KR100803174B1

KR100803174B1 - 식물체 스트레스 저항성 부여방법 및 이에 의해 얻어지는 식물체

Info

Publication number: KR100803174B1
Application number: KR1020060084587A
Authority: KR
Inventors: 한창덕; 은무영; 윤도원; 남민희; 이기환; 한성숙; 이증주; 박해룡; 박수현
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2005-09-05
Filing date: 2006-09-04
Publication date: 2008-02-14
Also published as: KR20070026257A; WO2007029955A1

Abstract

본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 OsCIPK9 유전자 발현의 억제변이를 유도하여 도열병 저항성 및 제초제 파라쿼트 내성 식물체를 획득하는 방법 및 그에 의해 획득된 식물체에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, OsCIPK9 유전자의 발현을 억제함으로 callose 축적을 감소시키며 재해저항성이 향상된 식물체를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명에 의해서 다양한 변이유발원을 통해 OsCIPK9 변이를 유도하여 식물체에 재해 저항성을 향상시킬 수 있다.

스트레스, 저항성, 칼로스, 벼, 단자엽 식물, 도열병, 제초제, 파라쿼트, 그라목손

Description

식물체 스트레스 저항성 부여방법 및 이에 의해 얻어지는 식물체{A Method for Producing a Stress-resistant Plant and the Plant by the Method}

도 1a는 본 발명에서 적용된 TAIL-PCR의 진행흐름을 보여주는 개념도.

도 1b는 TAIL-PCR 결과물의 전기영동 사진.

도 2a는 OsCIPK9 :: Ds 대립인자의 염색체상의 구조도.

도 2b는 OsCIPK9 :: Ds 식물체에서 OsCIPK9 mRNA발현이 억제되는 것을 보여 주는 사진.

도 3a 및 도 3b는 OsCIPK9 유전자가 상처에 반응하여 빠르게 발현됨을 보여주는 사진.

도 4는 변이체 (OsCIPK9::Ds)와 정상적인 식물체에서 상처부위와 수술화분에서의 callose 축적을 보여주는 사진.

도 5는 본 발명에 의해 도열병에 의한 상처 부위에서의 callose 축적을 보여주는 사진.

도 6은 aluminum 용액에 노출된 뿌리에 대한 정상적인 식물체와 변이체의 차이를 보여주는 immunolocalization 사진.

도 7는 OsCIPK9 변이체(OsCIPK9::Ds)의 도열병 저항성을 보여주는 사진.

도 8a은 OsCIPK9 변이체(OsCIPK9::Ds)의 제초제 내성을 보여주는 사진.

도 8b는 제초제에 의한 손상정도를 나타내는 과산화지질양 측정결과 도표.

도 9은 본 발명에 의한 과발현 벡터의 개념도.

도 10은 OsCIPK9-과발현 형질전환체에서 callose이 과량 축적됨을 보여주는 사진.

도 11은 제초제에 대해 잎 엽록소 파괴 정도를 보여 주는 사진.

도 12a 및 12b는 OsCIPK9 유전자 산물과 다른 유사 단백질의 아미노산 서열의 상동성을 보여주는 표.

본 발명은 스트레스 저항성에 관련된 단백질, 그를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 식물체에 스트레스 저항성을 부여하는 방법 및 그에 의해 제작된 식물체에 관한 것이다.

식물은 생활사 동안 다양한 환경 스트레스를 받게 되고, 이는 식물체의 올바른 생육에 좋지 않은 영향을 준다. 식물은 변화하는 환경에 대응하기 위해 적극적인 저항성 반응을 유도하는데, 그중 가장 흥미로운 것은 다양한 방어-관련 유전자 들의 발현을 유도하는 것이다.

예를 들면, 식물이 손상(wounding) 되거나 저온-고온 스트레스를 받거나, 바이러스나 미생물 등의 병원균에 의해 공격당하거나(pathogen attach) 중금속(특히 aluminum)에 노출되거나, 세포해리(cell plasmolysis) 등과 같이 다양한 종류의 외부 자극을 받았을 경우 (1→3) β-glucan (일명 "callose")이 세포벽에 축적되는 것으로 밝혀졌다 (Stone, B.A. and Clarke, A.E. 1992 "The Chemistry and Biology of (l, 3)-[β-Glucans]" La Trobe University Press, Australia ; Samuels, A.L., Giddings, T.H. Jr. and Staehelin, L.A. 1995 J. Cell Biol. 130: 1345~1357; Brown, R.C., Lemmon, B.E., Stone, B.A. and Olsen, O.-A. 1997 Planta 202: 414~426.). 이러한 현상은 세포내의 Ca⁺⁺ 이 증가됨에 따라 callose synthase가 활성화되기 때문인 것이며, 생성된 callose는 식물체의 스트레스, 병 또는 중금속에 대한 저항성을 부여하는 중요한 물질로서, 농업적으로 매우 중요한 것으로 알려져 있다. (Stone, B.A. and Clarke, A.E. 1992 "The Chemistry and Biology of (l, 3)-[b-Glucans]" La Trobe University Press, Australia; Granados G, Pandey S and Ceballos H. 1993 Crop Sci. 33: 936~940 ; StaβA and Horst W J. 1995 Plant Soil 171:89~103; Taylor G 1995 J. Plant Soil 171:111~118) 그러나 현재 이러한 외부 내부 자극에 의해 어떻게 callose synthase의 활성이 조절되어 callose가 생성되고 축적되는지는 전혀 밝혀지지 않고 있다.

벼에는 약 31개의 유사한 OsCIPK (Oryza sativa Calcineurin B-like protein interacting protein kinase) 유전자가 존재하는데, 이들은 세포 내에서 Ca⁺⁺ 농도 변화에 따라 Calcineurin B-like (CBL) 단백질과 결합하게 되는 인산화 단백질 유전자이다.(Uner Kolukisaoglu et al., 2004 Plant Physiology, 134: 43-58; Albrecht et al., 2001 EMBO J 20:1051-1063) 그러나, 아직까지 이들 유전자들이 어떠한 기능을 하는지, 스트레스 저항성과 관련이 있는지, 관련이 있다면 스트레스 저항성 발현과 관련하여 어떠한 신호 전달 경로를 가지는지, 이들이 정확히 어떠한 기작으로 저항성을 발현되도록 하는지에 대해서는 명확히 밝혀진 바가 없다.

