CN104630237B - 一种适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因及其应用 - Google Patents

Abstract

一种适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因及其应用。本发明利用分子生物学技术人工拼接了一个融合基因，命名为WX02，其核酸序列如SEQ ID No.1所示。同时构建由CaMV 35S启动子驱动WX02融合基因表达的双元表达载体，并采用花苞浸泡法转化拟南芥，对所获得的35S‑ WX02转基因拟南芥的研究证明，该融合基因的表达对转基因植株的生长发育无任何不利影响，同时可延缓转基因植株的叶片衰老，显著提高其干旱抗性。说明WX02基因具有适度延迟叶片衰老和提高植物逆境抗性的功能，将其转入主要经济作物中，可能获得叶片衰老延缓、逆境抗性增强、产量和品质性状得到改善的转基因作物新品种，具有重要的应用价值。

Description

一种适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体说是用分子生物学技术人工获得一种适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因及其在转基因植物中的应用。

背景技术

我国是一个农业大国，但是随着人口的逐年增长，耕地面积的不断减少和农业可利用资源的日趋紧张，粮食供给面临着巨大挑战，因此提高和稳定粮食产量、改善粮食品质就成为我国当前国家重大战略发展的需求（周建军等，2014）。

延缓衰老与农作物的增产和品质改良密切相关，对于粮食作物和多数经济作物来说，伴随着产量器官的发育和品质性状的逐渐形成，功能叶片中的同化产物和衰老叶片中积累的营养物质不断向产量器官转运。作物过早衰老必定影响产品产量和品质，某些杂交水稻在发育后期叶片和功能早衰导致结实率低，严重影响了杂交水稻产量潜力的进一步发挥（Gan等，1997）。绿叶类作物的叶片衰老进程不仅影响到产量和品质等要素的形成，而且还会直接影响到采收产量、采后品质和货架寿命。据报道，目前我国的蔬菜采后损失率高达10%-50%（张学杰和闫岩，2009）。对于花卉植物而言，叶片和花器官的衰老进程直接影响到其观赏价值和销售价格。综上所述，改善植物的衰老进程几乎可以影响到所有主要作物的产量和品质。

衰老是叶片发育的最后一个阶段，是一个主动的生理过程，大量的衰老相关基因（senescence-associated genes, SAGs）表达水平增加，参与衰老过程的调节和控制。衰老过程中，细胞内的代谢活动极其活跃，积累在叶片中的大量同化产物，包括可降解的细胞结构，被高效有序地降解和转化，并转运到新生器官，特别是籽粒和果实中（Buchanan-Wollaston等，2005；Lim等，2007；Lin等，2004）。叶片衰老受到内部信号（如叶龄相关信号和内源激素的水平等）和各种环境因子（如温度，光照，逆境等）的协调控制。植物内源激素是影响叶片衰老的主要因子之一，叶片衰老进程的调控与细胞分裂素密切相关。汤日圣等（1998）发现，外施苯基脉型细胞分裂素（4-PU-30）对杂交水稻叶片具有显著的保绿和延缓衰老效果，同时还提高了叶片光合速率，促进籽粒灌浆和干物质积累，增加粒重和产量。刘文大等（2001）采用不同浓度的GA₃、BA、PP₃₃₃喷施天堂草和马尼拉草草坪发现，三种生长调节剂均可使草坪草衰老延缓，延长绿色期，增强抗寒能力。叶片衰老也是受外界环境因子影响的高度程序化过程，病害、遮荫、高温、干旱和水涝等逆境都可能导致植物的早衰。丁四兵等（2004）研究表明，在水稻灌浆期间高温促使水稻剑叶的衰老加快，同时籽粒灌浆加速，有效灌浆期缩短，籽粒充实度降低。文汉和聂凡（2000）发现，干旱导致水稻抽穗后剑叶面积和叶绿素含量下降，叶片易早衰，千粒重降低，产量下降。

