CN113388017A

CN113388017A - 一种耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用

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Publication number: CN113388017A
Application number: CN202110822249.0A
Authority: CN
Inventors: 周强; 刘志鹏; 罗栋
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113388017B

Abstract

本发明公开了一种耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用，涉及生物技术领域。本发明公开的耐旱基因其编码如SEQ ID NO.1所示的蛋白，本发明公开的耐旱基因及其编码蛋白具有耐旱功能，可以用于培育耐旱植物或微生物，本发明为紫花苜蓿抗旱分子设计育种提供了新的基因资源，将在培育紫花苜蓿抗旱新材料中发挥重要作用，同时也为其它非粮食类经济作物抗旱性状的改良提供了新方案，可对我国畜牧业、农业、林业等产生实质性的影响。

Description

一种耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上种植面积最大的牧草之一，因其营养价值和地上生物量较高被誉为“牧草之王”(Triboi和Triboi-Blondel，2014)，是美国的第四大农作物。在我国，紫花苜蓿的种植区域主要包括西北、华北以及东北等地区(杨青川等，2016)。而日益加剧的干旱已成为制约紫花苜蓿生长及其生产的最重要因素(Song等，2016；Luo等，2019)。

干旱是指某一地区长期无雨或高温少雨，使空气及土壤的水分缺乏。而干旱发生主要与偶发性或周期性的降水减少有关。干旱具有出现频率高、持续时间长、波及范围广等特点。干旱的频繁发生和长期持续，会给农业生产带来巨大的损失，还会造成水资源短缺、荒漠化加剧、沙尘暴频发等诸多生态和环境方面的不利影响。紫花苜蓿有一定抗旱(Drought resistance)能力，主要通过发达的根系从土壤深层吸收水分从而维持叶片高水势避旱(Drought avoidance)，但其生理渗透调节能力、水分利用效率、叶片抗氧化能力等较弱，因此紫花苜蓿在低水势下的耐旱(Drought tolerance)能力非常薄弱，低于豆科牧草沙打旺(Astragalus adsurgens)、羊柴(Hedysarum laeve)等(山仑等，2008)。因此，开展紫花苜蓿耐旱分子机理研究，可为其耐旱分子设计奠定理论基础。

2021年3月3日，在“Web of Science”数据库中，以“drought”为关键词检索几种主要农作物和紫花苜蓿关于耐旱研究的文献数量，结果发现：大豆(Glycine max)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)和小麦(Triticum aestivum)耐旱研究的文献数量分别有3168、8032、8094和11335篇，然而紫花苜蓿耐旱研究的文献数量仅有1194篇，分别是上述农作物的1/2.7、1/6.7、1/6.8和1/9.5。由此可知，紫花苜蓿耐旱研究远远落后于主要农作物的耐旱研究。

紫花苜蓿耐旱基因的挖掘方法主要包括同源克隆(Jia等，2020；Li等，2017a)、转录组(Li等，2017b；Luo等，2019；Zhao等，2019)、蛋白质组(Ma等，2016；Ma等，2017)、GWAS(Zhang等，2015)等。这些技术的广泛应用促使紫花苜蓿耐旱基因研究取得了飞速发展，但仍落后于模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和蒺藜苜蓿(M.truncatula)等物种。制约紫花苜蓿耐旱基因研究的因素主要有3点：①无突变体库、多年生、遗传转化周期长；②基因组虽已公布，但其基因注释信息仍需优化；③异花授粉，与苜蓿复合体其他亚种间存在广泛的基因流，导致紫花苜蓿遗传背景复杂，遗传变异较大。近年来，紫花苜蓿研究取得了突破性进展，我国研究人员相继公布了新疆大叶和中苜1号紫花苜蓿的基因组数据(Chen等，2020；Shen等，2020)，并建立了紫花苜蓿基因编辑体系，基因型编辑效率高达75％(Wolabu等，2020)。这些成果将有助于紫花苜蓿耐旱基因的克隆，加快全球紫花苜蓿耐旱研究。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用。本发明为紫花苜蓿抗旱分子设计育种提供了新的基因资源，将在培育紫花苜蓿抗旱新材料中发挥重要作用，同时也为其它非粮食类经济作物抗旱性状的改良提供了新方案，可对我国畜牧业、农业、林业等产生实质性的影响。

