WO2023200023A1 - 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물 및 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법 - Google Patents

벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물 및 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법 Download PDF

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oryzae
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첸야페이
왕주안
진중현
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세종대학교산학협력단
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for promoting or improving resistance to rice blast disease, comprising a rice susceptibility gene and a corresponding gene deletion or inhibitor.
  • Blast disease caused by the fungus Magnaporthe oryzae , is the most destructive rice disease, causing a loss of 10-30% of rice production worldwide every year. After the blast fungus begins to infect rice leaves by appressoria differentiation and conidia germination at the apex of the germ tube, narrow penetrating tubes (penetrating pegs) invade the cytoplasmic membrane during the biotrophic stage. Differentiates into hyphae. Blast fungus, a semi-active parasitic pathogen, does not initially kill plant cells, but kills plants in the late stage of infection through continued growth of infected hyphae, and blast lesions are generally visible within 7 days of infection.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for promoting or improving resistance to rice blast disease.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for promoting or improving resistance to rice blast disease.
  • the purpose of the present invention is to provide rice with enhanced or improved rice blast resistance.
  • NLP Nodule inception-like protein
  • the expression defect or inhibitor is EMS (ethyl methanesulfonate), DMS (dimethyl sulfate), T-DNA (transfer-DNA), siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), and miRNA (A composition for promoting or improving resistance to rice blast disease, which is microRNA), ribozyme, PNA (peptide nucleic acids) or CRISPR/Cas9 nuclease (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated sequences9 nuclease).
  • a method of promoting or improving rice blast resistance comprising the step of deleting or inhibiting NLP (Nodule inception-like protein) gene expression in Poaceae plants.
  • NLP Nodule inception-like protein
  • NLP gene is the OsNLP2 (Oryza sativa nodule inception-like protein 2) gene.
  • the expression defect or inhibition is EMS (ethyl methanesulfonate), DMS (dimethyl sulfate), T-DNA (transfer-DNA), siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), and miRNA ( Enhancement or improvement of rice blast resistance, which is performed by introducing microRNA), ribozyme, PNA (peptide nucleic acids), or CRISPR/Cas9 nuclease (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated sequences9 nuclease) into the plant. method.
  • the NLP gene is OsNLP2 (Oryza sativa nodule inception-like protein 2) gene, rice with enhanced or improved blast resistance.
  • the expression defect or inhibition is EMS (ethyl methanesulfonate), DMS (dimethyl sulfate), T-DNA (transfer-DNA), siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), and miRNA ( Enhancement or improvement of blast resistance performed by introducing microRNA), ribozyme, PNA (peptide nucleic acids) or CRISPR/Cas9 nuclease (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated sequences9 nuclease) into plants. grown rice.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • DMS dimethyl sulfate
  • T-DNA transfer-DNA
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA Enhancement or improvement of blast resistance performed by introducing microRNA
  • ribozyme PNA (peptide nucleic acids) or CRISPR/Cas9 nuclease (Clust
  • the present invention has the effect of enhancing or improving rice blast resistance by deleting or inhibiting the expression of the NLP gene, a susceptibility gene of rice.
  • Figure 1 shows the transcription level of OsNLP2 in leaf sheaths of Dongjin rice during M. oryzae P06-6 and 007 infection.
  • Figure 2A shows the domain of the OsNLP2 gene
  • Figure 2B shows the intracellular location of OsNLP2:GFP and one of the OsNLP2 functional domains truncated.
  • Figure 3 compares the phenotypes of Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant lines infected with M.oryzae P06-6.
  • Figure 4 compares the accumulation of ROS and iron ions (Fe 3+ ) and the degree of lipid peroxidation in leaf sheath cells of Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant during infection with M. oryzae P06-6.
  • Figure 5 confirms the accumulation of ROS and iron ions (Fe 3+ ) and inhibitory effects of HR cell death of deferoxamine (DFO) on ⁇ Osnlp2 leaf sheaths infected with M. oryzae P06-6.
  • Figure 6 confirms the effects of ferrostatin-1 on the accumulation of ROS and iron ions (Fe 3+ ), lipid peroxidation, and HR cell death inhibition on ⁇ Osnlp2 leaf sheaths infected with M. oryzae P06-6.
  • Figure 7 confirms the accumulation of ROS and iron ions (Fe 3+ ) and inhibitory effects of HR cell death of cytochalasin A (Cyt A) on ⁇ Osnlp2 leaf sheaths infected with M. oryzae P06-6.
  • Figure 8 confirms the accumulation of ROS and iron ions (Fe 3+ ) and inhibitory effects of HR cell death of DPI on ⁇ Osnlp2 leaf sheaths infected with M. oryzae P06-6.
  • Figure 9 shows real-time qRT-PCR analysis of defense-related gene expression over time in leaf sheaths of Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant (#4-2) plants infected with M. oryzae P06-6.
  • Figure 10 compares the infection response of Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant strains to various M. oryzae strains KI215, KJ401, 70-15, Y34, and RO1-1.
  • Figures 11a to 11d show the amino acid sequence alignment of the GAF-like domain, RWP-RK domain, and PB1 domain of rice NLP family proteins with other plant NLP proteins.
  • Figure 12 shows the phylogenetic tree of other plant NLP proteins and rice NLP family proteins.
  • Figure 13A is a schematic diagram of the ⁇ Osnlp2 mutant
  • Figure 13B is the genotyping result of the ⁇ Osnlp2 mutant
  • Figure 13C is the RT-PCR and real-time qRT-PCR analysis results of OsNLP2 expression in Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant.
  • Figure 14 shows that when OsNLP2 and the PB1 and RWP-RK-PB1 domains were transiently expressed in N.benthamiana leaves using Agrobacterium, they did not cause apoptosis in cells in N.benthamiana leaves.
  • Figure 15 shows ROS accumulation in Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant cells at different time points after inoculation with M.oryzae P06-6.
  • Figure 16 shows real-time qRT-PCR analysis of defense-related gene expression over time in leaf sheaths of Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant plants infected with M. oryzae P06-6 and 007.
  • Figure 17 shows a complementation vector for restoring the wild-type OsNLP2 gene to ⁇ Osnlp2 rice.
  • Figure 18a shows the production process of plants with restored Osnlp2 genes
  • Figure 18b shows wild-type rice (DJ), ⁇ Osnlp2 rice (#6-4), and plants with restored Osnlp2 genes (Complementation No. 3, No. 11, No. 12), the expression of the Osnlp2 gene was confirmed
  • the present invention relates to a composition for promoting or improving resistance to rice blast disease, comprising a defect or inhibitor of NLP (Nodule inception-like protein) gene expression in plants of the Poaceae family.
  • NLP Nodule inception-like protein
  • composition of the present invention inhibits the invasion of pathogens into leaves by deleting or inhibiting the NLP gene, thereby suppressing the invasion of pathogens regardless of the type of blast strain (race-nonspecific), and thus is effective against various strains (broad-spectrum). may exhibit resistance to
  • the NLP gene targeted for deletion or inhibition may be a gene present in the target Poaceae plant.
  • the target plant is rice (Oryza sativa)
  • it may be the NLP2 (nodule inception protein-like protein 2) gene. This may, for example, consist of the sequence of SEQ ID NO: 26, but is not limited thereto.
  • expression deletion or inhibition means inhibiting (reducing the expression level) or completely eliminating the expression of the gene (DNA or mRNA) or protein, and “completely eliminating” means that the expression of the gene (DNA or mRNA) or protein is reduced. This includes becoming undetectable or existing at a meaningless level.
  • NLP gene expression defect or inhibitor is any substance that can defect or inhibit the expression of the NLP gene and is not limited to the type or type of substance, for example, EMS (ethyl methanesulfonate), DMS (dimethyl sulfate), T-DNA (transfer-DNA), small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), microRNA (miRNA), ribozyme, peptide nucleic acids (PNA), or CRISPR/Cas9 nuclease.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • DMS dimethyl sulfate
  • T-DNA transfer-DNA
  • small interfering RNA small interfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA microRNA
  • PNA peptide nucleic acids
  • CRISPR/Cas9 nuclease CRISPR/Cas9 nuclease.
  • the substances exemplified above are those that cause modifications in the nucleic acid sequence of the NLP gene or changes in gene expression by chemical methods (e.g., EMS, DMS, etc.), or are designed to match the NLP gene sequence of the target plant and affect the expression of the gene. It may be something that can inhibit or cause defects.
  • the present invention relates to a method for promoting or improving resistance to rice blast disease, including the step of deleting or inhibiting NLP (Nodule inception-like protein) gene expression in Poaceae plants.
  • NLP Nodule inception-like protein
  • the NLP gene targeted for deletion or inhibition may be a gene present in the target Poaceae plant.
  • the target plant is rice (Oryza sativa)
  • it may be the NLP2 (nodule inception-like protein 2) gene. This may, for example, consist of the sequence of SEQ ID NO: 26, but is not limited thereto.
  • Deletion or inhibition of expression of the NLP gene can be performed by methods known in the art, for example, ethyl methanesulfonate (EMS), dimethyl sulfate (DMS), transfer-DNA (T-DNA), small interfering RNA (siRNA) ), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme, PNA (peptide nucleic acids) or CRISPR/Cas9 nuclease (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated sequences9 nuclease) to plants. It can be implemented by introducing EMS, dimethyl sulfate (DMS), transfer-DNA (T-DNA), small interfering RNA (siRNA) ), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme, PNA (peptide nucleic acids) or CRISPR/Cas9 nuclease (Clustered Regularly Interspaced Short Palindro
  • the above-mentioned substances are designed to cause modifications in the nucleic acid sequence of the NLP gene or changes in gene expression by chemical methods (e.g., EMS, DMS, etc.), or are designed to match the NLP gene sequence of the target plant and cause changes in the gene's expression. It may be something that can inhibit or cause a defect in expression.
  • the present invention relates to rice with enhanced or improved blast resistance in which NLP (Nodule inception-like protein) gene expression is defective or inhibited.
  • NLP Nodule inception-like protein
  • the NLP gene to be deleted or inhibited may be a gene present in rice.
  • the NLP gene may be, for example, the NLP2 (nodule inception-like protein 2) gene of rice (Oryza sativa). This may, for example, consist of the sequence of SEQ ID NO: 26, but is not limited thereto.
  • Deletion or inhibition of expression of the NLP gene can be performed by methods known in the art, for example, ethyl methanesulfonate (EMS), dimethyl sulfate (DMS), transfer-DNA (T-DNA), small interfering RNA (siRNA) ), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme, PNA (peptide nucleic acids) or CRISPR/Cas9 nuclease (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated sequences9 nuclease) to plants. It may have been implemented by introducing it.
  • the above-mentioned substances are designed to cause modifications in the nucleic acid sequence of the NLP gene or changes in gene expression by chemical methods (e.g., EMS, DMS, etc.), or are designed to match the NLP gene sequence of the target plant and cause changes in the gene's expression. It may be something that can inhibit or cause a defect in expression.
  • the bacterial strains that cause rice blast disease are different for each rice variety.
  • Rice plants in which the expression of the NLP gene of the present invention is defective or inhibited show resistance regardless of the type of blast strain (race-nonspecific). Therefore, the rice of the present invention can have increased or improved resistance to blast disease caused by various strains (broad-spectrum) regardless of the rice variety.
  • the rice variety may be, for example, japonica rice or indica rice, but is not limited thereto.
  • Rice is meant to include not only mature plants, but also plant cells, plant tissues, callus derived from plant cells or tissues, and plant seeds that can develop into mature plants.
  • Seeds of the rice ( Oryza sativa L. ) cultivar Dongjin (DJ) were provided by the National Institute of Crop Science, Jeonju, Korea.
  • ⁇ Osnlp2 knock-out (KO) mutant seeds were obtained from the Rice Functional Genomic Express Database (RiceGE) managed by the Salk Institute.
  • Rice seeds were germinated in water at 28°C for 5 days under continuous light conditions (80 ⁇ mol photons m -2 sec -1 ). Germinated rice seeds were planted in pots (12 cm in diameter, 11 cm in height) with Baroker soil (Seoul Bio, Seoul, Korea).
  • Rice is grown in a growth chamber under photoperiod conditions of 28°C, 60% humidity, white fluorescent light (150 ⁇ mol photons m -2 sec -1 ), and 16-hour light/8-hour dark conditions (16-h day/8-h night). was grown in
  • Nicotiana benthamiana seeds were germinated in water for 7 days under light conditions at 25°C. Germinated seedlings were planted in pots (8 cm in diameter, 6 cm in height) with Baroker soil (Seoul Bio, Seoul, Korea). N. benthamiana plants were grown in a growth chamber at 25°C, under a white fluorescent light (150 ⁇ mol photons m -2 sec -1 ), and under a photoperiod of 16 hours of light/8 hours of darkness (16-h day/8-h night). It was grown.
