JPH03112488A - 調節ｄｎａ配列 - Google Patents

調節ｄｎａ配列

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JPH03112488A
JPH03112488A JP2243701A JP24370190A JPH03112488A JP H03112488 A JPH03112488 A JP H03112488A JP 2243701 A JP2243701 A JP 2243701A JP 24370190 A JP24370190 A JP 24370190A JP H03112488 A JPH03112488 A JP H03112488A
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JP
Japan
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sequence
gene
plant
dna
chitinase
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JP2243701A
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Frederick Meins
フレデリック　マインス
Hideaki Dr Shinshi
進士　秀明
Jean-Marc Dr Neuhaus
イエン―マルク　ノイハウス
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Original Assignee
Ciba Geigy AG
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、植物キチナーゼ遺伝子の５１領域から得られ
、そしてあらゆる所望の発現性ＤＮＡと操作可能に連結
されて形質転換された植物において非常に高められたレ
ベルの発現を導く、新規で実質的に純粋な調節ＤＮＡ配
列に関する。
本発明はまた、発現可能なＤＮＡと操作可能に連結され
た本発明に係るＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子、お
よびそれらから誘導されたベクターに関する。本発明は
また、前記組換えＤＮＡまたはそれらから誘導されたベ
クターを含む宿主細胞および／または宿主有機体ならび
にトランスジェニック植物を包含する。
本発明はさらに、ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハバ
ナ４２５　（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　Ｌ
、ｃ。
ｖ、Ｈａｖａｎａ　４２５）植物から得られ、そして５
を非翻訳領域に本発明に係る調節ＤＮＡ配列を含む新規
キチナーゼ遺伝子を包含する。
本発明は、本発明に係るＤＮＡ配列の作成方法、該ＤＮ
Ａ配列を含む組換えＤＮＡ分子およびベクターの作成方
法、およびトランスジェニック植物を作出するために前
記ＤＮＡ配列等を使用する方法にも関する。
〔従来の技術〕
新規で有用な特性を有するトランスジェニック植物の作
出における基本的な限定要因の一つは、いくつかの場合
において低い挿入された外来遺伝子の発現のレベルであ
る。外来遺伝子のこの低い発現および植物における関連
した低いタンパク質濃度の結果として、所望の効果はも
しあるとしてもしばしば不満足な程度にしか生じない。
細菌の発現系の鋭意研究された分野において、種々の可
能な方法がクローン化された構造遺伝子の転写のレベル
を高めるために利用可能になった。例えば構造遺伝子は
、多くの場合に遺伝子発現のレベルにおける増加を導く
レプリコンの強力なプロモーターの後ろに挿入され得る
。
さらに、遺伝子の全体のオペロン単位、すなわちプロモ
ーターならびにオペレーターおよびターミネータ−をマ
ルチコピープラスミド内にスプライシングさせることは
原理的に可能である。
増加された遺伝子発現の結果として、または第２の場合
においては増加された遺伝子分量の結果として、細胞に
おけるタンパク質濃度の増加が達成されるかもしれない
。
（発明が解決しようとする課題） 対照的に、植物系のそれほど十分には研究されていない
分野においては転写および翻訳の制御機構は未だ大部分
わかっておらず、転写のレベルを高めるために現在利用
可能な方法は依然として非常に限定されている。また可
能である場合でも、しばしば非常に低い成功のレベルで
適用されるにすぎない。
従って、操作可能に結合された外米遺伝子またはその他
の有用なＤＮＡ配列、例えばアンチセンスＤＮＡの発現
を増加させ得る！Ｉ節配列を、所望の表現型の効果、例
えばある種の病原体または化学物質に対する耐性の発生
が明確に目視でき、そして当該植物がそれ故にそれらの
有害な影響から有効に保護されるような様式で提供する
ことは本発明の第一の目的とみなされなければならない
。
本発明の調節ＤＮＡ配列の適用のその他の分野として、
有用で価値ある化合物の製造のために作出されたトラン
スジェニック植物の合成収量の増加に注意が払われ得る
。
驚くべきことに、本発明の範囲内で、い（つかが公知で
ある手段の使用により上記の課題を解決することが今回
能となった。
〔課題を解決するための手段〕
詳しくは本発明は、植物キチナーゼ遺伝子の５′非翻訳
領域から、好ましくはタバコキチナーゼ遺伝子の５１非
翻訳領域から得られる調節ＤＮＡ配列であって、植物細
胞内で活性である適当な発現シグナルおよび構造遺伝子
またはその他の発現性ＤＮＡ配列に操作可能に連結され
て、植物材料において、操作可能に結合された構造遺伝
子またはその他の操作可能に結合されたＤＮＡ配列、例
えばアンチセンスＤＮＡの発現レベルにおける著しい増
加を導く、前記調節ＤＮＡ配列に関する。
本発明は調節ＤＮＡ配列、好ましくは実質的に純粋な形
態にある調節ＤＮＡ配列に関し、それらはニコチアナ・
ツバカムの園芸品種ハバナ４２５植物の塩基性キチナー
ゼ遺伝子の５′非翻訳領域から得られ、そして以下のＤ
ＮＡ配列：５　’　−ＴＴＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＴ
ＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＡ−３’ を実質的に有する。
本発明はまた、１個またはそれ以上の塩基の突然変異に
基づいているがしかし依然として上記配列に実質的に相
同であり、そして本発明に必須の特性を依然として有す
る上記ＤＮＡ配列の全ての誘導体に関する。
突然変異は本明細書において、１個またはそれ以上の塩
基の欠失または挿入、そしてまた特に１個またはそれ以
上の塩基の置換を意味するものと理解されるべきである
。
本発明の範囲内で、あるＤＮＡ配列の活性部分の少なく
とも６０％、好ましくは少なくとも８０％そして特に好
ましくは少なくとも９０％が第２のＤＮＡ配列と相同で
ある場合に、それらは実質的に相同である。
本発明はまた、上に非常に詳細に記載したＤＮＡ配列か
ら、または該ＤＮＡ配列の誘導体から得られ、そして出
発配列の特定の特性を依然とし゛て有する断片または部
分配列を包含する。
以下のＤＮＡ配列： ５　’−ＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＡ−３’を有する
か、または１個またはそれ以上の塩基の突然変異に基づ
いているがしかし依然として上記配列に実質的に相同で
あり、そして出発配列の特定の調節発現増加特性を依然
として有する上記ＤＮＡ配列の全ての誘導体である部分
配列が特に好ましい。
本発明はさらに、本発明に係る調節ＤＮＡ配列が発現性
ＤＮＡおよび植物細胞内で活性なその他の発現シグナル
、例えばプロモーターおよび終結配列に操作可能に連結
され、その結果、植物宿主への形質転換で操作可能に結
合された発現性ＤＮＡの発現レベルにおける著しい増加
を導く、キメラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分子に
関する。
カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）からの３５
３プロモーターおよびキチナーゼまたはグルカナーゼ構