除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种耐旱基因，其编码具有耐旱能力的蛋白，蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少具有90％的同一性。

本发明的发明人通过研究发现，源于紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的蛋白是一种功能未知的跨膜蛋白，被命名为MsDINP1(Drought Induced Improvement 1)，其由80个氨基酸残基组成。发明人发现MsDINP1蛋白及其编码基因具有抗旱性。利用该蛋白及其编码基因可以培育耐旱微生物和植物，为提高微生物和植物的耐旱胁迫能力或抗干旱胁迫能力提供一种新的思路或策略。

需要说明的是，抗旱性是指对抗干旱胁迫的能力。干旱胁迫具体为与Mannitol(甘露醇)终浓度为300mM-500mM的模拟逆境相同或等同的自然逆境。

在其他实施方式中，蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等的同一性，且其功能具有增强植物抗旱性、或改造植物的抗旱性、或与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相当或略有下降或略有提高或大幅提高的抗旱性能增强表现。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述耐旱基因的碱基序列与SEQ ID NO.2所示的DNA序列至少具有90％的同一性。

耐旱基因源自紫花苜蓿，其编码SEQ ID NO.1所示的蛋白，本发明成功从豆科植物紫花苜蓿中克隆得到的MsDINP1的编码基因。但需要说明的是，基于密码子的简并性，在本发明所公开的内容基础上，本领域技术人员容易想到在SEQ ID NO.2的基础进行密码子的替换或修改，得到不同于SEQ ID NO.2的编码序列，但只要其编码SEQ ID NO.1所示的蛋白也是属于本发明的保护范围。

在一种实施方式中，耐旱基因的碱基序列与SEQ ID NO.2所示的DNA序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等的同一性。

本发明提供了一种具有耐旱能力的蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少具有90％的同一性。例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等的同一性。

需要说明的是，在其他的一些实施例中，本领域技术人员容易想到在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个氨基酸的替换(例如使用理化性质类似的氨基酸进行替换等)、添加(例如在蛋白的一端或两端添加标签、荧光标记或融合其他功能性蛋白等)或删除(例如删除该蛋白非功能结构域区域的冗余氨基酸等)，所得到的变异体蛋白其氨基酸序列虽然不同于SEQ ID NO.1，但只要其具有与SEQ ID NO.1基本类似、提高或者是降低的耐旱能力，其也是属于本发明的保护范围。

上述蛋白可以通过生物表达和/或人工合成得到。

本发明提供了一种载体，其含有上述的SEQ ID NO.2的耐旱基因。

在一种实施方式中，上述载体为过表达载体，例如将上述SEQ ID NO.2的耐旱基因插入过表达载体获得。可选的，过表达载体可以是pEarleyGate 100。

本发明提供了一种重组菌或重组细胞，其含有上述的载体或上述的耐旱基因。

本发明实施例提供了一种耐旱基因、具有耐旱能力的蛋白或者载体在培育耐旱微生物中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：使耐旱基因在目标微生物体内表达。

在一种实施方式中，上述目标微生物为细菌。

在一种实施方式中，上述目标微生物为大肠杆菌或农杆菌。

需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际需要，选择合适的目标微生物，将上述耐旱基因导入其体内，并使该耐旱基因在该目标微生物体内能够持续表达或在特定条件下表达，以赋予该目标微生物耐旱能力，无论是何种类型的目标微生物包括但不限于大肠杆菌或农杆菌，只要其耐旱能力的提高是利用了本发明所提供的耐旱基因，即属于本发明的保护范围。将上述耐旱基因导入微生物体内的技术可以是本领域熟悉已知的常规技术。

