KR100682129B1 - 벼 유래 ＯｓＣＫ1 유전자, 이 유전자를 포함하는발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이형질전환체의 제조방법 - Google Patents

벼 유래 ＯｓＣＫ1 유전자, 이 유전자를 포함하는발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이형질전환체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼 유래 OsCK1 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 벼 내에서 과다발현시키면 벼의 벼흰잎마름병 및 벼도열병에 대한 저항성이 높아지는, 벼 유래 OsCK1을 코딩하는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터 pSBM-LS28, 이 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움 형질전환체(수탁번호:KACC 95034P) 및 벼 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
벼, 콜린 카이나제, 형질전환체, 벼 도열병 저항성, 벼흰잎마름병 저항성

Description

벼 유래 ＯｓＣＫ1 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법{OsCK1 GENE FROM ORYZA SATIVA, EXPRESSION VECTOR COMPRISING THE GENE, TRANSFORMANTS TRANSFORMED WITH THE VECTOR AND PRODUCTION METHOD OF THE TRANSFORMANTS}
도 1a는 본 발명의 벼(Oryza sativa) 유래 OsCK1 유전자 서열분석 결과를 나타내고, 도 1b는 본 발명의 벼(Oryza sativa) 유래 OsCK1 단백질의 상동성 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 온도, 염 및 호르몬 처리에 따른, 본 발명의 벼 유래 OsCK1 유전자의 발현 양상을 노던블랏으로 분석한 결과 사진이다.
도 3은 본 발명의 벼 유래 OsCK1 유전자를 포함하는, 형질전환용 발현벡터 지도를 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 벼 유래 OsCK1 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 동형접합체(homozygotes)를 나타내는 사진이다.
도 5는 본 발명의 벼 유래 OsCK1 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼에서 추출한 DNA의 서던블랏 결과(도 5a) 및 mRNA의 노던블랏 결과(도 5b) 사진이다.
도 6은 본 발명의 벼 유래 OsCK1 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼에서 벼흰잎마름병 저항성 결과를 나타낸 사진이다.
도 7는 본 발명의 벼 유래 OsCK1 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼에서 벼도열병 저항성 결과를 나타낸 사진이다.
본 발명은 벼흰잎마름병 및 벼도열병에 대한 저항성 향상과 관련된 벼(Oryza sativa)에서 분리된 OsCK1 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
벼흰잎마름병은 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 에 의해서 발생되는 세균성 도관병으로, 보통 출수기 전후에 나타나나 상습발생지나 다발생 발생지에는 본답 초기에 발병하며, 드물게는 묘판에서도 발병된다. 국내에서 최초 발병보고는 1930년 전라남도 해남군에서 처음 발견된 이래 1960년까지 남부 일부 지역에 제한적인 발생을 보이다 이병성 품종인 금남풍의 재배 확대로 전국적인 발생을 나타내었으며, 이후 다수계 품종 재배에 의한 밀양 23호에 의해 피해가 확대되어 재배기간 중 후기에 발생되는 잎에서의 발병 뿐만 아니라 이앙 후 분얼기까지 주 전체가 발생되는 금성형 증상을 보여 벼의 3대 병해의 하나로 간주된다.
벼도열병은 Magnaporthe gresea에 의하여 유발되는 병이다. 병원균인 Magnaporthe gresea는 불완전균류에 속하며 분생포자를 형성하는데, 균사 발육 온도는 16~40℃이고 최적 온도는 27~29℃이다. 분생포자의 발아 최적온도는 25~28℃ 이다. 도열병균은 피해짚의 목 가지 마디에서 균사의 상태로 월동하거나, 잡초에서 월동한 후 다음해 전염원이 된다. 일단 벼도열병균의 분생자경이 형성되고 분생포자 형성, 분생포자 이탈, 분생포자의 비산, 식물체에의 부착, 발아, 부착기형성, 침입, 병반형성의 과정을 거친다. 병발생 환경을 살펴보면 온도는 27~29℃와 90%이상의 습도에서 발병이 높다
콜린 카이나제(choline kinase)는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine:PC) 생합성 경로에 관여하는 중요 효소로서, 포스파티딜콜린 생합성은 세포막의 지질구성을 결정하고, 그 결과 세포막 유동성에 관여하여 내냉성 등과 같은 비생물적 스트레스의 저항성과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다(Kinney 등(1987), Biochem. J. 242:755-759). 포스파티딜콜린 생합성 경로는 CDP-콜린 경로와 메틸화 경로 두 가지가 있으며, 이중에서 식물은 CDP-콜린 경로를 따르는 것으로 보고되고 있다. 콜린 카이나제는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine:PC) 생합성 경로중에서 CDP-콜린 경로의 첫번째 반응에 관여하는 중요 효소로서, 콜린을 인산화콜린(phosphorylcholine:pCho)으로 변환시키는 것이라고만 알려져 있다.