造遺伝子と操作可能に連結された本発明に係る上記ＤＮ
Ａ配列を含む組換えＤＮＡ分子が特に好ましい。
本発明はまた、本発明に係る上記組換えＤＮＡ分子を含
むクローニング、形質転換および発現ベクター、ならび
に該ベクターを用いて形質転換された宿主有機体を包含
する。
本発明はさらに、本発明に係る上記組換えＤＮＡ分子を
含み、そして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）およびアグロバク
テリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｔｍ　ｔｕａｅｆａｃｉｅｎｓ）の両方において安
定に複製し得るいわゆるシャトルベクターに関する。
宿主有機体の中で、植物プロトプラスト、細胞、カルス
、組織、器官、接合子、胚、花粉および／または種子か
らなる群から選択される植物宿主が好ましく、そして上
記組換えＤＮＡを用いて形質転換された全体の、好まし
くは活性の植物が特に好ましい。全体の植物は例えば本
発明に係る組換えＤＮＡ分子を用いて直接形質転換され
るか、または予め形質転換されたプロトプラスト、細胞
および／または組織から再生により得ることができる。
野生型に比べ著しく増加されているキチナーゼおよび／
またはグルカナーゼ含量を有するトランスジェニック植
物、侍にトランスジェニック活性植物が非常に好ましい
。
本発明はまた、トランスジェニック植物の全ての増殖材
料を包含し、該トランスジェニック植物は本発明に係る
組換えＤＮＡ分子を用いた直接形質転換により形成され
るか、または予め形質転換されたプロトプラスト、細胞
、カルス、組織、器官、接合子、胚、花粉および／また
は種子から再生により得られるが、それらに限定されな
い。
本発明の範囲内で、増殖材料は有性的にまたは無性的に
、そして試験管内または生体内で増殖され得るあらゆる
植物材料であるとして理解され、本発明に係るトランス
ジェニック植物から得られるプロトプラスト、細胞、カ
ルス、組織、器官、胚珠、接合子、胚、花粉または種子
が好ましい。本発明はまた、上記植物の後代ならびにそ
れらの突然変異体および変種に関し、体細胞融合、遺伝
子修飾または突然変異選択により得られる植物からの誘
導体を包含する。
本発明はさらに以下の方法にも関する。
（ａ）　　本発明に係る調節ＤＮＡ配列の作成方法（ｂ
）　　適当なプロモーターおよび構造遺伝子と操作可能
に連結されている本発明に係る上記ＤＮＡ配列を含む本
発明に係る組換えＤＮＡ分子の作成方法 （ＣＪ　　本発明に係る組換えＤＮＡ分子を含むクロニ
ング、形質転換および／または発現ベクターの作成方法 （山　形質転換された宿主有機体、特に植物プロトプラ
スト、細胞、カルス、組織、器官、接合子、胚、花粉お
よび／または種子からなる群から選択される植物宿主、
および特に全体の、好ましくは活性の植物の作成方法 （ｅ）　　形質転換された植物材料からの増殖材料の作
成方法、特に有性および無性の後代の作成方法 げ）　キチン含有病原体、特に病原菌および病原虫から
の植物の保護方法 本発明に係る調節ＤＮＡ配列の作成方法は、（ａ）　　
植物キチナーゼ遺伝子の５′非翻訳領域、好ましくはタ
バコの塩基性キチナーゼ遺伝子の５１非翻訳領域から公
知方法を用いて上記配列またはその誘導体を単離するか
、または（ｂ）　　化学的操作により上記配列またはそ
の誘導体を合成することから実質的になる。
詳しくは、工程段階（ａ）は、それ自体公知である以下
の段階： （ａ）　　キチナーゼを発現し得る組織からのゲノムＤ
ＮＡの抽出および精製 （ｂ）　　抽出および精製されたＤＮＡ調製物の、クロ
ーニングベクター中への引き続く挿入に適当な大きさの
断片への切断 （Ｃ）　　断片化されたＤＮＡのクローニングベクター
内でのクローニングおよび遺伝子ライブラリィの作成 （ｄ）　　プローブ分子によるキチナーゼ遺伝子または
それらの一部を含むクローンの選択 （ｅ）　　プローブ分子との強いハイブリダイゼーショ
ンシグナルを示すクローンの単離 （ｆ）　　（ｅ）において単離されたクローンの生化学
的操作による特徴づけ （ｇ）　　発現の増加に関与する調節ＤＮＡ配列の同定
および単離 からなる。
本発明に係る組換えＤＮＡ分子の作成方法は、本発明の
調節ＤＮＡ配列の一つを所望の発現性ＤＮＡの開始コド
ンの前に直接挿入し、そしてその構築物を植物細胞内で
活性な発現シグナルに操作可能な様式で連結することか
ら実質的になる。　本発明の範囲内で、病原体、化学物
質および悪い環境要因に対する保護を形質転換された植
物細胞およびそれから生長する組織、しかし特に植物に
〜付与する構造遺伝子が本発明に係る調節ＤＮＡ配列に
結合されている組換えＤＮＡ分子の作成が特に好ましい
。
本発明に係る調節ＤＮＡの一つと操作可能に連結されて
いる植物細胞内で発現可能なＤＮＡを含む発現ベクター
の作成方法は、 （ａ）　　所望の発現性ＤＮＡの開始コドンの前に直接
、調節ＤＮＡ配列を挿入し、そして 伽）植物細胞内で活性な発現シグナルの間に形質転換体
選択に適当なマーカー遺伝子を含んでいてよい公知植物
発現ベクター内に（ａ）の構築物を操作可能な様式でス
プライシングする、ことから実質的になる。
プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚
、花粉、胚珠、接合子その他からなる群から選択される
植物材料の作成方法は、上記組換えＤＮＡ分子の一つを
用いてそれ自体公知の方法により、上記植物材料を形質
転換することから実質的になる。
野生型に比べ著しく増加されている形質転換された細胞
および／または組織におけるタンパク質含量を有するト
ランスジェニック植物の作出方法は、上記組換えＤＮＡ
分子の一つを用いてそれ自体公知の方法により、上記植
物を形質転換することから実質的になる。
野生型に比べ著しく増加されているグルカナーゼおよび
／またはキチナーゼ含量を有するトランスジェニック植
物の作出方法が特に好ましい。
植物材料の形質転換は、植物プロトプラストのポリエチ
レングリコール処理、熱シヨツク処理およびエレクトロ
ポレーション；植物プロトプラスト、細胞または胚中へ
のマイクロインジェクション；マイクロプロジェクタイ
ルでの細胞または組織の打ち込み；植物プロトプラスト
、細胞もしくは組織または全体の植物のアグロバクテリ
ウム仲介形質転換；および植物プロトプラスト、細胞も
しくは組織または全体の植物のＣａＭＶ仲介形質転換か
らなる群から選択される公知方法により行われるのが好
ましい。
トランスジェニック種子の作出方法は上に詳細に記載し
たトランスジェニック植物を有性的に増殖させ、そして
挿入された遺伝物質を依然含有する発生種子を公知方法
により得ることから実質的になる。
トランスジェニック植物の形質転換された生育可能な部
分の作出方法は、上に詳細に記載したトランスジェニッ
ク植物から、プロトプラスト、細胞、細胞クローン、細
胞集合体、カルスおよび／または組織培養体、種子、花
粉、胚珠、接合子および胚からなる群から選択される植
物の形質転換された一部を得、そして挿入された遺伝物
質を依然含有するそれらの部分を選択することから実質
的になる。
上に非常に詳細に記載したトランスジェニック植物材料
を用いるハイブリダイゼーション物および融合物の作成
方法は、上記植物材料を自体とまたは外来材料とハイブ
リダイゼーションまたは融合させ、そして挿入された遺
伝物質を依然含有しそして本発明に必須の特性を依然有
するそれらのハイブリダイゼーション物および融合物を
選択することから実質的になる。
上により詳細に記載したトランスジェニック植物の変種
および突然変異体の作成方法は、トランスジェニック植
物またはそれらの生育可能な部分ならびにそれらの有性
および無性の後代を公知方法により突然変異させ、そし
て次に挿入された遺伝物質を依然含有しそして本発明に
必須の特性を依然有するそれらの個体を選択することか
ら実質的になる。
花、茎、果実、葉および根からなる群から選択される植
物のトランスジェニック部分の作出方法は、植物の上記
部分を分離し、そしてそれらの細胞の大部分に挿入され
た遺伝物質を依然含有するそれらの部分を選択すること
から実質的になる。
本発明はまた、本発明に係る調節ＤＮＡ配列がキチナー
ゼをコードする構造遺伝子および植物細胞内で活性なそ
の他の発現シグナルに操作可能に連結されているキメラ
遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分子を用いて植物を形