本发明实施例提供了一种耐旱基因、具有耐旱能力的蛋白、载体、重组菌或重组细胞在培育耐旱植物中的应用。日益加剧的干旱严重威胁着作物的生长及生产，间接影响到了我国的农业、畜牧业和林业的发展。本发明提供的技术方案从遗传学上对植物品种进行了优化，在不改变植物基本的生理结构和营养价值的前提下，通过对抗旱性相关的MsDINP1基因改造和利用，提升了植物对干旱胁迫的耐受能力，在无法改变生存现状的情况下，让植物能趋近于正常生长。本发明技术方案对于推动我国乃至世界畜牧业、农业、林业的发展具有重要意义。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：使耐旱基因在目标植物体内表达。

在本发明应用较佳的实施方式中，使得具有SEQ ID NO.2所示的耐旱基因或如SEQID NO.3所示的序列导入目标植物体内表达。转化的方法包括不限于农杆菌介导基因转化法，基因枪转化法、花粉管通道法。

SEQ ID NO.3所示的序列为MsDINP1编码基因的CDS序列。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述目标植物选自双子叶植物。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述目标植物选自拟南芥、烟草、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿中的任意一种。

需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际需要，选择合适的目标植物，将上述耐旱基因导入其体内，并使该耐旱基因在该目标植物体内能够持续表达或在特定条件下表达，以赋予该目标植物耐旱能力，无论是何种类型的植物包括但不限于拟南芥、烟草、紫花苜蓿、油菜、小麦、玉米、水稻、大麦、棉花、甘蓝和高粱，只要其耐旱能力的提高是利用了本发明所提供的耐旱基因，即属于本发明的保护范围。将上述耐旱基因导入植物体内的技术可以是本领域熟悉已知的常规技术。

可选的，一种获得抗旱性增强的转基因植物新品种的方法，包括步骤：

将上述MsDINP1编码基因或其CDS区域导入目的植物基因组中，获得转基因植物种子；将转基因植物种子人工培育或自然生长成植株，即得到抗旱性增强的转基因植物。

在一种实施方式中，本发明还提供扩增上述扩增SEQ ID No.2中任意片段的引物；所述引物包括如序列SEQ ID No.4至SEQ ID No.9中所示的至少一条引物序列。

本发明具有以下有益效果：

本发明从豆科植物紫花苜蓿中克隆得到的编码基因，在干旱和植物激素脱落酸的诱导下表达增加；同时将该编码基因转入植物后可以提高目的植物的抗旱能力，本发明对研究抗旱相关调控基因提供思路和方法，对培育和获得具有抗旱性的豆科植物具有重要的参考及借鉴意义。

本发明明确了蛋白质MsDINP1的功能，并将其应用于功能增强品种的培养。本发明的MsDINP1基因及所编码的蛋白对原始蛋白及其编码基因的抗旱性增强，有利于培育抗旱性更强的植物品种或者改造其它植物的抗旱性。抗旱性能增强表现在转基因植物幼苗在干旱胁迫下的根系发达、根长更长等。

本发明为紫花苜蓿抗旱分子设计育种提供了新的基因资源，将在培育紫花苜蓿抗旱新材料中发挥重要作用，同时还为其它非粮食类经济作物抗旱性状的改良提供新方案，可对我国畜牧业、农业、林业等具有实质性的影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为MsDINP1基因特性分析；

图2为qRT-PCR(实时荧光定量)分析MsDINP1基因受胁迫诱导表达情况；

图3为分子检测转基因拟南芥中的目的基因；

图4为转基因拟南芥和野生型根系比较；

图5为转基因拟南芥和野生型抗旱性评价；

图6为转基因紫花苜蓿和野生型抗旱性评价。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例进行克隆和测序MsDINP1基因，包括以下步骤：