본 발명은 콜린카이나제 활성을 갖는 효소를 인코딩하는 OsCK1 유전자가 벼내에서 과다발현 되면, 벼도열병 및 흰잎마름병 저항성이 높아진다는 사실을 최초로 발견하여, 벼도열병 및 흰잎마름병 저항성 증진에 관여하는 벼 유래 OsCK1 유전자 및 그 염기서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 벼도열병 및 흰잎마름병 저항성을 증진시키는 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환되어 벼도열병 및 흰잎마름병 저항성을 증진시키는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벼도열병 및 흰잎마름병 저항성을 증진시키는 형질전환체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면, 벼 유래 OsCK1 유전자 및 그 염기서열이 제공된다.
본 발명의 상기 유전자는 서열목록의 서열번호 1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지고, 약 1107bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 것을 특징으로 하며, 벼를 저온 처리하면 특이적으로 발현이 유도되는 유전자이다. 본 발명자들은 벼를 저온으로 처리할 때 특이적으로 발현되는 유전자를 분리하여 "LS28"로 명명하였다.
상기 LS28 유전자에 의해 번역되는 단백질은 콜린 카이나제 활성을 갖는 효소로서, 368개의 아미노산으로 구성된다. 본 발명자들은 상기 단배질의 상동성을 분석한 결과, 도1b에 나타난 바와 같이 상기 단백질과 콩 유래 콜린카이나제 유전자 산물이 높은 상동성을 나타내는 것을 확인하여, 이를 "벼 유래 OsCK1"으로 명명 하였다.
본 발명자들은 상기 벼 유래 OsCK1 유전자를 벼에서 과다발현시키면 벼도열병 및 흰잎마름병에 대한 저항성이 현저히 증가하는 것을 발견하여 본 발명에 이르렀다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 벼 유래 OsCK1 유전자를 포함하는 발현벡터가 제공된다. 이를 위하여 본 발명의 상기 유전자를 공지의 적절한 발현벡터에 삽입하여, 이 유전자를 포함하는 발현벡터를 얻을 수 있다. 상기 발현벡터는 예컨대, 프로모터로서 꽃양배추 모자이크바이러스(CaMV) 35S를, 선별마커로서 제초제저항성을 나타내는 바스타 유전자를 포함하여 제조하는 것이 바람직하다(도 3). 본 발명의 발명자들은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 "pSBM-LS28"이라고 명명하였다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 벼 유래 OsCK1 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 "형질전환체(transformants)"가 제공된다. 본 발명의 상기 형질전환에 사용할 수 있는 숙주세포로는 본 발명의 상기 유전자의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 식물체내로의 형질전환, 세포배양 및 구입의 용이 등의 측면에서 특히 아그로박테리움(Agrobacterium)이 바람직하다.
여기서, '형질전환체'란 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 유용물질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 구조물(DNA construct)에 의해 형질전환된 세포 또는 식물체를 의미한다. 본 발명에서 형질전환체는 형질전환된 미생물, 동물세포, 식물세포, 형질전환된 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함 하는 의미이다.
본 발명자들은 본 발명의 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 pSBM-LS28을 제작한 후, 이 발현벡터를 아그로박테리움에 형질전환시켜 안정적인 아그로박테리움 형질전환체를 확립하였으며, 이를 형질전환체 "LBA4404:pSBM-LS28"이라고 명명하였다. 이 형질전환체 "LBA4404:pSBM-LS28"을 농촌진흥청 부설 농업생명공학연구원 한국농용미생물보존센터에 2005년 3월 17일에 수탁번호 KACC 95034P로 기탁하였다.
또한, 상기 아그로박테리움 형질전환체를 이용하여, 상기 발현벡터 pSBM-LS28을 낙동벼에 형질전환시켜 안정적인 벼 형질전환체를 확립하였으며, 이를 형질전환체 "LS28-30"이라고 명명하였다.
본 발명의 상기 형질전환체의 제조방법은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:
1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열 또는 그것의 일부로 이루어지는 OsCK1 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.