質転換し、そしてキチン含有病原体を死滅させるか、ま
たは該病原体を制御下に保つのに十分な量で挿入された
キチナーゼ遺伝子を発現させることからなる、キチン含
有病原体から植物を保護する方法を包含する。
本発明はさらに、本発明に係るＤＮＡ配列がキチナーゼ
をコードする構造遺伝子および植物細胞内で活性なその
他の発現シグナルに操作可能に連結されているキメラ遺
伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換さ
れ、その結果、キチン含有病原体を死滅させるか、また
は該病原体を制御下に保つのに十分な量でトランスジェ
ニック植物またはそれらの一部に挿入されたキチナーゼ
遺伝子を発現させるようなトランスジェニック植物また
はそれらの一部とキチン含有病原体を接触させることか
らなるキチン含有病原体を制御する方法を包含する。
本発明はまた、植物材料中に遺伝子発現を増加させるた
めの、および同様の作用を有する相同ＤＮＡ配列を同定
するための本発明に係る調節ＤＮＡ配列の使用に関する
。
図面 本発明を以下に詳細に記載する前に、ここで図面に関し
て簡単に説明する。
第１図はプラスミドＩ）ＳＣＨ１２の特徴的領域および
それらの開始点を示すｐｓｃＨ１２の遺伝子地図を示す
。（図中、Ｐ３５Ｓ→ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；Ｔ
８５Ｓ−”ＣａＭＶ終結配列；ＴＮＯ３→ネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の終結配列、ＰＮＯ３
→ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のプロ
モーター；ＬＢ、ＲＢ→アグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのＴｉプラスミドからの左側または右側境界
配列） キチナーゼをコードするキメラ遺伝子横築物の５′領域
の関連部分はヌクレオチド配列により詳細に示されてい
る。
第２図はｐｃＩＢ２００の制限地図を示す。
第３図はプラスミドｐｓｃＨ１２構築の概略図である。
詳細は実施例８に示されている。
第４図はプラスミド１）ＳＧＬ７構築の概略図である。
詳細は実施例９に示されている。
第５図はニコチアナ・シルベストリス５１（Ｎｉｃｏｔ
ｉａｎａ　５ｙＬｖｅｓｔｒｉｓ　Ｓｌ）植物（Ｋｍ”
／Ｋｍ”）の葉中のキチナーゼ濃度を対照（Ｋｍ”／Ｋ
ｍ”）と比較して一般的方法で示すグラフである。葉に
は下から上へ番号を付す。
定義 以下の記載において組換えＤＮＡ技術および植物遺伝学
において慣用である多（の用語が用いられている。発明
の詳細な説明および特許請求の範囲、およびこれらの用
語にあてられた範囲の明確な、そして首尾一貫した理解
を確実にするために、以下に定義を記載する。
植物材料：培養液中でまたはそのままで生育可能な植物
の部分、例えばプロトプラスト、細胞、カルス、組織、
胚、植物器官、芽、種子等、および全体の植物。
植物細胞：プロトプラストおよび細胞壁からなる植物の
構造的および生理学的単位。
ら分離され、そして細胞クローンまたは全体の植物に再
生する能力を有する細胞壁のない「裸の」植物細胞。
植物組織：構造的および機能的単位の形態に組織化され
た植物細胞の群。
植物器官二種々の組織、例えば根、茎、葉または胚から
構成される構造的および機能的単位。
表現型の特徴ニー個またはそれ以上の遺伝子の発現に基
づいた認識可能であるか、または少なくとも検出可能で
ある特徴。しかしながら、表現型の特徴は、例えばアン
チセンスＤＮＡが使用される場合に、遺伝子の発現の抑
制を介して発現され得る。
非相同遺伝子またはＤＮＡ　：特定の生成物をコードす
るか、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が
挿入される種板外の種に由来するＤＮＡ配列；該ＤＮＡ
配列は外来遺伝子または外来ＤＮＡとも記載される。
相同遺伝子またはＤＮＡ　：特定の生成物をコードする
か、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿
入される種と同一種に由来するＤＮＡ配列。
合成遺伝子またはＤＮＡ　：特定の生成物をコードする
か、または生物学的機能を遂行し、そして合成手段によ
り製造されるＤＮＡ配列。
植物プロモーター：植物内であらゆる所望の相同または
非相同ＤＮＡ遺伝子配列の転写を確実に行わせるＤＮＡ
発現の制御配列であるが、前記遺伝子配列はそのような
プロモーターと操作可能に結合されている。
終結配列：転写工程の終了をシグナルで伝える転写単位
の末端のＤＮＡ配列。
過産生植物プロモーター（ＯＰＰ）：このＯＰＰで形質
転換されなかった宿主細胞において自然状態で観察され
るよりも明らかに高い程度まで（ＲＮＡの形態またはポ
リペプチドの量で測定される）、操作可能に結合された
機能遺伝子配列のトランスジェニック植物細胞内での発
現を引起し得る植物プロモーター るけれどもポリペプチドに翻訳されないコード領域の上
流／下流に位置するＤＮＡ部分。この領域は、調節配列
例えばリポソーム結合部位（５１）またはポリアデニル
化シグナル（３′）を含む。
ＤＮＡクローニングベクター：適当な宿主細胞内に挿入
されたＤＮＡのクローニングに必要な全てのシグナル配
列を含有するクローニングビヒクル、例えばプラスミド
またはバクテリオファージ。
ＤＮＡ発現ベクター：適当な宿主細胞内に挿入されたＤ
ＮＡの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクロ
ーニングビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオ
ファージ。
ＤＮＡ　）ランスファーベクター：適当な宿主細胞内へ
の遺伝物質の挿入を可能にするトランスファービヒクル
、例えばＴｉプラスミドまたはウィルスファージ。
トランスジェニック植物の突然変異体、変種：自然に、
または公知方法例えば紫外線処理、突然変異誘発剤での
処理その他を用いて人工的に作製され、そして本発明に
必須である出発植物の特徴および特性を依然有するトラ
ンスジェニック植物の誘導体。
実　的に純粋なＤＮＡ配列：天然または非天然源から実
質的に純粋な形態で単離されたＤＮＡ配列。そのような
配列は天然系、例えば細菌、ウィルスまたは植物もしく
は動物細胞中に存在していても、また合成ＤＮＡまたは
ｃＤＮＡの形態で利用されてもよい。実質的に純粋なＤ
ＮＡ配列は挿入物として上記ＤＮＡを含むベクターの形
態で一般に単離される。実質的に純粋とは、その他のＤ
ＮＡ配列がほんの無視できる量で存在し、そして５％未
満、好ましくは１％未満、そして特に好ましくは０．１
％未満含有されることを意味する。そのような配列およ
び該配列を含むベクターは一般に水溶液中に、すなわち
緩衝液または慣用の培養基の一つの中に存在する。
本発明は主として、植物キチナーゼ遺伝子の５′非翻訳
領域から得られる調節ＤＮＡ配列であって、該配列が発
現性ＤＮＡおよび植物細胞内で活性な発現シグナルに操
作可能に連結されている場合に、植物宿主への形質転換
で操作可能に結合された発現性ＤＮＡの発現レベルにお
ける著しい増加を導く、新規な前記調節ＤＮＡ配列に関
する。
本発明は特に、植物キチナーゼ遺伝子の５′非翻訳領域
から得られ、あらゆる所望の構造遺伝子に操作可能に連
結されて、形質転換された植物材料内で結合された構造
遺伝子の発現のレベルにおける大きな増加を導く、新規
で実質的に純粋な調節ＤＮＡ配列に関する。
本発明の範囲内で、タバコからの塩基性キチナーゼ遺伝
子の５１非翻訳領域中に存在し、そしてそれ自体公知の
技術によりそれらから得ることができるＤＮＡ配列が特
に好ましい。
本発明はまた、本発明に係る調節ＤＮＡ配列を得るため
の出発材料として作用し得、モして５１非翻訳領域に以
下の特定の構造的特徴：（ａ）１９６７ないし１９７１
位のＣＴＡＣＴ配列内に転写開始部位 ら）該転写開始部位の１１ｂｐＴ流１９８０位に第１の
可能な開始コドン （Ｃ）　　転写開始部位の上流で、５′フランキング領
域の−２８ないし一２３位にＴＡＡＡＴＡ配列（ＴＡＴ
Ａボックス） （ｄ）−１１４位にＣＣＡＡＴＴ配列 （ｅ）−１４０位に６ｂｐからなる不完全逆方向反復配