본 발명자들은 식물체의 환경 스트레스에 대한 저항성과 관련된 유전자를 탐색하기 위한 연구를 수행한 결과, 벼에 존재하는 OsCIPK 중 OsCIPK9가 세포내의 callose의 생성이나 축적에 관련하는 기능을 가지고 있다는 것을 기초하여 본 발명을 완성한 것이다.

본 발명은, 식물체에 스트레스 저항성 관련 단백질 및 그를 코딩하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 식물체 스트레스 저항성에 관여하는 유전자로써 스트레스 저항성 식물체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

삭제

본 발명은 종래 기능이나 역할이 전혀 밝혀지지 않았던 벼 유래의 OsCIPK9 유전자가 callose의 생성·축적을 조절하는 기능을 가지며, 상기 유전자가 변이되어 callose의 생성·축적이 미미하게 된 변이체가 병 저항성 및 제초제 저항성을 가짐을 최초로 발견함으로써 이루어진 것이다.
즉, 본 발명자들이 개발한 벼에서의 삽입 변이 유도체계인 Ac/Ds tagging system(Chin HG, et al.. Plant J 19, 615-623, 1999; Kim et al., 2004 Plant J 39: 252-263)을 이용하여 식물 변이체를 얻고 각 변이체의 특성을 분석하였다. Ac/Ds tagging system은 옥수수의 전이인자인 Ac와 Ds를 유전자 조작한 후 벼의 genome 상에 형질전환 방법으로 삽입시켜 확립했다. Ds는 Ac가 같은 게놈 상에 존재할 때 전이된다는 사실에 착안하여 system을 구축하였다. 상기 시스템은 Ds 안에 reporter gene이 설치되어 Ds가 염색체상의 유전자 부근 또는 내부에 삽입되었을 때 host 유전자에 의해 reporter gene의 형질이 발현되도록 고안된 것이다. 이 tagging system은 유전자의 기능을 변이를 통해 동정하고 동시에 형질발현을 reporter gene을 통해 관찰할 수 있는 매우 강력한 연구 방법이다. 상기 논문 및 본 발명에서 reporter gene으로는 GUS를 사용하였지만, 적절한 표시기능이 있는 유전자라면 reporter gene으로 활용할 수 있을 것이다.

Ac/Ds tagging system을 이용하여 얻어진 본 발명의 상기 변이체 (OsCIPK9::Ds)는 OsCIPK9 유전자에 Ds가 삽입된 것이다. 상기 변이체를 통하여 OsCIPK9 유전자가 callose 발생에 관여하는 유전자임을 밝혔으며 이어서 상기의 변이체가 병(도열병)과 제초제 (파라쿼트(그라목손)) 저항성을 갖게 되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하 단계별로 본 발명을 상세히 설명한다.

(1) 특정 변이체의 선별, 변이된 유전자 및 변이체 발현 분석

본 발명자들이 개발한 삽입 변이 유도체계인 Ac/Ds tagging system을 이용하 여 벼의 변이체를 다량 제작하고, 특이 표현형질을 나타내는 변이체로부터 변이된 유전자를 분석하였다. Ac/Ds tagging system의 Ds안에는 GUS coding region이 존재하므로 상기 시스템에 의해 변이된 변이체들은 정상 식물체와는 달리 특정 부위에서 GUS가 발현될 수 있으며, GUS staining을 통하여 GUS가 발현되는 부위를 확인할 수 있다. 또한 상기 시스템을 이용하는 경우 TAIL-PCR을 통하여 Ds flanking DNA를 얻을 수 있으므로 염색체 상의 Ds가 삽입된 부위(유전자)를 용이하게 분리할 수 있는 특성이 있다.

본 발명에서는 전이인자 Ds가 삽입된 다양한 벼 변이체 중에서 특히 vascular system에 GUS가 발현되는 변이체를 선발하였다. 이어서 통상의 방법으로 변이체의 DNA를 추출하였고 TAIL-PCR 방법을 사용하여 Ds가 위치한 벼의 genomic DNA에 대한 정보를 얻었다. 본 발명에 사용한 TAIL-PCR은 Ds의 말단에 3개의 프라이머(각각 서로 다른 위치에 있음)와 하나의 AD 프라이머를 이용하여 3차에 걸친 PCR로 수행하였으며 이를 통해 Ds와 인접한 벼의 genomic DNA (Ds flanking DNA)를 얻었다. 본 발명자들은 Ds flanking DNA의 염기서열을 기초로 아래 "실시예 1"에서 자세히 기술한 바와 같이 bioinformatic search 및 cDNA 크로닝 분석을 통하여 Ds에 의해 변형되기 전 유전자에 대한 서열번호 2를 얻었다. 서열번호 2의 유전자를 computer bioinformatic search를 통하여 검색한 결과, 분리된 유전자는 벼에 약 31개 이상 존재하는 Calcineurin B-like (CBL) 단백질과 결합하는 인산화 단백질 (CIPK: Calcineurin B-like (CBL) protein Interacting Protein Kinase) 중의 하나를 코딩하는 OsCIPK9 유전자인 것으로 판명되었다. 얻어진 Ds flanking DNA의 염기서열 (서열번호 3)과 전 유전자 염기서열을 분석한 결과, 변이체는 유전자의 genomic DNA 중 ATG (start codon)으로부터 927번째 base 에 4.7kb 크기의 Ds 서열이 삽입되어 있음을 확인하였다. Ds가 삽입되어 생긴 대립인자를 OsCIPK9::Ds라 명하였다.

실시예1은 OsCIPK9 유전자의 발견과 염기서열 분석에 관한 실험과 변이체 OsCIPK9::Ds가 OsCIPK9 mRNA를 발현하지 못함을 보여주는 Northern 분석에 관한 것이다.

(2) OsCIPK9 유전자의 형질 발현 분석

분석된 OsCIPK9 유전자가 실제 스트레스에 관계된 유전자인지 즉, 스트레스가 가해질 때 OsCIPK9 유전자의 발현이 증가하는지를 RNA Northern hybridization을 통하여 확인하였다.