近年来，随着分子生物学技术的发展，很多衰老相关基因被克隆（Quirino等，2000），通过分子遗传手段延缓某些植物叶片衰老的成功显示出诱人的前景。Gan和Amasino（1995）在烟草叶片衰老过程中特异性表达细胞分裂素合成途径的关键基因-异戊烯基转移酶（IPT）基因显著延缓了转基因烟草植株的衰老，其中SAG12-IPT转基因烟草的种子产量和干重提高了50%；袁政等（2002）将融合基因SAG12-IPT导入青菜，转基因植株表现出衰老延迟的生理现象，增加青菜采收产量的同时，也可保持商品的新鲜程度，为绿叶类蔬菜的耐储存育种提供了新的思路。张晓等（2008）利用基因枪法将Leafy-ipt融合基因导入冷季型草坪草高羊茅，转基因植株的抗寒性明显提高，延缓了植株的衰老。丁在松等（2007）将玉米的ppc基因转入水稻可以显著提高水稻光合速率，特别是逆境条件下的水稻光合速率，在一定程度上延缓了衰老。

另一方面，环境中多种逆境胁迫如干旱、洪涝、冻害、高温和病害等都会严重影响作物的产量和品质。其中，干旱是我国重大自然灾害之一，也是对作物产量影响最大、区域最广、发生最频繁的气象灾害（王春乙，2007）。近年来受全球变暖的影响, 我国干旱灾害不断加剧，旱灾发生区域从西部、北方逐步扩展到东部、南方, 覆盖我国多个粮食主产区。据统计, 1950~2007年, 全国农业平均每年因旱受灾2173.33万hm²，年均因旱损失粮食高达158亿kg, 占各种自然灾害造成粮食损失的60%以上（康蕾和张红旗，2014）。为了减轻干旱灾害所造成的损失，在加强生态环境动态监测和风险评估、提高水资源利用效率等综合治理的同时，利用植物基因工程等手段培育新的抗旱品种也是一个有力的手段。

近年来，随着对干旱胁迫调控的分子机制认识逐渐加深，许多与干旱相关信号因子、转录因子、功能基因相继被鉴定克隆，包括AREB1、AREB2、rd19、rd22以及转录因子MYC、MYB、bZIP等（降云峰，2013；Umezawa等，2006）。这些研究不仅为人们在分子水平上了解植物对干旱的调控机制提供了依据，更为通过基因工程提高作物的抗旱性提供了潜力基因。Taji等（2002）研究发现在转基因拟南芥中过量表达肌醇半乳糖苷合成酶（AtGolS2），可以引起内源肌醇半乳糖苷和棉子糖含量上升，减少叶片蒸发，提高拟南芥的抗旱能力。Haake（2002）等研究表明，将转录因子CBF4（能与CRT/DRE结合）转入拟南芥，导致TGGCCGAC元件以及下游基因的活性增强，提高拟南芥的抗旱和抗寒能力。Pellegrineschi等（2002）将DREB1a基因转入小麦中，在严重水分胁迫条件下，对照小麦都萎蔫死亡，而转基因小麦能存活。Capell等（1998）将燕麦的精氨酸脱羧酶基因（Argininedecarboxylase，Adc）转到了水稻中，在干旱条件下能减少叶绿素损失，避免水稻旱害。Xu等（1997）将大麦的晚期胚胎发生丰富蛋白（Lea）基因HVA1导入水稻，水稻叶片Lea蛋白的表达量很高，第二代转基因水稻的抗旱性和抗盐性明显提高。在胁迫条件下，转基因水稻具有较高的生长速率，能延缓由胁迫引起的伤害症状，在胁迫消除后恢复也快。Nelson等（2007）也证明过表达拟南芥中转录因子AtNF-YB2的同源基因——ZmNF-YB2的转基因玉米，在干旱胁迫条件下，其叶绿素含量、光合速率和气孔导度明显高于对照玉米，而叶片温度明显低于对照，对干旱胁迫的耐受性显著提高。

总之，获得适度延缓叶片衰老和逆境抗性相关基因，并利用生物工程技术调控其在主要经济作物中的表达方式和表达水平，使得转基因植物既能延缓衰老，又不会延长植物的生长周期，是提高和稳定作物产量、改善作物品质性状的有效手段，具有重大的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明目的是通过在模式植物拟南芥中的功能分析，提供一种适度延缓叶片衰老和提高逆境抗性相关基因及其应用，为适度延迟叶片衰老进程，提高作物逆境抗性，改善作物产量和品质性状提供操作策略和基因资源。

本发明通过利用分子生物学技术人工拼接了一个全长为1206 bp的融合基因，命名为WX02，其核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。分析证明该融合基因具有适度延缓叶片衰老、增强干旱抗性的功能，将该基因转入主要经济作物中，具有提高和稳定作物产量、改善作物品质性状的潜力。