列（ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣ）げ）　　−１５２位
と一２２８位に１０ｂｐからなる完全反復配列（ＡＴＧ
ＴＣＣＡＡＡＣ）（掲　−１６６位と一５６９位に２０
ｂｐからなる不完全直接反復配列（ＴＴＴＴＡＡＣＴＡ
ＡＡＴＣＴＡＴＧＴＣＣ） （ｈ）　−１９１位と一２１７位に２５ｂｐからなる不
完全直接反復配列（ＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＴＡ
ＴＴＴＴＴＴＡＡＡ） （ｉ）−２ａ９位に２０ｂｐからなるパリンドローム（
ＴＡＡＡＡＴＡＴＧＡＩＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡ） （ｊ）−４３５位と一４８０位に１１ｂｐからなる完全
直接反復配列（ＴＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣ）（ｋ）　　−
５１４位と一６４４位に１５ｂｐからなる不完全直接反
復配列（ＴＡＡＡＡＴＡＣＡＣＧＴＣＧＡ） （１）３’フランキング領域内の翻訳停止配列ＴＡＡの
下流で、５２位と１２０位に２個のＡＡＴＡＡＡ配列 を有するタバコからの塩基性キチナーゼ遺伝子を包含す
る。
本発明の範囲内で、ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハ
バナ４２５植物から得られ、そして下に示すＤＮＡ配列
にニコチアナ・ツバカムの塩基性キチナーゼ遺伝子であ
る遺伝子４８）を含む塩基性キチナーゼ遺伝子が特に好
ましい。
？へパ〕＋＋ナーｔ”逢イ云主＋２の７７しオ÷１−１
ｔＩｚ月５゜ １０り０ １３９゜ １４フＯ １０フ０ Ｔ入ＡＧＡＡＡＧＡＴＡＴＧＡＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＧ
Ｔ１６７゜ １９フＯ ２２９０２３１Ｇ ＣｉＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＴ
’ＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴｒＡＴＣ入入ｏ１０ ２３７゜ ２３９゜ ２４５゜ ２フ５０ Ｂ１０ ｏ７０ ３フ３０ ３７５゜ ＣＧＡＧＣＴＧＣ入Ｇ 適当なキチナーゼ遺伝子の単離のために、当業者には十
分に公知の慣用の一般的方法により創生され得るゲノム
またはｃＤＮＡ遺伝子ライブラリィを出発材料として使
用するのが好ましい。ゲノムまたはｃＤＮＡ遺伝子ライ
ブラリィの基本的創生方法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ　ｅｔ　ａｌ　（１９８２）に詳細に記載され、また
植物系への導入およびそれらの方法の応用は、例えばＭ
ｏｈｎｅｎ　（１９７９）に記載されている。
ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは種々の方法で入手され得
る。ゲノムＤＮＡは、例えば公知方法を用いて適当な細
胞から抽出され、そして精製され得る。ｃＤＮＡの作成
のために、選択された細胞または組織から、しかし特に
高いキチナーゼ濃度を有することが知られている細胞ま
たは組織から単離され得るｍＲＮＡが出発材料として一
般的に使用される。単離されたｍＲＮＡは次に相当する
ＣＤＮＡ作成のためのマトリックスとして逆転写におい
て使用され得る。ＣＤＮＡ作成のための出発材料として
特に好ましいのは、適当な手段により予め刺激され高レ
ベルでキチナーゼを産生する植物細胞もしくは組織また
はその他の適当な植物材料である。これは、例えば培養
された細胞もしくは組織またはその他の適当な植物材料
を無ホルモン培地上に接種し、そして高キチナーゼレベ
ルの誘導に十分な期間それらを培養することにより達成
され得る。発明の範囲内で、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　ａｎ
ｄ　Ｓｋｏｏｇ（１９６５）により提案された塩および
チアミンＨＣＩ濃度を含有する基本培地（ＬＳ培地）が
特に好ましい。
ポリ（Ａ”）ＲＮＡを単離する方法およびＣＤＮＡを作
成する方法は当業者に公知であり、そして実施例におい
て以下に詳細に記載されている。
抽出され、そして精製されたＤＮＡ調製物は次に引き続
くクローニングのための断片に切断される。クローン化
されるべきゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、機械的切断
または好ましくは適当な制限酵素での切断により、クロ
ーニングベクター内への挿入に適当な大きさに断片化さ
れ得る。ゲノムおよび／またはｃＤＮＡ遺伝子ライブラ
リィの創生のための一般的物質として既に使用されてい
る適当なりローニングベクターは例えば、ファージベク
ター例えばλシャロンファージ、または細菌ベクター例
えば大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２を包含する。その他
の適当なりローニングベクターは当業者に公知である。
上記方法で創生された遺伝子ライブラリィから、キチナ
ーゼ遺伝子またはそれらの部分を含む適当なりローンが
スクリーニングプログラム、例えば適当なオリゴヌクレ
オチドプローブ（プローブ分子）を用いて同定され、そ
して次に単離され得る。種々の方法、例えば分別コロニ
ハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼ
ーションが適当なりローンを同定するために利用可能で
ある。特有の翻訳産物の同定に基づいた免疫学的検出方
法が使用されてもよい。
プローブ分子として、例えば同一のキチナーゼ遺伝子ま
たは構造的に関連するキチナーゼ遺伝子から予め単離さ
れ、そして本発明に係るキチナーゼ遺伝子内の配列の相
当する部分とハイブリダイゼーションし得るＤＮＡ断片
が使用され得る。
単離されるべき遺伝子のアミノ酸配列または該配列の少
なくとも一部が公知であれば、その配列情報に基づいて
相当するＤＮＡ配列は引き出され得る。遺伝コードは縮
重していることが知られているから、異なるコドンが大
部分の場合、一つおよび同じアミノ酸のために使用され
得る。結果として、い（っかの例外を別にして、特定の
アミノ酸配列が、互いに類似しているオリゴヌクレオチ
ドの全体の系により一般にコード化され得る。しかしな
がら、オリゴヌクレオチドの系の一つだけが検索されて
いる遺伝子内の相当する配列に実際に相当することを確
認することに注意が払われなければならない。可能性の
あるオリゴヌクレオチドの数を始めから制限するために
、特定のコドンが真核細胞において実際に使用されてい
る頻度を考慮するＬａｔｈｅ　Ｒｅｔ　ａｔ　（１９８
５）により主張されたコドンの使用に関する規則が例え
ば適用され得る。
その情報に基づいて、プローブ分子をゲノムＤＮＡまた
はｃＤＮＡと上記方法の一つにおいてハイブリダイゼー
ションさせることにより、適当なりローンの同定および
単離のためのプローブ分子として使用され得るオリゴヌ
クレオチド分子を引き出すことも可能である。
キチナーゼをコードする所望の遺伝子の検出を促進する
ために、上記のＤＮＡプローブ分子が適当な容易に検出
可能な群で標識され得る。
本発明の範囲内で、検出可能な群は特に容易に同定可能
な物理的または化学的特性を有するあらゆる物質として
理解されるべきである。そのような物質は特にイムノア
ッセイの分野で広く使用されており、そしてそれらの大
部分は本発明において使用され得る。酵素的に活性な群
、例えば酵素、酵素基質、補酵素および酵素阻害剤、お
よび蛍光剤および発色剤、発色団および放射性同位元素
、例えばＩＨ，ＩＩＳ、　ｌ″Ｐ。
１２１７および１４Ｃがこの点で特別な記載がなされ得
る。これらの標識の容易な検出性は、一方で固有の物理
的特性（例えば蛍光標識、発色団、放射性同位元素）、
そして他方でそれらの反応および結合特性（例えば酵素
、基質、補酵素、阻害剤）に基づいている。
高いキチナーゼレベルの産生のために誘導された組織ま
たは細胞から順に単離されるポリ（Ａ”）ＲＮＡから誘
導された一本鎖ｃ　ＤＮＡがプローブ分子として適当で
ある。キチナーゼをコードするＤＮＡ配列を含むけれど
も、Ｎ末端シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を