정상적 벼 식물체에서 정상적인 조건에서는 상기 유전자의 발현이 낮으나 상처 스트레스를 가하면 매우 높은 수준으로 상기 유전자가 발현되는 것을 관찰하였다. 변이체에서도 스트레스가 가해진 경우, Ds안에 존재하는 GUS coding region을 통하여 OsCIPK9::Ds가 높은 수준으로 발현하는 것을 GUS staining을 통하여 관찰하여 Northern blot과 같은 결과를 얻었다.

실시예 2는 위에 기술한 OsCIPK9 유전자의 발현 양상을 분석한 것이다.

(3) OsCIPK9 변이체 ( OsCIPK9::Ds )를 통한 유전자의 기능 검증

OsCIPK9 변이체 (OsCIPK9::Ds)가 다양한 스트레스를 받았을 때 callose를 생성하는지 여부를 확인하였다. callose의 존재 여부는 callose와 특이적으로 결합하여 형광을 내는 aniline blue chemical을 식물체 조직에 가하고 자외선으로 관찰하여 확인하였다.(Sprau, F. 1955 Ber. Dtsch. Bot. Ges. 68:239-246; Schrich, W. 1956 Protoplasma 47:487-530; Hood, M. E., Shew, H. D., 1996 Phytopathology 86:704-708)

① 전통적으로 callose가 축적되는 것으로 알려진 상처부위, 화분을 만드는 수술, 그리고 aluminum 중금속에 노출되었을 경우, 정상적인 식물체는 aniline blue가 강하게 염색되어 callose가 축적되는 것이 관찰되었으나 변이체에서는 전혀 aniline blue의 형광이 관찰되지 않았다.

② 병충해 침입에 따른 callose 축적도 OsCIPK9에 의해 결정되는지를 관찰하기 위하여 도열병 침입에 따른 상처 부위에 callose 축적을 조사하였다.

정상적인 식물체에서 강한 aniline blue 염색이 관찰된 반면 변이체에서는 도열병 상처 부위에 aniline blue 염색이 관찰되지 않아 callose가 축적되지 않는 것으로 확인되었다.

③ callose 축적을 재확인하기 위해서 callose-specific 항체를 이용하여 관찰하였다. 정상적인 식물체와 변이체의 뿌리를 중금속에 노출시킨 후 뿌리를 잘라 callose 항체를 이용한 immunolocation을 실시하였다. 정상적인 식물체에서 많은 callose가 축적되었으나 변이체에서는 callose가 적게 축적되는 것으로 확인되었다.

④ 또한 정상적 조건에서는 발현정도가 매우 낮은 OsCIPK9을 과발현 promoter를 이용하여 과발현시킨 형질전환체에서는 callose가 많이 생성되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과들은 OsCIPK9이 callose 형성에 매우 중요한 역할을 하고 있다는 결정적인 실험적 증거들이다.

실시예 3은 변이체와 정상적인 식물체를 이용하여 OsCIPK9 유전자가 callose 생성·축적에 관여한다는 증거와 OsCIPK9 과발현 식물체의 callose 생성 정도를 확인한 것이다.

(4) 변이체의 도열병에 대한 저항성

OsCIPK9 변이체(OsCIPK9::Ds)가 callose를 축적하지 못함으로써 정상적인 식물체에 병을 유발하는 도열병균주에 대해 저항성을 획득하게 되었음을 실험적으로 증명하였다.

실시예 5는 OsCIPK9 변이체가 정상적인 식물체에는 없는 병저항성을 획득하는 것을 보여준 실험이다.

(5) 변이체의 제초제 paraquat에 대한 내성 획득

제초제 paraquat는 세포(특히 엽록체) 내에서 ROS(radical oxygen species; superoxide, hydroxyl 기, 과산화수소 등)를 과다 생성하게 하여 세포를 사멸하게 하는 기작을 가지고 있다.

OsCIPK9 변이체(OsCIPK9::Ds)의 제초제 paraquat에 대한 내성을 테스트한 결 과 OsCIPK9 변이체가 정상적인 식물체에 비해 현저하게 내성이 높아 생육이 정상으로 유지되는 것을 알 수가 있었다. ROS에 의한 세포막의 불포화 지방산 손상 정도를 알기 위하여 래디칼에 의한 최종산물인 MDA (malondialdehyde)을 측정한 결과 정상적인 식물체에서는 높은 농도의 지질 산화산물인 MDA가 생성된 반면 OsCIPK9 변이체는 거의 생성되지 않았다.

이러한 결과는 OsCIPK9 변이체가 활성산소에 대한 강한 내성을 가진다는 것을 보여준다.

실시예 6은 OsCIPK9 변이체가 정상적인 식물체에는 존재하지 않는 제초제 파라쿼트 저항성을 획득하는 것을 보여준 실험이다.

이상 설명한 본 발명에 의하면, 여러 변이유발원 [삽입변이유발원(insertional mutagens) (T-DNA, transposable elements (전이인자)), 화학적 변이유발원(chemical mutagens) (MMS (methyl methane sulfonate), EMS (ethyl methane sulfonate), dDES (diethylsulfate), 혹은 NTG, NG (nitrosoguanidine)) 그리고 물리적 유발원(physical mutagens (UV, X-ray 또는 gamma-ray)]을 통해 OsCIPK9 변이를 유도하여 식물체에 재해 저항성을 향상시킬 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 예시적으로 열거한 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위나 내용이 변경되거나 축소되는 것은 아니다. 하기 실시예에서는 본 발명에 의한 유전자를 벼에서 발현을 억제하거나 과량 발현되도록 하였으나, 당업자에게 있어 동일한 개념하에 다른 식물체 특히 단자엽 식물체에 상기 유전자의 발현을 억제하거나 과량 발현되도록 하여 스트레스 저항성을 조절할 수 있음은 당연하고 용이할 것이다.

실시예 1 : 특정 변이체의 선별, 변이된 유전자 및 변이체 발현 분석

본 발명자들에 의해 만들어 진 Ac/Ds Tagging system을 이용하여 벼 변이체 집단으로부터 관다발계에 GUS가 높게 발현된 변이체를 선별하고, 이에 관련된 유전자를 탐색하여 분석하였다.

