KR20000006119A

KR20000006119A - 도열병에대해내성이있는벼유전자

Info

Publication number: KR20000006119A
Application number: KR1019990021797A
Authority: KR
Inventors: 야노마시히로; 이와모토마사오; 가타요세유이치; 사사키다쿠지; 왕지-수앙; 야마노우치우타코; 이시마루리사
Original assignee: 카쯔라 나오끼; 농림수산성농업생물자원연구소장이 대표하는 일본국
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2000-01-25
Also published as: AU3499599A; CN1247229A; EP0969092B1; DE69921025D1; US6274789B1; JP3440258B2; JPH11346783A; EP0969092A1; CA2272599A1; DE69921025T2; AU753646B2

Abstract

본 발명은 도열병-내성 유전자(Pi-b), 이와 기능적으로 동등한 유전자 및 이 유전자에 의해 코드화된 단백질을 제공한다. 이 유전자는 도열병에 대한 내성이 있는 식물을 제조하는데 유용하고, 광범위한 벼 도열병균류에 대한 내성을 식물에 부여할 수 있다. 따라서 도열병을 억제하고, 작물 생산량을 증대시키는데 유용하다.

Description

도열병에 대해 내성이 있는 벼 유전자{Rice gene resistant to blast disease}

본 발명은 식물의 도열병에 대한 내성을 조절하는 유전자, 상기 유전자에 의해 코드화(encoding)된 단백질, 및 이들의 용도에 관한 것이다.

도열병은 벼 등의 식물에 있어 심각한 질병이며 벼 도열병균류, 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea)에 의해 발병한다. 이 병은 일본 및 다수의 다른 벼재배 국가의 쌀 생산량에 상당한 피해를 준다. 이러한 피해는 저온 및 높은 습도에서 특히 심각하다. 이 병은 농화학 물질의 적용뿐 아니라 내성이 있는 변종의 개량에 의해 회피되어 왔다. 본래, 이 병에 대해 내성이 있는 벼 균주가 있다. 이들 균주 및 변종은 도열병균류의 특정한 품종에 대해 내성이 있는 유전자를 가지고 있으며, 이들 유전자는 오랜 기간 동안 분석되어 왔다. 현재, 약 30개의 유전자가 도열병에 대해 내성이 있는 것으로 확인되고 있다(Kinoshita, Rice Genet. Newsl. 7:16-57(1990), Iwata, Rice Genet. Newsl. 13:12-35(1996), Iwata, Rice Genet. Newsl. 14:7-22(1997)). 이들 유전자는 매우 내성이 큰 변종을 개량하는데 사용되어왔으며, 그 결과 다수의 내성 변종들이 개량되어 왔다. 그러나, 도열병균류의 새로운 품종들이 출현함으로써, 도입된 내성 유전자들은 그 효과가 떨어지고 있다(내성 변종의 붕괴). 더욱이, 도열병 내성 발현의 분자 메카니즘 및 벼 도열병균류와 내성 유전자 간의 상호작용은 밝혀지지 않고 있다.

내성 유전자 Pi-b는 벼 염색체 2의 긴 팔(long arm)의 말단에 위치하고, 033b를 제외한 일본에서 확인된 도열병균류의 모든 품종에 대해 내성을 나타낸다(표 1).

R: 내성

S: 감응성

이 유전자는 인도네시아 및 말레이시아의 엥카텍(Engkatek), 밀렉쿠닝(Milek Kuning), 티나(Tjina) 및 타하자(Tjahaja) 등의 인디카(Indica) 변종에 내포되어있다. 일본에서는, Pi-b에 대한 균주 동형접합체(homozygous)이고 감응성 변종 Sasanishiki의 유전학적 배경을 갖고 있는 TohokuIL9가 미야기현 후루까와 농업 시험국에서 개량되었다.

그러나, 내성 발현 메카니즘은 밝혀지지 않았고, Pi-b유전자도 분리되지 않았다.