含まない、そして５ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　ａＬ　（１９
８７）に記載されているキチナーゼｃＤＮＡクローンｐ
ＣＨＮ５０が本発明の範囲内で特に好ましい。
ハイブリダイゼーションに関する一般的記載は、例えば
Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ　ｅｔ　ａｔ（１９８２）および
Ｈａｙｍｅｓ　ＢＴ　ｅｔ　ａｌ　（１９８５）に記載
されている。
プローブ分子とハイブリダイゼーションし得、そして上
記の検出方法の一つにより同定され得る上記遺伝子ライ
ブラリィ内のそれらのクローンは、キチナーゼをコード
する配列の範囲および性質を詳細にさらに決定するため
に次に分析され得る。
キチナーゼ遺伝子をクローニングする別の方法は発現ベ
クターからなる遺伝子ライブラリィの創生に基づいてい
る。その方法において、上記方法と同様に、ゲノムＤＮ
Ａ、Ｌかし好ましくはｃＤＮＡがキチナーゼを発現し得
る細胞または組織からまず分離され、そして次に適当な
発現ベクター内にスプライシングされる。そのようにし
て創生された遺伝子ライブラリィは次いで適当な手段を
用いて、好ましくは抗キチナーゼ抗体を用いてスクリー
ニングされ、そして挿入物として所望の遺伝子または少
なくともその一部を含むクローンが選択され得る。
上記方法を用いて、あらゆる所望の構造遺伝子と操作可
能に連結して、形質転換された植物材料において発現の
非常に増加されたレベルを導く調節ＤＮＡ配列を５１領
域に有する植物キチナーゼ遺伝子、しかし特にタバコか
らの塩基性キチナーゼ遺伝子を単離することが可能であ
る。
キチナーゼ遺伝子のその他の特徴づけのために、上記の
ように精製および単離されたＤＮＡ配列を配列分析に供
する。予め単離されたキチナーゼ遺伝子を最初に適当な
制限酵素により断片に切断し、そして次に適当なりロー
ニングベクター、例えばＭ１８ベクターｍｐ１８および
ｍｐ１９内にクローン化する。配列決定は５１→３１方
向に行われ、好ましくはＳａｎｇｅｒ［Ｓａｎｇｅｒｅ
ｔ　ａｔ、１９７７１によるジデオキシヌクレオチド鎖
停止法またはＭａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ［Ｍ
ａｘａｍ　ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ、　１９８０１による
方法が用いられる。配列決定におけるエラーを防止する
ために、同時に２本のＤＮＡ鎖の配列を決定することが
有利である。ヌクレオチド配列および相当するアミノ酸
配列の分析は適当なコンピュータソフトウェアを用いて
有利にコンピュータアシストされている。
下の実施例において詳細に記載されている本発明の好ま
しい態様において、染色体タバコＤＮＡのゲノム遺伝子
ライブラリィは最初に創生され、そして予め単離された
ｃＤＮＡクローン（ｐＣＨＮ　５　Ｑ、　５ｈｉｎｓｈ
ｉ　ｇｔ　ａＬ、１９８７に記載）をプローブ分子とし
て用いるプラークハイブリダイゼーションによりスクリ
ーニングされる。
総計で５Ｘ１０’個のプラークの実験の後、１０個の組
換え体が得られ、これらは最初に精製され、次にサザン
プロット分析により部分的に特徴づけられる。これらの
クローンのうちの２個（λＣＨＮ１４およびλＣＨＮ１
７）がゲノム内の異なる領域から誘導され、完全なキチ
ナーゼ遺伝子を含む。クローンλＣＨＮ１７がプローブ
分子として作用するｃＤＮＡクローンｐｃＨＮ５０およ
びｐＣＨＮ４８（実施例４．４に記載）と非常に強いハ
イブリダイゼーションシグナルを生じるから、その他の
特徴づけのためにクローンλＣＨＮ１７が選択される。
ＨｉｎｄＩＩ［制限酵素との消化の後、５．４ｋｂＤＮ
Ａ断片が得られ、これは完全キチナーゼ遺伝子を含み、
そしてタバコＤＮＡからの同じ大きさの断片と関連する
。！３８５０ｂｐからなり、そして全体のコード配列を
含む該断片の一部を次に配列決定する。タバコからの塩
基性キチナーゼ遺伝子の完全なＤＮＡ配列は遺伝子４８
として上に示した。
タバコからの塩基性キチナーゼ遺伝子の５ｖおよび３１
−フランキング領域は、その他の真核遺伝子に類似の調
節機能と直接連結され得る種々の領域を示す。例えばｍ
ＲＮＡの転写開始部位はＳｌヌクレアーゼマツピングに
より決定され得る。全体で２本のバンドが見られ、これ
は種々の開始部位がキチナーゼ遺伝子上に存在するとい
う予測を導く。当該バンドの強度を根拠とすれば、主要
転写開始部位はＣＴＡＣＴ配列内の１９６９位にあるＡ
と同一である。第１の可能性のある開始シグナルは上記
転写開始部位の１１ｂｐ下流の１９８０位にある、塩基
配列ＴＡＡＡＡＴＧＡＧ内に見出され、これは植物遺伝
子のその他の翻訳開始部位と並んでおり、コンセンサス
配列と呼ばれる。
５′フランキング領域は以下の塩基配列：（ａ）　　転
写開始部位の上流で、５′フランキング領域の−２８な
いし一２３位にＴＡＡＡＴＡ配列（ＴＡＴＡボックス） （ｂ）ＴＡＴＡボックスの上流で動物遺伝子にときどき
見出されるＣＡＡＴボックスに類似している、−１１４
位のＣＣＡＡＴＴ配列 （Ｃ）　　動物遺伝子の調節熱シヨツクコンセンサスエ
レメントに類似している、−１４０位に６ｂｐからなる
不完全逆方向反復配列（ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣ） （ｄ）−１５２位と一２２８位に１０ｂｐからなる完全
反復配列（ＡＴＧＴＣＣＡＡＡＣ）（ｅ）−１６８位と
一５６９位に２０ｂｐからなる（ｆ）−１９１位と一２
１７位に２５ｂｐからなる（□□□　−２８９位に２０
ｂｐからなるパリンドローム（ＴＡＡＡＡＴＡＴＧＡＩ
ＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡ） （ｈ）　　−４３５位と一４８０位に１１ｂｐからなる
完全直接反復配列（ＴＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣ）（ｉ）　
　−５１４位と一６４４位に１５ｂｐからなる不完全直
接反復配列（ＴＡＡＡＡＴＡＣＡＣＧＴＣＧＡ） によりさらに特徴づけられる。
３′フランキング領域は、翻訳停止配列ＴＡＡの下流で
、５２位と１２０位の２個のＡＡＴＡＡＡ配列により特
徴づけられる。
本発明に係る調節ＤＮＡは、当業者には十分公知である
適当な方法により予め単離されたキチナーゼ遺伝子の５
′領域から得ることができる。ニコチアナ・ツバカムの
塩基性キチナーゼ遺伝子の５′領域からの調節ＤＮＡ配
列が本発明の範囲内で特に好ましい。配列のこの部分は
、少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、そ
して特に少なくとも７０％の範囲までＡ／Ｔを含み、そ
して少なくとも１００塩基対、好ましくは少なくとも４
０塩基対、そして特に少なくとも３１塩基対からなるＡ
／Ｔに富んだ領域である。
ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハバナ４２５植物［Ｂ
ｉｃｈｈｏｌｚ　ｅｔ　ａｌ、１９８３］の柔細胞髄組
織のクローン化系列から単離された塩基性キチナーゼ遺
伝子の場合、上記配列は一３１位から翻訳開始点の始ま
りである一１位に延びている。
配列分析を用いて、以下のヌクレオチド配列が配列の当
該部位に対して決定され得る：５　’　−ＴＴＧＣＡＴ
ＴＴＣＡＣＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＡ
−３” この調節ＤＮＡ配列は公知の塩基配列であり、適当なキ
チナーゼ遺伝子から各同断たに単離される必要はなく、
もちろんいつでも化学的操作により非常に容易に合成さ
れ得る。短いＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成に適当な
方法、例えばホスホトリエステル法またはホスフィツト
法は当業者には公知である。今日、多くのオリゴヌクレ
オチド合成は機械化され、そして自動化されており、そ
のため短いＤＮＡ断片は短時間で製造され得る。
それ故に、１個またはそれ以上の塩基対の欠失、挿入ま
たは置換による、上で非常に詳細に記載されたＤＮＡ配
列の変種または突然変異体は容易に製造され得、そして
それらの適性が検査され得る。