本发明提供的WX02融合基因的获取方法，具体操作如下：

第一、以拟南芥cDNA为模板，利用PCR方法设计特异引物扩增WX02融合基因的下游部分，同时在扩增用的上游引物中引入WX02融合基因的上游部分，从而获得全长的WX02融合基因片段；

第二、回收PCR扩增产物；

第三、将上述第二步回收的扩增产物，与pMD18-T载体（购自Takara公司）在连接酶催化下进行连接反应；

第四、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

第五、通过抗性筛选，获得该WX02融合基因的阳性TA克隆。

其中所设计的WX02融合基因的PCR扩增引物如下，先利用上游引物2和下游引物2扩增，然后以该扩增产物为模板利用上游引物1和下游引物1扩增获得WX02融合基因片段。其中上游引物1中引入了Xba I酶切位点，下游引物1引入了Sac I酶切位点：

上游引物1：

5’- TCTAGA ATGGGTCTTCCTCTAATGATGGAGAGATCATCAAACAACAACACTAGT-3’ （ 引入Xba I酶切位点）

上游引物2：

5’-GAGAGATCATCAAACAACAACACTAGTATGGTTAAACCCTGTTGGAGAATAGG-3’

下游引物1：

5’- GAGCTC TCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAC-3’ （ 引入Sac I酶切位点）

下游引物2：

5’-AACATCGTATGGGTACTCGAGTGATGTTGAATGCATCGGGTATC-3’。

本发明同时提供了一种适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因WX02的应用，即：利用所获得的WX02融合基因，构建由CaMV35S启动子驱动WX02融合基因表达的双元表达载体（即“CaMV35S启动子-WX02”），并进行植物转化，从而获得基因组中含有可在植物中组成型表达含有以上所述核酸序列基因的转基因植株，并对其生长发育、叶片衰老和逆境抗性进行表型分析。操作过程如下：

所述应用中的双元表达载体“CaMV35S启动子- WX02”的构建方法，包括如下步骤：

第六、用Xba I/Sac I双酶切含有WX02融合基因的TA克隆质粒，回收WX02融合基因片段；

第七、用Xba I/Sac I双酶切pBI121（购自Clontech公司）质粒，回收大的载体片段（其中含有CaMV35S启动子序列）；

第八、混合上述第六步得到的WX02融合基因片段和第七步得到的pBI121载体片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成以pBI121为基本载体的“CaMV35S启动子-WX02”融合基因的构建。

所述应用中的“CaMV35S启动子-WX02”构建在转基因植株中组成型表达和表型分析，操作过程如下：

第九、采用农杆菌介导的花苞浸泡法转化拟南芥，获得的种子经过25 mg/L卡那霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养，并采用基因组PCR和半定量RT-PCR的方法检测基因WX02的整合与表达。

第十、分别将野生型和“CaMV35S启动子-WX02”转基因拟南芥（即35S-WX02）种子消毒后铺于1/2 MS培养基中，长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ℃垂直板培养10天；

第十一、选取发育状态一致的野生型与转基因拟南芥幼苗移至营养土中长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ℃培养；

第十二、持续观察野生型与转基因拟南芥的表型并记录，比较它们的莲座大小以及叶片衰老情况的差别；

第十三、选取于1/2 MS培养基上生长、发育状态一致的野生型与35S-WX02转基因拟南芥的7天苗龄的幼苗移至营养土中长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ℃培养14天，然后停止浇水进行干旱处理。停水处理21天后，恢复浇水，观察野生型与转基因拟南芥干旱处理时的萎蔫情况和复水后的恢复情况的差别。

本发明的优点和积极效果：

本发明利用分子生物学技术人工拼接获得了一个适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因——WX02，同时构建出由CaMV 35S启动子驱动WX02融合基因表达的双元表达载体，并通过转化模式植物拟南芥及在转基因拟南芥中的功能分析发现，在相同培养条件下，35S-WX02转基因拟南芥在保持旺盛的生长发育的同时，其叶片衰老较野生型明显延缓，并且干旱抗性显著提高，说明WX02融合基因可以延缓叶片衰老、提高逆境抗性，具有重大育种价值。

