序列中，获得ips-MIM396b序列片段；

(2)将ips-MIM396b序列片段转入禾本科植物中，获得转基因植物，其为改良的禾本科植物。

在另一优选例中，采用农杆菌发将ips-MIM396b序列片段转入禾本科植物中。

在另一优选例中，步骤(1)中，将mimicry miR396序列置于ips基因序列中的CCTCTAGAAA和AGCTTCGGTT之间的位点内；或所述的mimicry miR396序列如SEQ ID NO:14所示。

在另一优选例中，所述的提高植物的抗虫性是提高植物对昆虫的抗性，所述的昆虫是半翅目飞虱科昆虫。

在本发明的另一方面，提供一种miR396或其前体的下调剂的用途，用于改良禾本科植物的性状，包括：

促进种子粒长增加；

促进种子的长/宽比增加；

提高植物的抗虫性；

提高植物的耐盐性；

提高植物中的花青素含量；或

提高植物的产量。

在一个优选例中，所述的下调剂是特异性下调miR396或其前体表达的干扰分子，或是基于target mimicry技术的miR396沉默体。

在另一优选例中，所述的禾本科植物是禾本科谷类作物。

在另一优选例中，所述的禾本科谷类作物例如包括水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦等。

在另一优选例中，所述的禾本科植物是禾本科稻属植物如水稻，禾本科小麦属植物如小麦。

在本发明的另一方面，提供一种用于改良禾本科植物性状的miR396沉默体，所述miR396沉默体基于target mimicry技术建立，其包括ips基因序列中以及位于该序列中的mimicry miR396序列。

在另一优选例中，所述的miR396沉默体中，所述的mimicry miR396序列位于ips基因序列中CCTCTAGAAA和AGCTTCGGTT之间的位点内。

在本发明的另一方面，提供包含所述miR396沉默体的表达载体。

在本发明的另一方面，提供包含所述miR396沉默体的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供一种miR396或其前体的用途，用于作为鉴定禾本科植物性状的分子标记；所述的性状包括：种子粒长、粒宽，植物抗虫性，植物的耐盐性，植物花青素含量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、PBSK(pBluescript II SK(+))载体的图谱。

图2、MIM396b质粒构建的示意图。

图3、MIM396b转基因植株的表型。

A、MIM396b转基因植株呈现粒长增加的表型；

B、MIM396b转基因植株呈现出粒宽减小的表型；

C、MIM396b转基因植株粒长、粒宽和长宽比的统计图；

D、MIM396b转基因植株种子的淀粉颗粒扫描电镜；

E、ZH11种子的淀粉颗粒扫描电镜；

F、MIM396b转基因植株的种子千粒重的统计图。

图4、MIM396b转基因植株呈现明显的抗褐飞虱的表型。MIM396b-1与MIM396b-2为两株转基因植株。

图5、MIM396b转基因植株呈现明显的耐盐的表型。

图6、MIM396b转基因植株的花青素含量测定。

A、花青素的粗提物；

B、花青素含量用分光光度计测定的结果。

图7、p1301-35SNOS载体的图谱。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现miR396与禾本科植物的种子性状、抗虫性、耐盐性及花青素含量密切相关，下调miR396可增加种子粒长、促进植物抗虫性和耐盐性，以及增加植物花青素含量。因此，miR396或调节miR396的物质和方法可应用于实现植物品种的改良。

如本文所用，所述的“植物”是表达miR396或其前体的植物。所述的植物包括：禾本科植物。比如，所述的禾本科植物包括但不限于：禾本科稻属植物如水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米等。

如本文所用，所述的“禾谷类作物”或“禾本科谷类作物”可以是禾本科植物或有芒植物(作物)。例如是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。有芒植物是指种子壳上存在针状物植物。

如本文所用，所述的“飞虱科昆虫”包括但不限于：褐飞虱(Brown planthopper，BPH)，白背飞虱(white back planthopper,WBPH)及灰飞虱(small brown planthopper，SBPH)。

如本文所用，所述的“miR396”指稻属植物的miR396。多种来源于稻属植物的miR396的基因以及相应的成熟miR396的序列被列于表1中。本领域技术人员可以理解，鉴于这些miRNA(或它们的前体)之间具有很高的序列相同性，下调这些miRNA均能实现对禾本科植物的种子性状、抗虫性、耐盐性及花青素含量的调节，实现与本发明实施例中所验证的下调miR396b相同的技术效果。

表1、源于水稻(osa)的编码miR396的基因以及相应的成熟miR396的序列

本发明涉及的miR396在理论研究和植物改良中具有重要的应用价值。这个序列可以被应用于特定植物如水稻的抗虫性、耐盐性、产量研究；并且，其还与调控植物体内的花青素含量相关。

一种改良禾本科植物的性状的方法，所述方法包括：下调禾本科植物中miR396或其前体的表达。

在得知了所述的miR396的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来下调所述的miR396的表达，这些方法均可被包含在本发明中。比如，可以采用本领域人员熟知的多种方法来干扰miR396的表达或使之缺失表达。