  • T-DNA insertion ⁇ Osnlp2 Mutant seeds were sterilized with 100% ethanol for 1 min, then seed coats were removed and sterilized with 50% Clorox for 30 min. Sterilized seeds were cultured in half Murashige and Skoog (MS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) medium under continuous light conditions at 25°C for 2 weeks. Fresh rice leaves were collected from each single plant and genomic DNA for genotyping was extracted. Genomic DNA was extracted using the CTAB (cetyl trimethylammonium bromide) method.
  • CTAB cetyl trimethylammonium bromide
  • RNA from homozygous plants was extracted using Trizol reagent (Invitrogen).
  • OsNLP2 RT primer (Forward: 5'-GCATCAAGCCACCCTACCTT-3' (SEQ ID NO. 4); Reverse: -5'TCACGATTCGCGACCCTATG-3' (SEQ ID NO. 5)) is used for RT-PCR and Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Real -time qRT-PCR) was used to analyze Osnlp2 transcript levels in Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant lines.
  • M. oryzae ( Magnaporthe oryzae ) strains PO6-6, KI215, KJ401, 70-15, Y34, RO1-1 and 007 was obtained from the Center for Fungal Genetic Resources, Seoul National University, Seoul, Korea.
  • M.oryzae PO6-6, KI215, KJ401, 70-15, Y34 and RO1-1 are toxic to Dongjin rice, but M.oryzae 007 is not toxic to Dongjin rice.
  • M. oryzae strains were stored at -20°C and cultured on rice bran agar medium (20 g rice bran, 20 g sucrose, and 20 g agar) under dark conditions at 25°C for 14 days.
  • Sporulation of M.oryzae culture was induced by culturing the culture plate for 3 days under continuous fluorescent light (80 ⁇ mol photons m -2 sec -1 ). Conidial suspensions of 0.025% (v/v) Tween 20 were adjusted to appropriate conidial concentrations.
  • M. oryzae conidia suspension (1.0 x 10 5 conidia ⁇ ml -1 ) was sprayed uniformly on the leaves of 3-week-old seedlings.
  • the inoculated rice plants were cultured at 25°C in dark and humid conditions for 24 hours and then placed under normal conditions (16h day/8h night). Five days after inoculation, disease symptoms on rice leaves were monitored.
  • rice leaf sheaths (5 cm in length) cut at the 6-week-old seedling stage were inoculated with M. oryzae conidia suspension (5.0 x 10 5 conidia ⁇ ml -1 ).
  • the inoculated rice leaf sheaths were cultured under dark conditions in a humid chamber for 2 days.
  • the epidermal layer was excised from the rice mulch and monitored under a fluorescence microscope (Zeiss equipped with Axioplan 2; Campbell, CA, USA).
  • the observed infected epidermal cells include extended infection (invasive hyphae colonized inside multiple cells), single cell infection (limited hyphal growth inside a single cell), and hypersensitivity reaction ( HR (hypersensitive response) cell death was classified into three infection types. Counting of cells infected with each infection type was performed in four replicates per one of three independent experiments.
  • entry clones were recombined into the Gateway green fluorescent protein (GFP)-containing vector pGWB552 using Gateway LR Clonase II enzyme (Invitrogen). .
  • GFP Gateway green fluorescent protein
  • OsNLP2 The coding sequence of OsNLP2 (LOC_Os04g41850) and the functional domain is the Gateway attB1 and attB2 sites (full OsNLP2 sequence Forward, 5'- AAAAAGCAGGCTTC ATGGATATGCCTACG-3' (SEQ ID NO: 6); full OsNLP2 sequence Reverse, 5'- AGAAAGCTGGGT TTATGAGCTATGTGC-3' ( SEQ ID NO: 7) RWP-RK-PB1 domain Forward, 5'- AAAAAGCAGGCTTC ATGAATATTAGCTTG-3' (SEQ ID NO: 8); PB1 domain Forward, 5'- AAAAAGCAGGCTTC ATGCTGACAGTTAAG-3' (SEQ ID NO: 9); It was amplified from a rice cDNA library using red primers. The gene-specific primers used were designed based on genome information provided by the Rice Genome Annotation Project.
  • OsNLP2 Ligation Independent Cloning
  • Their coding sequences are adapters (full OsNLP2 sequence Forward, 5'- CGACGACAAGACCCT ATGGATATGCCTACGCCA-3' (SEQ ID NO: 10); RWP-RK-PB1 domain Forward, 5'- CGACGACAAGACCCT ATGAATATTAGCTTGGAT-3' (SEQ ID NO: 11); PB1 domain Forward, 5'- CGACGACAAGACCCT ATGCTGACAGTTAAGGCA-3' (SEQ ID NO: 12); and full OsNLP2 sequence Reverse, 5'- GAGGAGAAGAGCCCT TTATGAGCTATGTGCCGC-3' (SEQ ID NO: 13). It was amplified from a rice cDNA library using primers. The amplified PCR product was subcloned into vector
  • OsNLP2 construct of OsNLP2 and its functional domains inside pGWB552:GFP were transformed into Agrobacterium GV3101. Empty vector pGWB552:GFP was also transformed as a negative control.
  • Transformed Agrobacteria with different constructs were cultured overnight at 28°C in Luria Bertani (LB) liquid medium containing 100 ⁇ g ml -1 spectinomycin.
  • the collected Agrobacterium cells were suspended in infiltration buffer [97.5 mg 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid sodium salt (MES), 0.5 ml of 1 M MgCl 2 , and 0.1 mM acetosyringone in 50 ml of water].
  • MES 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid sodium salt
  • Agrobacterium suspension was infiltrated into N. benthamiana leaves. After culturing for 2 days, the infiltrated leaves were stained with 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solution (1 ⁇ g ⁇ ml -1 ) in dark conditions for 10 minutes to visualize the nuclei of the cells.
  • Fluorescence microscope Zeiss equipped with Axioplan 2; Campbell) with green fluorescence (GF) filter (Ex/Em: 488 nm/505-550 nm wavelength) and DAPI filter (Ex/Em: 405/421-523 nm). , CA, USA) was used to observe epidermal cells.
  • Osnlp2 primers forward, 5′-ATGGATATGCCTACGCCATC-3′ (SEQ ID NO: 27); reverse, 5′-CTTGAGGTCCATTCTGGCACCCCA-3′ (SEQ ID NO: 2)
  • Bar gene primers forward, 5) ′-ACCACTACATCGAGACAAGCACGGTC-3′ (SEQ ID NO: 28); reverse, 5′-AAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGT-3′ (SEQ ID NO: 29) was used.
  • OsNLP2, OsPBZ1, OsWRKY104, OsRbohB, OsPIP-3A and OsWRKY90 was analyzed by real-time qRT-PCR using TOPreal TM qPCR 2X PreMIX (SYBR Green with low ROX, Enzynomics) with gene-specific primer sets.
  • the relative expression levels of the tested rice genes were determined by normalizing the expression level of rice OsUbiquitin, an internal control. Data correspond to the mean ⁇ SD of relative gene expression levels in leaf sheaths from three independent experiments.
  • the list of gene-specific primers used in this example is shown in Table 1 below.
  • CM-H 2 DCFDA chloromethyl-2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester
  • DAB dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester
  • the stained epidermal cells were analyzed under a fluorescence microscope (Zeiss equipped with Axioplan 2; Campbell, CA, USA).
  • the epidermal layer separated from the infected rice leaf sheath was cultured in 1 mg ml -1 DAB solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) at room temperature for 8 hours, and then incubated with a mixture of ethanol, acetic acid, and glycerol (3:1:1, v/v/v). The location of ROS inside epidermal cells was observed under a microscope.
  • ROS production in rice sheath cells after inoculation was measured by chemiluminescence assay.
  • the separated epidermal layer was cut into small pieces (0.5 cm) and soaked in Milli-Q water at 4°C for 5 minutes to reduce wound-induced ROS.
  • Pieces of the epidermal layer were incubated with 30 ⁇ l luminol (Bio-Rad, Hercules, CA), 1 ⁇ l horseradish peroxidase (1 mg ⁇ ml -1 , Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), and 69 ⁇ l Milli-Q water. Transferred to the containing solution and incubated at room temperature for 5 min in the dark. Chemiluminescence (RLU, relative luminescent units) was detected from ROS signals using a GloMax ® 96 Microplate Luminometer (Promega, Madison, WI).
  • DFO deferoxamine
  • Fe-1 ferrostatin
  • Cyt A cytochalasin A
  • DPI diphenyleneiodonium
  • the epidermal layer of rice leaf sheaths was isolated at 42 hpi (h post infection) and cultured in 3 mM DFO for 6 h at room temperature.
  • Fer-1 treatment the epidermal layer of rice leaf sheath was isolated at 24 hpi and incubated in 10 ⁇ M Fer-1 for 24 h in the dark at room temperature after vacuum infiltration.
  • Cyt A and DPI treatment rice leaf sheaths ( 5-7 cm long) were incubated with a conidial suspension (5 5 ⁇ M) solution was inoculated. The inoculated and treated rice leaf sheaths were cultured in the dark at 25°C for 48 hours. The middle thin epidermal layer of infected and treated rice leaf sheaths was stained differently and observed under a fluorescence microscope (Zeiss equipped with Axioplan 2, Campbell, CA).
  • NIN-like protein A protein containing a truncated RWP-RK domain was screened from a rice cDNA library, which was identified as a NIN-like protein (named OsNLP2) by DNA sequence Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) of the National Center of Biotechnology Information (NCBI). ) was identified. NIN family proteins have been identified as transcription factors (TFs) in nodal and nitrate signaling. The present inventors aligned the amino acid sequences of rice RWP-RK family proteins (NLP subfamily and RKD subfamily proteins) with other plant ( Arabidopsis thaliana , Medicago truncatula , and Brachypodium distachyon ) NLP proteins ( Figure 11).
  • OsNLP2 used in this example has a GAF-like domain, a RWP-RK domain (N567 to V615), and a C-terminal Phox and Bem1 (PB1) domain (L835 to D915) ( Figure 11).
  • GAF-like domains have been detected in the N-terminal region of NLP subfamily proteins.
  • the function of the GAF-like domain in NLP proteins is still unknown.
  • the RWP-RK motif contains the conserved amino acid sequence Arg-Trp-Pro-X-Arg-Lys (X, any amino acid), which is responsible for DNA binding of the RWP-RK family proteins.
  • the PB1 domain contains a positively charged lysine (K, lysine) and a negatively charged OPCA motif (DxD/ExD/E) ( Figure 11).
  • K, lysine a positively charged lysine
  • DxD/ExD/E a negatively charged OPCA motif
  • the function of the GAF-like domain in NLP is still unknown.
  • Most of the aligned NLP proteins share a conserved RWP-RK domain and a PB1 domain, except OsNLP6, which lacks the canonical RWP-RK motif.
  • the OsRKD protein lacks a PB1 domain.
  • a phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method using MEGA7 software ( Figure 12). NLP subfamily proteins are distinct from RKD subfamily proteins in the phylogenetic tree.
  • OsNLP2 used in this example is phylogenetically very close to BdNLP4, OsNLP5, and BdNLP3 ( Figure 12).
  • Amino acid sequences of plant RWP-RK family proteins were aligned based on information from the rice genome annotation project, the Arabidopsis Information Resource (TAIR), Phytozome, and NCBI.
  • TAIR Arabidopsis Information Resource
  • Phytozome Phytozome
  • NCBI NCBI.
  • accession numbers of sorted plant NPL proteins are listed in Table 2 below.
  • OsNLP1 os03g03900
  • OsNLP2 os04g41850
  • OsNLP3 os01g13540
  • OsNLP4 os09g37710
  • OsNLP5 os11g16290
  • OsNLP6 os02g04340
  • OsRKD1 os01g14420
  • OsRKD3 os01g37100
  • OsRKD4 os04g47640
  • OsRKD5 os06g12360
  • OsRKD6 os02g51090
  • OsRKD7 Os08g19820
  • OsRKD8 os12g12970
  • OsRKD9 Os09g27190 OsRKD10 os02g20530
  • ⁇ Osnlp2 mutant lines #4-2, #5-1, and #6-4 were generated from wild-type rice cultivar DJ (dongjin) by T-DNA insertion mutagenesis. All information on the ⁇ Osnlp2 mutant was obtained from the Rice Functional Genomic Express Database (RiceGE) maintained by the Salk Institute. T-DNA pGA2715 was inserted at -385 bp of the 5'-untranslated region (UTR) of OsNLP2 genomic DNA ( Figure 13A).
  • OsNLP2 forward and OsNLP2 reverse were designed to select homozygous transgenic ⁇ Osnlp2 plants through polymerase chain reaction (PCR) with OsNLP2 genomic DNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the three ⁇ Osnlp2 mutant lines #4-2, #5-1, and #6-4 were confirmed as homozygous mutants by electrophoresis of PCR products ( Figure 13B).