植物材料：中苜1号紫花苜蓿

在正常条件下将健康饱满的种子在铺好双层滤纸的培养皿中萌发5天，当幼苗子叶展开后，移至配好的1/2MS营养液(pH＝5.8)。培养7天后，在1/2MS营养液中添加Mannitol至终浓度为300mM，处理24小时，分别快速的取植物地上部分和地下部分，在液氮速冻，在-80℃保存备用。

采用Trizol法提取样品的RNA，并用cDNA合成反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA；同时采用CTAB法提取其DNA。PCR扩增体系的总体积为50μL，其中包括5×Phusion HFBuffer 10μL，2.5mM dNTP 4μL，引物MsDINP1-F(5’-3’)：ATGTGTTGCTGTTGTGGTGAAG(SEQ IDNo.4)1μL，MsDINP1-R(5’-3’)：TTAACATGGAATCTTGGATGTG(SEQ ID No.5)1μL，ddH2O 32.5μL，Phusion DNA Polymerase 0.5μL和cDNA/DNA 1μL；扩增条件为：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s；(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸15s；(5)2-4步骤循环32次；(6)72℃延伸5min；(7)16℃终止。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，回收该基因的cDNA和DNA片段连接pMD19-T载体后，转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞。在含Amp、IPTG和X-Gal的LB抗性平板涂上含pMD19-T-MsDINP1的大肠杆菌，在37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑，挑入含有Amp抗性的液体菌落中，在37℃摇床中200转过夜培养。菌液检测合适后送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果表明菌落具有SEQ ID No.2(DNA)和SEQ ID No.3(cDNA)中的核苷酸序列，将其命名为MsDINP1，将该基因编码的蛋白命名为MsDINP1蛋白，蛋白序列如SEQ ID No.1所示。

MsDINP1蛋白与其他5个物种进行同源比对(图1)，与蒺藜苜蓿Medtr2g015540蛋白的同源性最高。图1中，(A)图表为MsDINP1基因结构；(B)图表为MsDINP1与其他5个物种DINP1氨基酸序列的同源比对；(C)图表为拟南芥和蒺藜苜蓿DINP1基因在干旱胁迫下的表达情况。

实施例2

本实施例通过实时荧光定量PCR分析MsDINP1的表达特性，包括以下步骤：

紫花苜蓿种子萌发和水培同实施例1，用12d的紫花苜蓿幼苗进行胁迫处理：

干旱处理：在1/2MS水培营养液中添加Mannitol至终浓度为500mM，处理时间分别为0h、1h、3h、6h、12h和24h。分别快速的取植物地上部分和地下部分，样品在液氮速冻，在-80℃保存备用。

植物激素脱落酸处理：1/2MS水培营养液中添加80μM ABA，分别处理0h，1h，3h，6h，12h和24h。地上和地下分别取样，液氮速冻，-80℃保存备用。

样品RNA提取和反转录cDNA方法如同实施例1。将cDNA稀释成50ng/μL。用qRTMsDINP1-F(5’-3’)：GTGTTGCTGTTGTGGTGAAGAT(SEQ ID No.6)和qRTMsDINP1-R(5’-3’)：GGAGCCTTGATGAGAGCCAGAG(SEQ ID No.7)检测目的基因表达量，以MsACTIN-F(5’-3’)：ACTGGAATGGTGAAGGCTGG和MsACTIN-R(5’-3’)：TGACAATACCGTGCTCAATGG作为内参。PCR检测体系的总体积为20μL，其中包括2×SG Fast qPCR Master Mix 10μL，引qRTMsDINP1-F 0.5μL，引物qRTMsDINP1-R 0.5μL，DNF buffer 2μL，ddH2O 5μL和cDNA 2μL；扩增条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s；(3)60℃退火1min；(4)2-3步骤循环40次。qRT-PCR反应在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪上进行，每个样品设置3个技术重复。

利用2^-ΔΔCt方法计算相对表达量。ΔΔCt＝(Ct._目的基因-Ct._内参基因)_Time _x-(Ct._目的基因-Ct._内参基因)_Time ₀；Time x表示逆境处理的任意5个时间点，具体为1h，3h，6h，12h或24h。Time 0表示逆境处理0小时(对照组)。利用Origin 9软件进行做图。

