CN110643615A - 佛甲草抗旱基因SlATHB-7及其应用 - Google Patents
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Abstract
本发明公开了佛甲草抗旱基因SlATHB‑7及其应用，佛甲草抗旱基因SlATHB‑7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，实验证明，采用SlATHB‑7基因转染的拟南芥和烟草杨增强了对旱的耐受力，说明本发明提供的抗旱基因SlATHB‑7在改良作物抗旱能力方面起着重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种佛甲草(Sedum lineare)抗旱基因SlATHB-7及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术
干旱是指长期晴天高温少雨或无雨，使空气和土壤中水分严重缺乏，降水量一般较常年明显偏少而形成的。干旱会影响人类社会和经济活动的各个方面，尤其是对农业生产的危害更为严重。干旱对农业生产的影响主要表现在降低粮食质量和品质，影响粮食安全，破坏土地结构，增加农业病虫害，森林火灾频繁出现等。干旱灾害的出现也会影响生态环境安全，会使江河湖泊干涸、生态环境恶化、动植物栖息范围缩小、空气质量和水质量降低。因此，亟需能转入植物中，增强植物对干旱的耐受性，对修复生态环境和提高土地利用率具有重要战略意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种佛甲草抗旱基因SlATHB-7。
本发明的第二个目的是提供含佛甲草抗旱基因SlATHB-7的克隆载体pJET1.2_SlATHB-7。
本发明的第三个目的是提供含佛甲草抗旱基因SlATHB-7的表达载体pBI121_SlATHB-7。
本发明的第四个目的是提供含有表达载体pBI121_SlATHB-7的宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供佛甲草抗旱基因SlATHB-7增强植物对旱的耐受性的应用。
本发明的技术方案概述如下：
佛甲草抗旱基因SlATHB-7，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
含佛甲草抗旱基因SlATHB-7的克隆载体pJET1.2_SlATHB-7。
含佛甲草抗旱基因SlATHB-7的表达载体pBI121_SlATHB-7。
含表达载体pBI121_SlATHB-7的宿主细胞。
佛甲草抗旱基因SlATHB-7增强植物对旱的耐受性的应用。
所述植物优选拟南芥或烟草。
本发明的优点：
实验证明，采用SlATHB-7基因转染的拟南芥和烟草表现出对旱的耐受力提高，说明本发明提供的抗旱基因SlATHB-7在改良作物抗旱能力方面起着重要的作用。
附图说明
图1为佛甲草抗旱基因SlATHB-7克隆电泳示意图。
图2为佛甲草抗旱基因SlATHB-7插入表达载体后示意图。
图3为pBI121_SlATHB-7转化拟南芥后，转化子基因组PCR筛选结果(1-9号分别代表的是pBI121_SlATHB-7的单菌落菌液)。
图4为pBI121_SlATHB-7转化拟南芥后，T3纯合体半定量PCR测定表达水平结果(1，2代表中表达的拟南芥；3号代表高表达量的拟南芥；4，5号代表低表达量的拟南芥)。
图5为佛甲草抗旱基因SlATHB-7转基因拟南芥T3纯合体抗旱的实验效果照片。
图6为佛甲草抗旱基因SlATHB-7转基因烟草抗旱的实验效果照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
载体pJET1.2 pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231。
载体pBIl21购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/
实施例1
1.佛甲草(Sedum lineare,简称Sl)SlATHB-7基因的克隆
从用100g/L聚乙二醇(HO[CH2CHO]nH相对分子质量：697.661)水溶液进行抗旱处理的佛甲草(取自天津市滨海新区)中，使用植物RNeasy Plant Mini Kit(TransgeneCode#E101-0150rxns)提取总RNA，并且利用EasyScript Frist-Strand cDNA SynSgesisSuperMix(Transgene Code#AE301-03100 rxns)反转录出cDNA。对cDNA进行高通量测序获得78407转录本(诺禾致源公司进行高通量测序)，通过与GO数据库进行对比分析，获得SlATHB-7基因的3’端序列，使用RACE技术(Takara-RACE kit)获得SlATHB-7基因的全长cDNA序列，将扩增得到的SlATHB-7基因进行测序分析，得到完整的SlATHB-7基因全长为1104bp(SEQ ID No.1)。由佛甲草SlATHB-7基因编码的蛋白质，是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端添加pBI121重组位点，上游5'–ACGGGGGACTCTAGAGGATCC-3'(SEQ ID No.3)，下游5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTC-3'(SEQ IDNo.4)，以利于后期表达载体的构建。