  • the transcript levels of OsNLP2 in wild-type Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant lines were analyzed using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and real-time qRT-PCR using RT primer sets (LP and RP).
  • OsNLP2 was significantly suppressed in the three ⁇ Osnlp2 mutant lines used in further experiments (Figure 13C).
  • Agrobacterium-mediated rice transgenic plants were constructed using the ⁇ Osnlp2 mutant line #6-4.
  • OsNLP transcript levels in wild-type rice DJ, Osnlp2 mutant line #6-4, and restored plants were analyzed by performing RT-PCR and real-time qRT-PCR analysis using RT primer sets (LP and RP).
  • OsNLP2 expression was significantly lower in the ⁇ Osnlp2 mutant line #6-4 compared to wild-type rice DJ, but the expression level increased again in restored plants (Complementation No. 3, No. 11, and No. 12 in Figure 18b) ( Figure 18b) .
  • OsNLP1 a key regulator gene of nitrogen (N) utilization, was rapidly induced by N deficiency, and OsNLP1 is a potential target for improving nitrogen use efficiency (NUE) and rice yield.
  • NUE nitrogen use efficiency
  • OsNLP3 is induced after germination and repressed by heat treatment.
  • OsNLP4 is repressed by several abiotic stresses and induced by low phosphate availability.
  • RWP-RK family proteins are involved in plant disease and immunity.
  • the inventors analyzed the transcription level of OsNLP2 in the leaf sheath of Dongjin rice during M. oryzae infection ( Figure 1).
  • Infected leaf sheaths of DJ cultivar used as wild-type rice were sampled at early time points after inoculation with M. oryzae PO6-6 (virulent) and 007 (non-virulent).
  • Real-time qRT-PCR data show that virulent M.oryzae PO6-6 infection markedly induced OsNLP2 expression in DJ leaf sheaths at the early infection stage (3-48 hpi).
  • infection with avirulent M. oryzae 007 did not induce OsNLP2 expression until 48 hpi during the incompatible interaction of rice with M. oryzae.
  • This OsNLP2 expression pattern ( Figure 1) shows that OsNLP2 is a negative regulator involved in blast disease (susceptibility), inhibits HR (hypersensitive response) cell death, and suppresses the defense response of rice against M. oryzae infection. gene), indicating that it can play a role.
  • OsNLP2 contains a characteristic RWP-RK domain and C-terminal Phox and Bem1 (PB1) domains ( Figure 2A, Figure 11), which may function in DNA binding and protein-protein interactions, respectively.
  • the OsNLP2 coding sequence and its truncated RWP-RK or PB1 domain region were constructed with a green fluorescent protein (GFP) tag and transiently expressed in N. benthamiana leaves using the agro-infiltration method. Nuclei inside N. benthamiana leaf cells were counterstained with DAPI and observed using a fluorescence microscope ( Figure 2B).
  • GFP green fluorescent protein
  • the control GFP construct (00:GFP) was detected ubiquitously in the plasma membrane and cytoplasm of N. benthamiana cells.
  • OsNLP2:GFP was located only in the nucleus of N. benthamiana cells and overlapped with DAPI-stained nuclei ( Figure 2B).
  • RWP-RK+PB1:GFP and PB1:GFP were located in both the cytoplasm and nucleus.
  • the entire OsNLP2 coding sequence may be required for OsNLP2 to localize to the nucleus, but the specific RWP-RK domain or PB1 domain is not required.
  • OsNLP2 induces cell death in plants
  • we transiently expressed full-length OsNLP2 and functional PB1 and RWP-RK-PB1 domains in N. benthamiana leaves using agro-infiltration (Figure 14).
  • Transient expression of the positive control Infestin 1 (INF1) clearly induced a typical cell death response.
  • Infestin 1 INF1
  • transient expression of full-length OsNLP2 , PB1 and RWP-RK-PB1 domains did not induce any cell death response in N. benthamiana leaves. This transient expression indicates that OsNLP2 expression does not cause cell death in plants.
  • Virulent M. oryzae PO6-6 caused extended infection in 70.4% of cells, but caused HR cell death in 17.6% of wild-type Dongjin rice cells ( Fig. 3B ).
  • M.oryzae PO6-6 infection caused an HR cell death response in more than 72% of cells in the leaf sheaths of the three ⁇ Osnlp2 mutant lines.
  • the HR cell death rate was reduced to 27.88%, similar to wild-type rice DJ ( Figure 18c).
  • Infection with avirulent M. oryzae 007 induced HR cell death responses in more than 86% of epidermal cells in both Dongjin rice and ⁇ Osnlp2 mutant lines.
  • CM-H 2 DCFDA green fluorescence
  • DAB dark brown staining images show that ROS (H 2 O 2 ) strongly accumulated within and around invasive hyphae (IH) in ⁇ Osnlp2 epidermal cells, but not during early M.oryzae PO6-6 infection. It shows that it did not accumulate in wild-type Dongjin rice cells ( Figure 4A). ROS-localized fluorescence specific for CM-H 2 DCFDA was clearly visible within and around the IH in ⁇ Osnlp2 mutant cells at 20-48 hpi ( Figure 4A, Figure 15). DAB is oxidized by H 2 O 2 in the presence of peroxidase to produce a dark brown precipitate in plant cells.
  • Iron ion (Fe 3+ ) accumulation and localization in rice epidermal cells was detected by Prussian blue (blue) staining at 48 hpi of M. oryzae 007 infection ( Fig. 4A ).
  • Highly reactive Fe 2+ is oxidized by H 2 O 2 to generate Fe 3+ and toxic OH ⁇ (Fenton reaction), causing serious damage to lipids, proteins, DNA and cellular components.
  • accumulation of Fe 3+ was observed inside and around invasive hyphae in ⁇ Osnlp2 epidermal cells (blue) but not in Dongjin rice cells ( Fig. 4A ).
  • Lipid oxidation or lipid peroxidation is generated under the influence of several ROS (hydroxyl radicals, hydrogen peroxide, etc.) that attack polyunsaturated fatty acids in the fatty acid membrane, resulting in significant tissue damage.
  • ROS hydroxyl radicals, hydrogen peroxide, etc.
  • Malondialdehyde (MDA) an important indicator of lipid peroxidation, was quantified using a spectrophotometer after reaction with thiobarbituric acid (TBA).
  • the lipid peroxidation level (MDA level) was significantly higher in ⁇ Osnlp2 leaf sheaths than in Dongjin rice cells ( Figure 4C ), indicating that the enhanced ROS and Fe 3+ levels lead to elevated levels of oxidative stress in ⁇ Osnlp2 cells.
  • ROS and iron ion (Fe 3+ ) accumulation and lipid peroxidation in ⁇ Osnlp2 leaf sheaths may be involved in the ROS and iron-dependent ferroptotic cell death response to M. oryzae infection.
  • the iron chelator deferoxamine (DFO, deferoxamine) (3 mM) was inoculated into M. oryzae PO6-6 and then treated on the leaf sheaths of the ⁇ Osnlp2 mutant line #4-2. DFO treatment inhibited the accumulation of ROS and iron ions and HR cell death in ⁇ Osnlp2 leaf sheaths infected with M. oryzae PO6-6 (Fig. 5). ROS accumulation was detected by DAB staining, and iron ion (Fe 3+ ) accumulation was visualized by Prussian blue staining ( Figure 5A).
  • DFO iron chelator deferoxamine
  • Fer-1 treatment significantly inhibited the HR cell death response around cell aggregates (dark brown) IHs in ⁇ Osnlp2 leaf sheaths, leading to successful colonization of IHs in rice sheat cells ( Figures 6A and Figure 6D).
  • Chemiluminescence analysis also showed that Fer-1 treatment significantly inhibited ROS production in ⁇ Osnlp2 outer epidermal cells at 48 hpi ( Figure 6B ).
  • M.oryzae PO6-6 infection markedly induced lipid peroxidation in ⁇ Osnlp2 sheath cells, indicating HR cell death response.
  • 10 ⁇ M Fer-1 treatment inhibited lipid peroxidation in ⁇ Osnlp2 leaf sheaths infected with M.oryzae PO6-6.
  • DPI treatment significantly inhibited ROS production in ⁇ Osnlp2 leaf sheaths at 48 hpi, as quantified by chemiluminescence assay ( Figure 8B ).
  • DPI treatment clearly promoted M. oryzae PO6-6 infection but inhibited HR cell death in ⁇ Osnlp2 leaf sheaths ( Figure 8C ).
  • OsPBZ1 was identified as a PBZ (probenazole)-inducible gene in rice.
  • Aquaporins, plasma membrane intrinsic proteins (PIPs) are membrane channels that facilitate the transport of water and small neutral molecules through biological membranes of living organisms.
  • OsPIP-2;1 has been proven to play an important role in water transport and plant growth regulation.
  • WRKY proteins are a large family of transcription factors involved in a variety of plant processes, but especially in inducible defense responses to biotic and abiotic stresses.
  • OsWRKY104 induction was evident in leaf sheaths of ⁇ Osnlp2 mutant line #4-2 at 3-24 hpi.
  • OsWRKY90 was not induced in ⁇ Osnlp2 leaf sheaths compared to OsWRKY104 .
  • Plant respiratory burst oxidase homologs PBOH
  • ROS reactive oxygen species
  • ⁇ Osnlp2 mutant line was resistant to other M. oryzae strains KI215, KJ401, 70-15, Y34, and RO1-1, which are virulent to wild-type Dongjin rice.
  • the initial infection response of the ⁇ Osnlp2 mutant was examined microscopically at the cellular level 48 h after inoculation of rice leaf sheaths with various M. oryzae strains (Fig. 10).
  • wild-type Dongjin rice was highly susceptible to all M. oryzae strains tested.
  • ⁇ Osnlp2 mutant lines #4-2, #5-1, and #6-4 were highly resistant to these M.oryzae strains. During initial infection by all M.
  • leaf sheath cells of wild-type Dongjin rice exhibited a susceptible infection pattern, i.e., 60–80% of cells with expanded periapical hyphal growth in multiple cells.
  • M.oryzae KI215 induced an HR cell death response in more than 60% of the epidermal cells of the leaf sheath in the ⁇ Osnlp2 mutant.
  • M.oryzae KJ401, 70-15, Y34, and RO1-1 infection induced HR cell death responses in epidermal cells at a level of approximately 80% cells at 48 hpi.
  • the present inventors inoculated M.oryzae PO6-6, KJ401, 70-15, RO1-1, and Y34 strains into the leaf sheaths of wild-type Dongjin rice, ⁇ Osnlp2 mutant line #6-4, and plants with restored Osnlp2 genes to produce resistance response. It was confirmed that it represents .
  • the number of cells showing three types of infection (extended infection, single-cell infection, and hypersensitive response (HR) cell death) in rice cells was counted microscopically at 48 hpi. As shown in Figure 18c, restoration plant no. 3, No. 11, No.
  • plants in which the Osnlp2 gene was restored developed blast disease by inoculation with the blast pathogen normally like wild-type Dongjin rice, unlike the Osnlp2 gene-deficient mutant rice that showed resistance to the blast pathogen.
  • the Osnlp2 gene is a negative regulator that determines resistance to rice blast disease.

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Abstract

본 발명은 벼의 감수성 유전자와 해당 유전자의 발현 결손 또는 저해제를 포함하는 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물 및 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 또는 방법을 이용하면, 다양한 도열병균에 대하여 레이스 비특이적인(race-nonspecific) 저항성을 갖는 벼를 얻을 수 있다.

Description

벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물 및 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법
본 발명은 벼의 감수성 유전자와 해당 유전자 결손 또는 저해제를 포함하는 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
도열병균(Magnaporthe oryzae)에 의해 발생하는 도열병은 매년 전 세계적으로 벼 생산량의 10-30% 손실을 야기시키는 가장 파괴적인 벼 질환이다. 도열병균은 발아관의 정단에서 부착기(appressoria) 분화와 코니디아(conidia) 발아에 의해 벼 잎에 감염을 시작한 후, 좁은 침입관(penetrating peg)은 활물기생(biotrophic) 단계 동안에 세포질 막에 쌓인 침입 균사로 분화한다. 반활물기생 병원균인　도열병균은 식물 세포를 초기에 죽이지 않고, 감염 후기에 감염된 균사의 지속적인 성장으로 식물을 죽이며 병변(blast lesion)은 일반적으로 감염 7일 이내에 가시적으로 볼 수 있다.
본 발명은 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 도열병 저항성이 증진 또는 개선된 벼를 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 벼과 식물체의 NLP(Nodule inception-like protein) 유전자 발현 결손 또는 저해제를 포함하는 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 NLP 유전자는 OsNLP2 (Oryza sativa nodule inception-like protein 2) 유전자인, 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 발현 결손 또는 저해제는 EMS(ethyl methanesulfonate), DMS(dimethyl sulfate), T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제(Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/CRISPR-associated　sequences9 nuclease)인, 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물.
