CN103320450A - 一种叶片衰老和逆境抗性相关基因及其应用 - Google Patents

Abstract

一种叶片衰老和逆境抗性相关基因及其应用。该基因核酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明克隆了拟南芥中的SSPP基因，它编码一种受衰老抑制的蛋白磷酸酶（SenescenceSuppressedProteinPhosphatase,SSPP），序列及功能未经报道。我们构建了由CaMV35S启动子驱动该基因表达的双元表达载体，并采用花苞浸泡法转化模式植物拟南芥。得到的35S-SSPP转基因植株叶片衰老显著延缓，干旱抗性大幅度提高。说明该基因具有延迟叶片衰老和提高植物逆境抗性的功能，将该基因转入主要经济作物中，可能获得叶片衰老延缓、逆境抗性增强、产量和品质性状得到改善的转基因作物新品种，具有重要的应用价值。

Description

一种叶片衰老和逆境抗性相关基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体说是用分子生物学技术获得一种叶片衰老和逆境抗性相关基因及其在转基因植物中的应用。

背景技术

我国是一个农业大国，但是随着人口的逐年增长，耕地面积的不断减少和农业可利用资源的日趋紧张，粮食供给面临着巨大挑战，因此提高和稳定粮食产量、改善粮食品质就成为我国当前国家重大战略发展的需求。

延缓衰老与农作物的增产和品质改良密切相关，对于粮食作物和多数经济作物来说，伴随着产量器官的发育和品质性状的逐渐形成，功能叶片中的同化产物和衰老叶片中积累的营养物质不断向产量器官转运。作物过早衰老必定影响产品产量和品质，某些杂交水稻在发育后期叶片和功能早衰导致结实率低，严重影响了杂交水稻产量潜力的进一步发挥（Gan等，1997）。绿叶类作物的叶片衰老进程不仅影响到产量和品质等要素的形成，而且还会直接影响到采收产量、采后品质和货架寿命。据报道，目前我国的蔬菜采后损失率高达30%-50%（赵瑞平，1999）。对于花卉植物而言，叶片和花器官的衰老进程直接影响到其观赏价值和销售价格。综上所述，改善植物的衰老进程几乎可以影响到所有主要作物的产量和品质。

衰老是叶片发育的最后一个阶段，是一个主动的生理过程，大量的衰老相关基因(senescence-associated genes, SAGs)表达水平增加，参与衰老过程的调节和控制。衰老过程中，细胞内的代谢活动极其活跃，积累在叶片中的大量同化产物，包括可降解的细胞结构，被高效有序地降解和转化，并转运到新生器官，特别是籽粒和果实中（Buchanan-Wollaston等，2005；Lim等，2007；Lin等，2004）。

叶片衰老受到内部信号（如叶龄相关信号和内源激素的水平等）和各种环境因子（如温度，光照，逆境等）的协调控制。植物内源激素是影响叶片衰老的主要因子之一，叶片衰老进程的调控与细胞分裂素密切相关。汤日圣等（1998）发现，外施苯基脉型细胞分裂素（4-PU-30）对杂交水稻叶片具有显著的保绿和延缓衰老效果，同时还提高了叶片光合速率，促进籽粒灌浆和干物质积累，增加粒重和产量。叶片衰老也是受外界环境因子影响的高度程序化过程，病害、遮荫、高温、干旱和水涝等逆境都可能导致植物的早衰。丁四兵等（2004）研究表明，在水稻灌浆期间高温促使水稻剑叶的衰老加快，同时籽粒灌浆加速，有效灌浆期缩短，籽粒充实度降低。刘文大等（2001）采用不同浓度的GA₃、BA、PP₃₃₃喷施天堂草和马尼拉草草坪发现，3种生长调节剂均可使草坪草衰老延缓，延长绿色期，增强抗寒能力。文汉和聂凡（2000）发现，干旱导致水稻抽穗后剑叶面积和叶绿素含量下降，叶片易早衰，千粒重降低，产量下降。

近年来，随着分子生物学技术的发展，很多衰老相关基因被克隆（Quirino等，2000），通过分子遗传手段延缓某些植物叶片衰老的成功显示出诱人的前景。Gan和Amasino（1995）在烟草叶片衰老过程中特异性表达细胞分裂素合成途径的关键基因-异戊烯基转移酶（IPT）基因显著延缓了转基因烟草植株的衰老，其中SAG12-IPT转基因烟草的种子产量和干重提高了50%；袁政等（2002）将融合基因SAG12-IPT导入青菜，转基因植株表现出衰老延迟的生理现象，增加青菜采收产量的同时，也可保持商品的新鲜程度，为绿叶类蔬菜的耐储存育种提供了新的思路。张晓等（2008）利用基因枪法将Leafy-ipt融合基因导入冷季型草坪草高羊茅，转基因植株的抗寒性明显提高，延缓了植株的衰老。丁在松等（2007）将玉米的ppc基因转入水稻可以显著提高水稻光合速率，特别是逆境条件下的水稻光合速率，在一定程度上延缓了衰老。