其具体步骤如下：
1).cDNA第一链的合成
用购买于金唯智的反转录试剂盒EasyScript First-Strand CDNA SynthesisSuperMix(Lot#10227)，以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，在E-Mix逆转录酶的作用下合成cDNA，反转录体系如下：
反应条件：42℃30min，85℃5min。
2).佛甲草SlATHB-7基因反转录质量PCR扩增检测
用佛甲草Actin基因特异引物SEQ ID No.5:5'-GAACTTACTAGCCGACTG-3',SEQ IDNo.6：5'-CCTCAAGCCTTATACGCAA-3'，PCR扩增，以验证反转录反应及RNA质量。
PCR反应体系如下：
反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。
3).佛甲草SlATHB-7基因片段PCR扩增
根据已知cDNA序列利用primer软件设计SlATHB-7基因上下游引物:
SEQ ID No.7:5'-CTGCCTACAACCTTTTACAACCA-3'，
SEQ ID No.8:5'-GAACCTCAAGTCAAACTCTCCGT-3'，其PCR反应程序如下：
反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。
PCR反应结束后，取1μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量(见图1)，其余用作产物的纯化回收。
4).构建含有佛甲草SlATHB-7基因的克隆载体
构建含有佛甲草SlATHB-7基因的载体pJET1.2_SlATHB-7
胶回收纯化后的佛甲草SlATHB-7基因目的片段利用Clone JET PCR Cloning Kit(pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231)重组到载体pJET1.2上，得到载体pJET1.2_SlATHB-7。
其反应程序如下：
反应条件24℃,10min冰上静止30min，42℃热激1min30s冰上静止2min30s，转入感受态细胞TOP10，37℃，180rpm，45min，此程序结束后将菌液涂到LB(添加抗生素Amp100uM)固体培养基(蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，琼脂15g，定容至1L，pH＝7)中，37℃过夜培养。
分别利用目的片段的上下游引物(SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)对不同的菌落进行菌落PCR验证，筛选阳性菌落测序，得到含有克隆载体pJET1.2_SlATHB-7的宿主细胞。
注：pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231载体购于invitrogen；所用大肠杆菌为TOP10感受态细胞，TIANGEN，CB101-2。
5).构建含有佛甲草SlATHB-7基因的表达载体
构建含有佛甲草SlATHB-7基因的表达载体pBI121_SlATHB-7，
SEQ ID No.9:5'-ACGGGGGACTCTAGAGGATCCCTGCCTACAACCTTTTACAACCA-3'
SEQ ID No.10:5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCGAACCTCAAGTCAAACTCTCCGT-3'
提取测序正确的pJET1.2-基因的质粒，作为模版，利用含有重组位点SEQ IDNo.9，SEQ ID No.10为引物进行PCR扩增，其反应程序如下:
PCR反应结束后，取1μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量，其余用作产物的纯化回收。
提取pBI121质粒，其载体图谱(见图2)，对其进行双酶切线性化，程序如下：
反应条件：37℃，12h，80℃20min失活。
将基因和线性化的pBI121质粒使用Clone Express Entry One Step CloningKit试剂盒进行重组构建，反应程序如下：
(线性化pBI121质粒需50-200ng均可；胶回收基因片段需20-200ng均可；本实验线性化pBI121质粒浓度100ng/μL；胶回收基因片段浓度在100ng/μL)
反应程序：37℃，30min，冰上5min，42℃热激1min30s冰上静止2min30s，转入感受态细胞TOP10，37℃，180r，45min，此程序结束后将菌液涂到LB(添加抗生素kan 50uM)固体培养基中，37℃过夜培养。