(1) TAIL-PCR를 통한 관련된 유전자 동정

선별된 변이체의 DNA를 추출하고 PCR를 통하여 크로닝된 Ds flanking DNA의 염기서열을 밝힘으로써 관련된 유전자를 동정하였다. 구체적으로는, 전이인자 Ds Primer와 5 종의 AD (arbitrary degenerate) primer를 사용한 TAIL-PCR을 통하여 flanking DNA sequence를 결정하였다. 상기 프라이머들은 본 발명에서 활용되는 Ac/Ds Tagging system에서 flanking DNA sequence를 분석하기 위해 설계된 것 (Liu et al. 1995 Plant J. 8:457-463)으로서, 직접 제작하거나 다른 연구그룹 (Ueli Grossniklaus, University of Zurich)에서 양도받아 이용하였다. 프라이머 서열을 표 1에 도시하였는데, 다양하게 degeneration된 5 종의 AD primer (AD-1~5)를 각각 사용하여 TAIL-PCR를 사전에 실시한 바 (도시 생략) 이들 모두로부터 PCR product 가 생성되었다.

벼의 잎을 액체질소에 넣어 분쇄한 다음 1×lysis buffer〔10×lysis buffer(3.5M NaCl, 0.1M Tris-Hcl pH7.6, 0.01M EDTA pH8.0), 7M Urea, 2% SDS, 50mM EDTA〕를 넣고 다시 한 번 잘 저어 준 후 37℃에서 10분간 shaking하여 원심분리한다.

동일양의 P/C/I(phenol/chroloform/isoamylalcohol=25:24:1)를 넣고 vortex 한 다음 다시 한 번 10분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 상층액에 0.6vol IPA (Iso-propanol)를 넣고 실온에서 20분간 둔 후 10분간 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 펠렛에 70% 에탄올 400㎕를 가하고 10분간 원심분리한 다음 에탄올 용액을 깨끗이 제거한 후 상온에서 에탄올이 완전히 제거되면 적당량의 TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)를 가하여 genomic DNA 용액을 준비하였다.

genomic DNA 1㎍을 template로 사용하고, Ds5-1, AD Primer를 이용하여 total 20㎕에 1차 PCR reaction을 시킨다. 1차 PCR product를 1/50 dilution 시키고 그것의 1㎕를 template로 Ds5-2와 AD primer을 이용 total 10㎕에 2차 PCR reaction을 시킨다. 2차 PCR product를 1/50 dilution 시키고 그것의 1㎕를 template로 Ds5-3, AD primer를 이용하여 마지막 3차 PCR을 수행하였다(도 1a).

도 1a에서 볼 수 있듯이, 3차에 걸친 Tail-PCR에서 AD 프라이머는 항상 동일 하지만 Ds 프라이머는 매번 PCR 할 때마다 Ds의 말단에 보다 가까운 프라이머를 사용하였기 때문에 PCR product의 크기도 프라이머 위치 차이만큼 감소하였다. 1~3차 PCR product를 전기영동(도 1b)하여 2차 PCR product와 3차 PCR product 크기가 각각의 PCR에 사용한 Ds primer 간의 거리와 같은 80bp가 되는 DNA band를 cloning하여 Ds flanking DNA를 분리하였다. 분리된 Ds flanking DNA를 통상의 방법으로 서열을 분석하여 서열번호 3을 얻었다.

도 1b는 genomic DNA 1㎍을 template로 사용하고, (Ds5, AD2) 또는 (Ds3, AD2) 프라이머 세트를 이용하여 1~3차 PCR을 수행하였을 때 2차와 3차 PCR 결과물을 전기영동한 결과 사진이다. 도에서 M은 Size marker, II는 2차 TAIL-PCR 결과물, III은 3차 TAIL-PCR 결과물을 의미한다. 1차 결과물은 밴드가 너무 연하게 나와 별도의 사진으로 첨부하지 않았다. Ds5+AD2, Ds3+AD2는 PCR에 사용된 primer 세트를 나타낸다.

도 1a의 개념도에서 볼 수 있듯이 TAIL-PCR은 3단계의 PCR을 거쳐 Ds Insertion flanking DNA를 얻을 수 있다. 도 1b의 사진에서도 보면 알 수 있듯이 II와 III PCR에 사용된 primer의 위치가 대략 80bp 정도 차이가 나므로 결과물 사이에 * 표시된 band를 보면 2차 PCR 과 3차 PCR 사이에 약 80 bp 정도 사이즈의 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 이렇게 확인된 band의 DNA를 cloning 하였다.

크로닝하여 분석한 서열번호 3에 대하여 NCBI (National Center of Biotechnology Information, USA)에서 computer bioinformatic search 해 본 결과 OsCIPK9으로 예측되는 유전자에 Ds가 삽입되어 있는 것을 확인하였다.

NCBI에서는 genomic DNA에 대한 정보 밖에 없으므로, 본 연구실에서 작성한 cDNA library를 통해 cDNA를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하여 유전자내의 exon과 intron을 구분하였고 protein coding region을 구명하였다. OsCIPK9 cDNA는 ATG (start codon)과 TAA (stop codon) 사이의 protein coding region이 1362bp의 nucleotide되어 있었다. OsCIPK9의 start codon에서 stop codon까지의 cDNA 염기서열은 서열번호 4로 나타내었다.

Genomic DNA(서열번호 2)와 cDNA의 염기서열(서열번호 4)을 비교 분석한 결과, OsCIPK9은 16개의 exon과 15개의 intron으로 이루어졌으며 총 454개 아미노산의 단백질을 만드는 유전자인 것으로 확인되었다. 또한, Ds가 첫 번째 intron 말단에 삽입되어 있다는 것을 알 수 있었다.

분리된 유전자는 벼에 존재하는 Calcineurin B-like (CBL) 단백질과 결합하는 31개의 인산화 단백질 (CIPK: Calcineurin B-like (CBL) protein Interacting Protein Kinase) 중의 하나를 코딩하는 유전자인 것으로 판명되었다. Ds가 삽입되어 생긴 대립인자를 OsCIPK9::Ds라 명하였다.