作为本发明的一种实施方式，提供了一种降低植物中miR396的表达的方法，所述的方法包括：

(1)构建基于target mimicry技术的miR396沉默体，其包括ips基因序列中以及位于该序列的CCTCTAGAAA(SEQ ID NO:10)和AGCTTCGGTT(SEQ ID NO:11)之间的位点内的mimicry miR396序列；

(2)将(1)获得的miR396沉默体转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；

(3)将步骤(2)获得的转入了所述miR396沉默体的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

其它抑制miR396或其前体的方法是本领域周知的。

本发明还提供了用于下调所述的miR396或其前体的物质，其通过下调miR396或其前体从而发挥改良植物的性状的功能。所述物质可以是：核酸抑制物、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调miR396或其前体的表达水平。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

用于下调所述的miR396或其前体的物质可以是任何可阻止miR396(特别是其中的结合关键位点)或其前体与其靶向序列结合、降低miR396或其前体的活性、降低miR396或其前体的稳定性、下调miR396或其前体的表达、减少miR396或其前体有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调miR396有用的物质。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调miR396的表达。

作为本发明的优选方式，所述物质包括特异性下调miR396或其前体的干扰分子或基于target mimicry技术的miR396沉默体。更佳地，将mimicry miR396序列置于ips基因序列中的CCTCTAGAAA(SEQ ID NO:10)和AGCTTCGGTT(SEQ ID NO:11)之间的位点内，获得ips-MIM396b序列片段，将该片段置于合适的载体中，转化植物，从而获得性状改良的转基因植物。

本发明还提供包含所述ips-MIM396b序列的表达载体，优选植物表达载体；更优选适合于进行后续转基因操作(如应用农杆菌的转基因操作)的表达载体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明还提供遗传工程化的宿主细胞，其含有ips-MIM396b序列或含有包含ips-MIM396b序列的载体。宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

在本发明的优选实施方式中，所述的“miR396”是miR396b”，其是具有SEQ ID NO:2序列的RNA。

在本发明的具体实施例中，本发明人克隆了水稻miR396b基因，并通过targetmimicry技术，构建了miR396b竞争性下调的转基因植株(MIM396b)。通过分析表明，MIM396b植株种子粒长明显加长、而粒宽明显减小，从而可能对稻米的品质造成影响。同时，通过鉴定证明MIM396b植株具有明显的抗褐飞虱的特征和耐盐的特征；进一步的分析表明，MIM396b转基因植物中花青素的含量上升，本发明人推测，MIM396b植株可能通过提高花青素的含量达到抗褐飞虱和耐盐的效果。MIM396b转基因植株对于改善稻米品质和提高抗褐飞虱和耐盐的能力，具有应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、MIM396b转基因植株的构建

用IPSF和IPSR扩增拟南芥的ips基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:18)，通过BamHI和SacI酶切，构建到克隆载体pBSK(图1)的BamHI和SacI位点中。

IPSF(BamHI)序列：5’-GTGGATCCaagaaaaatggccatcccctagc-3’(SEQ ID NO:12)。

IPSR(SacI)序列：5’-CTGGAGCTCgaggaattcactataaagagaatcg-3’(SEQ ID NO:13。

设计mimicry miR396b序列如下：

5’-TTCCACAGCTTtagaTCTTGAACTG-3’(SEQ ID NO:14)。

序列中，“taga”的加入使得MIM396结合靶基因的能力大大加强，从而使得正常的miR396在结合靶基因的时候不具备竞争力，达到下调正常的miR396的目的。

根据所述的mimicry miR396b以及ips基因中相关序列，设计如下MIM396b-I和MIM396b-II序列：

MIM396b-I序列：

5’-cgaagctTTCCACAGCTTtagaTCTTGAACTGtttctagagggagataa-3’(SEQ ID NO:15)；

MIM396b-II序列：

5’-cctctagaaaCAGTTCAAGATCTAAAGCTGTGGAAagcttcggttcccctcg-3’(SEQ ID NO:16)。

然后，以得到的质粒为模板，以IPSF和MIM396b-I匹配、IPSR和MIM396b-II匹配，进行overlapping PCR(Higuchi,R.,Krummel,B.,and Saiki,R.K.(1988).Nucleic AcidsRes 16,7351-7367)，将mimicry miR396b替换到ips基因中miR399的不完全靶位点的位置(图2中虚线框内的碱基)。