附图说明

图1 35S-WX02转基因拟南芥植株的鉴定。A，转基因植株的基因组PCR鉴定。泳道M：plus2000 Marker；泳道1：包含35S-WX02融合基因的双元表达载体质粒为模板的PCR的正对照；泳道2~8：35S-WX02转基因拟南芥植株的基因组DNA为模板的PCR产物；泳道9：用野生型拟南芥的基因组DNA为模板的负对照；泳道10：H₂O为模板的PCR的负对照。B， 35S-WX02转基因拟南芥不同株系中WX02融合基因的表达水平的半定量RT-PCR鉴定。泳道M：plus2000Marker；其余泳道：以不同35S-WX02转基因株系的9天苗龄光下苗中提取的RNA反转录的cDNA为模板的PCR产物，泳道上方的数字表示株系编号。TIP41-like作为半定量分析的内标基因。

图2 35S-WX02转基因拟南芥正常生长条件下的表型观察。A和B分别为野生型（WT）和35S-WX02转基因拟南芥27天（A）和48天（B）苗龄土培苗的莲座表型。

图3 野生型（WT）和35S-WX02转基因拟南芥在干旱处理和复水前后的表型。将野生型与35S-WX02转基因拟南芥的21天苗龄土培苗停水处理21天，然后恢复浇水。图中分别为停水21天和复水1天后的莲座表型。

具体实施方式

实施例1：适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因——WX02的获得

以拟南芥cDNA为模板利用PCR方法扩增1206 bp的WX02融合基因，回收扩增产物并进行TA克隆。

（1）PCR扩增目的片段

用Trizol法提取拟南芥RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用特异引物进行PCR扩增WX02融合基因的下游部分，同时在上游引物中引入WX02融合基因的上游部分，从而制备WX02融合基因片段。

其中所设计的WX02融合基因的PCR扩增引物如下，先利用上游引物2和下游引物2扩增，然后以该扩增产物为模板利用上游引物1和下游引物1扩增获得WX02融合基因片段。其中上游引物1中引入了Xba I酶切位点，下游引物1引入了Sac I酶切位点：

上游引物1：

5’- TCTAGA ATGGGTCTTCCTCTAATGATGGAGAGATCATCAAACAACAACACTAGT-3’（ 引入XbaI酶切位点）

上游引物2：

5’-GAGAGATCATCAAACAACAACACTAGTATGGTTAAACCCTGTTGGAGAATAGG-3’

下游引物1：

5’- GAGCTC TCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAC-3’（引入Sac I酶切位点）

下游引物2：

5’-AACATCGTATGGGTACTCGAGTGATGTTGAATGCATCGGGTATC-3’。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

94 ℃ 3分钟；

94 ℃ 30秒，56 ℃ 30秒，72 ℃ 1分30秒，25个循环；

72 ℃ 10分钟；

（2）目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

① 目的片段的回收

采用PCR产物回收试剂盒（购自Axygen公司）回收PCR扩增的WX02融合基因片段，具体操作步骤见商品说明书。

② 连接

加入下列反应体系的试剂，16 ℃反应过夜，实现目的片段与pMD18-T载体（购自Takara公司）的连接。

③ 转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用10 mL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp的LB平板上，37 ℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Xba I和Sac I双酶切，产生2.7 kb的pMD18-T载体片段和WX02融合基因的1204 bp片段。利用前面步骤（1）所述的上游引物1和下游引物1，按照同样的PCR扩增条件，以本步中的质粒提取物为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生1206 bp的WX02融合基因片段，即为含有WX02融合基因序列的阳性克隆。

④ 测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌液到北京六合华大基因科技股份有限公司进行DNA测序，其核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

实施例2：利用pBI121载体（含有CaMV 35S启动子）构建由CaMV 35S启动子驱动WX02融合基因表达的双元表达载体。

（1）从大肠杆菌中提取载体pBI121质粒（该菌株可从生物公司或Clontech购买），用Xba I/ Sac I双酶切后回收大的载体片段（其中包含有CaMV 35S启动子序列）。

（2）从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用Xba I/ Sac I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收（同实施例1中步骤（2））WX02融合基因片段。

（3）将上述2个片段在连接酶催化下于16 ℃连接过夜，完成pBI121载体上的由CaMV35S启动子驱动WX02融合基因表达的双元表达载体的构建。

连接体系：

试剂	加入量
		pBI121载体回收片段	1 mL
WX02融合基因回收片段	4 mL
		Solution I	5 mL

（4）用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1中步骤（2）。

（5）挑选转化平板（Kan抗性）上的单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Xba I和Sac I双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是13 kb的pBI121载体片段，另一个是1204 bp的WX02融合基因片段。