본 발명의 목적은 도열병에 대한 내성 유전자인 Pi-b, 기능적으로 동등한 유전자 및 그 유전자에 의해 코드화된 단백질을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 이 유전자를 사용하여 도열병에 대한 내성 식물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 큰 염색체 부위로부터 유전자 Pi-b를 분리하기 위해 지도를 기초로 한(map-based) 클로닝(cloning)을 사용하여 벼 도열병에 대한 내성 유전자를 분리하는데 성공하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 분자 표지를 사용하는 연쇄분석(linkage analysis)을 실시하였다. 먼저, Pi-b 좌위(locus)를 특정 표지 사이에 있는 염색체 부위에 할당하였다. 다음, 할당된 부위 부근에 코스미드 클론을 배열함으로써 물리적 지도(physical map)를 제작하였다. 이후, 클론의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 몇몇 식물의 내성 유전자에서 공통적으로 발견되는 뉴클레오티드 결합 위치(NBS)를 함유하고 있는 Pi-b 후보 유전자의 부위를 찾았다. 이후, 도열병에 내성이 있는 변종으로부터 cDNA 라이브러리를 작성하였다. 이 라이브러리는 탐침(probe)으로서 상기 후보 게놈 부위를 사용하여 선별하였으며, 상기 게놈 부위에 상응하는 cDNA를 분리하였다. 분리한 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)를 사용하여, 도열병에 대해 감응적이고 내성이 있는 변종으로부터 제조된 각 mRNA 절편에 대해 RT-PCR을 실시하여 분리된 Pi-b 후보 cDNA의 발현 패턴을 분석하였다. 내성 변종에서 cDNA를선택적으로 증폭하였다. 그 결과, 본 발명자들은 분리된 cDNA 클론이 Pi-b 유전자임을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 분리된 유전자와 도열병에 대한 내성 사이에는 밀접한 관계가 있기 때문에, 분리된 유전자 또는 이와 상동인 유전자를 사용하여 도열병에 내성이 있는 식물을 제조할 수 있다는 것을 발견하였다.

도 1은 조-스케일(crude-scale) 연쇄분석에 의한 Pi-b 좌위의 예상 부위를 개략적으로 도시한 도면이다.

도 2는 정밀-스케일(fine-scale) 연쇄분석에 의한 Pi-b 좌위의 예상 부위를 개략적으로 도시한 도면이다.

도 3은 도열병에 감응적이고 내성이 있는 변종에서 Pi-b 후보 cDNA의 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타내는 전기영동 패턴의 사진이다. A에서, cDNA 클론 c23의 제2 인트론(intron)을 포함하는 프라이머(primer)가 사용된다. B에서, 부위 c23에 인접한 NBS를 함유하는 4.6kb 절편에 특정적인 프라이머가 사용된다. 사용된 주형은 레인 1,2에서 Sasanishiki 및 TohokuIL9의 게놈 DNA; 각 레인 3,4에서 TohokuIL9으로부터 유래하는 코스미드 클론 #40 및 #147; 레인 5에서 TohokuIL9의 cDNA c23을 함유하는 플라스미드 DNA; 레인 6에서 TohokuIL9의 미처리 잎으로부터 제조된 mRNA(2000ng; 하기 mRNA에 대해 동일한 양이 사용된다); 레인 7,8,9에서 각각 벼 도열병균류로 접종한 후 12시간, 24시간, 또는 4일이 지난후 TohokuIL9의 잎으로부터 제조된 mRNA; 레인 10에서 Sasanishiki의 미처리 잎으로부터 제조된 mRNA; 레인 10,11에서 각각 균류로 접종한후 12시간 및 24시간이 지난후Sasanishiki 잎으로부터 제조된 mRNA; 레인 12에서 멸균 처리된 물로 이루어져 있다. 크기 표지는 상부로부터 1.4K, 1.0K, 0.9K 및 0.6K이다.

도 4는 Pi-b 유전자와 공지된 내성 유전자의 보존 부위를 비교한 도면이다.