(2) 본 발명에서 OsCIPK9 돌연변이체는 1번째 intron의 말단에 reporter 유전자가 발현하는 방향으로 위치하고 있음을 flanking sequence 분석과 GUS의 발현을 통하여 확인할 수 있었다(도 2a). 도 2a에서, 작은 사각형은 엑손을 사각형 사이의 굵은 검정선은 인트론을 의미하며, 첫 번째 인트론 끝에 빨간 역삼각형은 삽입된 Ds를 나타낸다. 도 2a에서 아래 그림은 위 그림 중 Ds가 삽입된 부위를 자세히 표현한 것으로, 검은 사각형은 엑손을, 하얀 사각형은 인트론을 나타내고, 첫 번째 인트론의 700bp 뒤에 Ds가 삽입되어 있다.

다음과 같은 Northern 분석법을 통하여 OsCIPK9 변이체는 Ds의 삽입에 의해 정상적으로 mRNA가 발현되지 않는 것을 확인하였다(도 2b). 20일간 토양에서 스트레스 없이 키운 정상 식물체와 변이체에서 채취한 잎을 액체질소에 분쇄하고 guanidium thiocyanate extraction buffer를 가하고 RNA를 추출하였다. 30분 동안 50V에서 pre-run된 1.3% formaldehyde agarose gel(1.3g agarose, 72㎖ dH₂O, 10㎖ 10X MOPs/EDTA, 18㎖ formaldehyde)에 약 20㎍의 RNA를 로딩하고 50V로 3시간, 100V로 2시간 전기영동하였다. 전기영동 후 gel을 5분 동안 물에 깨끗이 세척한 후 10× SSC에 1시간 동안 담근다(20분마다 한번씩 10× SSC를 교환). gel 상의 RNA를 nitrocellulose membrane으로 transfer후에 membrane을 3× SSC에 5 분정도 세척하고 UV cross-linker에 넣은 다음 80℃ oven에서 2시간 동안 건조시킨 후 6시간 정도 pre-soaked 시켰다. 한편, OsCIPK9 유전자의 N-말단을 SacI으로 잘라 나오는 약 400bp DNA를 elution하여 isotope에 labelling하여 실온에서 3시간 둔 것을 probe로 사용하였다. probe를 pre-soaked된 membrane에 넣어 12시간 hybridization시킨 후 washing solution에서 세척한 다음 membrane을 랩으로 싸서 cassette에 붙이고 그 위에 X-ray film을 넣고 1~3일이 지난 다음 film을 현상하였다(도 2b).

도에서 볼 수 있듯이, 정상적인 식물체 (+/+)와는 달리 OsCIPK9 변이체 (m/m)는 Ds의 삽입에 의해 mRNA가 발현되지 않는 것을 보여 주고 있다.

실시예 2 : OsCIPK9 유전자의 발현 양상 분석

스트레스 조건에서 OsCIPK9 유전자가 발현되는 양상을 조사하였다.

OsCIPK9 유전자는 정상적인 생장 조건에서 발현이 매우 약하게 이루어지나 엽과 뿌리에서 상처를 받았을 경우 매우 강하게 발현되는 것이 관찰되었다.

잎에 상처를 낸 후 시간 별로 OsCIPK9 mRNA가 발현되는 정도를 Northern hybridization을 통하여 관찰한 것과, 삽입된 Ds 안의 reporter 유전자로 붙여놓은 GUS를 X-Gluc을 통하여 발현시켜 관찰해 본 결과 Northern 분석과 동일한 결과를 얻었다.

(1) Northern hybridization을 통한 발현 양상 분석

정상 벼 식물체의 잎에 칼이나 핀셋으로 상처를 준 다음 시간 별로 잎을 채취하여 전술한 실시예 2에서 설명한 Northern 분석법에 따라 실험하였다(도 3a).

도에서, 시간은 상처 후 경과시간을 의미하며 아래 사진 (EtBr)은 물에 EtBr 시약을 넣고 transfer 하기 전 겔을 담그어 sample간에 상대적으로 같은 양의 RNA을 loading 했는지 조사하기 위해 UV 사진기 상에 사진을 찍은 것이다.

도에서 볼 수 있듯이, 상처를 받고 시간이 경과함에 따라 OsCIPK9 유전자의 발현이 빠르게 증가하는 것으로 보아, 본 발명에 의한 유전자는 상처에 매우 민감하게 반응하는 유전자라는 것을 확인할 수 있었다.

(2) GUS 염색을 통한 상처에 따른 발현 양상 규명

벼 종자를 소독약(스포닥)에 12시간 담군 다음 흐르는 물로 12시간 깨끗이 세척하여 페드리디쉬에 심고 2일간 암 상태에서 발아 시킨 후 사용하고자 하는 용기로 옮겨 15일 후 식물체의 잎과 뿌리를 이용한다.

벼의 잎과 뿌리에 칼이나 핀셋으로 상처를 주고 30분 후에 상처부위를 채취하여 GUS solution(50mM Na Phosphate Buffer pH7.0, 10mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 2mM potassium Ferrocyanide, 2mM Potassium Ferricyanide, 200㎍/㎖ Chloram-phenicol, 1㎎/㎖ X-Gluc)에 담그고 37℃에서 암상태로 2박3일 동안 둔 다음 70% 에탄올로 엽록소를 제거하고 현미경으로 관찰하였다(도 3b).

도에서 볼 수 있듯이, 상처가 난 자리에만 특이하게 파란색 GUS가 발현되는 것을 보아 본 발명에 의한 유전자가 상처에 특이하게 발현되는 유전자라는 것을 확인할 수 있었다.

이로서 잎과 뿌리에 상처를 낸 후 30분 안에 OsCIPK9 유전자가 발현되는 것이 GUS stain을 통해서 확인되었으며(도 3a), 잎에 상처를 낸 후 시간 별로 RNA를 추출하여 Northern blot을 실시하여 OsCIPK9이 상처에 반응하여 발현하는 것이 증명되었다(도 3b).

실시예 3 : 본 발명에 의한 OsCIPK9 유전자의 기능 분석

callose가 축적된다고 알려진 다양한 스트레스 조건에서 정상적인 식물체와 변이체에서의 callose 축적을 비교하여 OsCIPK9이 callose 축적에 관여한다는 것을 밝혔다. callose의 존재 여부는 callose와 특이적으로 결합하여 형광을 내는 aniline blue chemical을 가하고 자외선 형광으로 관찰하였다.