结果见图2，不论是在紫花苜蓿地上部分中，还是在紫花苜蓿根部中，MsDINP1基因均受到Mannitol和ABA胁迫的诱导。图2中，(A)图表为80μM ABA胁迫时MsDINP1在紫花苜蓿地上部分的表达情况；(B)图表为80μM ABA胁迫时MsDINP1在紫花苜蓿根部的表达情况；(C)图表为500mM Mannitol胁迫时MsDINP1在紫花苜蓿地上部分的表达情况；(D)图表为500mMMannitol胁迫时MsDINP1在紫花苜蓿根部的表达情况。

实施例3

本实施例验证MsDINP1在提高拟南芥抗逆性中的应用。

值得说明的是：拟南芥作为模式植物，本发明利用其对MsDINP1基因进行功能分析和验证，其结论可以认为等同于紫花苜蓿中MsDINP1调控植物响应干旱的分子机理。

本实施例实验操作包括如下步骤：

一、制备转MsDINP1拟南芥。

1.重组载体的构建。

1)MsDINP1基因的克隆

根据MsDINP1基因的序列设计引物MsDINP1-G-F和MsDINP1-G-R，引物5’端分别引入NcoI和XbaI酶切位点：

MsDINP1-G-F(5’-3’)：CATGCCATGTGTTGCTGTTGTGGTGAAG(SEQ ID No.8)

MsDINP1-G-R(5’-3’)：CTAGTCTATTAACATGGAATCTTGGATGTG(SEQ ID No.9)

以实施例1中的紫花苜蓿的cDNA为模板，使用MsDINP1-G-F和MsDINP1-G-R进行PCR扩增。PCR扩增体系的总体积为50μL，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μL，2.5mM dNTP 4μL，引物MsDINP1-G-F 1μL，MsDINP1-G-R 1μL，ddH2O 32.5μL，Phusion DNA Polymerase0.5μL和cDNA 1μL；扩增条件为：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s；(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸15s；(5)2-4步骤循环32次；(6)72℃延伸5min；(7)16℃终止。得到PCR扩增产物，并在1.5％琼脂糖胶上检测，确定产物大小约为257bp。

2)酶切、连接。

将PCR扩增产物回收纯化，用限制性内切酶NcoI和XbaI酶切，并回收酶切后的PCR产物，得到大小为250bp的酶切产物；同时，用限制性内切酶NcoI和XbaI酶切pEarleyGate100表达载体，回收大小约为11.6kb的载体骨架。

使用DNA连接酶(TaKaRa，货号：6022)将目的基因的酶切产物和pEarleyGate 100表达载体的载体骨架4℃过夜连接。将连接产物热击转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，PCR检测阳性克隆并送测序。

3)重组农杆菌的获得。

选取测序序列与MsDINP1的CDS序列完全一致的阳性克隆提质粒，并载体转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pEarleyGate 100-MsDINP1，与50％甘油1:1比例混合后，液氮速冻，-80℃保存备用。

2.转MsDINP1拟南芥获得

从-80℃取出重组农杆菌EHA105/pEarleyGate100-MsDINP1置于冰上，挑取部分冻住的菌块与3mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇24h。

取2mL小摇菌液加入到200mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇20h-24h，摇到OD600＝1.2-2.0。

取部分大摇菌液离心，转速4500g，离心时间15min，倒掉LB液体，使用5％蔗糖重悬和稀释至OD600＝0.8的花浸泡缓冲液。

将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)花序(前两天可以剪掉果荚，提高转染效率)浸泡入侵染液中，侵染3-5s；

浸泡完毕后，取出花盆，黑暗处理24h，于温室中继续培养。1周后侵染第2次。

收获T1代种子，筛选阳性植株用草铵膦(PPT，10mg/mL)筛选，传代，直至T3代获得纯合株系。

T2代表示T1代自交产生的种子及种子生长所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及种子生长所长成的植株。