分别利用载体和目的片段的上下游引物(见SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)对同一个菌落进行菌落PCR双重验证，筛选阳性菌落测序(见SEQ ID No.11)。
注：本步骤使用Clon Express Entry One Step Cloning Kit购于vazyme.。
6).含有佛甲草SlATHB-7基因的重组载体转化农杆菌感受态细胞
实验所用的农杆菌菌株为C58(购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/)，C58具有利福平抗性(Rif)，辅助质粒具有庆大霉素抗性(Gen)。
利用电击农杆菌转化法，将含有佛甲草SlATHB-7基因的大肠杆菌表达载体pBI121_SlATHB-7转化到农杆菌株C58(pMP90)感受态细胞中，28℃，培养36h，菌落PCR挑选阳性克隆菌落。
实施例2
1.转化拟南芥
(1)转化拟南芥。
转化拟南芥的具体操作步骤：
营养土(蛭石：无菌按照1：3的比例混合)，将在4℃冰箱春化72h的拟南芥种子(商业)播种到土壤表面，前7天用保鲜膜覆盖，放到组培架上。培养条件为光照为10000lux；白天16h，22℃；夜晚8h，温度为18℃。剪掉生长1.5个月、抽薹15公分左右拟南芥的果荚和已授粉的花。挑取含基因阳性克隆单菌落到50mL含有30μg/mL庆大霉素、50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基(蛋白胨5g，酵母浸出物1g，牛肉膏5g，蔗糖5g，定容至1L，pH＝7)中，28℃，180rpm，至OD 600值为0.6-0.8。将菌液25℃，4000rpm，离心10min，弃掉上清，加入50mL 5％的蔗糖重悬，加入9μL的黏着剂，混匀，倒入培养皿。将上述拟南芥的花苞放入培养皿中1min，套袋，暗处理12h，侵染15颗拟南芥苗。去除袋子，放回组培架子上，此时的拟南芥苗称为T1代。待上述拟南芥的种子完全成熟后，收取拟南芥的种子到1.5mL的EP管中，敞口至37℃的烘箱中，放置两个星期，彻底烘干，每管加入3颗干燥球以便长期保存。
(2)转基因拟南芥阳性转化子纯合体的筛选
将收取的T1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4℃三天，然后在超净台上将转基因拟南芥种子均匀播种在含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基(MS盐2.2g，蔗糖10g，定容至1L，pH＝5.7，琼脂7.2g)上，在1800Lux，光周期16h光照/8h黑暗，生长8-10天，叶子为深绿色即为转基因拟南芥的T1代阳性转化子。当T1代阳性转化子植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤(购于EPAGMA,荷兰，http://www.epagma.eu/)中，在温度25℃，1800Lux，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下继续生长14天，先作阳性转化子的鉴定(见图3；1-9号分别代表的是pBI121_SlATHB-7的单菌落菌液)，再通过半定量PCR先对其转基因的表达水平进行鉴定(见图4；1，2代表中表达的拟南芥；3号代表高表达量的拟南芥；4，5号代表低表达量的拟南芥)，选取表达水平高的独立转化株系3号和表达水平低的独立转化株系5号。在上述条件下继续生长，约一个半月后收集种子即为T2代转化种子。重复上述步骤得到3号和5号的T3代纯合体种子。
(3)对转基因拟南芥进行抗旱处理
将3号T3代纯合体种子、5号T3代纯合体种子、野生拟南芥种子分别种植在土壤中，在温度25℃，1800Lux，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下生长21天，每种植物保留21株长势一致的幼苗，随机分为三组平行实验，每组不同类型的植株各7株，用100g/L聚乙二醇(HO[CH2CHO]nH相对分子质量：697.661)水溶液模拟干旱胁迫处理。每隔5天处理一次，共处理20天后植物照相(见图5)。
实施例3
1.转化烟草
供阳性克隆菌转化的烟草为NC89(6855-2×6772)组培苗(商业)。
(1)选取生长30天状况良好的烟草组培苗，挑选厚实叶片，减去叶边缘，把叶生剪成1cm×1cm的外植体碎生。将选取的实施例1获得的阳性克隆菌菌液(OD600＝0.8)将剪好的叶生材料放到农杆菌的LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，定容至1L，pH＝7)上，24℃条件下震荡培养10min。侵染后，将外植体吸干后放在MS培养基上(MS盐4.4g，蔗糖30g，定容至1L，pH＝5.7，琼脂7.2g)，黑暗培养3天。将经过暗培养的外植体用灭过菌的蒸馏水清洗2-3次，用滤纸吸干后，外植体放在选择培养基上(MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，卡那霉素500mg，头孢霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7)；培养条件：2000Lux光下培养14天，光照/黑暗为16h/8h).