4. 벼과 식물체에서 NLP(Nodule inception-like protein) 유전자 발현을 결손 또는 저해하는 단계를 포함하는 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법.
5. 위 4에 있어서, 상기 NLP 유전자는 OsNLP2 (Oryza sativa nodule inception-like protein 2) 유전자인, 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법.
6. 위 4에 있어서, 상기 발현 결손 또는 저해는 EMS(ethyl methanesulfonate), DMS(dimethyl sulfate), T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제(Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/CRISPR-associated　sequences9 nuclease)를 식물체에 도입하여 수행되는, 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법.
7. NLP(Nodule inception-like protein) 유전자 발현이 결손 또는 저해된 도열병 저항성이 증진 또는 개선된 벼.
8. 위 7에 있어서, 상기 NLP 유전자는 OsNLP2 (Oryza sativa nodule inception-like protein 2) 유전자인, 도열병 저항성이 증진 또는 개선된 벼.
9. 위 7에 있어서, 상기 발현 결손 또는 저해는 EMS(ethyl methanesulfonate), DMS(dimethyl sulfate), T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제(Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/CRISPR-associated　sequences9 nuclease)를 식물체에 도입하여 수행된, 도열병 저항성이 증진 또는 개선된 벼.
본 발명은 벼의 감수성 유전자인 NLP 유전자의 발현을 결손 또는 저해시켜 벼 도열병 저항성을 증진 또는 개선시키는 효과가 있다.
도 1은 M.oryzae P06-6 및 007 감염 동안 동진 벼의 엽초에서 OsNLP2의 전사 수준을 나타낸 것이다.
도 2A는 OsNLP2 유전자의 도메인을 나타낸 것이고, 도 2B는 OsNLP2:GFP와 OsNLP2기능 도메인들 중 하나가 잘린 것의 세포 내 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 M.oryzae P06-6에 감염된 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이 라인의 표현형을 비교한 것이다.
도 4는 M.oryzae P06-6에 감염 동안 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이의 엽초 세포에서 ROS 및 철 이온(Fe3+)축적과 지질 과산화 정도를 비교한 것이다.
도 5는 M.oryzae P06-6에 감염된 ΔOsnlp2 엽초에 대한 데페록사민(DFO)의 ROS 및 철 이온(Fe3+)의 축적과 HR 세포 사멸 억제 효과를 확인한 것이다.
도 6은 M.oryzae P06-6에 감염된 ΔOsnlp2 엽초에 대한 페로스타틴 -1(ferrostatin-1)의 ROS 및 철 이온(Fe3+)의 축적, 지질 과산화 및 HR 세포 사멸 억제 효과를 확인한 것이다.
도 7은 M.oryzae P06-6에 감염된 ΔOsnlp2 엽초에 대한 사이토칼라신 A(Cyt A)의 ROS 및 철 이온(Fe3+)의 축적과 HR 세포 사멸 억제 효과를 확인한 것이다.
도 8은 M.oryzae P06-6에 감염된 ΔOsnlp2 엽초에 대한 DPI의 ROS 및 철 이온(Fe3+)의 축적과 HR 세포 사멸 억제 효과를 확인한 것이다.
도 9는 M.oryzae P06-6에 감염된 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이(#4-2) 식물의 엽초에서 시간 경과에 따른 방어 관련 유전자 발현을 실시간 qRT-PCR 분석한 것을 나타낸다.
도 10은 다양한 M.oryzae 균주 KI215, KJ401, 70-15, Y34 및 RO1-1에 대한 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이주의 감염 반응을 비교한 것이다.
도 11a 내지 도 11d는 벼 NLP 계열 단백질의 GAF 유사 도메인, RWP-RK 도메인 및 PB1 도메인과 다른 식물 NLP 단백질의 아미노산 서열 정렬을 나타낸 것이다.
도 12는 다른 식물 NLP 단백질과 벼 NLP 계열 단백질의 계통수를 나타낸 것이다.
도 13A는 ΔOsnlp2 돌연변이의 개략도이고, 도 13B는 ΔOsnlp2 돌연변이의 유전자형 분석 결과이며, 도 13C는 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이에서 OsNLP2 발현의 RT-PCR 및 실시간 qRT-PCR 분석 결과이다.
도 14는 OsNLP2 및 PB1 및 RWP-RK-PB1 도메인을 아그로 박테리움을 사용하여 N.benthamiana 잎에 일시적으로 발현한 경우, N.benthamiana 잎에서 세포에서 세포 사멸을 유발하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 15는 M.oryzae P06-6 접종 후 상이한 시점에서 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이 세포에서 ROS 축적을 나타낸 것이다.
도 16은 M.oryzae P06-6 및 007에 감염된 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이 식물 엽초에서 시간 경과에 따른 방어 관련 유전자 발현을 실시간 qRT-PCR 분석한 것을 나타낸다.
도 17은 ΔOsnlp2 벼에 야생형OsNLP2 유전자를 복원시키기 위한 보완 벡터를 나타낸 것이다.
도 18a는 Osnlp2 유전자가 복원된 식물의 제작 과정을 나타낸 것이고, 도 18b는 야생형 벼(DJ), ΔOsnlp2 벼(#6-4) 및 Osnlp2 유전자가 복원된 식물(Complementation No. 3, No. 11, No. 12)에서 Osnlp2 유전자의 발현 여부를 확인한 것이며, 도 18c는 M.oryzae PO6-6, KJ401, 70-15, RO1-1 및 Y34 균주에 대한 야생형 벼(DJ), ΔOsnlp2 벼(#6-4) 및 Osnlp2 유전자가 복원된 식물(Com 3, 11, 12)의 감염 반응을 나타낸 것이다(n=3, hpi(hours post inoculation)=48).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 벼과 식물체의 NLP(Nodule inception-like protein) 유전자 발현 결손 또는 저해제를 포함하는 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 NLP 유전자를 결손 또는 저해시켜 병원균의 잎으로의 침입 자체를 억제하여, 도열병 균주의 종류에 무관하게(race-nonspecific) 병원균의 침입 자체를 억제하므로 다양한 균주(broad-spectrum)에 대해 저항성을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 결손 또는 저해 대상인 NLP 유전자는 그 대상인 벼과 식물체에 존재하는 유전자일 수 있다. 예를 들면 대상 식물체가 벼(Oryza sativa)인 경우 NLP2 (nodule inception protein-like protein 2) 유전자일 수 있다. 이는 예를 들면 서열번호 26의 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “발현 결손 또는 저해”는 그 유전자(DNA 또는 mRNA) 또는 단백질의 발현을 저해(발현량 감소)시키거나 그 발현을 완전히 제거하는 것을 의미하며, “완전히 제거하는 것”은 유전자 또는 단백질 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 포함한다.
NLP 유전자의 발현 결손 또는 저해제는 NLP 유전자의 발현을 결손 또는 저해할 수 있는 모든 물질로서 물질의 타입이나 종류에 국한되지 않으며, 예를 들면 EMS(ethyl methanesulfonate), DMS(dimethyl sulfate), T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제(nuclease) 등일 수 있다.
상기 예시한 물질들은 화학적인 방법에 의해 NLP 유전자의 핵산서열 내 변형 또는 유전자 발현의 변화를 유발하는 것이거나(예컨대, EMS, DMS 등) 대상 식물의 NLP 유전자 서열에 맞추어 설계되어, 그 유전자의 발현을 저해 또는 결손 시킬 수 있는 것일 수 있다.
본 발명은 벼과 식물체에서 NLP(Nodule inception-like protein) 유전자 발현을 결손 또는 저해하는 단계를 포함하는 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 결손 또는 저해 대상인 NLP 유전자는 그 대상인 벼과 식물체에 존재하는 유전자일 수 있다. 예를 들면 대상 식물체가 벼(Oryza sativa)인 경우 NLP2 (nodule inception-like protein 2) 유전자일 수 있다. 이는 예를 들면 서열번호 26의 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “발현 결손 또는 저해”는 전술한 범위 내의 것일 수 있다.
NLP 유전자의 발현 결손 또는 저해는 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들면 EMS(ethyl methanesulfonate), DMS(dimethyl sulfate), T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제(Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/CRISPR-associated　sequences9 nuclease)를 식물체에 도입하여 수행될 수 있다.
상기 예시한 물질들의 경우 화학적인 방법에 의해 NLP 유전자의 핵산서열 내 변형 또는 유전자 발현의 변화를 유발하는 것이거나(예컨대, EMS, DMS 등) 대상 식물의 NLP 유전자 서열에 맞추어 설계되어, 그 유전자의 발현을 저해 또는 결손 시킬 수 있는 것일 수 있다.
본 발명은 NLP(Nodule inception-like protein) 유전자 발현이 결손 또는 저해된 도열병 저항성이 증진 또는 개선된 벼에 관한 것이다.
본 발명에서 결손 또는 저해 대상인 NLP 유전자는 그 대상인 벼에 존재하는 유전자일 수 있다. NLP 유전자는 예를 들면 벼(Oryza sativa)의 NLP2 (nodule inception-like protein 2) 유전자일 수 있다. 이는 예를 들면 서열번호 26의 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “발현 결손 또는 저해”는 전술한 범위 내의 것일 수 있다.
NLP 유전자의 발현 결손 또는 저해는 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들면 EMS(ethyl methanesulfonate), DMS(dimethyl sulfate), T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제(Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/CRISPR-associated　sequences9 nuclease)를 식물체에 도입하여 수행된 것일 수 있다.
상기 예시한 물질들의 경우 화학적인 방법에 의해 NLP 유전자의 핵산서열 내 변형 또는 유전자 발현의 변화를 유발하는 것이거나(예컨대, EMS, DMS 등) 대상 식물의 NLP 유전자 서열에 맞추어 설계되어, 그 유전자의 발현을 저해 또는 결손 시킬 수 있는 것일 수 있다.
벼 품종마다 도열병을 유발하는 도열병균 균주가 상이하다. 본 발명의 NLP 유전자 발현이 결손 또는 저해된 벼는 도열병 균주의 종류에 무관하게(race-nonspecific) 저항성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 벼는 벼의 품종에 관계 없이 다양한 균주(broad-spectrum)가 유발하는 도열병에 대해 저항성이 증진 또는 개선될 수 있다.
벼의 품종은 예를 들면 자포니카 벼 또는 인디카 벼 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
벼는 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물 세포, 식물 조직, 식물 세포 또는 조직으로부터 유래된 캘러스 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 식물 재료 및 성장 조건
벼(Oryza sativa L.) 재배종인 Dongjin(DJ)의 종자는 전주 국립 식량 과학원(National Institute of Crop Science, Jeonju, Korea)에서 제공했다. ΔOsnlp2 녹아웃(knock-out, KO) 돌연변이 종자는 Salk Institute에서 관리하는 Rice Functional Genomic Express Database (RiceGE) 에서 획득하였다. 벼 종자는 28℃의 물 속에서 5일 간 연속 광 조건(continuous light condition, 80 μmol photons m-2 sec-1) 하에서 발아시켰다. 발아된 벼 종자는 Baroker soil (Seoul Bio, Seoul, Korea)이 있는 화분(직경 12 ㎝, 높이 11㎝)에 심었다. 벼는 28℃, 습도 60%, 백색 형광등(150 μmol photons m-2 sec-1), 16 시간 광 조건/ 8시간 암 조건(16-h day/8-h night)의 광주기 조건에서 생장 챔버에서 생육되었다.
Nicotiana benthamiana 종자는 25℃의 광 조건 하에서 7일 동안 물에서 발아시켰다. 발아된 묘목은 Baroker soil (Seoul Bio, Seoul, Korea)이 있는 화분(직경 8㎝, 높이 6㎝)에 심었다. N. benthamiana 식물은 25℃, 백색 형광등(150 μmol photons m-2 sec-1), 16 시간 광 조건/ 8시간 암 조건(16-h day/8-h night)의 광주기 조건에서 생장 챔버에서 생육되었다.