以T3代再生植株的整个植株的DNA作为模板，用目的基因引物对35S-F(5′-3′)：GCACAATCCCACTATCCTTC和MsDINP1-R(5′-3′)：TTAACATGGAATCTTGGATGTG(SEQ ID No.5)，以及Bar引物对Bar-F(5′-3′)：TGCACCATCGTCAACCACTA和Bar-R(5′-3′)：ACAGCGACCACGCTGTTGAA进行PCR扩增。MsDINP1和Bar基因的PCR检测体系和扩增条件一致。PCR检测体系为：PCR的总体积为20μL，其中包括2×Eco Taq PCR SuperMix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH2O 6μL和DNA模板(50ng/μL)，2μL；扩增条件为：(1)94℃预变性4min；(2)94℃变性30s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环35次；(6)72℃延伸7min。结果如图3中(A)所示，T3代20个纯合株系在431bp扩增出单一条带。

提取T3代再生植株的整个植株的RNA，并反转录成cDNA作为模板，用目的基因部分片段引物对qRTMsDINP1-F和qRTMsDINP1-R，以及内参基因对AtACTIN-F(5′-3′)：TGTGCCAATCTACGAGGGTTT和AtACTIN-R(5′-3′)：TTTCCCGCTCTGCTGTTGT进行qRT-PCR扩增。qRT-PCR体系包括2×SG Fast qPCR Master Mix 10μL，引物qRTMsDINP1-F 0.5μL，引物qRTMsDINP1-R 0.5μL，DNF buffer 2μL，ddH2O 5μL和cDNA 2μL，总体积为20μL。qRT-PCR扩增条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s；(3)60℃退火1min；(4)步骤(2)至(3)循环40次。结果如图3中(B)所示，MsDINP1在野生型株系(WT)中不表达，而在纯合株系中有不同程度的表达。从纯合株系中挑选3个高表达株系进行后续的生理分析。

二、转基因植物的抗旱性评价

1.失水逆境对根长的影响

植物材料为T3代转MsDINP1拟南芥的3个代表性株系OE5、OE34、OE41和野生型WT。将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用10μL枪头均匀点在培养基上(MS培养基、含有300mM Manntiol的MS培养基)，用封口膜密封，春化3天后，移入温度22℃、光照时间为16h、相对湿度60％的培养箱中培养7天，挑选根系长度一致的3个转基因株系和野生型WT幼苗分别移至MS培养基和含有300mM Manntiol的MS培养基上，培养10天后统计各株系的相对根长及根部鲜重，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。

结果如图4中的A所示，正常生长条件下，在MS培养基上，野生型和MsDINP1转拟南芥株系的根长基本一致；图4中的B为300mM甘露醇处理6天后，转基因拟南芥和野生型的生长情况；图4中的C图表为300mM甘露醇处理10天后，转基因拟南芥和野生型的生长情况；图4中的D图表为300mM甘露醇处理10天后，转基因拟南芥和野生型的相对根长；图4中的E图表为正常生长条件和300mM甘露醇处理10天后，转基因拟南芥和野生型根部鲜重的变化情况。由图可知，在含有300mM Manntiol的MS培养基上，MsDINP1转拟南芥株系的根长显著大于野生型。

2.土壤失水对转基因植株抗性的影响

植物材料为T3代转MsDINP1拟南芥的3个代表性株系OE5、OE34、OE41和野生型WT。将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用1mL枪头均匀点在培养基上，封口膜密封，春化3天后，移入温度为22℃，光照时间为16h，相对湿度60％的培养箱中培养14天；将幼苗移小方盆中，每盆土壤重量一致，每盆6株幼苗，正常条件培养14天后，使每盆土壤吸水至饱和，然后停止水分供应，进行失水处理45天，直至野生型植株叶片干枯；最后开始复水，正常条件5天，观察植物表型并拍照。