(2)经过选择培养基，外植体长出小苗子的时候，将整棵小苗子切下，将根原基竖直插到MS培养基上，诱导生根。待生根完成后，对每一棵独立转化子进行阳性鉴定。
通过半定量PCR选取表达水平高的独立转化株系和表达水平低的独立转化株系进行抗盐实验。
(3)将烟草进行抗旱处理
将生长7天的长势均匀的转基因高表达烟草、低表达转基因烟草、野生型烟草移栽至土盆中，待土盆苗生长5天后，每种植物保留21株长势一致的幼苗，随机分成三组，每组不同类型的植株各7株，用100g/L聚乙二醇(HO[CH2CHO]nH相对分子质量：697.661)水溶液模拟干旱胁迫处理。每隔5天处理一次，共处理50天后植物照相(见图6)。
序列表
<110> 天津大学
<120> 佛甲草抗旱基因SlATHB-7及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1104
<212> DNA
<213> 佛甲草(Sedum lineare Thunb)
<400> 1
atgcatcatc ttcatgatca tgaactcaac acaatcacaa gcaacaagaa accaaagaag 60
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gagcaaatca agtcaatgga gatcattttt gaaacacaat caaaacttga gccaagaaag 180
aagttacaat tggctagaga gttagagttg catcctagac aaattgcaat atggtttcaa 240
aacaaaagag ctagatacaa atctaaacaa cttgagagag attacaacat acttagagat 300
agttatgatt ctcttgcttc aaggtttgat ttgttaaaca aggaaaaaca tgcattagca 360
atacaagtaa gtttattaaa attcatttga agatttctta atgttgtctt tttgaggttt 420
tagtcaagta atttatcaga atactgatct gatgctgcct acaacctttt acaaccacat 480
aaaactatgt cgtattgtgc taaattttta ttcgtctcat caaaacgaca ttatgatatt 540
tgtggcaccg gattcaaaat cagaaattat ttaagaaaaa aaaatgacag gaaagatcat 600
atcggtcaac ggagagtttg acttgaggtt catttacatt ttgcagttgg agaagctaaa 660
aaaggagatg gaaatggtgc aaggagaaac agaacagagc tgcaagaaac ggaggagctg 720
cggcggcggc ggcggctttt cgatcaacga cgaaaatgaa gaggaaagca taaaagccga 780
gtacattatt ggattagatg atgaagatga agaagttaca agaagccttg taaacatggt 840
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tctataaaaa ataaaaaata gtgtaaatct gatcgttcag taactgacaa gaagtcaata 1080
gttcaagctc tcgaagtaat gtaa 1104
<210> 2
<211> 367
<212> PRT
<213> 佛甲草(Sedum lineare Thunb)
<400> 2
Met His His Leu His Asp His Glu Leu Asn Thr Ile Thr Ser Asn Lys
1 5 10 15
Lys Pro Lys Lys Lys Asn Thr Ser Asn Asn Glu His Gln His Asn Asn
20 25 30
Asn Asn Lys Lys Arg Phe Ser Asp Glu Gln Ile Lys Ser Met Glu Ile
35 40 45
Ile Phe Glu Thr Gln Ser Lys Leu Glu Pro Arg Lys Lys Leu Gln Leu
50 55 60
Ala Arg Glu Leu Glu Leu His Pro Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln
65 70 75 80
Asn Lys Arg Ala Arg Tyr Lys Ser Lys Gln Leu Glu Arg Asp Tyr Asn
85 90 95
Ile Leu Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Leu Ala Ser Arg Phe Asp Leu Leu
100 105 110
Asn Lys Glu Lys His Ala Leu Ala Ile Gln Val Ser Leu Leu Lys Phe
115 120 125
Ile Ser Arg Phe Leu Asn Val Val Phe Leu Arg Phe Ser Gln Val Ile
130 135 140
Tyr Gln Asn Thr Asp Leu Met Leu Pro Thr Thr Phe Tyr Asn His Ile
145 150 155 160
Lys Thr Met Ser Tyr Cys Ala Lys Phe Leu Phe Val Ser Ser Lys Arg
165 170 175
His Tyr Asp Ile Cys Gly Thr Gly Phe Lys Ile Arg Asn Tyr Leu Arg