2. ΔOsnlp2 돌연변이 유전자형 분석(genotyping)
T-DNA 삽입 ΔOsnlp2 돌연변이 종자는 100% 에탄올로 1분 동안 살균 한 다음, 종자 껍질을 제거한 후 30분 동안 50% Clorox로 살균했다. 멸균된 종자는 25℃에서 2주 동안 연속 광 조건(continuous light condition) 하에서 half Murashige and Skoog(MS)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 배지에서 배양되었다. 각 단일 식물에서 신선한 벼 잎을 수집하여 유전자형 분석을 위한 genomic DNA를 추출했다. CTAB(cetyl trimethylammonium bromide) 방법을 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 사용된 프라이머(OsNLP2 Forward(F), 5'- GAGCCAAGGAATCTCCTCCTCTTC-3'(서열번호 1), OsNLP2 Reverse(R), 5'- CTTGAGGTCCATTCTGGCACCCCA-3'(서열번호 2), T-DNA2715 RB, 5'- GTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3(서열번호 3))는 돌연변이 데이터베이스의 정보를 기반으로 T-DNA 삽입 부위 근처에 설계되어, 종자 풀에서 동형 접합(homozygous) 및 이종 접합(heterozygous) 식물을 검출한다. 왼쪽 유전자 특이적 프라이머(LP, left gene-specific primer) 및 T-DNA 오른쪽 경계 프라이머(RB, T-DNA right border primer)를 역전자 PCR(RT-PCR) 분석에 사용하여 ΔOsnlp2 돌연변이 식물에서 T-DNA 삽입을 확인했다.
cDNA를 합성하기 위해 Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 동형 접합 식물의 총 RNA를 추출했다. OsNLP2 RT 프라이머(Forward: 5'-GCATCAAGCCACCCTACCTT-3'(서열번호 4); Reverse: -5'TCACGATTCGCGACCCTATG-3'(서열번호 5))는 RT-PCR 및 Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(Real-time qRT-PCR)을 통해 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이 라인에서 Osnlp2 전사 수준 분석을 위해 사용되었다. 벼 유비퀴틴(OsUbi) 전사 수준은 OsNLP2의 전사 수준을 정규화하는 데 사용하였다. 데이터는 다른 벼 식물(n=4)의 엽초에서 OsNLP2의 상대적 발현량의 평균 ± SD로 표시된다.
3. 곰팡이 배양 및 성장 조건
M. oryzae (Magnaporthe oryzae) 균주 PO6-6, KI215, KJ401, 70-15, Y34, RO1-1 및 007은 서울대학교 진균 유전 자원 센터(Center for Fungal Genetic Resources, Seoul National University, Seoul, Korea)에서 입수하였다. M.oryzae PO6-6, KI215, KJ401, 70-15, Y34 및 RO1-1은 동진 벼에 독성이 있지만, M.oryzae 007은 동진 벼에 독성이 없다. M. oryzae 균주는 -20℃에서 보관하고 쌀 겨(rice bran) 한천 배지(20 g rice bran, 20 g sucrose 및 20 g agar)에서 암 조건, 25℃에서 14일 동안 배양했다. M.oryzae 배양물의 포자 형성 (Sporulation) 배양 플레이트를 연속적인 형광등 (80 μmol photons m-2 sec-1) 하에서 3일 동안 배양하여 유도되었다. 0.025%(v/v) Tween 20의 분생 포자 현탁액(conidial suspensions)을 적절한 분생 포자 농도(conidial concentrations)로 조정했다.
4. 곰팡이 접종 및 감염 평가
벼 잎의 질병 증상을 모니터링하기 위해 3주된 묘목의 잎에 M. oryzae 분생 포자 현탁액(1.0 x 105 conidia·ml-1)을 균일하게 뿌렸다. 접종된 벼를 25℃에서 어둡고 습한 조건에서 24시간 동안 배양한 후 정상 조건(16h day/8h night)에 두었다. 접종 5일 후 벼 잎의 질병 증상을 모니터링 하였다.
본 실시예의 벼 엽초(leaf sheath) 시험을 위해, 6주령 묘목 단계에서 자른 벼 엽초(길이 5 ㎝)에 M. oryzae 분생 포자 현탁액(5.0 x 105 conidia·ml-1)을 접종하였다. 접종된 벼 엽초를 습한 챔버에서 2일 동안 암 조건에서 배양하였다. 표피층을 쌀 덮개에서 절제하고 형광 현미경(Zeiss equipped with Axioplan 2; Campbell, CA, USA)으로 모니터링했다. 관찰된 감염된 표피 세포는 확장 감염(다중 세포 내부에 집락화된 침습성 균사, invasive hyphae colonized inside multiple cells), 단일 세포 감염(단일 세포 내부의 제한된 균사 성장, limited hyphal growth inside a single cell) 및 과민 반응(HR, hypersensitive response) 세포 사멸의 세 가지 감염 유형으로 분류되었다. 각 감염 유형으로 감염된 세포의 계수(counting)는 세 개의 독립적인 실험 중 하나 당 네 번의 반복 실험으로 수행되었다.
5. 클로닝 및 플라스미드 구성
OsNLP2 및 그 기능적 도메인의 세포 내 위치(subcellular localization)를 파악하기 위해, 엔트리 클론(entry clones)은 Gateway LR Clonase II 효소 (Invitrogen)를 사용하여, Gateway green fluorescent protein (GFP) 함유 벡터 pGWB552로 재조합되었다. OsNLP2 (LOC_Os04g41850) 및 기능적 도메인의 코딩 서열은 Gateway attB1 및 attB2 부위(full OsNLP2 sequence Forward, 5'-AAAAAGCAGGCTTCATGGATATGCCTACG-3'(서열번호 6); full OsNLP2 sequence Reverse, 5'-AGAAAGCTGGGTTTATGAGCTATGTGC-3'(서열번호 7)RWP-RK-PB1 domain Forward, 5'-AAAAAGCAGGCTTCATGAATATTAGCTTG-3'(서열번호 8); PB1 domain Forward, 5'-AAAAAGCAGGCTTCATGCTGACAGTTAAG-3'(서열번호 9);)를 포함하는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 벼 cDNA 라이브러리에서 증폭되었다. 사용된 유전자 특이적 프라이머는 Rice Genome Annotation Project에서 제공한 유전체(genome) 정보를 기반으로 설계되었다.
N. benthamiana 잎에서 OsNLP2의 일시적인 발현 테스트를 위해 OsNLP2 코딩 영역과 그 기능적 도메인을 Ligation Independent Cloning(LIC) 벡터 pCAM2300-LIC에 클로닝했다. 이들의 코딩 서열은 어댑터(full OsNLP2 sequence Forward, 5'-CGACGACAAGACCCTATGGATATGCCTACGCCA-3'(서열번호 10); RWP-RK-PB1 domain Forward, 5'-CGACGACAAGACCCTATGAATATTAGCTTGGAT-3'(서열번호 11); PB1 domain Forward, 5'-CGACGACAAGACCCTATGCTGACAGTTAAGGCA-3'(서열번호 12); and full OsNLP2 sequence Reverse, 5'-GAGGAGAAGAGCCCTTTATGAGCTATGTGCCGC-3'(서열번호 13))가 있는 프라이머를 사용하여 벼 cDNA 라이브러리에서 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물은 T4 DNA 중합 효소(NEB)를 사용하여 SnaB1 제한 효소에 의해 분해된 벡터 pCAM2300-LIC에 서브클로닝되었다.
6. 아그로박테리움(agrobacterium) 형질전환, 세포 내 위치 및 일시적 발현 에세이(transient expression assays)
OsNLP2의 세포 내 위치를 결정하기 위해, OsNLP2의 구성과 pGWB552:GFP 내부의 기능적 도메인을 Agrobacterium GV3101으로 형질 전환했다. 빈 벡터 pGWB552:GFP 도 음성 대조군(negative control)으로서 형질 전환되었다. 다른 구조체를 가진 형질 전환된 아그로 박테리아를 100 ㎍ ㎖-1 스펙티노마이신(spectinomycin)을 함유하는 Luria Bertani (LB) 액체 배지에서28℃에서 밤새 배양하였다. 수집된 아그로 박테리움 세포를 침투 완충액(infiltration buffer)[97.5 ㎎ 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid sodium salt (MES), 1 M MgCl2 0.5 ㎖, 0.1 mM acetosyringone을 50 ㎖ 물에 넣음]에 현탁시켰다. 아그로 박테리움 현탁액을 N. benthamiana 잎에 침투시켰다. 2일 동안 배양한 후 침윤된 잎을 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 용액 (1 ㎍·㎖-1)으로 10분 동안 암 조건에서 염색하여 세포의 핵을 시각화했다. 녹색 형광(GF, green fluorescence) 필터(Ex/Em: 488 ㎚/505-550 ㎚ 파장)와 DAPI 필터(Ex/Em: 405/421-523 ㎚)가 있는 형광 현미경(Zeiss equipped with Axioplan 2; Campbell, CA, USA)을 사용하여 표피 세포를 관찰했다.
N.benthamiana 잎에서 OsNLP2를 일시적으로 발현하기 위해, 이원 벡터(binary vector) pCAM2300-LIC에서 full length OsNLP2 및 이의 기능적 도메인을 Agrobacterium GV3101으로 형질 전환했다. 침투 완충액의 아그로 박테리움 현탁액은 최종 농도 OD600=1.0로 조정되었다. 세 가지 다른 구조체를 각각 포함하는 아그로-형질전환체(agro-transformants)의 현탁액을 동일한 N.benthamiana 잎의 개별 부위에 침투시켰다. 빈 벡터 pCAM2300-LIC 및 Infestin 1(INF1):pCAM2300-LIC는 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용되었다. 2일 동안 배양한 후 침윤된 N.benthamiana 잎에서 세포 사멸 증상이 관찰되었다.
7. ΔOsnlp2 돌연변이 식물에서 Osnlp2 의 복원
ΔOsnlp2 돌연변이 식물에서 Osnlp2의 발현을 복원하기 위해, 이원 벡터 pB2GW7(선택 마커로서의 Bar 유전자) 내부의 Osnlp2의 코딩 서열을 Agrobacterium C58C1로 형질전환시켰다. ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #6-4를 사용하여 Osnlp2가 복원된 식물을 제작하였다. 4주령 벼 캘러스(calli)를 Osnlp2 유전자의 full cDNA로 형질전환된 아그로박테리움과의 3일 공동 배양에 사용하였다(도 18a). 포스피노트리신(PPT, phosphinothricin, 3mg/L 및 6mg/L) 농도가 증가하는 배지에서 형질전환된 캘리를 선택하였다. 촬영 및 발근 후 캘러스는 25℃에서 빛이 있는 조건 하에서 2주간 마지막 재생 배지에서 배양하였고, 2일 동안 물에 적응시킨 후 토양으로 옮겼다. 형질전환 식물에서 Osnlp2를 확인하기 위해 Osnlp2 프라이머(forward, 5′-ATGGATATGCCTACGCCATC-3′(서열번호 27); reverse, 5′-CTTGAGGTCCATTCTGGCACCCCA-3′(서열번호 2))와 Bar 유전자 프라이머(forward, 5′-ACCACTACATCGAGACAAGCACGGTC-3′(서열번호 28); reverse, 5′-AAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGT-3′(서열번호 29))를 사용하였다.
8. RT-PCR 및 실시간 qRT-PCR 분석
M. oryzae에 감염된 엽초 조직에서 벼 유전자 발현 수준은 역전사 PCR (RT-PCR) 및 실시간 정량 PCR (qRT-PCR)로 분석되었다. TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 벼 조직에서 총 RNA를 추출한 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 cDNA 합성 키트 (Invitrogen)를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 수행했다. RT-PCR 및 실시간 qRT-PCR 모두에 대해 동일한 양의 cDNA가 템플릿으로 사용되었다. OsNLP2, OsPBZ1, OsWRKY104, OsRbohB, OsPIP-3A 및 OsWRKY90 의 발현은 TOPrealTM qPCR 2X PreMIX (SYBR Green with low ROX, Enzynomics)를 사용하여 실시간 qRT-PCR에 의해 유전자 특이적 프라이머 세트로 분석되었다. 테스트 된 벼 유전자의 상대적 발현 수준은 내부 대조군인 벼 OsUbiquitin의 발현 수준을 정규화하여 결정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 엽초의 상대적인 유전자 발현 수준의 평균 ± SD에 해당한다. 이 실시예에 사용된 유전자 특이적 프라이머 목록은 하기 표 1과 같다.