总之，获得叶片衰老和逆境抗性相关基因，并利用生物工程技术调控其在主要经济作物中的表达方式和表达水平，是提高和稳定作物产量、改善作物品质性状的有效手段，具有重大的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明目的是通过在模式植物拟南芥中的功能分析，提供一种叶片衰老和逆境抗性相关基因及其应用，为延迟叶片衰老进程，提高作物逆境抗性，改善作物产量和品质性状提供操作策略和基因资源。

本发明首先从拟南芥中克隆了一个新的叶片衰老和逆境抗性相关基因，并首次证明该基因具有延缓叶片衰老、增强干旱抗性的功能，将该基因转入主要经济作物中，具有提高和稳定作物产量、改善作物品质性状的潜力。

本发明提供的新的叶片衰老和逆境抗性相关基因，它编码一种受衰老抑制的蛋白磷酸酶（Senescence Suppressed Protein Phosphatase, SSPP），并将其命名为SSPP，该基因全长1113bp。该基因核酸序列选自：

（a）如序列表SEQ ID No.1所示的核酸序列；

（b）在（a）限定的核酸序列中至少具有85%以上的同源性的核酸序列。

作为具体应用的实例，本发明提供了一种SSPP基因的克隆方法，具体操作如下：

第一、以拟南芥cDNA为模板，用PCR方法扩增SSPP基因；

第二、回收PCR扩增产物；

第三、将上述第二步回收的扩增产物，与pMD18-T载体（购自Takara公司）在连接酶催化下进行连接反应；

第四、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

第五、通过抗性筛选，获得该SSPP基因的阳性TA克隆。

所设计的基因PCR扩增引物如下，其中上游引物中引入了Xba I酶切位点，下游引物中引入了Sac I酶切位点：

上游引物：5’- TCTAGA ATGGTTAAACCCTGTTGGAGAATAG -3’（ SEQ ID No.2）

下游引物：5’- GAGCTC TCATGATGTTGAATGCATCGGGTAT -3’ （SEQ ID No.3）。

本发明同时提供了一种叶片衰老和逆境抗性相关基因SSPP基因的应用，即：利用获得的SSPP基因，构建获得由CaMV35S启动子驱动SSPP基因表达的双元表达载体（即“CaMV35S启动子-SSPP”），并进行植物转化，从而获得基因组中含有可在植物中组成型表达含有以上所述核酸序列基因的转基因植株。操作过程如下：

所述应用中的双元表达载体“CaMV35S启动子-SSPP”的构建方法，包括如下步骤：

第一、用Xba I/ Sac I双酶切含有基因SSPP的TA克隆质粒，回收SSPP基因片段；

第二、用Xba I/ Sac I双酶切pBI121（购自Clontech公司）质粒，回收大的载体片段（其中含有CaMV 35S启动子的序列）；

第三、混合上述第一步得到的SSPP基因片段和第二步得到的pBI121载体片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pBI121载体上的“CaMV35S启动子- SSPP”构建。

所述应用中的“CaMV35S启动子-SSPP”构建在转基因植株中组成型表达，操作过程如下：

拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的花苞浸泡法（Clough与Bent，1998），获得的种子经过30 mg/L卡那霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养；采用基因组PCR的方法检测基因SSPP的表达。

作为具体应用的实例，本发明提供了一种在转基因拟南芥中筛选叶片衰老和逆境抗性相关基因的方法。操作过程如下：

第一、分别将野生型与转基因拟南芥种子消毒后铺于1/2MS培养基中，长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ^oC垂直板培养9天；

第二、选取发育状态一致的野生型与转基因拟南芥幼苗移至营养土中长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ^oC培养；