전통적으로 callose가 축적되는 것으로 알려진 상처부위, 화분을 만드는 수술 부위 또는 aluminum 중금속에 노출되었을 경우 정상적인 식물체는 aniline blue가 염색되어 나타나나 변이체에서는 전혀 aniline blue의 형광이 관찰되지 않았다. 도 4에서 m/m은 본 발명에 의한 유전자 OsCIPK9가 변이된 변이체(OsCIPK9::Ds)를, +/+는 Ds가 다시 전이되어 정상적인 기능을 회복한 식물체 (OsCIPK9 - Rev)를 나타낸다.

(1) 상처에 따른 callose 축적 조사

볍씨 소독을 위해 스포닥에 12시간 담근 다음 흐르는 물로 12시간 깨끗이 씻은 후 용기에 심고 15일 후 식물체의 잎과 뿌리를 이용한다. 벼 잎에 칼로 상처를 내고 24시간 방치한 다음 상처난 부위의 벼잎을 fixing solution(Acetic acid : EtOH=1:2)에 12시간 이상 담가둔다. 이때 4시간 간격으로 fresh한 용액으로 갈아준다. 잎을 건져 1M KOH 용액에 넣고 전자레지에서 2min 처리한 다음 멸균수로 잎을 세척한다. 잎을 슬라이드 위에 올리고 그 위에 anilin blue dye(0.05% aniline blue dye in 0.067M K₂HPO₄ at pH9.0)를 200㎕ 정도 가하여 커버 글라스로 덮고 10min 지난 다음 UV 현미경상에서 관찰한다(도 4에서 A).

도에서 볼 수 있듯이, 상처 부위에 callose 축적을 알리는 강한 aniline blue 염색이 정상적인 식물체 (+/+)에서 관찰된 반면 변이체 (m/m)에서는 상처 부위에 aniline blue 염색이 관찰되지 않아 callose가 축적되지 않는 것이 관찰되었다.

(2) 출수전 anther에 callose 축적 조사

출수전 anther를 채취하여 fixing solution(10% Acetic acid in ethanol)에 12hr 이상 담근 후 다시 1M NaOH에 12hr 담근다. 50mM KPO₄ buffer로 3번 씻은 다음 anther를 전기 (1)과 같은 방법으로 관찰한다(도 4에서 B).

이 경우에도 마찬가지로 본 발명에 의한 유전자가 변이된 변이체 (m/m)에서는 정상 식물체 (+/+)와는 달리 anther에서 callose의 생성이 관찰되지 않았다.

(3) 도열병에 따른 callose 축적 조사

벼 종자를 스포닥에 12시간 담군 다음 흐르는 물로 12시간 깨끗이 씻어 용기에 심고 15일 후 식물체의 잎과 뿌리를 이용한다.

벼에 도열병을 일으키는 친화성 도열병균주(Magnaporthe grisea) (KJ-105a)의 증식은 아래와 같이 실시하였다. Rice bran agar(rice bran powder 20g, sugar 20g, D.W. 1ℓ) plate에 멸균된 막대를 이용하여 도열병균주를 깔고 25~28℃에서 7일간 배양하였다. 도열병균이 배양된 plate에 20㎖의 0.05% Tween 20 용액을 붓고 멸균된 고무 스크레이퍼(scraper)로 배지로부터 균주를 분리시켰다. 분리된 균주들은 면 가아제를 이용하여 filter 하였다.

도열병균을 1.5×10⁵ spores/㎖ 농도로 식물체의 잎에 분무한 다음 식물체를 26~28℃ 항온항습기(dew chamber)에서 두고 48시간 경과 후에 잎을 채취한다. 도열병에 의해 상처가 난 부위의 벼 잎을 전술한 (1)과 같은 과정을 통해 관찰한다(도 5).

도에서 볼 수 있듯이, 도열병 침입에 따른 상처 부위에 callose 축적을 알리는 강한 aniline blue 염색이 정상적인 식물체(+/+)에서 관찰된 반면 변이체(m/m)에서는 도열병 상처 부위에 aniline blue 염색이 관찰되지 않아 callose가 축적되지 않는 것을 확인하였다.

(4) 항체를 통해 뿌리에서 중금속에 반응하여 축적되는 callose 확인

볍씨 소독을 위해 스포닥에 12시간 담근 다음 흐르는 물로 12시간 깨끗이 씻은 후 발아시켜 뿌리가 2cm 자랐을 때, 뿌리를 20㎛ Aluminum에 3시간 동안 침지하였다가 멸균수로 세척하였다. 식물체 전체를 고정액(fixation solution; 3.7% paraformaldehyde, 0.2% picric acid, 50mM potassium phosphate, 5mM EGTA pH 6.8)에 넣어 실온에서 2시간 동안 고정한 후 워싱버퍼(washing buffer; 50mM potassiun phosphate, 5 mM EGTA, pH6.8)로 세척하였다. 샘플을 OCT(optimal cutting temperature)-embedding medium에 고정시키기 위해 Sucrose와 OCT를 점차적으로 높혀 30%, 60%에서 각각 30분간, 그리고 100%에서 1시간 동안 담아두어 샘플이 OCT에 서서히 침투될 수 있도록 한다. 마지막으로 100% OCT에 샘플을 고정시켜 둔다. 고정된 샘플을 -20℃ cryostat를 이용하여 10um 두께로 자른 다음 슬라이드위에 옮겨 둔다. 샘플이 옮겨진 슬라이드는 -70℃ 냉동고에 넣어 하룻밤 둔 다음 꺼내어 37℃ incubater 안에서 2-3시간 동안 완전히 건조하였다. 건조된 슬라이드를 PBS(140mM NaCl, 2.7mMKCl, 10mM Na₂HPO₄, and 1.8mM KH₂PO₄, pH7.4)에 3% BSA와 1% NP-40가 용해된 용액에 담가 실온에서 30분간 둔다. 30분 후 슬라이드를 꺼내어 1:50으로 희석한 callose항체용액으로 처리하고 37℃에 2시간 정도 넣어 둔다. 이어서 PBA버퍼로 10~15분간 깨끗이 씻어준 다음 1:50으로 희석한 Texas-RED가 붙어 있는 2° 항체를 다시 처리하여 37℃에서 2시간 동안 넣어둔다. 슬라이드를 꺼내어 PBS 용액에 넣어 1시간 동안 깨끗이 씻어준다. 슬라이드를 coverslip으로 덮어서 1시간 이상 암상태로 둔 다음 현미경(green excitation filter 546/10nm, dichroic mirror 580nm, orange-red barrier filter 590nm)으로 관찰하였다(도 6).