Gene name Sequence 유전자좌 용도 서열번호
OsNLP2 F AAAAAGCAGGCTTCATGGATATGCCTACG Os04g41850 유전자형
분석		 6
R AGAAAGCTGGGTTTATGAGCTATGTGC 7
RWP-RK dommian F AAAAAGCAGGCTTCATGAATATTAGCTTG 8
PB1 domian F AAAAAGCAGGCTTCATGCTGACAGTTAAG 9
OsNLP2 RT LP GCATCAAGCCACCCTACCTT 4
RP TCACGATTCGCGACCCTATG 5
OsNLP2 F GAGCCAAGGAATCTCCTCCTCTTC 1
R CTTGAGGTCCATTCTGGCACCCCA 2
T-DNA2715 RB GTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA 　 3
OsPBZ1 F GCTACAGGCATCAGTGGTCA Os12g36880 qRT-PCR 14
R GACTCAAACGCCACGAGAAT 15
OsPIP 3A F TCATCCTCGTCTACACCGTC Os09g36930 16
R CACCCAGAAGATCCAGTGGT 17
OsWRKY90 F ATGGCCAGCAGTAGCGACCATG Os09g30400 18
R CTCTCTGTTTCTCTCAAACTGA 19
OsWRKY104 F TGCCATTACTTCCGAGCGAC Os11g02520 20
R ATTGTGAGGTGCTTGAGCCA 21
OsRbohB F GAATTCATGGCTGACCTGGAAGCAGGCA Os01g25820 22
R CTCGAGTTAGAAGTTCTCCTTGTGGAAA 23
Ubiquitin F GTGGTGGCCAGTAAGTCCTC Os06g46770 24
R GGACACAATGATTAGGGATCA 25
9. ROS 감지 및 정량화
M. oryzae에 감염된 벼 엽초(leaf sheaths)의 세포 ROS(H2O2) 위치는 염료 5-(and-6) chloromethyl-2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester (CM-H2DCFDA) 및 3,3′(DAB) 염색 방법을 사용하여 시각화되었다. 분리된 벼 엽초의 표피층을 4℃에서 5분 동안 물에 담가 상처로 유발된 ROS(wound-induced ROS)를 씻어낸 후, 2 μM, CM-H2DCFDA (Molecular Probes Life Technologies, Eugene, OH)에서 30분 동안 상온의 암 조건에서 염색하였다. 1 × phosphate-buffered saline (PBS) 완충액으로 3회 세척한 후, 염색된 표피 세포를 GF 필터 (Ex/Em: 488 ㎚/505-550 ㎚ 파장)를 사용하여 형광 현미경(Zeiss equipped with Axioplan 2; Campbell, CA, USA)으로 관찰했다. 감염된 벼 엽초에서 분리된 표피층을 1 ㎎ ㎖-1 DAB 용액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 실온에서 8시간 동안 배양한 다음 에탄올, 아세트산, 글리세롤 혼합물(3:1:1, v/v/v)로 용해하였다. 현미경으로 표피 세포 내부의 ROS 위치를 관찰했다.
접종 후 벼 엽초 세포에서 ROS 생산은 화학 발광 분석(chemiluminescence assay)으로 측정되었다. 분리된 표피층을 작은 조각(0.5 ㎝)으로 자르고 Milli-Q 물에 5분 동안 4℃에 담가 상처로 유발된 ROS를 감소시켰다. 표피층 조각을 30 ㎕ 루미놀(Bio-Rad, Hercules, CA), 1 ㎕ 홀스래디쉬(horseradish) 과산화 효소(1 ㎎·㎖-1, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) 및 69 ㎕ Milli-Q 물이 포함된 용액에 옮기고 암실에서 5분 동안 실온에서 배양했다. 화학 발광(RLU, relative luminescent units)은 GloMax® 96 Microplate Luminometer (Promega, Madison, WI)를 사용하여 ROS 신호로부터 검출되었다.
10. 철 이온 검출을 위한 프러시안 블루(Prussian blue) 염색
벼 엽초(leaf sheaths) 세포에서 철 이온(Fe3+)의 축적은 프러시안 블루 염색에 의해 시각화되었다. 벼 엽초(rice sheaths)의 표피층을 분리하고 15시간 동안 프러시안 블루 용액(7% potassium ferrocyanide and 2% hydrochloric acid (HCl))으로 염색하였다. 프러시안 블루로 염색된 표피 세포를 현미경(Zeiss equipped with Axioplan 2; Campbell, CA, USA)으로 관찰했다. 세포 내부에서 Fe3+와 결합하는 ferric ferrocyanides는 외피 표피 세포에서 밝은 파란색으로 보인다.
11. 지질 과산화 에세이(lipid peroxidation assay)
M.oryzae에 감염된 벼 엽초(rice sheaths)의 지질 과산화 수준을 검출하기 위해 불포화 지방산 과산화의 산물인 malondialdehyde(MDA)를 thiobarbituric acid(TBA)와 반응시킨 후 분광 광도계를 사용하여 정량화했다. 벼 엽초를 액체 질소로 분쇄한 후 동량의 조직 분말을 반응 용액[0.5 % (w/v) thiobarbituric acid (TBA), 20 % (v/v) trichloroacetic acid (TCA) and 0.25 ㎖ 175 mM NaCl in total 2 ml of 50 mM Tris-Cl, pH 8.0]과 혼합하였다. 혼합된 반응 용액을 끓는 물에서 5분 동안 배양하고, 14,000 g에서 5분 동안 4℃에서 원심 분리하였다. 생성된 상층액은 SP-2000UV 분광 광도계(Woongki Science, Seoul, Korea)로 450, 532, 600 ㎚ 파장에서 흡광도(OD, optical density)를 측정하기 위해 사용되었다. MDA 농도(C)는 식 C (MDA) = 6.45 x (OD532 OD600) (0.56 x OD450)에 따라 계산되었다.
12. 데페록사민(deferoxamine), 페로스타틴(ferrostatin), 사이토칼라신 A(cytochalasin A) 및 다이페닐렌아이오도늄(diphenyleneiodonium) 처리
철 킬레이터(iron chelator)인 데페록사민(DFO, deferoxamine), 강력한 페롭토시스(ferroptosis) 억제제인 페로스타틴(Fer-1, ferrostatin), 액틴 필라멘트 억제제인 사이토칼라신 A(Cyt A, cytochalasin A) 및 산화 효소 억제제인 다이페닐렌아이오도윰(DPI, diphenyleneiodonium)을 사용하여, M.oryzae 감염 동안 ΔOsnlp2 엽초에서 철 및 ROS 의존성 페롭토시스의 억제를 조사했다. DFO, Fer-1 및 DPI는 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO에서 구입했으며 Cyt A는 Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI에서 구입했다. DFO 처리를 위해, 벼 엽초의 표피층을 42 hpi(h post infection)에서 분리하고 실온에서 6 시간 동안 3 mM DFO에서 배양했다. Fer-1 처리를 위해, 벼 엽초의 표피층을 24 hpi에서 분리하고 진공 침투 후 실온의 암실에서 24 시간 동안 10 μM Fer-1에서 배양했다. Cyt A 및 DPI 처리를 위해, 벼 엽초(길이 5-7 ㎝)에 분생 포자 현탁액 (5 x 105 분생 포자 ml-1)을 물(mock), Cyt A(20 ㎍· ml-1) 또는 DPI (5μM) 용액에 접종되었다. 접종 및 처리된 벼 엽초를 암실에서 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 감염되고 처리된 벼 엽초의 중간의 얇은 표피층을 다르게 염색하고 형광 현미경(Zeiss equipped with Axioplan 2, Campbell, CA)으로 관찰했다.
결과
1. OsNLP2, ΔOsnlp2 돌연변이체 및 OsNLP2 복원 식물의 동정(identification)
잘린(truncated) RWP-RK 도메인을 포함하는 단백질을 벼 cDNA 라이브러리에서 스크리닝하였고, 이는 NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 DNA 서열 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)에 의해 NIN-유사 단백질(OsNLP2로 명명됨)로 식별되었다. NIN 계열 단백질은 결절 및 질산염 신호 전달에서 전사 인자(TF)로 확인되었다. 본 발명자는 벼 RWP-RK 계열 단백질(NLP 하위 계열 및 RKD 하위 계열 단백질)의 아미노산 서열을 다른 식물(Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula, and Brachypodium distachyon) NLP 단백질과 정렬했다(도 11). 본 실시예에 사용된 OsNLP2는 GAF 유사 도메인, RWP-RK 도메인(N567 to V615) 및 C-말단 Phox 및 Bem1(PB1) 도메인(L835 to D915)을 가지고 있다(도 11). GAF-유사 도메인은 NLP 서브 패밀리 단백질의 N-말단 영역에서 검출되었다. NLP 단백질에서 GAF-유사 도메인의 기능은 아직 알려지지 않았다. RWP-RK 모티프에는 RWP-RK 계열 단백질의 DNA 결합을 담당하는 보존된 아미노산 서열 Arg-Trp-Pro-X-Arg-Lys (X, 모든 아미노산)이 포함되어 있다. PB1 도메인에는 양으로 하전된 라이신(K, lysine)과 음으로 하전된 OPCA 모티프(D-x-D/E-x-D/E)가 포함되어 있다(도 11). NLP에서 GAF 유사 도메인의 기능은 아직 알려지지 않았다. 정렬된 NLP 단백질의 대부분은, 표준 RWP-RK 모티프가 없는 OsNLP6을 제외하고는, 보존된 RWP-RK 도메인과 PB1 도메인을 공유한다. OsRKD 단백질에는 PB1 도메인이 없다. 또한 MEGA7 software를 사용하여 인접 결합 방법(neighbor-joining method)으로 계통 발생 트리를 구성했다(도 12). NLP 서브 패밀리 단백질은 계통 발생 트리에서 RKD 서브 패밀리 단백질과 구별된다. 본 실시예에 사용된 OsNLP2는 계통 발생적으로 BdNLP4, OsNLP5 및 BdNLP3에 매우 가깝다(도 12). 식물 RWP-RK 계열 단백질의 아미노산 서열은 rice genome annotation project, the Arabidopsis Information Resource (TAIR), Phytozome 및 NCBI의 정보를 기반으로 정렬되었다. 정렬된 식물 NPL 단백질의 수탁 번호는 하기 표 2에 나열되어 있다.
Arabidopsis thaliana
AtNLP1 AT2G17150
AtNLP2 AT4G35270
AtNLP3 AT4G38340
AtNLP4 AT1G20640
AtNLP5 AT1G76350
AtNLP6 AT1G64530
AtNLP7 AT4G24020
AtRKD1 AT1G18790
AtRKD2 AT1G74480
AtRKD3 AT5G66990
AtRKD4 AT5G53040
AtRKD5 AT4G35590
Medicago truncatula
MtNLP1 Medtr2g099350
MtNLP2 Medtr4g068000
MtNLP3 Medtr1g100970
Brachypodium distachyon
BdNLP1 Bradi1g76340
BdNLP2 Bradi4g37147
BdNLP3 Bradi 4g20717 & Bradi4g20730
BdNLP4 Bradi5g23300
BdNLP5 Bradi3g03170
BdNLP6 Bradi2g31710
BdNLP7 Bradi2g08177
Oryza sativa ssp. japonica
OsNLP1 Os03g03900
OsNLP2 Os04g41850
OsNLP3 Os01g13540
OsNLP4 Os09g37710
OsNLP5 Os11g16290
OsNLP6 Os02g04340
OsRKD1 Os01g14420
OsRKD3 Os01g37100
OsRKD4 Os04g47640
OsRKD5 Os06g12360
OsRKD6 Os02g51090
OsRKD7 Os08g19820
OsRKD8 Os12g12970
OsRKD9 Os09g27190
OsRKD10 Os02g20530
OsUbiquitin Os06g46770
ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #4-2, #5-1 및 #6-4는 T-DNA 삽입 돌연변이 유발에 의해 야생형 벼 재배종 DJ(dongjin)로부터 생성되었다. ΔOsnlp2 돌연변이체의 모든 정보는 Salk Institute에서 관리하는 Rice Functional Genomic Express Database (RiceGE)에서 얻었다. T-DNA pGA2715는 OsNLP2 genomic DNA의 5'-비번역 부위(UTR, untranslated region)의 -385 bp에 삽입되었다(도 13A). 두 쌍의 프라이머(OsNLP2 forward and OsNLP2 reverse; OsNLP2 forward and T-DNA pGA2715 RB reverse)는 OsNLP2 genomic DNA와의 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 동형 접합(homozygous) transgenic ΔOsnlp2 식물을 선택하도록 설계되었다. 3개의 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #4-2, #5-1 및 #6-4는 PCR 산물의 전기 영동에 의해 동형 접합 돌연변이로 확인되었다(도 13B). 야생형 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이 라인에서 OsNLP2의 전사 수준은 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR) 및 RT 프라이머 세트(LP 및 RP)를 사용한 실시간 qRT-PCR을 사용하여 분석되었다. OsNLP2는 추가 실험에 사용된 3개의 ΔOsnlp2 돌연변이 라인에서는 유의하게 억제되었다(도 13C). ΔOsnlp2 돌연변이 라인 # 6-4를 사용하여 아그로박테리움 매개 벼 형질전환 식물을 제작하였다. 야생형 벼 DJ, Osnlp2 돌연변이 라인 # 6-4 및 복원 식물의 OsNLP 전사 수준은 RT 프라이머 세트(LP 및 RP)를 사용하여 RT-PCR 및 실시간 qRT-PCR 분석을 수행하여 분석하였다. OsNLP2 발현은 야생형 벼 DJ에 비해 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #6-4에서 유의하게 낮았으나, 복원 식물(도 18b의 Complementation No. 3, No. 11, No. 12)에서는 다시 발현 수준이 높아졌다(도 18b).