詳しくは、操作は、本発明に係る調節ＤＮＡ配列の一つ
を含む遺伝子を最初に同定および単離することであって
よい。適当なりローニングベクター内にスプライシング
させた後、上記遺伝子、特に５１調節配列は次に公知工
程手段により変性され得る。特定の突然変異体を作成す
る特に適した方法はいわゆるオリゴヌクレオチド仲介突
然変異誘発である。その方法において、野生型配列に実
質的に相同であるけれども、個々のヌクレオチドにおい
て相違する短いオリゴヌクレオチド断片が合成される。
上記相違は１個またはそれ以上のヌクレオチドの挿入、
欠失または置換であってよい。これらの突然変異された
断片は次に一般的公知方法により野生型遺伝子の相同対
と置換される。最終構築物は次いで、以下に詳細に記載
されるように、適当な植物発現ベクターにクローン化さ
れ、そして植物内に形質転換され得る。
それ故に、本発明は上に非常に詳細に記載された塩基配
列に制限されず、１個またはそれ以上の塩基の欠失もし
くは挿入または特に１個またはそれ以上の塩基の置換に
より形成されており、そして出発配列の特定の調節発現
増加特性を依然として有する上記ＤＮＡ配列の全ての突
然変異体および／または誘導体をも包含する。
本発明はまた、上に非常に詳細に記載されたＤＮＡ配列
から、または出発配列の特定の調節発現増加特性を依然
として有する上記ＤＮＡ配列の誘導体から得られる断片
または部分配列を包含する。
以下のＤＮＡ配列： ５　’−ＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＡ−３’を有する
部分配列が特に好ましい。
上記したように単離され得る調節ＤＮＡ配列またはそれ
らの部分配列は、同じ作用を有する相同ＤＮＡ配列を同
定するために今使用され得る。それは、例えば最初にゲ
ノム遺伝子ライブラリィを創生じ、そしてプローブ分子
とハイブリダイゼーションし得る相同ＤＮＡの存在のた
めに該プローブ分子として本発明に係る調節ＤＮＡの一
つを用いて上記の方法で上記ライブラリィを調べること
により行われる。
本発明はまた、本発明に係るＤＮＡ配列の一つを用いて
同じ作用を有する相同ＤＮＡ配列を同定するための方法
に関する。
本発明はさらに、本発明に係る調節ＤＮＡ配列が構造遺
伝子および植物細胞内で活性なその他の発現シグナル、
例えばプロモーターおよび終結配列に操作可能に連結さ
れているキメラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分子の
横築に関する。
プロモーター配列と本発明に係る隣接調節ＤＮＡ配列と
の間にスペーサー配列を含むことはしばしば有利であり
、前記スペーサー配列の長さは該プロモーター配列と本
発明に係る調節ＤＮＡ配列との間の距離が結合された構
造遺伝子の発現に対して最適な距離であるように選択さ
れる。ｌｂｐないし１００ｂｐ、好ましくは２ｂｐない
し４６ｂｐからなるスペーサー配列が本発明の範囲内で
特に好ましい。
構造遺伝子および植物細胞内で活性なその他の発現シグ
ナル、例えばプロモーターおよび終結配列に操作可能に
連結される場合、本発明に係る調節ＤＮＡ配列は、発現
のレベルにおいて著しい増加を導くが、それは４００倍
まで、またはそれ以上の増加であり得る。従って、遺伝
子の発現があまりに低く、そのため細胞中のタンパク質
濃度が低かったから、これまで達成できなかったか、ま
たは不満足な範囲までしが達成できなかった植物におけ
る特定の特徴の表現型発現、例えばある種の病原体また
は化学物質に対する耐性を十分に改善することが、本発
明の範囲内で初めて可能である。このことは特徴の発現
が細胞内のタンパク質濃度と直接関係する場合に特に重
要である。
細胞毒素に対する耐性は、例えば細胞毒素を解毒する酵
素、例えばカナマイシン、ハイグロマイシンおよびその
他のアミノグリコシド抗生物質を解毒するように作用す
るネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■型もしくは
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ■型、また
はグルタチオン−３−）ランスフェラーゼもしくはチト
クロームＰ−４５０、またはトリアジン、スルホニル尿
素もしくはその他の除草剤を解毒することが知られてい
るその他の異化的に活性な酵素をコードし、そして植物
細胞内に発現する遺伝子を導入することにより与えられ
てもよい。細胞毒素に対する耐性はまた、細胞毒素の活
性に対して耐性である「標的酵素」の特定の形態（細胞
毒素活性の作用部位）、例えばスルホニル尿素もしくは
イミダゾリノン、またはこの特定の異化段階で相互作用
するその他の除草剤による阻害に対して感受性でないア
セトヒドロキシ酸シンターゼの変形、またはグリホセー
トによる阻害に対して感受性でないことがわかっている
ＥＰＳＰシンターゼの変形を植物内に発現する遺伝子に
より与えられてもよい。
植物細胞での正確な細胞内小器官、例えば上記の例にお
ける葉緑体内へそれらを移送させる形態にあるこれらの
改変された標的酵素を発現することは有利であり得る。
さらにある場合には、ミトコンドリア、液胞、細胞質内
部の小胞もしくはその他の細胞領域内に、または細胞間
空間（アポブラスト）内にも遺伝子産物を導くことは有
利である。
ある種の菌類に対する耐性は、例えば植物組織内にキチ
ナーゼを発現する遺伝子の挿入により与えられてもよい
。非常に多（の植物病原性菌類は、菌糸および胞子構造
の欠（ことのできない成分としてキチンを含有し、例え
ば担子菌類（黒穂菌およびサビ菌）および子のう菌類お
よび不完全菌類〔アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉ
ａ）およびビボラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）　、エク
セロフィラム・タルシカム（ＥｘｅｒｏｐｈｉＬｕｒｎ
　ｔｕｒｃｉｃｕａ）、コレトラトリカム（Ｃｏｌｌｅ
１０ｔｒｉｃｕａ）　、グレオセルコスボラ（ＧＬｅｏ
ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）およびセルコスポラ（Ｃｅｒｃ
ｏｓｐｏｒａ）〕を包含する。キチナーゼは試験管内で
ある種の病原体の菌糸体の増殖を阻害し得る。構造的に
、または病原体侵入に応じてキチナーゼを発現する植物
の葉または根は、非常に多（の異なる菌類の攻撃から保
護される。キチナーゼは最初に新たな合成のための誘発
剤を待つ必要なしに高い濃度ですぐに存在するから、特
別な状態に応じて、構造的な発現は、多（の植物におい
て病原体攻撃に対する正常な応答として起こる誘導性発
現より有利であるかもしれない。
タバコから得られる塩基性キチナーゼ遺伝子、特にニコ
チアナ・ツバカムの園芸品種ハバナ４２５植物［Ｂｉｃ
ｈｈｏｌｚ　ｅｔ　ａｔ、１９８３］の柔細胞髄組織の
クローン化系列から得られ、そして上に示した遺伝子４
８の配列を有する塩基性キチナーゼ遺伝子が本発明の範
囲内で特に好ましい。
昆虫耐性は、例えば昆虫および／またはそれらの幼虫に
対して毒性であるポリペプチド、例えばバチラス・スリ
ンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｌｌｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓ）の結晶性タンパク質をコードしている遺伝子
により付与され得る。昆虫耐性を与える第二類のタンパ
ク質はプロテアーゼインヒビターである。プロテアーゼ
インヒビターは植物貯蔵構造体の通常の構成要素である
。ダイズから単離・精製されたボウマン−パーク（Ｂｏ
ｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ）プロテアーゼインヒビターは、テ
ネブリオ幼虫の内蔵プロテアーゼを阻害することが示さ
れた［Ｂｉｒｋ　ｅｔ　ａＬ　（１９６３）］　、ササ
ゲトリブシンインヒビターをコードしている遺伝子は、
Ｈｉｌｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９８７）に記載されて
いる。
プロテアーゼインヒビターをコードしている遺伝子は、
植物プロモーター、例えばＣａＭＶ８５Ｓプロモーター
のような構造的なプロモーターの制御下で適当なベクタ