（6）以质粒为模板，利用实施例1中步骤（1）所述的上游引物1和下游引物1，按照实施例1步骤（1）同样的体系和PCR扩增条件进行PCR反应，鉴定质粒中的WX02融合基因，扩增片段的大小是1206 bp。

（7）经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序，其核酸序列与序列表SEQID No.1所示一致。

（8）从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌GV3101，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例3：转基因拟南芥的制备

（1）用实施例2构建的由CaMV 35S启动子驱动WX02融合基因表达的双元表达载体转化拟南芥，具体转化方法采用农杆菌（实施例2获得的）介导的花苞浸泡法（Clough与Bent，1998），获得的种子经过25 mg/L卡那霉素抗性筛选，生长正常的植株转土培养。

（2）转基因植株的PCR检测：分别剪取转基因植株和野生型植株的叶片，参考《分子克隆实验指南（第三版）》（黄培堂等，2002）方法提取叶片基因组DNA作为模板，利用实施例1中步骤（1）所述的上游引物1和下游引物1，按照同样的体系和PCR扩增条件进行PCR反应：

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现1206 bp的WX02融合基因条带，非转基因植株未出现融合基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中（见图1中A）。

（3）转基因株系中WX02融合基因过表达的检测：分别选取35S-WX02转基因拟南芥不同株系的9天苗龄光下苗，采用Trizol法提取其总RNA，然后参考刘栋博士毕业论文（2010）中的方法完成半定量RT-PCR，其中以TIP41-like基因作为内标。所用特异性引物如下：

扩增WX02融合基因：

上游引物：5’-GGCCATGGAGGTCCAGAGGCT-3’

下游引物：5’-TCTTGTGGGCTAAGCCGCGT-3’

扩增TIP41-like基因：

上游引物：5’-GAAATTCAGGAGCAAGCCGTCTCAG-3’

下游引物：5’-ATCAACTCTCAGCCAAAATCGCAAG-3’

结果显示：不同转基因株系中均出现了不同亮度的大小为572 bp的WX02融合基因特异性条带，证明该融合基因在转基因拟南芥中有效地过表达（见图1中B）。

实施例4：转基因拟南芥中WX02融合基因功能分析

（1）通过实施例3获得的转基因拟南芥各株系单株收获种子，分别用25 mg/L卡那霉素抗性筛选，选取抗性分离比为3:1的株系，分别单独转土培养，仍单株收获种子，分别将获得的种子用25 mg/L卡那霉素抗性筛选，所铺种子全部正常生长的株系为纯合株系；

（2）分别将野生型与纯合的35S-WX02转基因拟南芥种子消毒后铺于1/2MS培养基中，长日照（16 h光照/8 h黑暗）22℃垂直板培养10天；

（3）选取发育状态一致的野生型与转基因拟南芥幼苗移至营养土中长日照（16 h光照/8 h黑暗）22℃培养；

（4）持续观察并记录野生型与转基因拟南芥的表型，包括莲座大小和叶片衰老情况（见图2）。

结果显示：在植株旺盛生长时期，35S-WX02转基因拟南芥能够维持正常生长，其莲座大小与野生型没有明显差异（见图2中A），但是其叶片衰老进程相比于野生型拟南芥明显延缓（见图2中B）。这证明35S-WX02转基因拟南芥具有叶片衰老延缓的性状，同时在旺盛生长时期能够维持正常的生长，从而不影响植物的终株高甚至产量，说明WX02融合基因具有适度延长叶片功能期，改善作物产量和品质的潜力。

实施例5：35S-WX02转基因拟南芥干旱胁迫耐受性分析

（1）分别将野生型与纯合的WX02转基因拟南芥种子消毒后铺于1/2MS培养基中，长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ℃垂直板培养7天；

（2）选取发育状态一致的野生型与转基因拟南芥幼苗移至营养土中长日照（16 h光照/8 h黑暗）22 ℃培养；

（3）继续培养野生型与转基因拟南芥植株14天，并于处理前一晚将土壤完全浸透水，此后保持21天不浇水，然后进行复水处理；

（4）持续观察并记录野生型与转基因拟南芥的表型，即植株对干旱的抗性情况（见图3）。

结果显示：野生型与两种转基因拟南芥在干旱胁迫处理21天、复水1天后，35S- WX02转基因拟南芥与野生型相比，其生长发育受干旱胁迫影响更小，这说明35S-WX02转基因拟南芥的干旱抗性相比野生型拟南芥显著提高。

【参考文献】

丁四兵，朱碧岩，吴冬云等. 温光对水稻抽穗后剑叶衰老和籽粒灌浆的影响. 华南师范大学学报，2004，1（1）：117-121.