본 발명은 벼 도열병 내성 유전자 Pi-b, 상동 유전자, 및 유전자에 의해 코드화된 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이 유전자를 사용함으로써 도열병에 내성이 있는 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 다음에 관한 것이다: (1) 식물에 도열병 내성을 부여하고, 서열번호: 1의 아미노산 서열, 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 첨가된 그의 변형 서열을 포함하는 단백질,

(2) 식물에 도열병 내성을 부여하고, 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA와 혼성화한 DNA로 코드화된 단백질,

(3) 단백질 (1) 또는 (2)를 코드화하는 DNA,

(4) DNA (3)을 포함하는 벡터,

(5) 벡터 (4)를 가지고 있는 숙주세포,

(6) 식물 세포인 숙주세포 (5),

(7) 숙주세포 (5)를 배양하는 것을 포함하는 단백질 (1) 또는 (2)의 제조 방법,

(8) 숙주세포 (6)를 포함하는 변형 식물,

(9) 포아세아애(Poaceae) 인 식물 (8),

(10) 피.오리자(P. oryza) 인 식물 (8),

(11) 도열병에 대한 내성을 나타내는 식물 (8), (9) 또는 (10) 중 어느 한 식물,

(12) 단백질 (1) 또는 (2)에 결합하는 항체, 및

(13) 15 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, DNA (3)에 특이적으로 혼성화하는 DNA.

본 발명은 도열병에 내성이 있는 표현형(phenotype)을 식물에 부여하는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 단백질에 포함된 "Pi-b" 유전자(이하, Pi-b 단백질이라 함)에 의해 코드화된 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 1에 나타나 있다. 도열병에 내성이 있는 표현형을 벼에 부여하는 단백질을 코드화하는 Pi-b 유전자는 벼 염색체 2의 부위내 어딘가에 위치해 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 그 좌위를 확인하고 단일 유전자로서 유전자를 분리하는데 최초로 성공하였다. Pi-b 단백질은 033b를 제외한 일본 벼 도열병균류의 모든 품종에 대한 내성을 벼에 부여한다. 이것은 지금까지 확인된 유전자 중에서 가장 광범위한 내성이다(표 1). 이러한 Pi-b 단백질의 특성은 Pi-b 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 단백질이 도열병에 내성이 있는 식물 변종을 제조하는데 매우 적합하다는 것을 의미한다.

예컨대 하기에 기재된 방법에 따라 Pi-b 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 제조할 수 있다. 돌연변이를 Pi-b 단백질의 아미노산 서열로 도입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 즉, 당업자는 부위-지정 돌연변이 유발성에 의해 Pi-b단백질의 아미노산 서열(서열번호: 1)을 변경(Kramer, W. 및 Fritz, H. -J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA, Methods in Enzymology. 154:350-367, (1987))하여 Pi-b 단백질과 기능적으로 동등한 돌연변이체 단백질을 제조할 수 있다. 아미노산의 돌연변이는 자연발생적으로 발생할 수 있다. 본 발명의 단백질은 하나 이상의 아미노산이 치환, 삭제 또는 첨가된 야생형(wild type) Pi-b 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및 야생형 Pi-b 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 포함한다. 변경된 단백질이 야생형 Pi-b 단백질과 기능적으로 동등하다면, 단백질내 변경된 아미노산 잔기의 부위 및 수는 한정되지 않는다. 통상 50 이하, 바람직하게는 30 이하, 보다 바람직하게는 10 이하, 가장 바람직하게는 3 이하의 변경된 아미노산 잔기가 있다. 본 명세서에 사용된 "야생형 Pi-b 단백질과 기능적으로 동등"이란 변경된 단백질이 식물에 도열병 내성을 부여한다는 것을 의미한다. 식물에 "도열병 내성을 부여"란 단백질이 하나 이상의 벼 도열병균류의 품종에 대한 내성을 하나 이상의 식물 변종에 부여한다는 것을 의미한다. 내성이 부여되는 식물은 바람직하게는 포아세아애(Poaceae), 보다 바람직하게는 포아세아애 오리자(Poaceae oryza)이다. 단백질이 도열병 내성을 식물에 부여하는가에 대한 여부는 예컨대 (i) 벼 도열병균류의 몇몇 품종에 의해 형성된 포자의 현탁액으로 직접 살포함으로써 어린 식물(예컨대 3 내지 4주의 벼 묘목)에 벼 도열병균류를 접종하고, (ii) 접종 직후 24시간 동안 25℃, 100% 습도에서 접종된 식물을 배양한 다음, 약 2주 동안 정상 조건하에서 배양하고, (iii) 과민성(hypersensitive) 반응 결과로서 특정 괴사에 의한 국소 손상의 확대가 정지할지(내성 유전자를 가지고 있는 식물) 또는 식물의 괴사를 유발하는 국소 손상이 계속 확대될지(내성 유전자가 없는 식물)를 관찰함으로써 판단할 수 있다.