2. 벼와 M.oryzae 상호 작용에서의 OsNLP2 발현 패턴
질소(N) 활용의 핵심 조절자 유전자인 OsNLP1은 N 부족에 의해 빠르게 유도되었으며, OsNLP1은 질소 사용 효율(NUE, nitrogen use efficiency) 및 벼 수확량 개선을 위한 잠재적 타겟이 된다. 벼에서 OsNLP3는 발아 후 유도되고 열 처리에 의해 억제된다. OsNLP4는 여러 비생물적 스트레스에 의해 억제되고 낮은 인산염 가용성(low phosphate availability)에 의해 유도된다. 그러나 RWP-RK 계열 단백질이 식물 질병 및 면역에 관여하는지 여부는 알려져 있지 않다. 본 발명에서 발명자들은 M.oryzae 감염 동안 동진 벼의 엽초에서 OsNLP2의 전사 수준을 분석했다(도 1). 야생형 쌀로 사용된 DJ 품종의 감염된 엽초는 M.oryzae PO6-6 (독성) and 007 (비독성)을 접종한 후 초기 시점에 샘플링되었다. 실시간 qRT-PCR 데이터는 독성 M.oryzae PO6-6 감염이 초기 감염 단계(3-48hpi)에서 DJ 엽초에서 OsNLP2 발현을 뚜렷하게 유도했음을 보여준다. 대조적으로, 무독성 M.oryzae 007에 의한 감염은 벼와 M.oryzae의 비호환(incompatible) 상호 작용 동안 48hpi까지 OsNLP2 발현을 유발하지 않았다. 이러한 OsNLP2 발현 패턴(도 1)은 OsNLP2가 도열병(blast disease, susceptibility)에 관여하고 HR(hypersensitive response) 세포 사멸을 억제하고 M.oryzae 감염에 대한 벼의 방어 반응을 억제하는 음성 조절 유전자(negative regulator gene) 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
3. OsNLP2 의 세포 내 위치 및 일시적 발현
전사 인자의 식물 특이적 RWP-RK 패밀리 단백질은 적어도 부분적으로 핵에 위치되어 있다. OsNLP2에는 특징적인 RWP-RK 도메인과 C-말단 Phox 및 Bem1(PB1) 도메인(도 2A, 도 11)이 포함되어 있으며, 이는 각각 DNA 결합 및 단백질-단백질 상호 작용에 기능할 수 있다. OsNLP2 코딩 서열 및 그 잘린 RWP-RK 또는 PB1 도메인 영역은 녹색 형광 단백질(GFP) 태그로 구성되고 아그로-침투법(agro-infiltration method)을 사용하여 N.benthamiana 잎에서 일시적으로 발현되었다. N.benthamiana 잎 세포 내부의 핵을 DAPI로 대조 염색하고 형광 현미경을 사용하여 관찰했다(도 2B). 대조군 GFP 구조체(00:GFP)는 N.benthamiana 세포의 원형질막 및 세포질에서 편재적으로 검출되었다. OsNLP2:GFP 는 N.benthamiana 세포의 핵에만 위치했으며, DAPI 염색된 핵과 겹쳤다(도 2B). 그러나, RWP-RK+PB1:GFP 및 PB1:GFP는 세포질과 핵 모두에 위치하였다. 이러한 세포 내 위치 이미지는 OsNLP2가 특정 DNA 서열에 결합하는 전사 인자로 작용할 수 있는 핵 내에 위치함을 나타낸다. OsNLP2가 핵에 위치하기 위해 전체 OsNLP2 코딩 서열이 필요할 수 있지만 특정 RWP-RK 도메인 또는 PB1 도메인은 필요하지 않다. OsNLP2가 식물에서 세포 사멸을 유발하는지 여부를 조사하기 위해 아그로-침투법을 사용하여 N.benthamiana 잎에서 full length OsNLP2와 기능적 PB1 및 RWP-RK-PB1 도메인을 일시적으로 표현했다(도 14). 양성 대조군 인페스틴 1(INF1, Infestin 1)의 일시적 발현은 명백하게 전형적인 세포 사멸 반응을 유도했다. 그러나, full length OsNLP2, PB1 및 RWP-RK-PB1 도메인의 일시적인 발현은 N.benthamiana 잎에서 어떠한 세포 사멸 반응도 유발하지 않았다. 이 일시적 발현 여부는 OsNLP2 발현이 식물에서 세포 사멸을 유발하지 않음을 나타낸다.
4. OsNLP2 돌연변이의 M.oryzae 감염에 대한 과민 반응(HR, hypersensitive response) 내성 반응 유발 효과
식물 질병 및 면역에서 OsNLP2의 역할을 조사하기 위해, 3주령 묘목에서 야생형 동진 벼 및 ΔOsnlp2 녹아웃(KO, knockout) 돌연변이 라인 #4-2, #5-1 및 #6-4의 잎을 M.oryzae PO6-6 (독성) and 007 (비독성)의 분생 포자 현탁액(1.0 x 105 conidia·㎖-1)과 함께 분무 접종(spary-inoculated)시켰다. 이 ΔOsnlp2 돌연변이 라인은 야생형 동진 벼처럼 정상적으로 잘 자랐다. M.oryzae 와 함께 접종 후 5일째에 전체 잎의 병(disease) 표현형을 관찰하고 사진을 찍었다(도 3A). 독성 M.oryzae PO6-6 감염은 동진 벼 잎에 크고 타원형이며 칙칙한 확장된 병변을 나타내는 전형적인 감수성 질병 반응(susceptible disease reaction)을 일으켰다. 대조적으로, ΔOsnlp2 돌연변이 잎은 M.oryzae PO6-6 감염은 작고 괴사성(necrotic)인 짙은 갈색의 제한된 반점과 함께 전형적인 과민 반응(HR) 내성 반응을 나타냈다. 무독성 M.oryzae 007 감염은 또한 동진 벼와 Osnlp2 돌연변이 잎에서 작은 크기의 갈색 병변과 저항 반응을 유도했다(도 3A). 특히, ΔOsnlp2 돌연변이체의 잎은 M.oryzae 007 감염 동안 변색되어 황백색 또는 옅은 노란색으로 변색되었다. 이러한 감염 표현형은 ΔOsnlp2 돌연변이 #4-2, #5-1 및 #6-4가 M.oryzae PO6-6 및 007에 대해 매우 내성이 있음을 나타낸다.
세포 수준에서 ΔOsnlp2 돌연변이 라인의 초기 감염 반응을 조사하기 위해, M.oryzae PO6-6 및 007의 분생 포자 현탁액(5.0 x 105 conidia·㎖-1)을 5주령된 식물 성장 단계의 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이 라인의 엽초에 접종했다. 감염된 벼 엽초의 표피층을 잘라내어 현미경으로 48hpi에서 관찰하였다. M.oryzae에 대한 벼 표피 세포의 감염 반응은 세 가지 감염 유형으로 분류되었다; 1) 세포 그룹에서 구상(bulbous) 침습성 균사(IH, invasive hyphae)를 발생시키는 확장 감염, 2) 단일 세포에서 제한된 얇고 사상(filamentous)의 균사 성장이 있는 단일 세포 감염, 3) 소포(vesicles)를 포함한 세포 응집체(암갈색)에 의한 과민 반응(HR) 세포 사멸(도 3B). 독성 M.oryzae PO6-6는 70.4% 세포에서 확장 감염을 일으켰지만, 야생형 동진 벼의 17.6% 세포에서 HR 세포 사멸을 일으켰다(도 3B). 대조적으로, M.oryzae PO6-6 감염은 3개의 ΔOsnlp2 돌연변이 라인의 엽초에서 72% 이상의 세포에서 HR 세포 사멸 반응을 일으켰다. 그러나, ΔOsnlp2 복원 식물에서는 HR 세포 사멸 비율이 27.88%로 감소하여 야생형 벼 DJ과 유사하였다(도 18c). 무독성 M.oryzae 007 감염은 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 모두 86% 이상의 표피 세포에서 HR 세포 사멸 반응을 유도했다. 이러한 초기 감염 반응 데이터는 ΔOsnlp2 돌연변이가 M.oryzae PO6-6 및 007에 대해 매우 내성이 있음을 나타낸다.
5. ΔOsnlp2 돌연변이체에서 M.oryzae 에 대한 ROS 및 철 의존성 ferroptotic 세포 사멸 효과
Osnlp2 knockout 돌연변이가 벼에서 HR 세포 사멸 반응을 유발하는지 여부를 조사하기 위해, 초기 M.oryzae PO6-6 감염 동안 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이체의 엽초 세포에서 ROS 및 철 이온(Fe3+) 축적과 지질 과산화를 분석했다(도 4). ROS 축적은 CM-H2DCFDA 및 DAB 염색에 의해 감지되고 시각화되었다. ROS 민감성인 CM-H2DCFDA 염료는 살아있는 식물 세포에서 ROS 위치를 모니터링하는 데에 사용되었다. CM-H2DCFDA 염료는 살아있는 세포에서 ROS와 반응하여 2', 7' - dichlorofluorescein (DCF)를 생성한다. 이는 녹색 형광(GF) 필터가 있는 형광 현미경을 사용하여 검출할 수 있는 고형광(highly fluorescent) 제품이다.
CM-H2DCFDA(녹색 형광) 및 DAB(짙은 갈색) 염색 이미지는 ROS(H2O2)가 ΔOsnlp2 표피 세포에서 침습성 균사(IH) 내부 및 주변에 강하게 축적되었지만 초기 M.oryzae PO6-6 감염 동안 야생형 동진 벼 세포에는 축적되지 않았음을 보여준다(도 4A). CM-H2DCFDA에 특이적인 ROS-localized 형광은 20-48hpi에 ΔOsnlp2 돌연변이 세포에서 IH 내부 및 주변에서 뚜렷하게 볼 수 있었다(도 4A, 도 15). DAB는 과산화 효소의 존재 하에 H2O2에 의해 산화되어 식물 세포에서 암갈색 침전물을 생성한다. 세포 응집체(암갈색)를 갖는 DAB로 염색된 표피 세포는 48hpi에 ΔOsnlp2 돌연변이체의 엽초에서 관찰되었다. 화학 발광 분석은 ROS 축적 수준이 48hpi에 동진 벼 세포에서보다 ΔOsnlp2 돌연변이 세포에서 유의하게 더 높았다는 것을 보여준다(도 4B).
벼 표피 세포에서 철 이온(Fe3+) 축적 및 위치는 M.oryzae 007 감염 48hpi에 프러시안 블루(파란색) 염색에 의해 검출되었다(도 4A). 반응성이 높은 Fe2+는 H2O2에 의해 산화되어 Fe3+ 및 독성 OH·을 생성하여(Fenton 반응) 지질, 단백질, DNA 및 세포 성분에 심각한 손상을 초래한다. 48hpi에 Fe3+의 축적 ΔOsnlp2 표피 세포에서 침습성 균사 내부 및 주변에서 관찰되었지만(파란색) 동진 벼 세포에서는 관찰되지 않았다(도 4A). 이러한 결과는 ROS와 철 이온(Fe3+)이 감염 중에 ΔOsnlp2 세포에 동시에 축적되었음을 나타낸다.
다음으로, 본 발명자는 M.oryzae 007을 사용하여 48hpi에서 동진 벼와 ΔOsnlp2 엽초의 지질 과산화를 분석했다(도 4C). 지질의 산화 또는 지질 과산화는 지방산 막의 다중 불포화 지방산을 공격하는 여러 ROS(히드록실 라디칼, 과산화수소 등)의 영향에 의해 생성되어 상당한 조직 손상을 초래한다. 지질 과산화의 중요한 지표인 말론디알데히드(MDA, Malondialdehyde)는 티오바르비투르 산(TBA, thiobarbituric acid)과의 반응 후 분광 광도계를 사용하여 정량화되었다. 지질 과산화 수준(MDA 수준)은 동진 벼 세포(도 4C)보다 ΔOsnlp2 엽초에서 유의하게 높았으며, 이는 강화된 ROS 및 Fe3+ 수준이 ΔOsnlp2 세포에서 산화 스트레스 수준의 상승으로 이어진다는 것을 나타낸다. ΔOsnlp2 엽초에서 ROS 및 철 이온(Fe3+) 축적 및 지질 과산화는 M.oryzae 감염에 대한 ROS 및 철 의존성 ferroptotic 세포 사멸 반응에 관여할 수 있다.
6. DFO(철 킬레이터) 및 Fer-1(페롭토시스 억제제)의 M.oryzae 에 대한 ΔOsnlp2 돌연변이체에서 ROS 및 철 의존성 페롭토시스 세포 사멸 억제 효과
철 킬레이터(chelator) 데페록사민(DFO, deferoxamine)(3 mM)을 M.oryzae PO6-6으로 접종한 후 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #4-2의 엽초에 처리했다. DFO 처리는 M.oryzae PO6-6에 감염된 ΔOsnlp2 엽초에서 ROS 및 철 이온의 축적과 HR 세포 사멸을 억제했다(도 5). ROS 축적은 DAB 염색에 의해 검출되었고, 철 이온(Fe3+) 축적은 프러시안 블루 염색에 의해 가시화되었다(도 5A). ROS 및 철 이온(Fe3+) 축적 및 HR 세포 사멸은 DFO로 처리된 ΔOsnlp2 엽초의 감염된 벼 세포에서 뚜렷하게 억제되었다. ROS 생산의 화학 발광 분석은 DFO 처리가 M.oryzae PO6-6에 감염된 ΔOsnlp2 엽초에서 ROS 축적을 유의하게 억제했음을 보여준다(도 5B). 다음으로, 현미경을 사용하여 48 hpi에서 DFO(3 mM)로 처리된 벼 엽초(rice sheaths)에서 감염된 세표 표현형(확장 감염, 단일 세포 감염 및 HR 세포 사멸)을 정량화했다(도 5C). DFO 처리는 ΔOsnlp2 엽초에서 HR 세포 사멸 반응의 유도를 강력하게 억제하여 궁극적으로 M.oryzae의 호환적인(compatible) IH 성장을 유도했다.