상기 발현벡터를 제조하는 단계 1)에 있어서, 저온처리 cDNAs 은행으로부터 분리된 EST를 사용하고, 역 노던블랏(Reverse Northern Blotting) 방법을 이용하여, 저온에 특이적으로 반응하는 유전자를 분리, 벼 유래 OsCK1 유전자의 부분 단 편을 포함하는 클론을 선별할 수 있다. 이 클론의 유전자 단편을 3'-연장 및 5'-연장하므로써 전장(full length) DNA를 획득하고, 얻어진 전장 DNA를 식물 발현벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터인 pSBM-LS28을 제작할 수 있다.
상기 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계 2)에 있어서, 얻어진 pSBM-LS28을 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 입자 충격법(particle bombardment), 일렉트로포레이션법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 등이 있으며, 트리페어런털 메이팅(triparental mating) 방법이 가장 바람직하다.
또한, 상기 단계 2)에 있어서, 얻어진 pSBM-LS28을 식물에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 진공을 이용한 형질전환법(Vacuum infiltration method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method) 및 화아 침지법(Floral meristem dipping method) 등과 같은 방법이 있다.
상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계 3)에 있어서, 선별방법은 숙주세포의 항생제 저항성을 이용하여 선별할 수 있는데, 즉 선별마커로서 세포탁심(cefotaxime)과 포스피노트리신(phosphinothricin) 등의 내성 유전자를 포함하는 상기 발현벡터 pSBM-LS28이 도입된 숙주세포만이 첨가 배지에서 생존함을 이용하여 선별할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예1:벼 유래 OsCK1 유전자, 아미노산 서열 분석]
저온처리 cDNAs 은행으로부터 분리된 EST를 사용하고, 역 노던블랏(Reverse Northern Blotting) 방법을 이용하여, 저온에 특이적으로 반응하는 유전자를 분리하여 LS28로 최초명명하였다. 선별된 LS28 유전자의 전장 DNA 염기서열을 결정한 결과, 기존에 보고된 콜린 카이나제 유전자(GenBank ID:AK098914)와 같은 유전자로 나타났으며, 216bp의 5' UTR, 1,107bp의 코딩영역 및 폴리A(polyA)부위를 포함한 389bp의 3' UTR로 구성되어 있는 것을 확인하였다. 상기 LS28 유전자를 벼 유래 OsCK1(Oryza sativa Choline Kinase1)으로 명명하였다. 상기 벼 유래 OsCK1의 ORF가 368개의 아미노산으로 구성된 42.2kD의 단백질을 암호화하는 것을 도 1a로부터 확인할 수 있다.
벼의 전체 염색체 염기서열 데이터베이스를 이용한 상동성 분석 결과, 벼 유래 OsCK1 유전자는 염색체 1번에 위치해 있으며, 2개의 유사한 콜린 카이나제 유전자가 벼 유전체에 존재해 있으나, cDNA 형태가 아닌 어노테이션(annotation)에 의해 유추되어 있다. 벼 유래 OsCK1 유전자는 다른 2개의 벼 콜린 카이나제 유전자와 아미노산 레벨에서 60%와 75%의 상동성을 보여주고 있다. 아미노산 서열에 근거한 단백질의 구조적 특징을 보면, 콜린 카이나제에 특징적인 카이나제 촉매활성 도메인이 잘 보존되어 있으며, 또한 현재까지 알려진 모든 콜린 카이나제에 보존된 아미노산 서열이 잘 보존되어 있다(도 1b).
[실시예2:벼 유래 OsCK1 유전자의 발현양상 분석]
수경 재배한 벼 유묘에서 RNA를 추출, 전기영동으로 분리하여 나일론 막에 블로팅 한 후 32P로 표지한 벼 유래 OsCK1 cDNA를 이용하여 노던혼성화를 수행하였다. OsCK1 유전자의 발현을 분석하기 위해 2주간 키운 벼 유묘에 ⅰ)아무런 처리도 하지 않음, ⅱ)4℃ 저온처리, ⅲ)NaCl염 처리, ⅳ)ABA 처리, ⅴ)4℃ 저온 및 ABA 처리, 및 ⅵ)NaCl염 및 ABA 처리한 다음, 각각의 싹에서 RNA를 분리하여 노던분석을 수행하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 벼 유래 OsCK1 유전자는 저온처리에 의해 그 발현이 강하게 유도되었으나, 고농도 염스트레스나 ABA처리에 의해서는 그 발현이 유도되지 않았다. 따라서, OsCK1 유전자는 저온에서만 특이적으로 발현하는 유전자임을 확인하였다.