또한, 혼성화 기술(southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503(1975)) 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술(Saiki, R.K 등., Science 230:1350-1354, (1985); Saiki, R.K. 등., Science 239:487-491, (1988))은 기능적으로 동등한 단백질을 제조하는 다른 방법으로서 당업자에게 공지되어 있다. 즉, 당업자는 통상적으로 탐침으로서 Pi-b 유전자의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 2 또는 서열번호: 4) 또는 그 일부를 사용하거나, 또는 Pi-b 유전자(서열번호: 2 또는 서열번호: 4)로 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, 벼 또는 다른 식물의 Pi-b 유전자와 매우 상동인 DNA를 분리하여 상기 DNA의 Pi-b 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 얻을 수 있다. 본 발명의 단백질은 혼성화 기술 또는 PCR 기술에 의해 분리되는 Pi-b 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "Pi-b 단백질과 기능적으로 동등함"이란 혼성화 기술 또는 PCR 기술에 의해 분리된 단백질이 도열병에 대한 내성을 식물에 부여한다는 것을 의미한다. 상기 기술에 유전자를 분리하기 위해 사용되는 식물은 벼 이외에, 보리(Hordeum), 밀(Triticum), 조(Setaria), 기장(Panicum), 에키노클로아(Echinochloa), 및 율무(Coix) 등의 도열병균류의 숙주가 될 수 있는 작물을 포함한다(Crop Disease Encyclopedia, (1988), Kishi, K. ed. Japan Agriculture Education Association). 일반적으로, 분리된 유전자에 의해 코드화된 단백질이 Pi-b 단백질과 기능적으로 동등하다면, 아미노산 수준에서 Pi-b 단백질에 대해 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 의미한다.

본 발명의 단백질은 재조합 DNA 기술로 당업자에게 공지된 방법을 사용하는 재조합 단백질으로서, 또는 천연 단백질으로서 제조될 수 있다. 예컨대, 재조합 단백질은 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA를 적절한 발현 벡터로 삽입하고, 상기 벡터를 적절한 세포로 도입한 다음, 상기 변형 세포로부터 단백질을 정제함으로써 제조될 수 있다. 천연 단백질은 예컨대 본 발명의 단백질을 발현하는 세포(예컨대 벼 세포) 추출물을 재조합 단백질 또는 그 일부로 적절한 면역 동물을 면역화함으로써 제조된 항체로 충전시킨 친화성 칼럼에 노출시키고, 결합된 단백질을 상기 칼럼으로부터 정제함으로써 제조될 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA에 관한 것이다. DNA가 본 발명의 단백질을 코드화하는 한, 본 발명의 DNA는 한정되지 않으며 게놈 DNA, cDNA 및 화학적으로 합성된 DNA를 포함한다. 본 발명의 Pi-b cDNA 및 Pi-b 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호: 2 및 서열번호: 4에 나타나 있다.