ー内に導かれていてもよい。遺伝子、例えばダイズボウ
マンーバークブロテアーゼインヒビターのコード配列は
、ｃＤＮＡクローニング方法を用いて得ることができる
。１００個より少ないアミノ酸を有するプロテアーゼイ
ンヒビター、例えばリママメトリブシンインヒビターを
得る方法は、それを合成することである。コード配列は
アミノ酸配列のバックトランスレーションにより予測さ
れ得る。さらに、所望の特定のベクターに対して適当な
制限部位は両端部に包含される。合成遺伝子は３０ない
し６０塩基対の重複オリゴヌクレオチド断片を合成し、
それらの断片にリン酸転移し、次に互いを連結し［Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａＬ。
（１９８２）］　、そして最後に適当なベクター内にク
ローン化することにより製造される。その挿入が正確な
配向にあるクローンは、配列決定により同定され得る。
プロトプラスト内への挿入のために、単離されたプラス
ミドＤＮＡが使用され得る。
多（の昆虫は、ラメラ層中のキチンミセルが基質内に埋
め込まれているクチクラ骨格を有する。それ故に、病原
虫に対する耐性または少なくとも許容性を生じさせるそ
の他の考えられる方法は、キチナーゼ酵素をコードする
遺伝子の使用であり、そして植物中への挿入の後、それ
をそこで発現させることである。タバコから得られる塩
基性キチナーゼ遺伝子、特にニコチアナ・ツバカムの園
芸品種ハバナ４２５植物［Ｂｉｃｈｈｏｌｚ　ｅｔ　ａ
ｌ、１９８３］の柔細胞髄組織のクローン化系列から得
られ、そして上に示した遺伝子４８の配列を有する塩基
性キチナーゼ遺伝子が本発明の範囲内で特に好ましい。
病原体に対する植物の保護機構において中心的な役割を
おそら（演じるその他の酵素はβ−１，８−グルカナー
ゼであり、それ故に、この酵素もまた本発明の範囲内で
好ましい。
上記全ての場合において、挿入された遺伝子の発現が増
加し、そしてその結果としてタンパク質（酵素）ａ度が
高まるので、植物に対する保護作用が高まるであろうこ
とが期待されるべきである。
驚（べきことに、本発明の範囲内で、植物内で発現して
該植物に対して保護作用を導く構造遺伝子を本発明に係
る調節ＤＮＡ配列に、そして所望によりさらに発現に必
要な配列部位ならびに転写や翻訳の制御に必要な配列部
位（なお、これらの配列部位は標的植物に関して相同お
よび非相同の起源であってよい）に操作可能に連結し、
そして生成するキメラ遺伝子構築物をそれ自体公知の方
法により標的植物内に挿入することにより挿入された外
来遺伝子の発現のレベルにおける増加を達成することが
今回能となった。
形質転換された植物細胞およびそれらから発生する組織
、そして特に植物に保護作用、例えば病原体（例えば植
物病原性菌類、バクテリア、ウィルスその他）に対する
増加した耐性：化学物質〔例えば除草剤（例えばトリア
ジン、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾール
ピリミジン、ビアラホス、グリホセートその他）、殺虫
剤もしくはその他の殺生物剤〕に対する耐性；不利な環
境要因（例えば暑さ、寒さ、風、不利な土壌条件、湿気
、乾燥その他）に対する耐性を導く全ての遺伝子が本発
明の方法における使用に特に適している。
本発明に係るＤＮＡ配列はまた、植物細胞自体またはよ
り高度なオーガナイゼーション単位、例えば組織、カル
ス、器官、胚または全体の植物の一部に望ましく有用な
化合物の産生における可能な増加を生じさせるために理
想的な様式で使用され得る。本発明のＩ！！囲内で使用
され得る遺伝子は、例えば、葉、種子、塊茎、根、茎そ
の他における保存物質または貯蔵物質の増加した形成を
導く遺伝子を包含する。トランスジェニック植物により
産生され得る望ましい物質は、例えばタンパク質、デン
プン、糖、アミノ酸、ビタミン、アルカロイド、フラビ
ン、芳香剤および色素、脂肪その他を包含する。
薬学的に活性な物質、例えばある種のアルカロイド、ス
テロイド、ホルモン、免疫モジュレータ−およびその他
の生理学的に活性な物質をコードする構造遺伝子もまた
、本発明に係る調節ＤＮＡ配列に結合され得る。
それ故に、本発明範囲内で考慮され得る遺伝子は公知遺
伝子、例えば植物に特有の遺伝子、例えばトウモロコシ
からのゼイン遺伝子、オート麦からのアペニン遺伝子、
イネからのグルテリン遺伝子等、哺乳類特有の遺伝子、
例えばインシュリン遺伝子、ソマトスタチン遺伝子、イ
ンターロイキン遺伝子、ｔ−ＰＡ−遺伝子等、または微
生物起源の遺伝子、例えばＮＰＴＩ［遺伝子等ならびに
合成遺伝子、例えばインシュリン遺伝子等を包含するが
、しかしこれに限定されない。
有用でそして望ましい特性をコードする天然に生じる構
造遺伝子を別にして、本発明の範囲内で、化学的方法ま
たは遺伝子操作方法を用いる特定の方法で予め変形した
遺伝子を使用することも可能である。
さらに、本発明の広い概念はまた、化学合成により全体
が製造される遺伝子も包含する。それ故に、本発明の範
囲内で使用され得る遺伝子またはＤＮＡ配列は、本発明
の範囲内で与えられた定義に従う、相同および非相同遺
伝子またはＤＮＡおよび合成遺伝子またはＤＮＡである
。
インシュリン遺伝子がこの点で合成遺伝子の例として記
載され得る。
本発明の範囲内で、植物細胞内で活性な発現シグナルと
操作可能に連結されて、センスＤＮＡによりコードされ
たｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、それ故に
該ｍＲＮＡを結合し得るＲＮＡ分子の産生を導くいわゆ
るアンチセンスＤＮＡを使用することも可能である。こ
の様式で、特定のｍＲＮＡの相当するタンパク質への翻
訳は防止されるか、または少なくとも制限され得、その
結果、ある手段が植物において選択された遺伝子の遺伝
子発現を有効に制御するために利用可能である。
本発明の範囲内で使用され得るＤＮＡ配列は、ゲノムＤ
ＮＡから、ｃＤＮＡから、または合成ＤＮＡから排他的
に構築される得る。もう一つの可能性は、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡからなるハイ
ブリッドＤＮＡ配列の構築である。
その場合、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡと同じ遺伝子から生
じてもよく、またｃＤＮＡとゲノムＤＮＡの両方が異な
る遺伝子から生じてもよい。
しかしながら、あらゆる場合において、ゲノムＤＮＡお
よび／またはｃＤＮＡは同一遺伝子または異なる遺伝子
から個々に各々製造されてもよい。
ＤＮＡ配列が１以上の遺伝子の部分を含む場合には、こ
れらの遺伝子は１種そして同一個体に由来しても、また
は同−属の同一種もしくは様々な種の種々の株もしくは
変種に属する種々の個体に由来しても、また同一もしく
は異なる分類学上の単位（門）の１以上の属に属する個
体に由来してもよい。
植物細胞中の上記構造遺伝子の発現を確実にするために
、コード遺伝子配列は植物細胞内で機能し得る発現配列
に操作可能な様式で最初に連結されることが有利である
。
従って、本発明の範囲内のハイブリッド遺伝子構築物は
、本発明に係る調節ｌｉＤＮＡ配列に加えて、１種また
はそれ以上の構造遺伝子ならびにプロモーターおよびタ
ーミネータ−配列の両方および３１および５１非翻訳領
域のその他の調節配列を包含する発現シグナルを含有す
る。
コードＤＮＡ配列（構造遺伝子）の発現の誘導を引き起
こし得るあらゆるプロモーターおよびあらゆるターミネ
ータ−をハイブリッド遺伝子配列の成分として使用し得
る。植物または植物ウィルスの遺伝子に由来する発現シ
グナルは特に適当である。適当なプロモーターおよびタ
ーミネータ−の例は、カリフラワーモザイクウィルス遺
伝子（ＣａＭＶ）のもの、または記載した発現シグナル
の特徴的な特性を依然有する相同ＤＮＡ配列である。細
菌の発現シグナル、特にアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのＴｉプラスミドからのツバリンシンターゼ
遺伝子（ｎｏｓ）またはオクトピンシンターゼ遺伝子（
ＯＣＳ）もまた適当である。
ＣａＭＶゲノムの３５３および１９３発現シグナルまた
はそれらの相同物が本発明の範囲内で好ましく、例えば
Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８２）に記載