结果参照图5所示，其中(A)图表为正常生长条件下、干旱处理45天和复水5天后，转基因拟南芥和野生型的生长情况；(B)图表为干旱处理45天和复水5天后，转基因拟南芥和野生型的绿苗率；(C)图表为转基因拟南芥和野生型的离体叶片失水率变化情况。图5A所示，失水前，MsDINP1转拟南芥株系和野生型生长状况基本一致；失水后，野生型明显比转基因株系生长情况要弱；复水后，野生型的存活率比转基因株系要低。

实施例4

本实施例验证MsDINP1在提高紫花苜蓿抗逆性中的应用。

本实施例实验操作包括如下步骤：

1.转MsDINP1紫花苜蓿获得

(1)从-80℃取出重组农杆菌EHA105/pEarleyGate100-MsDINP1(实施例3中以构建成功的过表达载体)置于冰上，挑取部分冻住的菌块与3mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇24h；

(2)取2mL小摇菌液加入到200mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇20h-24h，摇到OD600＝0.6-0.8；

(3)在室温、4500g条件下，将振荡培养后的菌液进行离心，然后弃掉上清，利用SM4液体培养基进行重悬，最后调整菌液的OD600在0.2-0.4之间，并将其置于28℃摇床中振荡培养30分钟，转速为140rpm；

(4)采集新鲜紫花苜蓿复叶6-8个，在含有0.1％吐温20的蒸馏水中进行清洗，清洗至叶片表面无气泡为止，然后用蒸馏水洗涤3次；

(5)在超净工作台中，将清洗干净的叶片放于灭菌的组培瓶中，加入75％酒精浸泡20s；

(6)浸泡完成后，用灭菌超纯水清洗3次，然后加入30％的NaClO，用封口膜密封后放入摇床中振荡消毒10分钟，转速为140rpm；

(7)消毒完成后，用灭菌超纯水清洗3次；

(8)将叶片转入新的灭菌组培瓶中，加入农杆菌侵染液，然后将组培瓶置于干燥器中抽真空10分钟；

(9)抽真空完成后，将组培瓶放在超声波清洗仪中，在15-20℃条件下清洗3分钟左右(清洗至侵染液泛绿为止)；

(10)再次将组培瓶转入干燥器中进行抽真空10分钟；

(11)抽真空完成后，在超净工作台中将叶片平铺在灭菌滤纸上干燥20分钟；

(12)将干燥后的叶片转至SM4共培养基上，室温条件下黑暗培养3天(以叶片边缘出现菌落为标准)；

(13)然后依次将叶片转入选择培养基(培养约60天至愈伤膨大)、MSBK培养基(培养约30天至发芽)、SH9培养基(培养约60天至生根)，在培养过程中需每隔15天更换一次培养基；

(14)将生根后的植株移栽至土壤中，进行后续实验。

2.转MsDINP1紫花苜蓿阳性苗鉴定。

提取转MsDINP1紫花苜蓿叶片的DNA和RNA，按照实施例3中转MsDINP1拟南芥的鉴定方法，鉴定转MsDINP1紫花苜蓿阳性苗。

3.转基因植物的抗旱性评价。

植物材料为转MsDINP1紫花苜蓿的3个代表性株系OE51、OE82、OE94和野生型WT。扦插生长一致的野生型和转MsDINP1紫花苜蓿，扦插苗生根后将其移栽至9×9cm的小花盆中，生长介质为蛭石，定期浇灌1/2MS营养液。扦插苗正常生长2个月后，对生长一致的野生型和转基因紫花苜蓿植株进行干旱处理。

结果表明：正常条件下，过表达株系与野生型紫花苜蓿无明显差异；干旱处理2月龄的幼苗20天后，野生型紫花苜蓿的叶片已经萎蔫，而大部分过表达株系生长良好(请参照图6所示)。