之后，将该ips-MIM396b的片段(克隆到超表达载体p1301-35sNOS(图7)的35Snos上(位于p1301-35sNOS的BamHI和SacI之间)，并采用农杆菌法转化野生型水稻中花11，将该ips-MIM396b片段进行超表达，从而构建成miR396的target mimcry(简写为MIM396b)转基因植株。

ips-MIM396b的片段的完整序列为(SEQ ID NO:17)：

aaaacaccacaaaaacaaaagaaaaatggccatcccctagctaggtgaagaagaatgaaaacctctaatttatctagaggttattcatcttttaggggatggcctaaatacaaaatgaaaactctctaattaagtggttttgtgttcatgtaaggaaagcgttttaagatatggagcaatgaagactgcagaaggctgattcagactgcgagttttgtttatctccctctagaaaTTCCACAGCTTtagaTCTTGAACTGagcttcggttcccctcggaatcagcagattatgtatctttaattttgtaatactctctctcttctctatgctttgtttttcttcattatgtttgggttgtacccactcccgcgcgttgtgtgttctttgtgtgaggaataaaaaaatattcggatttgagaactaaaactagagtagttttattgatattcttgtttttcatttagtatctaataagtttggagaatagtcagaccagtgcatgtaaatttgcttccgattctctttatagtgaattcctctt

实施例2、MIM396b植株呈现出粒长变长、粒宽变小的表型特征

观察实施例1获得的转基因植物(MIM396b)，并与野生型中花11相比较。结果发现，MIM396b植株在营养生长时期没有呈现出明显的表型差异(数据略)；但是在生殖生长时期，MIM396b的种子形态发生了明显的变化。MIM396b植株的粒长(seed length)明显加大(图3A和C)，粒宽(seed width)相对减小(图3B和C)，从而造成籽粒的长/宽比(seed length/width)明显变大(图3C)。

同时，MIM396b转基因植株的粒重(seed weight)明显增加。野生型ZH11的籽粒千粒重为27.22667g，而MIM396b转基因植株的千粒重为35.90333g，比野生型对照增长30％多(图3F)。

对籽粒中的淀粉颗粒进行观察，发现转基因植株中的淀粉颗粒跟对照相比，明显变大(图3D和E)。

实施例3、MIM396b植株呈现出明显的抗褐飞虱特征

将MIM396b植物分单株进行抗褐飞虱鉴定。水稻苗在人工气候室生长一个月左右，然后分单株移栽到小盆中，适应一周左右，尽量剪除小的分蘖，然后每株放入10头左右差不多大小的褐飞虱，罩以罩子。保证植株的正常生长。在28℃左右转到的气候室中，观察植株的死亡情况。

结果表明，当野生型ZH11已经由于褐飞虱的吸食而枯死的时候，MIM396b植株仍然生长良好(图4)，说明MIM396b植株具有明显的抗褐飞虱的特征。

实施例4、MIM396b植株呈现出明显的耐盐性

在植物生长至发芽后14天左右，将MIM396b植株和野生型ZH11一起，用100mM NaCl处理7天，然后经过3天的恢复。

MIM396b植株的耐盐性测定结果如图5，发现与野生型相比，MIM396b植株具有明显的耐盐性。

实施例5、MIM396b植株中的花青素含量提高

由于观察到MIM396b的种子具有紫色颖壳的特征，本发明人推测可能MIM396b中花青素的含量有变化。

因此，本发明人测定了MIM396b中花青素的含量，发现MIM396b中花青素含量是野生型ZH11中的两倍多，如图6。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种改良禾本科植物的性状的方法，其特征在于，所述方法包括：下调禾本科植物中miR396或其前体的表达；其中，所述的改良禾本科植物的性状为：

促进种子的粒长增加；

促进种子的长/宽比增加；

提高植物对昆虫的抗性，所述的昆虫是半翅目飞虱科昆虫；和/或

提高植物中的花青素含量；

其中，所述的禾本科植物为水稻；所述的miR396为SEQ ID NO: 1所示的miR396。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的下调禾本科植物中miR396或其前体的表达包括：利用干扰分子特异性下调miR396或其前体的表达，或利用基于targetmimicry技术的miR396沉默体下调miR396或其前体的表达。

3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述利用基于target mimicry技术的miR396沉默体下调miR396表达的方法包括：

(1) 将mimicry miR396序列置于ips基因序列中，获得ips-MIM396b序列片段；

(2) 将ips-MIM396b序列片段转入禾本科植物中，获得转基因植物，其为改良的禾本科植物。

4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将mimicry miR396序列置于ips基因序列中的CCTCTAGAAA和AGCTTCGGTT之间的位点内；或

所述的mimicry miR396序列如SEQ ID NO: 14所示。

5.一种miR396或其前体的下调剂的用途，用于改良禾本科植物的性状，所述性状为：

促进种子粒长增加；

促进种子的长/宽比增加；

提高植物对昆虫的抗性，所述的昆虫是半翅目飞虱科昆虫；和/或

提高植物中的花青素含量；

其中，所述的禾本科植物为水稻；所述的miR396为SEQ ID NO: 1所示的miR396；所述的下调剂是特异性下调miR396或其前体表达的干扰分子，或是基于target mimicry技术的miR396沉默体。

6. 一种miR396或其前体的用途，用于作为鉴定禾本科植物性状的分子标记；所述的性状为：种子粒长、粒宽，植物抗虫性，植物花青素含量；其中，所述的禾本科植物为水稻；所述抗虫性是植物对昆虫的抗性，所述的昆虫是半翅目飞虱科昆虫；所述的miR396为SEQ IDNO: 1所示的miR396。