페롭토시스(ferroptosis) 억제제인 페로스타틴-1(Fer-1, ferrostatin-1)(10 μM)을 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #4-2의 감염된 벼 엽초에 24hpi에서 처리하였다. Fer-1 처리는 M.oryzae PO6-6 감염 동안 ΔOsnlp2 엽초에서 ROS 및 Fe3+의 축적, 지질 과산화 및 HR 세포 사멸을 뚜렷하게 억제했다(도 6). 현미경 이미지는 M.oryzae 감염 동안 Fer-1 처리가 ΔOsnlp2 돌연변이 #4-2의 엽초 표피 세포에서 IH 내부 및 주변의 ROS 및 Fe3+의 축적을 뚜렷하게 차단했음을 보여준다(도 6A). 특히, Fer-1 처리는 ΔOsnlp2 엽초에서 세포 응집체(암갈색) IH 주변의 HR 세포 사멸 반응을 유의하게 억제하여 벼 엽초 세포(rice sheat cell)에서 IH의 성공적인 집락화(colonization)을 유도했다(도 6A 및 도 6D). 화학 발광 분석은 또한 Fer-1 처리가 48 hpi에서 ΔOsnlp2 외피 표피 세포에서 ROS 생성을 상당히 억제했음을 보여준다(도 6B). MDA 분석을 사용하여 모의(mock) 및 Fer-1 처리된 ΔOsnlp2 엽초 세포에서 48 hpi에서 지질 과산화 수준을 추가로 정량화했다(도 6C). M.oryzae PO6-6 감염은 HR 세포 사멸 반응을 나타내는 ΔOsnlp2 엽초 세포에서 지질 과산화를 뚜렷하게 유도했다. 그러나 10 μM Fer-1 처리는 M.oryzae PO6-6에 감염된 ΔOsnlp2 엽초에서 지질 과산화를 억제했다.
7. Cyt A(액틴 중합 억제제) 및 DPI(NADPH 산화 효소 억제제)의 M.oryzae 에 대한 ΔOsnlp2 엽초에서 ROS 및 철 이온의 축적과 HR 세포 사멸 억제 효과
Cyt A(20 ㎍·㎖-1) 또는 DPI(5 μM) 용액에 M.oryzae PO6-6의 분생 포자 현탁액(conidial suspension)(5 x 105 conidia ㎖-1)을 벼 엽초(rice leaf sheaths)에 접종하였다. CM-H2DCFDA, DAB 및 프러시안 블루 염색 이미지(도 7A)에서 볼 수 있듯이 Cyt A 처리는 ΔOsnlp2 엽초에서 M.oryzae PO6-6에 의해 유도된 ROS 및 Fe3+의 축적과 HR 세포 사멸을 억제했다. 화학 발광 분석은 또한 Cyt A 처리가 48 hpi에서 ΔOsnlp2 엽초에서 ROS 생성을 유의하게 억제했음을 보여준다(도 7B). M.oryzae PO6-6은 Cyt A(20 ㎍·㎖-1)로 처리된 ΔOsnlp2 엽초 세포에서 정상적인 균사 균주로 잘 자랐다(도 7C). DPI(5 μM) 처리는 M.oryzae PO6-6에 감염된 ΔOsnlp2 엽초에서 ROS 및 Fe3+의 축적과 HR 세포 사멸을 뚜렷하게 억제하여 벼 엽초 세포 내부에 IH의 성공적인 집락화(colonization)을 유도했다(도 8). ΔOsnlp2 세포의 ROS 축적은 CM-H2DCFDA 및 DAB 염색에 의해 검출되었으며, Fe3+의 축적은 프러시안 블루 염색에 의해 시각화되었다(도 8A). 화학 발광 분석으로 정량화한 바와 같이 DPI 처리는 48hpi에서 ΔOsnlp2 엽초에서 ROS 생성을 현저하게 억제했다(도 8B). 그러나, DPI 처리는 M.oryzae PO6-6 감염을 분명하게 촉진시켰지만 ΔOsnlp2 엽초에서 HR 세포 사멸을 억제했다(도 8C).
8. M.oryzae 감염 동안 ΔOsnlp2 돌연변이 세포에서 방어 관련 유전자(defense-related genes)의 시간 경과에 따른 발현
본 발명자들은 다음으로 M.oryzae PO6-6 접종 후 시간에 따라 동진 벼 및 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #4-2 엽초에서 OsPBZ1, OsPIP-3A, OsWRKY104, OsWRKY90 및 OsRbohB의 발현 수준을 정량화했다(도 9). OsPBZ1는 벼에서 PBZ(probenazole) 유도성 유전자로 확인되었다. 플라즈마 막 내재 단백질(PIP, plasma membrane intrinsic proteins)인 아쿠아포린(aquaporins)은 살아있는 유기체의 생물학적 막을 통해 물과 작은 중성 분자의 수송을 촉진하는 막 채널이다. M.oryzae PO6-6 감염은 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #4-2 엽초에서 6-36hpi에서 OsPBZ1 발현을 뚜렷하게 유도했지만 야생형 동진 벼에서는 거의 나타나지 않았다. OsPIP-3A는 동진 벼에 비해 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #4-2에서 6hpi 및 24-48hpi에서 고도로 유도되었다. OsPIP2;1은 물 수송 및 식물 성장 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었다. WRKY 단백질은 다양한 식물 과정에 관여하지만 특히 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 유도성 방어 반응에 관여하는 대규모 전사 인자 군이다. OsWRKY104 유도는 3-24hpi에서 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #4-2의 엽초에서 명백했다. 그러나 OsWRKY90은 OsWRKY104에 비해 ΔOsnlp2 엽초에서 유도되지 않았다. 식물 호흡기 파열 산화 효소 동족체(PBOH, plant respiratory burst oxidase homologs)는 식물 면역에 관여하는 활성 산소 종(ROS)을 생성한다. 특히, NADPH 산화 효소 OsRbohB는 ΔOsnlp2 엽초에서 3-18hpi에서 뚜렷하게 촉발되었다. 무독성 M.oryzae P007 감염의 경우, 독성 M.oryzae PO6-6 감염과 달리, 초기 감염 시 야생형 동진 벼의 엽초에서 이러한 모든 방어 관련 유전자 OsPBZ1, OsPIP-3A, OsWRKY104, OsWRKY90 및 OsRbohB를 뚜렷하게 유도했다(도 16). 종합적으로, 이러한 결과는 M.oryzae PO6-6 감염이 ΔOsnlp2 엽초에서 OsPBZ1, OsPIP-3A, OsWRKY104 및 OsRbohB 발현을 유발한다는 것을 나타낸다.
9. 다른 M.oryzae 균주에 대한 ΔOsnlp2 돌연변이 라인의 높은 저항성(resistance) 및 Osnlp2 복원 식물의 감수성(susceptibility)
본 발명자들은 ΔOsnlp2 돌연변이 라인이 야생형 동진 벼에 대해 독성이 있는 다른 M.oryzae 균주 KI215, KJ401, 70-15, Y34 및 RO1-1에 내성이 있는지 여부를 추가로 조사했다. ΔOsnlp2 돌연변이체의 초기 감염 반응은 다양한 M.oryzae 균주로 벼 엽초를 접종한 지 48시간 후에 현미경으로 세포 수준에서 조사되었다(도 10). 전반적으로 야생형 동진 벼는 테스트된 모든 M.oryzae 균주에 매우 감수성(susceptibility)을 나타냈다. 그러나, ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #4-2, #5-1 및 #6-4는 이들 M.oryzae 균주에 대해 높은 내성을 가졌다. 테스트된 모든 M.oryzae 균주에 의한 초기 감염 동안, 야생형 동진 벼의 엽초 세포는 민감성 감염 유형, 즉 다중 세포에서 감연 균사 성장이 확장된 60-80%의 세포를 나타냈다. 대조적으로, M.oryzae KI215는 ΔOsnlp2 돌연변이체에서 엽초의 60% 이상이 표피 세포에서 HR 세포 사멸 반응을 유도했다. M.oryzae KJ401, 70-15, Y34 및 RO1-1 감염은 48hpi에서 약 80% 세포 수준으로 표피 세포에서 HR 세포 사멸 반응을 유도했다. 종합적으로, 이러한 결과는 ΔOsnlp2 돌연변이 라인이 다양한 M.oryzae 균주에 대한 광범위한 스펙트럼(broad spectrum)을 갖는 race 비특이적 저항성(race-nonspecific resistance)을 나타낸다는 것을 제시한다.
추가로 본 발명자들은 M.oryzae PO6-6, KJ401, 70-15, RO1-1 및 Y34 균주를 야생형 동진 벼, ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #6-4 및 Osnlp2 유전자가 복원된 식물의 엽초에 접종하여 저항성 반응을 나타내는지 확인하였다. 벼 세포에서 세 가지 감염 유형(확장 감염, 단일 세포 감염 및 과민 반응(HR) 세포 사멸)을 나타내는 세포 수를 48 hpi에서 현미경으로 계산하였다. 도 18c에 나타난 바와 같이, 복원 식물 No. 3, No. 11, No. 12은 야생형 동진 벼와 같이 M.oryzae PO6-6, KJ401, 70-15, RO1-1 및 Y34 균주에 의해 확장 감염을 나타냈다. 그리고 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #6-4이 M.oryzae PO6-6, KJ401, 70-15, RO1-1 및 Y34 균주 감염에 대해 60% 이상의 세포에서 과민 반응(HR) 세포 사멸을 나타낸 것과 달리, 복원 식물 No. 3, No. 11, No. 12은 HR 세포 사멸률이 약 20%~60%로 나타나 독극성 균주에 대한 저항성이 낮은 것으로 나타났다(도 18c). 이는 복원 식물 No. 3, No. 11, No. 12가 ΔOsnlp2 돌연변이 라인 #6-4과 달리 M.oryzae PO6-6, KJ401, 70-15, RO1-1 및 Y34에 대해 내성이 없음을 나타낸다.
즉, Osnlp2 유전자가 복원된 식물은 Osnlp2 유전자 결핍 돌연변이 벼가 도열병균에 대해 저항성을 보이는 것과 달리 야생형 동진 벼처럼 정상적으로 도열병균 접종에 의해 도열병이 발생하였다. 이는 Osnlp2 유전자가 벼의 도열병에 대해 저항성을 결정하는 음성(negative) 조절 인자임을 시사한다.

Claims (9)

  1. 벼과 식물체의 NLP(Nodule inception-like protein) 유전자 발현 결손 또는 저해제를 포함하는 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 NLP 유전자는 OsNLP2 (Oryza sativa nodule inception-like protein 2) 유전자인, 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 결손 또는 저해제는 EMS(ethyl methanesulfonate), DMS(dimethyl sulfate), T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제(Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/CRISPR-associated　sequences9 nuclease)인, 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물.
  4. 벼과 식물체에서 NLP(Nodule inception-like protein) 유전자 발현을 결손 또는 저해하는 단계를 포함하는 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 NLP 유전자는 OsNLP2 (Oryza sativa nodule inception-like protein 2) 유전자인, 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 발현 결손 또는 저해는 EMS(ethyl methanesulfonate), DMS(dimethyl sulfate), T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제(Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/CRISPR-associated　sequences9 nuclease)를 식물체에 도입하여 수행되는, 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법.
  7. NLP(Nodule inception-like protein) 유전자 발현이 결손 또는 저해된 도열병 저항성이 증진 또는 개선된 벼.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 NLP 유전자는 OsNLP2 (Oryza sativa nodule inception-like protein 2) 유전자인, 도열병 저항성이 증진 또는 개선된 벼.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 발현 결손 또는 저해는 EMS(ethyl methanesulfonate), DMS(dimethyl sulfate), T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 CRISPR/Cas9뉴클레아제(Clustered　Regularly　Interspaced　Short　Palindromic　Repeats/CRISPR-associated　sequences9 nuclease)를 식물체에 도입하여 수행된, 도열병 저항성이 증진 또는 개선된 벼.
PCT/KR2022/005307 2022-04-12 2022-04-12 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선용 조성물 및 벼 도열병 저항성 증진 또는 개선 방법 WO2023200023A1 (ko)

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