당업자는 표준 방법을 사용하여 게놈 DNA 또는 cDNA를 제조할 수 있다. 예컨대, 게놈 DNA는 2개의 공정으로 제조될 수 있다. 먼저, 도열병에 대한 내성 유전자를 가지고 있는 벼 변종(예컨대 TohokuIL9)의 잎으로부터 추출된 게놈 DNA를 사용하여 게놈 라이브러리(플라스미드, 파아지, 코스미드, 또는 BAC 등의 벡터를 사용한다)를 작성한다. 두번째로, 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA의 뉴클레오티드 서열(예컨대 서열번호: 1 또는 서열번호: 2)을 기초로 하여 제조된 탐침을 사용하여 스프레드 라이브러리상에 군체(colony) 혼성화 또는 플라크(plaque) 혼성화를 실시한다. 이와 다르게, 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA(서열번호: 1 또는 서열번호: 2)에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR을 실시함으로써 게놈 DNA를 제조할 수 있다. 또한 cDNA는 예컨대 도열병에 대한 내성 유전자를 가지고 있는 벼 변종(예컨대 TohokuIL9)의 잎으로부터 추출된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, cDNA를 λZAP 등의 벡터로 삽입하여 cDNA 라이브러리를 작성하고, 스프레드 라이브러리상에서 군체 혼성화 또는 플라크 혼성화를 실시함으로써 제조되거나, 또는 상술한 바와 같이 PCR을 실시함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 DNA는 재조합 단백질을 제조하거나 또는 도열병에 대한 내성이 있는 변형 식물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 단백질은 통상 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA를 적절한 발현 벡터로 삽입하고, 상기 벡터를 적절한 세포로 도입하고, 변형된 세포를 배양하고, 발현된 단백질을 정제함으로써 제조된다. 재조합 단백질은 쉽게 정제될 수 있도록 다른 단백질과의 융합 단백질로서, 예컨대 대장균(Escherichia coli)에서 말토오스 결합성 단백질과의 융합 단백질(New England Biolabs, 미국, 벡터 pMAL 시리즈), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질(Amersham Pharmacia Biotech, 벡터 pGEX 시리즈), 또는 히스티딘으로 표지(tag)된 것(Novagen, pET 시리즈)으로서 발현될 수 있다. 세포가 재조합 단백질을 발현하는데 적합하면, 숙주세포는 제한이 없다. 상술한 대장균(E.coli)이외에도, 효모 또는 다수의 동물, 식물, 또는 곤충 세포를 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 숙주세포로 벡터를 도입할 수 있다. 예컨대, 칼슘 이온을 사용하는 변형법(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 53:158-162, (1970); Hanahan, D.,J. Mol. Biol. 166:557-580, (1983))을 사용하여 벡터를 대장균에 도입할 수 있다. 숙주세포에서 발현된 재조합 단백질은 공지 방법에 의해 정제할 수 있다. 재조합 단백질이 말토오스 결합성 단백질 또는 다른 것과의 융합 단백질로서 발현되면, 이 재조합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 쉽게 정제될 수 있다.

본 발명의 DNA를 사용하여 도열병에 대한 내성이 있는 변형 식물을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA를 적절한 벡터로 삽입하고, 이 벡터를 식물 세포로 도입하고, 생성된 변형 식물 세포를 재생한다. 벡터가 식물 세포에서 삽입된 유전자를 발현시킬 수 있다면, 벡터는 그 제한이 없다. 예컨대, 식물 세포에서 구성 유전자(constitutive gene)를 발현시키기 위한 프로모터(예컨대 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터 등)를 함유하는 벡터, 또는 외부 자극에 의해 유도될 수 있는 프로모터를 사용할 수 있다. 벡터에 의해 감염되는 식물 세포는 한정되지 않지만, 포아세아애(Poaceae) 세포가 바람직하다. 벼 이외에, 세포의 예는 보리, 밀, 조, 기장, 에키노클로아 및 율무를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "식물 세포"란 배양된 세포 현탁액, 원형질체(protoplast), 엽 부위 및 유합조직(callus) 등의 다양한 형태의 식물 세포를 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 방법, 일렉트로포레이션(electroporation), 애그로박테리움 매개 전이, 및 입자 충격(particle bombardment) 등의 공지 방법에 의해 벡터를 식물 세포로 도입할 수 있다. 공지 방법에 의한 식물 세포의 유형에 따라 변형 식물 세포로부터 식물을 재생할 수 있다(Toki 등., (1995) , Plant Physiol. 100:1503-1507).