丁在松，赵明，荆玉祥等. 玉米ppc基因过表达对转基因水稻光合速率的影响. 作物学报，2007，33（5）：717-722.

黄培堂，等译．《分子克隆实验指南》（第三版），北京：科学出版社，2002.

康蕾，张红旗. 我国五大粮食主产区农业干旱态势综合研究.2014，22(8)：928-937.

刘栋. 拟南芥agy1突变体的研究和大豆GmATG8a基因功能的初步分析. 南开大学, 2010.

刘文大，魏臻武，王槐三. 植物生长调节剂对延缓天堂草、马尼拉草衰老的作用.草业科学，2001，18（5）：28-32.

汤日圣，刘晓忠，陈以峰等．4-PU-30延缓杂交水稻叶片衰老的效果与作用．作物学报，1998，24 (2)：231-236．

王春乙，娄秀荣，王建林. 中国农业气象灾害对作物产量的影响. 自然灾害学报，2007，16（5）：37-43.

文汉，聂凡. 干旱对水稻抽穗后旗叶衰老和产量构成因子的影响. 安徽农业大学学报, 2000，27（2）：135-137.

降云峰，赵晋锋，马宏斌等. 作物干旱研究进展. 2013，29（3）：1-5.

袁政，潘爱虎，简志英等. 转基因（SAG12-IPT）青菜的迟衰特性. 植物生理与分子生物学学报，2002，28（5）：379-384.

周建军, 刘倩. 我国农业生产现状问题研究. 北京农业, 2014, (15)

张晓，杨丽莉，杨晓玲. 转Leafy-ipt基因高羊茅草生育后期SOD, POD, MDA的变化. 山西农业科学，2008，36（9）：26-28.

张学杰，闫岩. 亚太经济合作组织成员果蔬质量安全及采后技术发展状况与启示. 北方园艺，2009.（9）：1-6.

Buchanan-Wollaston, V, Page, T, Harrison, E, et al. Comparativetranscriptome analysis reveals significant differences in gene expression andsignaling pathways between developmental and dark/starvation-inducedsenescence in Arabidopsis. The Plant Journal, 2005, 42: 567-585.

Capell T, Escobar C, Liu H, et al. Over-expression of the oatarginine decarboxylase cDNA in transgenic rice. (Oryza sativa L.) affectsnormal development patterns in vitro and results in putrescine accumulationin transgenic plants. Theor Appl Genet, 1998, 97: 246-254.

Clough SJ, BentAF. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 1998, 16:735-743.

Gan S, Amasino RM. Inhibition of leaf senescence by autoregulatedproduction of cytokinin. Science, 1995, 270: 1986-1988.

Gan S，Amasino RM. Making sense of senescence. Plant physiol, 1997,113: 313-319.

Haake V, Cook D, Riechmann JL, et al. Transcription factor CBF4 is aregulator of drought adaptation in Arabidopsis. Plant Physiol, 2002, 130(2):639-48.

Lim PO, Kim HJ and Nam HG. Leaf senescence. Annu. Rev. Plant Biol,2007, 58: 115-136.

Lin JF, Wu SH. Molecular events in senescing Arabidopsis leaves. ThePlant Journal, 2004, 39: 612-628.

Nelson DE, Repetti PP, Adams TR, et al. Plant nuclear factor Y (NF-Y)B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields onwater-limited acres. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(42): 16450-5.

Pellegrineschi A, Ribaut JM, Trethowan R, et al. Progress in thegenetic engineering of wheat for water-limited conditions. Jircas WorkingReport, 2002, 55-60.

Quirino BF, Noh YS, Himelblau E, et al. Molecular aspects of leafsenescence. Trends in plant science, 2000, 5: 278-282.

Taji T, Ohsumi C, Iuchi S, et al. Important roles of drought- andcold-inducible genes for galactinol synthase in stress tolerance inArabidopsis thaliana. The Plant Journal, 2002, 29(4 ): 417-426.

Umezawa T, Fujita M, Fujita Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.Engineering drought tolerance in plants: discovering and tailoring genes tounlock the future. Current Opinion in Biotechnology, 2006, 17:113–122.