第三、持续观察野生型与转基因拟南芥的表型并记录，比较野生型与转基因植株叶片衰老情况的差别。

第四、对苗龄30天的野生型和转基因拟南芥进行干旱处理，观察并记录表型，比较野生型与转基因植株对干旱胁迫的抗性差别。

本发明的优点和积极效果：

本发明克隆出一种新的叶片衰老和逆境抗性相关基因SSPP，构建出由CaMV 35S启动子驱动基因SSPP表达的双元表达载体，并通过转化模式植物拟南芥及在转基因拟南芥中的功能分析发现，在相同培养条件下，35S-SSPP转基因拟南芥叶片衰老较野生型显著延缓，干旱抗性显著提高，暗示SSPP基因可以延缓叶片衰老、提高逆境抗性，具有重大育种价值。

附图说明

图1是35S-SSPP转基因拟南芥植株的PCR鉴定；泳道M：plus2000 Marker；泳道1～7：各卡那霉素抗性拟南芥植株的基因组DNA为模板的PCR产物；泳道8：野生型拟南芥植株的基因组DNA为模板的PCR产物；泳道9：35S-SSPP质粒为模板的PCR的正对照；泳道10：H₂O为模板的PCR的负对照。

图2是35S-SSPP转基因拟南芥与野生型对照组拟南芥在57天苗龄时的表型图；左为野生型对照组拟南芥；中为35S-SSPP转基因沉默株系；右为35S-SSPP转基因过表达株系。

图3是35S-SSPP转基因拟南芥与野生型对照组拟南芥在干旱处理和复水前后的表型图；a为干旱处理前、b为干旱处理11天后和c复水2天后的35S-SSPP转基因拟南芥与野生型对照组拟南芥；各图中左为野生型对照组拟南芥，中、右为35S-SSPP转基因拟南芥。

具体实施方式

实施例 1 ：拟南芥叶片衰老和逆境抗性相关基因SSPP的克隆

第一、以拟南芥cDNA为模板利用PCR方法扩增1113 bp的SSPP基因，回收扩增产物并进行TA克隆。

（1）PCR扩增目的片段

根据已知的拟南芥SSPP基因的序列设计特异引物，在上游引物中引入Xba I酶切位点，在下游引物中引入Sac I酶切位点。

上游引物：5’- TCTAGA ATGGTTAAACCCTGTTGGAGAATAG -3’ （ SEQ ID No.2）

下游引物：5’- GAGCTC TCATGATGTTGAATGCATCGGGTAT -3’ （ SEQ ID No.3）

用Trizol法提取拟南芥RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备SSPP基因片段。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

94 ℃ 3分钟；

94 ℃ 30秒，58 ℃ 30秒，30个循环；

72 ℃ 10分钟；

（2）目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

① 目的片段的回收

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用大连宝生物（TaKaRa）公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。

②连接

加入下列反应体系的试剂，16 ℃反应过夜，实现目的片段与pMD18-T载体（购自Takara公司）的连接。

③ 转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用10 mL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp的LB平板上，37 ℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Xba I和Sac I双酶切，产生2.7 kb的pMD18-T载体片段和SSPP基因的1113 bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生1113 bp的SSPP基因片段，即为含有SSPP基因序列的阳性克隆。

④ 测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌液到北京六合华大基因科技股份有限公司进行DNA测序，其核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

实施例 2 ：利用pBI121载体（含有CaMV 35S启动子）构建由CaMV 35S启动子驱动基因SSPP表达的双元表达载体。

（1）从大肠杆菌中提取载体pBI121质粒（该菌株可从生物公司或Clontech购买），用Xba I/ Sac I双酶切后回收大的载体片段（其中包含有CaMV 35S启动子序列）。

（2）从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用Xba I/ Sac I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收（同实施例1）SSPP基因片段。

（3）将上述2个片段在连接酶催化下于16 ℃连接过夜，完成pBI121载体上的由CaMV35S启动子驱动基因SSPP表达的双元表达载体的构建。

连接体系：

（4）用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1。

（5）挑选转化平板（Kan抗性）上的单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Xba I和Sac I双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是13 kb的pBI121载体片段，另一个是1113 bp的SSPP基因片段。

（6）以质粒为模板进行PCR反应，方法同实施例1。

（7）经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序，其核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

（8）从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌GV3101，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例 3 ：转基因拟南芥的制备

（1）用实施例2构建的由CaMV 35S启动子驱动基因SSPP表达的双元表达载体转化拟南芥，具体转化方法采用农杆菌介导的花苞浸泡法（Clough与Bent，1998），获得的种子经过30 mg/L卡那霉素抗性筛选，生长正常的植株转土培养。

（2）转基因植株的PCR检测：分别剪取转基因植株和野生型植株的叶片，参考《分子克隆实验指南（第三版）》（黄培堂等，2002）方法提取叶片基因组DNA，用如下引物进行PCR反应，反应体系如同实施例1：