또한, 본 발명은 본 발명의 단백질에 결합한 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 다중클론성 항체이거나 또는 단일클론성 항체일 수 있다. 다중클론성 항체는 토끼 등의 면역 동물을 본 발명에 따라 정제된 단백질 또는 그 일부로 면역화시키고, 소정의 기간후에 채혈하고, 응혈을 제거함으로써 제조될 수 있다. 단일클론성 항체는 골수종(myeloma)세포와 상기 단백질 또는 그 일부로 면역화된 동물의 항체-형성 세포를 융합하고, 원하는 항체(히브리도마)를 발현하는 단일클론성 세포를 분리하고, 상기 세포로부터 항체를 회수함으로써 제조될 수 있다. 얻어진 항체는 본 발명의 단백질을 정제하거나 또는 검출하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA로 특이적으로 혼성화되고, 15 이상의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 DNA에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "특이적으로 혼성화함"이란 DNA가 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA와 혼성화하지만, 표준 혼성화 조건, 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건에서 다른 단백질을 코드화하는 DNA와는 혼성화하지 않는 것을 의미한다. DNA는 예컨대 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA를 검출하거나 또는 분리하는 탐침으로서, 또는 PCR 증폭용 프라이머로서 사용될 수 있다. 그 일례로서 서열번호: 2 또는 서열번호: 4의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 15 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 DNA가 있다.

본 발명은 도열병 내성 유전자 Pi-b, 이들과 기능적으로 동등한 유전자, 및 이 유전자에 의해 코드화된 단백질을 제공한다. 본 발명의 도열병 내성 유전자는 광범위한 벼 도열병균류에 대한 내성을 식물에 부여할 수 있다. 따라서, 예컨대 벼와 같은 수익성 작물로 도입되면, 이 유전자는 도열병을 억제하고 작물 생산량을 증대시키는데 크게 공헌할 수 있을 것이다.

이하 실시예를 참조로 하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예 1

조-스케일 연쇄분석

벼 염색체 2의 연쇄지도상에 Pi-b 유전자의 대략적인 부위을 확인하기 위해, 먼저 DNA 표지를 사용하는 연쇄분석을 실시하였다. 사용된 재료는 Sasanishiki와 TohokuIL9간의 교배로부터 생긴 F1 후대와 Sasanishiki와의 2번의 역교배로부터 유도된 F1 후대의 자가수정으로부터 생긴 94개 식물의 분리 집단이었다. 이 연쇄분석에 따르면, Pi-b 유전자는 염색체 2에서 RFLP 표지 C2882 및 C379 사이에 위치하고, R1792, R257 및 R2821과 함께 공-분리된다(Japanese Society of Breeding, 87차 회의, 도 1).

실시예 2

정밀-스케일 연쇄분석

큰 분리 집단을 분석하여 유전자를 분리하였다. 상기 94개 식물 집단으로부터, Pi-b 좌위에 대해 혼성을 형성하는 20개 식물을 선택하고, 자가수정 종자를 포함하는 약 20,000개 종자의 분리 집단을 분석용으로 사용하였다(Japanese Society of Breeding, 89차 회의). 분석시, 일을 최소화하기 위해 합동 표본추출법(poolsampling method)을 사용하였다(Churchill 등., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 90:16-20(1993)).

연쇄분석의 정확성을 증가시키기 위해, 표적 유전자 부근에 DNA 표지 수를 증가시키고, 표본 집단을 크게하는 것이 필요하다. 따라서, 조-연쇄분석에 의해 결정된 Pi-b 좌위를 내포하는 YAC 클론을 서브클로닝(subcloning)시켜 Pi-b 유전자 부근의 DNA 표지 수를 증가시켰다(Monna 등., Theor. Appl. Genet. 94: 170-176(1997)). 큰 집단을 사용하는 연쇄분석을 실시으로써 RFLP 표지 S1916과 G7030 사이의 부위로 Pi-b 좌위가 좁혀졌다. 또한, Pi-b 유전자는 3개의 RFLP 표지로 공-분리하였다(G7010, G7021 및 G7023; 도 2).