180 185 190
Lys Lys Asn Asp Arg Lys Asp His Ser Val Asn Gly Glu Phe Asp Leu
195 200 205
Arg Phe Ile Tyr Ile Leu Gln Leu Glu Lys Leu Lys Lys Gly Asp Gly
210 215 220
Asn Gly Ala Arg Arg Asn Arg Thr Glu Leu Gln Glu Thr Glu Glu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Phe Ser Ile Asn Asp Glu Asn Glu Glu Glu Ser
245 250 255
Ile Lys Ala Glu Tyr Ile Ile Gly Leu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Val
260 265 270
Thr Arg Ser Leu Val Asn Met Val Glu Ser Val Asp Gly Ser Phe Ser
275 280 285
Cys Ser Asn Asp Asp Trp Lys Gly Leu Gly Thr Asp Ile Thr Cys Leu
290 295 300
Met Asn Gln Glu Val Val Ile Asn Gly Gly Ile Ala Cys Leu Glu Ile
305 310 315 320
Arg Val Val Leu Val Val Phe Asp Leu Glu Lys Ser Val Gly Leu Val
325 330 335
Ser Ser Phe Phe Ser Ile Lys Asn Lys Lys Leu Cys Lys Ser Asp Arg
340 345 350
Ser Val Thr Asp Lys Lys Ser Ile Val Gln Ala Leu Glu Val Ile
355 360 365
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgggggact ctagaggatc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgatcgggga aattcgagct c 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaacttacta gccgactg 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctcaagcct tatacgcaa 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgcctacaa ccttttacaa cca 23
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<211> 23
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<211> 44
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<212> DNA
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<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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atcggtcaac ggagagtttg acttgaggtt catttacatt ttgcagttgg agaagctaaa 660
aaaggagatg gaaatggtgc aaggagaaac agaacagagc tgcaagaaac ggaggagctg 720
cggcggcggc ggcggctttt cgatcaacga cgaaaatgaa gaggaaagca taaaagccga 780
gtacattatt ggattagatg atgaagatga agaagttaca agaagccttg taaacatggt 840
ggaatcagta gatggatcat ttagttgctc aaatgatgat tggaaaggac ttggaacaga 900
taacttgttt gatgaatcag gaagtagtta tcaatggtgg gatcgcttgc cttgagattg 960
tagagtagtt ttagttgtgt ttgatttaga gaagagtgtg ggacttgttt catctttctt 1020
tctataaaaa ataaaaaata gtgtaaatct gatcgttcag taactgacaa gaagtcaata 1080
gttcaagctc tcgaagtaat gtaa 1104
Claims (6)
1.佛甲草抗旱基因SlATHB-7，其特征是所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含权利要求1的佛甲草抗旱基因SlATHB-7的克隆载体pJET1.2_SlATHB-7。
3.含权利要求1的佛甲草抗旱基因SlATHB-7的表达载体pBI121_SlATHB-7。
4.含有权利要求3的表达载体pBI121_SlATHB-7的宿主细胞。
5.权利要求1的佛甲草抗旱基因SlATHB-7增强植物对旱的耐受性的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是所述植物为拟南芥或烟草。
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