도에서 보는 것과 같이 aluminum 용액에 노출된 뿌리의 정상적인 식물체 (+/+) 에서 빨간색으로 나타나는 많은 callose의 축적을 관찰할 수 있는 반면 변이체 (m/m)에서는 callose가 적게 축적되는 것으로 확인되었다.

실시예 4 : OsCIPK9 과발현 형질전환체의 제작 및 특성 분석

OsCIPK9 유전자를 과발현시킬 경우 어떤 현상(표현형)이 나타나는지를 확인하기 위하여 강력한 promoter인 35S promoter를 이용하여 과발현 vector를 제작하고 이를 이용하여 벼를 형질전환하였다.

(1) 형질전환용 벡터의 제작

먼저 35S promoter에 OsCIPK9 cDNA를 연결하고, 이를 다시 GUS와 GFP를 가지고 있는 벡터 pCAMBIA1303 (CAMBIA사 제품, 호주)에 삽입하여 과발현 벡터인 pCAMBIA-CIPK9를 제작하였다. 상기 벡터 pCAMBIA1303는 식물체 형질전환 전용으로 만들어진 벡터로써 총 1,2361bp의 염기로 이루어져 있고, 식물체의 seletion marker로 Hygromycin, kanamycin 저항성 유전자를 가지고 있으며, GUS와 GFP와 fusion 단백질로 발현 시킬 수 있게 제작된 벡터이다.

본 발명에 의한 과발현 벡터 pCAMBIA-CIPK9는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다. ① pBSK plasmid vector(STRATAGENE사. 미국)에 35S promotor와 CIPK9 cDNA를 크로닝하였다. ② T-DNA vector pCAMBIA1303과, CaMV35S promotor와 CIPK9 cDNA가 들어있는 plasmid vector를 각각 BglII와 SpeI 효소로 double digestion한다. ③ 35S promoter와 CIPK9의 DNA를 gel에서 elution 한 후 pCAMBIA1303에 16℃에서 O/N 동안 ligation 시켰다. ④ Ligation된 DNA를 E.coli competent cell 에 transformation 시키고 나온 clone으로부터 DNA를 뽑아 Bgl I 과 SpeI 효소로 잘라 ligation 여부를 확인하여 형질전환용 벡터로 사용하였다.

완성된 본 발명에 의한 과발현 벡터 pCAMBIA-CIPK9의 주요부를 도 9에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 본 발명에 의한 OsCIPK9 cDNA가 35S promoter와 GUS 유전자 사이에 삽입되어 있다.

35S promoter와 pCAMBIA1303는 현재 용이하게 입수가 가능하며, OsCIPK9 cDNA는 본 발명에서 확인하였듯이 용이하게 확보할 수 있는 것이므로 벡터의 기탁을 생략하였다.

(2) 과발현 식물체의 제작

식물체의 형질전환은 통상 사용하는 아그로박테리움법을 적용하였다.

먼저 OsCIPK9 cDNA를 내재하고 있는 pCAMBIA-CIPK9를 Agrobacterium LBA4404 균주에 형질전환(transformation)하였다. 이를 AB plate에서 30℃에서 3일 동안 배양한 뒤 DNA를 추출하여 co-integration을 확인하여 확인된 균주를 다시 3일 동안 키워 infection에 사용하였다. 형질전환한 아그로박테리움 세포를 벼의 calli를 통해 infection하여 3일간 암실배양(AAM, 2N6-AS 배지), 3~4주간 암실에서 선택배양(N6-CH-Hyg50mg), 10일간 암실에서 전-계대배양(Pre-regeneration) (N6-7-CH), 3주 이상 명실에서 1차 계대배양(Regeneration I)(N6S3-CH-I), shooting 때 까지 명실에서 2차 계대배양(Regeneration II )(N6S3-CH-II)한 후 병 배지(MS)에 옮겨 명실에서 배양하여 형질전환 식물체를 획득하였다. 식물체가 형질전환 되었는지 여부는 식물체의 genomic DNA를 추출하여 PCR 및 Southern으로 확인하였다.

이렇게 제작된 OsCIPK9 유전자 과발현 형질전환 식물체는 정상적인 생육조건에서도 callose가 정상 식물체에 비해 callose가 많이 만들어짐을 알 수 있었다(도 10).

실시예 5 : 변이체의 도열병에 대한 저항성 분석

정상 식물체 및 본 발명에 의한 형질전환 식물체(벼)의 종자를 스포닥에 12시간 담군 다음 흐르는 물로 12시간 깨끗이 씻어 용기에 심고 온실에서 20일간(3~4잎 정도) 키웠다.

전술한 실시예 2에서 언급된 방법으로 도열병균을 감염시킨 식물체를 26~28℃ 항온항습기에 24시간 동안 두었다가 온실로 이동하여 7일 후 도열병 발병 여부를 관찰하였다(도 7).

도에서와 같이 친화성균주를 처리하고 7일 후 관찰한 결과, 정상적인 식물체 +/+)에서는 없는 저항성이 변이체(m/m)에서 나타났다. 도에서 Rev 식물체는 OsCIPK::Ds 대립인자에 삽입되었던 Ds가 다시 탈락되어(전이되어) 정상적으로 되돌아온 revertant 대립인자을 가진 식물체를 나타낸다. Revertant 식물체 (Rev) 와 과발현 식물체 (OX) 은 정상적인 식물체와 같이 병저항성을 보이지 못했다. 과발현식물체는 오히려 더욱 병반이 크게 발생하는 것이 관찰되었다.