실시예 3

코스미드 클론을 사용하는 Pi-b 좌위의 배열

Pi-b 좌위를 더 좁히기위해, 배열용으로 코스미드 클론을 사용하였다. CTAB 법으로 내성 유전자를 가지고 있는 TohokuIL9로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 다음, 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) Sau3A로 DNA를 부분 분해하였다. 분해 생성물로부터, 약 30 내지 50kb의 절편을 수크로오스 밀도구배 원심분리법에 의해 분류하였다. 생성된 DNA 절편 및 코스미드 벡터 SuperCos(Stratagene, Wahl 등., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 84:2160-2164(1987))을 사용하여 코스미드 라이브러리를 작성하였다. 탐침으로서 Pi-b 좌위 부근의 5개 DNA 클론(S1916, G7010, G7021, G7023 및 G7030)을 사용하여 코스미드 라이브러리를 선별하였다. 그 결과, 6개의 코스미드 클론(COS140, COS147, COS117, COS137, COS205 및 COS207)이선택되었다. 이들 클론의 제한지도의 작성 및 이들의 겹침 부위의 검사를 통해 Pi-b 좌위가 3개의 클론(COS140, COS147, 및 COS117; 도 2)에 의해 덮혀진 게놈 부위에 있다는 것을 알았다.

실시예 4

서열분석에 의한 후보 게놈 부위의 결정

Pi-b 유전자를 함유하는 것으로 추측되는 3개의 배열된 코스미드 클론을 서브클로닝시키고, 이들의 뉴클레오티드 서열을 부분적으로 분석하였다. 얻어진 뉴클레오티드 서열을 공개된 뉴클레오티드 데이타베이스상에서 도열병 상동성 조사를 통해 분석하였다. 그 결과, COS140으로부터 얻은 2.3kb의 부분 뉴클레오티드 서열 및 COS147로부터 얻은 4.6kb 클론이 아라비도프시스(Arabidopsis)의 RPM1 병 내성 유전자와 같은 몇몇 식물의 내성 유전자에서 공통적으로 발견되는 뉴클레오티드 결합 부위(NBS)를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 뉴클레오티드 서열은 Pi-b 유전자에 대한 후보 부위인 것으로 예상되었다.

실시예 5

cDNA의 분리 및 서열 분석

cDNA를 분리하여 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 밝혀진 후보 부위가 내성 변종 TohokuIL9에서 발현되는지를 검사하였다. 내성 변종 TohokuIL9를 뿌리고, 4-엽 단계의 묘목을 표준 방법에 따라 벼 도열병균류 TH68-141(품종 003)으로 접종하였다. 다음, 접종후 3개의 시점, 6시간, 12시간 및 24시간이 지난후 잎을 수집하였다. 전령 RNA을 표본으로부터 추출하고 cDNA 라이브러리를 작성하였다. 후보 게놈부위의 2.3kb 절편을 더 서브클로닝하여 얻은 1kb 절편(서열번호: 4에서 위치 3471 내지 4507)을 라이브러리를 선별하기 위한 탐침으로서 사용하였다. 그 결과, 8개의 cDNA 클론이 선택되었다. 클론의 서열분석을 통해 c23 뉴클레오티드 서열은 코스미드 클론 COS140과 완전히 일치한다는 것을 알았다. 따라서, 후보 게놈 부위가 TohokuIL9에서 발현되는 것으로 확인되었다. 선택된 c23 클론은 약 4kb이고 거의 모든 유전자 부위을 함유하는 것으로 추정된다. 이 클론의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정하였다(서열번호: 2).