上游引物：5’- CGTAAAGACTGGCGAACAGTTC -3’ （ SEQ ID No.4）

下游引物：5’- GCATCACCTATGGATCTTGTGACC -3’ （ SEQ ID No.5）

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现1229 bp的“CaMV35S启动子- SSPP”融合基因条带，非转基因植株未出现融合基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中（见图1）。

实施例 4 ：转基因拟南芥中SSPP基因功能分析

（1）通过实施例3获得的转基因拟南芥各株系单株收获种子，分别用30 mg/L卡那霉素抗性筛选，选取抗性分离比为3：1的株系，分别单独转土培养，仍单株收获种子，分别将获得的种子用30 mg/L卡那霉素抗性筛选，所铺种子全部正常生长的株系为纯合株系；

（2）分别将野生型与纯合转基因拟南芥种子消毒后铺于1/2MS培养基中，长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ^oC垂直板培养9天；

（3）选取发育状态一致的野生型与转基因拟南芥幼苗移至营养土中长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ^oC培养；

（4）持续观察并记录野生型与转基因拟南芥的表型，即叶片衰老情况（见图2：57天苗龄的野生型与转基因拟南芥的叶片衰老情况对比）。

结果显示：35S-SSPP转基因拟南芥的叶片衰老进程相比于野生型对照组拟南芥显著延缓，这证明35S-SSPP转基因拟南芥具有叶片衰老延缓的性状，说明SSPP基因具有延长叶片功能期，改善作物产量和品质的潜力。

实施例 5 ： 35S-SSPP转基因拟南芥抗旱性状分析

（1）分别将野生型与纯合转基因拟南芥种子消毒后铺于1/2MS培养基中，长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ^oC垂直板培养9天；

（2）选取发育状态一致的野生型与转基因拟南芥幼苗移至营养土中长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ^oC培养；

（3）培养30天的野生型与转基因拟南芥，处理前一晚将土壤完全浸透水，此后保持11天不浇水，待野生型对照株系完全萎蔫时；进行复水处理；

（4）持续观察并记录野生型与转基因拟南芥的表型，即植株对干旱的抗性情况（见图3：干旱处理及复水前后野生型与转基因拟南芥的表型对比，a为干旱处理前、b为干旱处理11天后和c复水2天后）。

结果显示：野生型与转基因拟南芥在干旱胁迫处理11天、复水2天后，35S-SSPP转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，植株存活率更高、生长发育受干旱胁迫影响更小，这说明35S-SSPP转基因拟南芥的干旱抗性相比野生型拟南芥显著提高。

参考文献

黄培堂，等译．《分子克隆实验指南》（第三版），北京：科学出版社，2002.

丁四兵，朱碧岩，吴冬云等. 温光对水稻抽穗后剑叶衰老和籽粒灌浆的影响. 华南师范大学学报，2004，1（1）：117-121.

丁在松，赵明，荆玉祥等. 玉米ppc基因过表达对转基因水稻光合速率的影响. 作物学报，2007，33（5）：717-722.

刘文大，魏臻武，王槐三. 植物生长调节剂对延缓天堂草、马尼拉草衰老的作用. 草业科学，2001，18（5）：28-32.

汤日圣，刘晓忠，陈以峰等．4-PU-30延缓杂交水稻叶片衰老的效果与作用．作物学报，1998，24 (2)：231-236．

文汉，聂凡. 干旱对水稻抽穗后旗叶衰老和产量构成因子的影响. 安徽农业大学学报, 2000，27（2）：135-137.

袁政，潘爱虎，简志英等. 转基因（SAG12-IPT）青菜的迟衰特性. 植物生理与分子生物学学报，2002，28（5）：379-384.

赵瑞平. 我国果蔬贮运保鲜现状发展趋势及对策. 北方园艺，1999.（6）：28-30.

张晓，杨丽莉，杨晓玲. 转Leafy-ipt基因高羊茅草生育后期SOD, POD, MDA的变化. 山西农业科学，2008，36（9）：26-28.

Gan S，Amasino R M. Making sense of senescence. Plant physiol, 1997, 113: 313-319.

Buchanan-Wollaston, V., Page, T., Harrison, E et al. Comparative transcriptome analysis reveals significant differences in gene expression and signaling pathways between developmental and dark/starvation-induced senescence in Arabidopsis. The Plant Journal, 2005, 42: 567-585.

Clough SJ, BentAF. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 1998, 16: 735-743.

Lim, P.O., Kim, H.J. and Nam, H.G. Leaf senescence. Annu. Rev. Plant Biol, 2007, 58: 115-136.