[실시예3:벼 유래 OsCK1 유전자의 벼 형질전환용 발현벡터 제작]
상기 실시에 1에서 얻어진 벼 유래 OsCK1 유전자의 개시코돈 상류에 제한효소 SpeI 사이트를 추가하여 5' PCR 프라이머를 제작하고, 종결코돈 하류에 제한효소 XbaI 사이트를 추가하여 3' PCR 프라이머를 제작한 후, 이들 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 산물을, SpeI과 XbaI으로 절단한 pKS 플라스미드에 삽입, 연결하여 pKS-LS28 벡터를 작성하였다. 그 다음, 상기 pKS-LS28 플라스미드를 제한효소 SpeI과 XbaI 처리하여, 1.2kb 단편의 OsCK1 유전자를 분리하고, 이를 pKS-PAT 플라스미드의 SpeI과 XbaI 사이트에 삽입시켜 pKS-PAT LS28 벡터를 제작하였다. 그 다음, 상기 pKS-PAT LS28 플라스미드를 제한효소 XhoI과 XbaI으로 처리하여, 약 2.5Kb 크 기의 액틴 프로모터와 OsCK1 유전자가 연결된 단편을 분리하였다. 이 2.5Kb 크기의 DNA 단편을, XhoI/XbaI 위치에 삽입하여, 벼 유래 OsCK1 유전자가 포함된 pSBM-LS28 발현벡터를 제작하였다(도 3).
[실시예4:아그로박테리움 및 벼의 형질전환체 제작]
트리페어런털 메이팅(triparental mating) 방법을 사용하여, 상기 pSBM-LS28 발현벡터를 아그로박테리움에 도입, 형질전환체를 제작하였다. 또한, 벼의 배상체 캘러스를 유기하여 공동배양한 후, 상기 아그로박테리움 형질전환체를 사용하여 벼의 캘러스에 상기 pSBM-LS28 발현벡터를 도입, 벼 형질전환체를 제작하였다. 상기 pSBM-LS28 발현벡터를 포함하는 벼 형질전환체를 세포탁심(cefotaxime)과 제초제 포스피노트리신(phosphinothricin)이 첨가된 배지에 치상하여 선별 및 재분화를 유도한 후, 순화과정을 거쳐 온실에서 재배되었다.
제초제 BastaR(PPT ammonium glufosinate 함량, 18%) 0.6% 용액을 벼 형질전환체의 잎에 처리한 후, 8일 후에 상기 제초제 저항성 분석을 실시하였다. 벼 유래 OsCK1 유전자가 도입된 형질전환체 32개체를 획득하였으며, 형질전환 효율은 1~3% 정도로 나타났다.
획득한 형질전환체에 대한 제초제 저항성 분석을 한 결과, 모두 상기 제초제에 대해서 저항성을 나타내었으며, 이중 11계통을 선발하여 이 계통들로부터 T2 종자를 획득하였다. 도입 유전자에 대한 동형접합체 계통을 선발하기 위하여, 40립 이상의 T2 종자를 포스피노트리신 6㎎/l가 첨가된 MS 배지에 치상하여 저항성을 검 정하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 치상 7~10일 후에, 대조군인 낙동벼(B)의 경우는 발아는 하였으나 거의 자라지 못하고 백색을 띄는 반면, 벼 형질전환체는 정상적으로 자라는 것을 관찰할 수 있었다(C, D). 대조군인 낙동벼의 경우 포스피노트리신이 없는 조건에서는 정상적으로 자라는 것을 알 수있다(A).
[실시예5:벼의 형질전환체 분석]
검정한 계통 중에서 치상한 40립의 종자 모두 저항성을 나타내었으므로, 정상적으로 자라는 동형접합체 7계통을 선발하여 이들 계통들에 대해 다음과 같은 분자생물학적 분석을 수행하였다.
상기 벼 형질전환체에서 벼 유래 OsCK1 유전자가 벼 염색체에 삽입된 것을 확인하기 위하여, 서던블랏을 수행하였다. 즉, 벼 형질전환체 잎으로부터 gDNA를 분리하여 SpeI과 XbaI으로 절단한 후, 나일론 막으로 DNA를 트랜스퍼시키고, 32P 방사성동위원소로 표지된 OsCK1 유전자와 bar 유전자를 프로브로 사용하여 혼성화(hybridization)시켰다.