실시예 6

후보 cDNA 발현 패턴 분석

후보 cDNA 부위의 발현 패턴 차이는 감응성 변종(Sasanishiki) 및 내성 변종(TohokuIL9)에서 나타났다. 상기 2 변종을 4-엽 단계에서 벼 도열병균류의 품종 003으로 접종하고, 접종후 6시간, 12시간 및 24시간이 지난후 잎을 수집하였다. 이후, mRNA를 추출하고 RT-PCR에 대한 주형(template)으로서 사용하였다. cDNA 클론 c23의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하는 프라이머 서열번호: 5/5'-AGGGAAAAATGGAAATGTGC-3'(안티센스, antisense) 및 서열번호: 6/5'-AGTAACCTTCTGCTGCCCAA-3'(센스)를 RT-PCR용으로 디자인하여 특이적으로 그 부위을 증폭시켰다. PCR을 94℃에서 2분 동안 1사이클; 94℃에서 1분, 55℃에서 2분 및 72℃에서 3분 동안 30사이클; 및 72℃에서 7분 동안 1사이클을 실시하였다. PCR을 실시한 후, 내성 변종 TohokuIL9에서 특이적인 증폭을 검출하였지만, mRNA를 사용하여 감응성 변종(Sasanishiki; 도 3)으로부터 어떠한 증폭도 검출되지 않았다. 이것은 cDNA 클론 c23이 내성 변종에서 특이적으로 발현됨을 의미한다. 또한, NBS를 함유하고 c23 부위에 인접한 4.6kb 절편의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하는 프라이머 서열번호: 7/5'-TTACCATCCCAGCAATCAGC-3'(센스) 및 서열번호: 8/5'-AGACACCCTGCCACACAACA-3'(안티센스)를 사용하여 RT-PCR을 실시하였다. 4.6kb 절편의 부위는 감응성 변종(Sasanishiki) 또는 내성 변종(TohokuIL9; 도 3)에서 증폭되지 않았다. 이는 클론 c23에 상응하는 게놈 부위가 Pi-b 좌위임을 강하게 시사한다.

실시예 7

Pi-b 후보 유전자의 게놈 DNA의 서열 분석

cDNA 클론 c23에 상응하는 게놈 부위의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 5개의 상이한 제한효소로 절단함으로써 코스미드 클론 COS140을 서브클로닝시키고, 생성된 서브클론의 뉴클레오티드 서열을 가능한 많이 양 말단으로부터 결정하였다. 상기 분석에 의해 알아낼 수 없는 부위을 삭제함으로써 보다 짧게 절단하고 DNA 서열검정(sequencing) 처리하였다. 결정된 부위는 10.3kb(서열번호: 4)로 연장되었다.

실시예 8

Pi-b 유전자의 구조

Pi-b 후보 cDNA c23은 전체적으로 3925개의 염기쌍이 있고, 2개의 인트론에 의해 분리된 3개의 엑손(exon)을 함유하는 3618개의 염기쌍의 ORF를 갖았다. Pi-b 번역된 생성물은 1205개의 아미노산 잔기를 갖는 단백질이고(서열번호: 1), 2개의NBS(아미노산 위치 386-395에서 P-루프 및 위치 474-484에서 키나아제 2) 및 다수의 내성 유전자에서 발견되는 3개의 보존 부위(아미노산 위치 503-512에서 도메인 1, 위치 572-583에서 도메인 2, 및 위치 631-638에서 도메인 3)을 갖았다. 이들 도메인은 RPM1 등의 공지된 내성 유전자의 보존 영역과 큰 상동성을 보였다(도 4). 또한, 이 유전자는 3'쪽에서 12개의 불완전하고 로이신이 풍부한 반복구조(아미노산 위치 755-1058에서 LRR)를 갖았다. 이들 구조는 이전에 보고된 NBS-LRR류의 내성 유전자와 매우 높은 상동성을 보였다. 상술한 결과를 기초로 하여, 본 발명자들은 분석된 cDNA 및 이에 상응하는 게놈 부위는 벼 도열병 내성 유전자 Pi-b라고 결론을 내렸다.

Claims

식물에 도열병 내성을 부여하고, 서열번호: 1의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 첨가된 그의 변형 서열을 포함하는 단백질.
식물에 도열병 내성을 부여하고, 서열번호: 2 및/또는 서열번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA와 혼성화한 DNA로 코드화된 단백질.
제1항 또는 제2항에 따른 단백질을 코드화하는 DNA.
제3항에 따른 DNA를 포함하는 벡터.
제4항에 따른 벡터를 가지고 있는 숙주세포.
제5항에 있어서, 상기 숙주세포가 식물 세포인 숙주세포
제5항에 따른 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 단백질의 제조 방법.
제6항에 따른 숙주세포를 포함하는 변형 식물.
제8항에 있어서, 상기 식물이 포아세아애(Poaceae)인 식물.
제8항에 있어서, 상기 식물이 피.오리자(P.oryza)인 식물.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 도열병에 대한 내성을 나타내는 식물.
제1항 또는 제2항에 따른 단백질에 결합하는 항체.
15 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 제3항에 따른 DNA로 특이적으로 혼성화하는 DNA.