Xu D, Duan X, Wang B, et al. Expression of a Late EmbryogenesisAbundant Protein Gene, HVA1, from Barley Confers Tolerance to Water Deficitand Salt Stress in Transgenic Rice. Plant Physiology, 1996, 110(1): 249-257.

序列表 SEQUENCE LISTING

SEQ ID No.1

<110> 南开大学

<120> 一种适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因及其应用

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctagaatgg gtcttcctct aatgatggag agatcatcaa acaacaacac tagtatggtt 60

aaaccctgtt ggagaatagg tgccggtatg gagagaagta agatcaatcc cacaaaggtt 120

gatggtttga catggtacaa agatcttggt cttcacacct ttggagagtt ttccatggca 180

atgatccaag ccaacagtgt gatggaggat cagtgccaga tcgaatcagg gccgcttaca 240

ttcaacaatc cgacagttca aggcacattt gttggagttt acgatggcca tggaggtcca 300

gaggcttcca gattcattgc agacaacatc ttccccaagt taaagaagtt tgcgtccgag 360

ggtagggaga tttcagagca ggtgatcagc aaagcatttg ccgagacaga caaagatttt 420

ctcaagacag tgacgaagca atggcctacg aacccacaga tggcatcagt ggggtcatgt 480

tgcttggcag gagtgatatg caacggattg gtgtatattg caaacacggg agattccaga 540

gctgtgttgg gcagatctga gagaggtgga gtgagagctg ttcagttatc tgtagagcac 600

aatgccaatc ttgagtctgc gaggcaagag ctatggtcat tgcatcctaa tgaccccacc 660

attcttgtga tgaagcaccg cttgtggcgt gtgaaaggcg ttatccaggt cacaagatcc 720

ataggtgatg catacctcaa aagagcagag ttcaacagag aacctttgct gcccaaattc 780

agactaccag aacatttcac taagccaatc cttagtgcgg atccatcagt caccattacg 840

cggcttagcc cacaagatga gtttataatt cttgcttcag atgggctttg ggagcatctt 900

agcaaccagg aagctgttga tattgtgcat aattcccctc gacaaggaat agcaaggaga 960

ctacttaaag ctgcattgaa ggaagcagca aagaaaagag agatgagata ctcagaccta 1020

acagagatcc atcctggtgt aagaaggcat ttccacgacg atataaccgt tattgtggtc 1080

tatctcaacc cccacccggt caaaaccaat tcttgggctt cacctctgtc aattagaggg 1140

ggatacccga tgcattcaac atcactcgag tacccatacg atgttccaga ttacgcttga 1200

gagctc 1206

Claims (2)

1.一种适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因WX02的应用，其特征在于，所述融合基因WX02，其序列如SEQ ID No.1所示的核酸序列；

所述WX02的获取方法，具体操作如下：

第一、以拟南芥cDNA为模板，利用PCR方法设计特异引物扩增WX02融合基因的下游部分，同时在扩增用的上游引物中引入WX02融合基因的上游部分，从而获得全长的WX02融合基因片段；

第二、回收PCR扩增产物；

第三、将上述第二步回收的扩增产物，与pMD18-T载体在连接酶催化下进行连接反应；

第四、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

第五、通过抗性筛选，获得该WX02融合基因的阳性TA克隆；

其中所设计的WX02融合基因的PCR扩增引物如下，先利用上游引物2和下游引物2扩增，然后以该扩增产物为模板利用上游引物1和下游引物1扩增获得WX02融合基因片段；其中上游引物1中引入了Xba I酶切位点，下游引物1引入了Sac I酶切位点：

上游引物1：

5’-TCTAGAATGGGTCTTCCTCTAATGATGGAGAGATCATCAAACAACAACACTAGT-3’；

上游引物2：

5’-GAGAGATCATCAAACAACAACACTAGTATGGTTAAACCCTGTTGGAGAATAGG-3’；

下游引物1：

5’-GAGCTCTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAC-3’；

下游引物2：

5’-AACATCGTATGGGTACTCGAGTGATGTTGAATGCATCGGGTATC-3’；

用构建获得由CaMV35S启动子驱动该融合基因表达的双元表达载体，并进行植物转化，从而获得基因组中含有可在植物中组成型表达含有以上所述核酸序列融合基因的转基因植株。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转基因植物为拟南芥，该转基因植株在保持旺盛生长的同时，其叶片衰老明显延缓，干旱抗性显著提高。