本发明提供了一种功能不明确的MsDINP1蛋白，首先通过qRT-PCR实验确定了MsDINP1基因的表达受到干旱胁迫的诱导，然后将MsDINP1基因在拟南芥中过表达后发现，转基因拟南芥比野生型拟南芥具有更强的抗旱性。本发明为紫花苜蓿抗旱分子设计育种提供了新的基因资源，将在培育紫花苜蓿抗旱新材料中发挥重要作用，同时还为其它非粮食类经济作物抗旱性状的改良提供新方案，可对我国畜牧业、农业、林业等具有实质性的影响。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 兰州大学

<120> 一种耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Cys Cys Cys Cys Gly Glu Asp Cys Lys Phe Arg Pro Leu Gly Phe

1 5 10 15

Leu Leu Gly Leu Pro Phe Ala Phe Leu Ser Leu Ile Ile Ser Leu Val

20 25 30

Gly Ala Val Ile Trp Ile Val Gly Leu Thr Leu Thr Cys Thr Cys Pro

35 40 45

Cys Cys Leu Cys Val Thr Leu Ile Val Glu Phe Ala Leu Ala Leu Ile

50 55 60

Lys Ala Pro Ile Lys Val Met Glu Trp Phe Thr Ser Lys Ile Pro Cys

65 70 75 80

<210> 2

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtgttgct gttgtggtga ggattgtaaa ttcaggcctc ttggttttct cctaggcctt 60

ccttttgctt tcttgtctct cataatctcc tttgtaggtg cagttatttg gattgttggg 120

taagtccctc tcttttccaa tctattagta ttttcttttg attatttttt ctttgaaaat 180

aataattata attgagaaaa agttatgaat gtgtatgatg ctatgtatgg caggttgact 240

ttgacatgta tatgtccatg ctgtctttgc gtgaccctca tagttgagtt tgctctggct 300

ctcatcaagg ctccagttaa ggttatggag tggttcacat ccaagattcc atgttaa 357

<210> 3

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtgttgct gttgtggtga agattgtaaa ttcaggcctc ttggatttct cctaggcttg 60

ccttttgctt tcttgtctct cataatttct cttgtaggtg cagttatttg gattgttggg 120

ttgactttga catgcacatg tccatgctgt ctttgcgtga ccctcatagt tgaatttgct 180

ctggctctca tcaaggctcc aattaaggtt atggagtggt tcacatccaa gattccatgt 240

taa 243

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtgttgct gttgtggtga ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttaacatgga atcttggatg tg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtgttgctgt tgtggtgaag at 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggagccttga tgagagccag ag 22

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

catgccatgt gttgctgttg tggtgaag 28

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctagtctatt aacatggaat cttggatgtg 30

Claims

1.一种耐旱基因，其特征在于，其编码具有耐旱能力的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少具有90％的同一性。

2.根据权利要求1所述的耐旱基因，其特征在于，所述耐旱基因的碱基序列与SEQ IDNO.2所示的DNA序列至少具有90％的同一性。

3.一种具有耐旱能力的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少具有90％的同一性。

4.一种载体，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的耐旱基因。

5.一种重组菌或重组细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的载体或权利要求1-2任一项所述的耐旱基因。

6.权利要求1或2所述的耐旱基因、权利要求3所述的具有耐旱能力的蛋白或者权利要求4所述的载体在培育耐旱微生物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括：使所述耐旱基因在目标微生物体内表达；

优选地，所述目标微生物为细菌；

优选地，所述目标微生物为大肠杆菌或农杆菌。

8.权利要求1或2所述的耐旱基因、权利要求3所述的具有耐旱能力的蛋白、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的重组菌或重组细胞在培育耐旱植物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括：使所述耐旱基因在目标植物体内表达；

优选地，使得具有SEQ ID NO.2所示的耐旱基因或如SEQ ID NO.3所示的序列导入目标植物体内表达。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述目标植物选自双子叶植物；

优选地，所述目标植物选自拟南芥、烟草、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿中的任意一种。