그 결과, T2 형질전환체의 경우 LS28 32~18 계통을 제외한 모든 계통에서 1.2kb의 OsCK1 특이 유전자가 벼 게놈상에 안정적으로 도입된 것을 확인할 수 있었다(도 5a: A). 또한, 프로브로서 OsCK1 유전자로 서던 분석을 했던 나일론 막에서 OsCK1 유전자를 제거한후, bar 유전자를 프로브로 하여 서던 분석을 하였다. 그 결과, 선발된 모든 OsCK1계통에서 bar 유전자 특이 밴드가 나타났으며, 따라서 벼 유 래 OsCK1 유전자가 벼의 염색체에 안정적으로 도입된 것을 확인할 수 있었다(도 5a: B).
또한, T2 형질전환체에서 OsCK1 유전자가 항상성 있게 과발현되는지를 확인하기 위하여, 전체 RNA를 분리하여 상기 서던 분석에서 사용한 각 프로브를 이용, 노던 분석을 실시하였다. 그 결과, 대조군으로서 낙동벼(wt)에서는 거의 발현되지 않았으나, LS28 32~18 계통의 형질전환체(lane 1, 2, 3, 4, 5)에서는 액틴 프로모터와 융합되어 형질도입된 OsCK1 유전자가 항상성 있게 과발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 5b).
[실시예6:벼 유래 OsCK1 형질전환체의 병 저항성 증진 확인]
벼 유래 OsCK1 형질전환체가 병 저항성과 관련이 있는지를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
벼흰잎마름병 저항성 증진효과
5×108 농도의 벼흰잎마름병균(Xanthomonas orzae pv. oryzae Kxo85)을 MgCl2(10mM)에 혼합하여 접종원을 만든 후, 가위를 접종원에 담갔다가 접종원이 묻어 있는 가위로 벼 잎 끝의 약 5cm 정도를 잘라주었다. 이러한 클리핑법(clipping method)은 벼 잎에 자연스럽게 상처를 주면서 균을 접종시키는 방법이며, 이 방법에 의해 벼흰잎마름병균(도관병균)은 벼의 도관을 따라 이동하게 된다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 접종 후 열흘이 지난 후 상기 병원균이 침투한 길이를 측정한 결과, 벼흰잎마름 현상이 비 형질전환체에서 뚜렷한 바, 벼 유래 OsCK1 형질전환체(도 6a)는 비 형질전환체(도 6b)에 비해 벼흰잎마름병균 감염 저항성을 나타내는 것이 확인되었다.
도열병저항성 증진효과
도열병균, Magnaporthe grisea (Pyricularia oryzae)을 쌀겨배지에 7일 정도 생장 번식을 시킨뒤 포자형성을 위하여 고무 주걱으로 스트레스를 준 후 형광등 아래에서 배양한다. 배양 2일 후 0.05% twin20용액을 이용하여 도열병균 포자를 채집한 뒤 그 농도를 해마토사이토메타를 이용하여 1×105 spore/ml로 맞춘다. 접종원을 4주 키운 벼에 가압 분무 살포하여 7일 후 병저항성 정도를 검정한다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 우측의 비 형질전환체에는 상기 병원균이 침투하여 도열병에 특징적인 병반을 보여주고 있는 반면, 좌측의 벼 유래 OsCK1 형질전환체는 벼도열병에 대한 저항성을 나타내는 것이 확인되었다.
본 발명은 도열병 및 흰잎마름병 저항성 증진에 관여하는 벼 유래 OsCK1 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의한 형질전환체를 제공한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는, 벼도열병과 벼흰잎마름병 저항성 관련 벼 유래 OsCK1 유전자.
  2. 제1항의 유전자를 포함하는 발현벡터 pSBM-LS28.
  3. 제2항의 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환체(수탁번호: KACC 95034P).
  4. 제3항의 형질전환체로 형질전환된 벼(Oryza sativa) 형질전환체.
  5. 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조방법:
    1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1로 이루어지는 벼 유래 OsCK1 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
    2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
    3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 아그로박테리움(Agrobacterium) 또는 벼 (Oryza sativa)인 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조방법.
KR1020050027204A 2005-03-31 2005-03-31 벼 유래 ＯｓＣＫ1 유전자, 이 유전자를 포함하는발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이형질전환체의 제조방법 KR100682129B1 (ko)

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Plant Mol Biol/2003년 8월/52(6)/1191-202쪽

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101491785B1 (ko) 2012-11-23 2015-02-13 대한민국 유전자변형 병저항성 벼 검정용 프라이머 및 이를 이용한 검정 방법

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