실시예 6: 변이체의 제초제 paraquat에 대한 내성 확인

(1) 제초제 paraquat에 대한 내성을 알기 위해 OsCIPK9 변이체와 정상 식물체(벼)의 종자를 소독약(스포탁)에 12시간 담가 소독한 후 흐르는 물로 12시간 세척한 다음 흙에 심어 온실에서 2주 (2~3잎 정도) 키웠다.

200g ai(active ingredient)/10a 농도의 paraquat를 200㎖의 계면활성제 Tween 20 0.1%와 아세톤 20%에 용해하여 준비한 제초제 살포용액을 1m² 공간에서 2주간 키운 변이체 식물체와 정상적인 식물체에 균일하게 살포하였다. 살포 후 2시간 정도 약액을 말리고 각 식물체를 30^oC, 230 umol/s.m² 빛 세기의 식물배양기에 넣고 10시간 동안 처리 후 꺼내서 식물체의 상태를 화상으로 기록하고 시료를 채취하였다. 식물체의 제초제 내성은 외관상으로 식물체가 말라가는 정도나 엽의 백화현상으로 측정하였다(도 8a).

도에서 좌측은 정상적인 식물체 (+/+) 와 변이체 (m/m)에 paraquat 제초제를 첨가하지 않은 용액을 처리한 식물체들이며 우측은 제초제 처리 10시간 후의 식물 상태를 나타내고 있다. 아래쪽 사진은 위쪽 사진을 확대한 것으로 정상적인 식물체는 시들어 잎들이 숙여지고 백화현상이 나타나기 시작하였으나 변이체에서는 정상적인 상태를 유지하는 것을 볼 수 있다.

(2) ROS에 의한 세포막의 불포화 지방산 손상 정도를 알기 위하여 래디칼에 의한 최종산물인 MDA (malondialdehyde)을 측정하였다.

채취한 시료를 액체 질소를 넣고 마쇄하고 차거운 에탄올 4㎖ 넣고 12000rpm에서 15분간 원심분리 후 상등액 2㎖를 취하여 20% TCA(Trichloroacetic acid)용액 2㎖, TBA(2-thiobarbituric acid)용액 1㎖ 및 BHT(butylated hydroxytoluene)용액 50㎕를 가하고 가볍게 흔들어 섞는다. 시료를 15분간 끓인 다음 얼음에 5분간 놓아두었다가 12000rpm에서 15분간 원심분리한다. 상등액 4㎖ 채취하여 각각 440nm, 532nm, 600nm에서 흡광도를 측정하여 다음에 공식에 대입하여 MDA값을 구한다. (식에서 FW는 fresh weight)

nmol ( MDA )/ gr (시료 생체중 ) =

[(A532-A600)-(A440-A600)× 0.0571]× 6.3694× 6× (2+FW)/FW

3중 실험을 통해 얻은 MDA에 값을 막대그래프로 나타냈다(도 8b).

도에서 나타난 것처럼, 정상적인 식물체는 무처리시 12.55 ± 3.28 nmol/gr 이며 제초제 처리시 10시간 만에 110.66 ± 22.43으로 증가하였으나 OsCIPK9 변이체는 무처리시 21.02 ± 4.52에서 12.03 ± 2.55로 오히려 MDA에 거의 차이가 없었다.

(3) 과발현 식물체의 제초제(파라쿼트) 내성을 정상적인 식물체와 변이체와 비교하였다.

정상, 변이 그리고 과발현 식물체를 14일정도 흙에서 키워 식물체들의 잎을 잘라 1㎛ 파라쿼트에 담가 식물배양실에서 4일 동안 둔 다음 파라쿼트에 의한 엽록소 파괴 정도를 비교 관찰하였다(도 11). 도에서 보는 것과 같이 정상적인 식물체 (+/+), 변이체 (m/m), 그리고 과발현 식물체 (OX) 잎들은 제초제가 첨가되는 않은 용액에서는 오랫동안 엽록소가 유지되는 것이 관찰되었다(도의 위쪽 시료들). 그러나 파라쿼트가 첨가된 용액에서는 변이체에 비해 정상, 과발현 식물체의 잎이 노랗게 변하는 것이 관찰되었다(도의 아래쪽 시료들). 특히 과발현 식물체는 정상적인 식물체보다 빨리 엽록소가 파괴되어 변색되는 것이 관찰되었다.

위의 실험들을 통해 OsCIPK9 변이체가 정상적인 식물체에 비해 현저하게 내성이 증가된 것을 알 수가 있었고 또한 과발현 식물체는 내성이 현저히 낮아지는 것이 관찰되었다. 따라서 OsCIPK9 유전자가 ROS (활성산소)에 대한 내성에 관련된 유전자임이 증명되었다.

한편, 도 12a 및 12b에 도시된 바와 같이 단자엽 식물인 벼, 옥수수, 밀 등에서도 아직 기능이 밝혀지지 않았으면서 OsCIPK9 유전자 산물과의 아미노산 서열의 상동성이 90% 이상인 단백질 유전자들이 존재한다. 따라서 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 전문가라면, 이들 유전자들도 OsCIPK9 유전자와 같은 callose 축적 및 저항성 증가를 유도하는 특성과 기능이 있을 것임을 유추할 수 있다. 이들 유전자 산물의 명칭과 서열번호, 유래를 표 2에 나타내었다.

본 발명에 의하여, callose 생성 및 축적에 관여하며 재해 저항성를 좌우하는 주요한 유전자인 OsCIPK9 유전자를 활용할 수 있게 된다.

또한 본 발명에 의하여, 스트레스 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 단자엽 식물을 보다 열악한 환경에서도 활용할 수 있도록 하는 것이 가능하게 된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

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서열번호 2의 염기서열을 갖는 OsCIPK9 유전자 발현의 억제변이를 유도하여 도열병 저항성 및 제초제 파라쿼트 내성 식물체를 획득하는 방법.
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제 9 항에 있어서,

상기 유전자의 억제변이 유도는 삽입변이유발원(insertional mutagens), 화학적 변이유발원(chemical mutagens) 또는 물리적 유발원(physical mutagens)에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 도열병 저항성 및 제초제 파라쿼트 내성 식물체를 획득하는 방법.
제 9 항 또는 제 11항의 방법에 따라 획득되는 도열병 저항성 및 제초제 파라쿼트 내성 식물체.