Lin JF, Wu SH. Molecular events in senescing Arabidopsis leaves. The Plant Journal, 2004, 39: 612-628.

Quirino BF, Noh YS, Himelblau E et al. Molecular aspects of leaf senescence. Trends in plant science, 2000, 5: 278-282.

序列表 SEQUENCE LISTING

SEQ ID No.1

<110> 南开大学

<120> 一种叶片衰老和逆境抗性相关基因及其应用

<160> 5

<170> Patentin Version 3.3

<210> 1

<211> 1113

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

atggttaaac cctgttggag aataggtgcc ggtatggaga gaagtaagat caatcccaca 60

aaggttgatg gtttgacatg gtacaaagat cttggtcttc acacctttgg agagttttcc 120

atggcaatga tccaagccaa cagtgtgatg gaggatcagt gccagatcga atcagggccg 180

cttacattca acaatccgac agttcaaggc acatttgttg gagtttacga tggccatgga 240

ggtccagagg cttccagatt cattgcagac aacatcttcc ccaagttaaa gaagtttgcg 300

tccgagggta gggagatttc agagcaggtg atcagcaaag catttgccga gacagacaaa 360

gattttctca agacagtgac gaagcaatgg cctacgaacc cacagatggc atcagtgggg 420

tcatgttgct tggcaggagt gatatgcaac ggattggtgt atattgcaaa cacgggagat 480

tccagagctg tgttgggcag atctgagaga ggtggagtga gagctgttca gttatctgta 540

gagcacaatg ccaatcttga gtctgcgagg caagagctat ggtcattgca tcctaatgac 600

cccaccattc ttgtgatgaa gcaccgcttg tggcgtgtga aaggcgttat ccaggtcaca 660

agatccatag gtgatgcata cctcaaaaga gcagagttca acagagaacc tttgctgccc 720

aaattcagac taccagaaca tttcactaag ccaatcctta gtgcggatcc atcagtcacc 780

attacgcggc ttagcccaca agatgagttt ataattcttg cttcagatgg gctttgggag 840

catcttagca accaggaagc tgttgatatt gtgcataatt cccctcgaca aggaatagca 900

aggagactac ttaaagctgc attgaaggaa gcagcaaaga aaagagagat gagatactca 960

gacctaacag agatccatcc tggtgtaaga aggcatttcc acgacgatat aaccgttatt 1020

gtggtctatc tcaaccccca cccggtcaaa accaattctt gggcttcacc tctgtcaatt 1080

agagggggat acccgatgca ttcaacatca tga 1113

SEQ ID No.2

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctagaatgg ttaaaccctg ttggagaata g 31

SEQ ID No.3

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagctctcat gatgttgaat gcatcgggta t 31

SEQ ID No.4

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtaaagact ggcgaacagt tc 22

SEQ ID No.5

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcatcaccta tggatcttgt gacc 24

Claims (5)

1.一种叶片衰老与逆境抗性相关基因，命名为SSPP，其核酸序列选自：

（a）如序列表SEQ ID No.1所示的核酸序列；

（b）在（a）限定的核酸序列中至少具有85%以上的同源性的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所设计的基因PCR扩增引物如下，其中上游引物中引入了Xba I酶切位点，下游引物中引入了Sac I酶切位点：

上游引物：5’- TCTAGA ATGGTTAAACCCTGTTGGAGAATAG -3’

下游引物：5’- GAGCTC TCATGATGTTGAATGCATCGGGTAT -3’ 。

3.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，从拟南芥cDNA中克隆获得该SSPP基因，具体操作步骤如下：

（1）以拟南芥cDNA为模板，用PCR方法扩增SSPP基因；

（2）回收PCR扩增产物；

（3）将上述（2）步回收的扩增产物，与pMD18-T载体在连接酶催化下进行连接反应；

（4）将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

（5）通过抗性筛选，获得该SSPP基因的阳性TA克隆。

4.一种权利要求1所述的叶片衰老与逆境抗性相关基因的应用，其特征在于，利用从拟南芥中克隆的叶片衰老与逆境抗性相关基因SSPP，构建获得由CaMV 35S启动子驱动该SSPP基因表达的双元表达载体，进行植物转化，从而获得基因组中含有可在植物中组成型表达含有以上所述核酸序列基因的转基因植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将CaMV 35S启动子驱动该基因表达的构建转化模式植物拟南芥，已获得该基因组成型表达的转基因植株，转基因植株表现出叶片衰老显著延缓，干旱抗性大幅度提高。

Images