されるような分子生物学的方法を用いて前記ゲノムから
単離され、そしてコードＤＮＡ配列に結合され得る。
３５Ｓおよび１９３発現シグナルの相同物は、本発明の
範囲内で、わずかな配列の相違があっても実質的に出発
配列と実質的に相同であり、そしてそれらの出発配列と
同一の機能を依然有する配列を意味するものとして理解
されるべきである。
本発明に従って、３５Ｓ転写制御配列に使用される出発
材料は、例えば遺伝子地図［Ｆｒａｎｋ　Ｇｅｔ　ａＬ
、　（１９８０）］の］ヌクレオチド６８０８−７６３
を包含するＣａＭＶ“Ｓ“株のＳｃａ　Ｉ断片であって
よい。
１９Ｓプロモーターおよび５１非翻訳領域は、ＣａＭＶ
遺伝子地図［Ｈｏｈｎ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８２）］
のＰＳｔ１部位（５３８６位）とＨｉｎｄＩ［Ｉ部位（
５８５０位）との間のゲノム断片上に位置する。相当す
るターミネータ−および３′非翻訳領域は、ＣａＭＶゲ
ノムの７３４２位と７６４３位との間の８ｃｏＲＶ／　
ＢｇｌＩＩ断片上に位置する。
完全なヌクレオチド配列がＧａｒｄｎｅｒ　ＲＣｅｔ　
ａｌ。
（１９８１）に記載されているＣａＭＶ　ＣＭＩ　８４
１株の発現シグナルが本発明の範囲内で好ましい。
使用し得る効果的な植物プロモーターのもう１つの例は
、過産生植物プロモーターである。
この種のプロモーターは、所望の遺伝子産物をコードす
る遺伝子配列に操作可能に連結されているならば、前記
遺伝子配列の発現を仲介可能であるべきでる。
本発明の範囲内で使用し得る過産生植物プロモータは、
ダイズからのりブロース−１，５ビスホスフエートカル
ボキシラーゼの小サブユニットのプロモーターおよびク
ロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターを包含
する。
これらの２種のプロモーターは、それらが真核植物細胞
において光により誘導されるという事実で知られている
〔例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　
ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、　Ａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ。
Ｃａｓｈｍｏｒｅ　Ａ（１９８３）参照）。
それ故に、本発明は、本発明に係る調節発現増加性ＤＮ
Ａ配列が発現性ＤＮＡおよび植物細胞内で活性なその他
の発現性シグナルに操作可能に連結され、その結果植物
宿主内での形質転換で前記の操作可能に結合された発現
性ＤＮＡの発現のレベルにおける著しい増加が得られる
キメラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明に係る調節発現増加性ＤＮＡ配列が形質転換され
た植物細胞およびそれらから発生する組織、特に植物に
、病原体、化学物質および不利な（土壌または大気の）
環境要因に対する保護作用を付与する構造遺伝子と操作
可能に連結されているキメラ遺伝子構築物を含む組換え
ＤＮＡ分子が特に好ましい。
本発明に係る調節発現増加性ＤＮＡが植物細胞内でキチ
ナーゼまたはグルカナーゼを発現する構造遺伝子と操作
可能に結合されているキメラ遺伝子構築物を含む組換え
ＤＮＡ分子が本発明の範囲内でとりわけ好ましい。
本発明はまた、形質転換された植物細胞自体または組織
、器官、カルス、胚および全体の植物からなる群から選
択されるより高度なオーガナイゼーション単位の部分に
おいて発現して、望ましく有用な化合物の産生の増加を
導く、構造遺伝子と本発明に係る調節発現増加性ＤＮＡ
配列が操作可能に結合されているキメラ遺伝子構築物を
含む組換えＤＮＡ分子を包含する。
キメラ遺伝子の横築に使用され得るその他の調節ＤＮＡ
配列は、例えば誘導または抑制によって植物組織内で結
合ＤＮＡ配列の転写を制御し得る配列を包含する。
種々の内部および外部要因、例えば植物ホルモン、熱シ
ョック、化学物質、病原体、酸素不足、光その他により
誘導されることが知られている個々の植物遺伝子が例と
して挙げられる。
植物ホルモンによる遺伝子調節の例として、ワタの後胚
期の間に生じる過剰のｍＲＮＡを誘導することが知られ
ているアブシジン酸（ＡＢＳ）が言及されるべきである
。その他の例は、ヒマの実におけるマレートシンターゼ
転写物および大麦の糊粉層におけるα−アミラーゼのイ
ソ酵素を誘導するジベレリン酸（ＧＡ３）である。
マメの葉におけるグルカナーゼおよびキチナーゼの活性
はストレスホルモンエチレンとの処理により著しく高め
られ得る。キチナーゼの場合、誘導作用はキチナーゼ遺
伝子のプロモーターを介して制御され、そしてマメ〔フ
ァセオルス・ヴアルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ））のキチナーゼ遺伝子からのプロモータ
ーを用いるリポータ−遺伝子試験により、これを示すこ
とが可能だった。
ダイズの熱ショック感受性タンパク質遺伝子の調節は詳
細に研究されてきた。４０℃の温度で数時間植物を処理
すると、いわゆる熱シヨツクタンパク質の新たな合成を
生じる。これまで非常に多くの遺伝子が単離され、そし
てそれらの調節が詳細に分析された。それらの遺伝子の
発現は転写段階で主として制御される。例えば、ｈｐｓ
７０遺伝子のプロモーターがネ、９オマイシンホスホト
ランスフェラーゼＩ［（ＮＰＴＩＩ）遺伝子と融合され
る場合、その様にして形成されたキメラ遺伝子は熱ショ
ックにより誘導され得る（Ｓｐｅｎａ　ｅｔ　ａＬ、　
１９８５）。
植物内に誘導可能な遺伝子のもう一つのクラスは、光誘
導化遺伝子、特にリブロース１．　５＝ビスホスフエー
トカルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニッ
トの核コード化遺伝子からなる。Ｍｏｒｅｌｌｉ　ｅｔ
　ａＬ　（１９８５）は、リポータ−遺伝子がエントウ
からのＲＵＢ　Ｉ　５ＣＯａ伝子の５１−フランキング
配列にキメラの形態で連結される場合に、該５′一フラ
ンキング配列がリポータ−遺伝子に光誘導性を導入し得
ることを示した。この観察をその他の光誘導化遺伝子、
例えばクロロフィルａ　／　ｂ結合タンパク質に広げる
ことも可能となった。
トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａ
ｄｈ遺伝子）が鋭意研究の対象だった。トウモロコシか
らａｄｈｌ−ｓ遺伝子が単離され、そして−時的に形質
転換された組織が嫌気条件下に暴露されたとき５１−フ
ランキングＤＮＡがキメラリポータ−遺伝子（例えばク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＣＡ
Ｔ）の発現を誘導し得ることが示された［Ｈｏｗａｒｄ
　ｅｔ　ａｔ　（１９８７）］。
制御可能なＤＮＡ配列のその他の群は化学的に制御可能
な配列であり、それは例えばタバコのＰＲ（病原体関連
）タンパク質遺伝子内に存在し、そして化学調節剤によ
り誘導され得る。
上に例示した調節性ＤＮＡ配列は、天然起源または合成
起源であってよく、また天然および合成ＤＮＡ配列の混
合物からなっていてよい。
それ故に、本発明は本発明に係る調節ＤＮＡ配列の他に
、構造遺伝子、そして例えば遺伝子発現の特異的に制御
された誘導または抑制を可能にするＤＮＡ配列のその他
の調節部位を操作可能に連結されて含むキメラ遺伝子構
築物を包含する。
配列の種々の部位はそれ自体公知の方法により互いに連
結されて、植物細胞内で発現可能な完全なＤＮＡ配列を
形成する。適当な方法は、例えば相同部位を有するＤＮ
Ａ配列の生体内組換えおよび制限断片の試験管内連結を
包含する。
一般的に使用されるクローニングベクターは宿主細胞に
適合する種起源の、複製および制御配列を有するプラス
ミドまたはウィルス（バクテリオファージ）ベクターで
ある。
クローニングベクターは一般的に、一つの複製開始点、
そしてさらに形質転換された宿主細胞内で表現型の選択
特性、特に抗生物質またはある種の除草剤に対する耐性
を導く特有の遺伝子を有する。宿主細胞内で形質転換後
、形質転換されたベクターはこれらの表現型マーカーに
より選択され得る。
本発明の範囲内で使用され得る選択可能な表現型マーカ
ーは、例えばこれが本発明の主題を限定することな（ア
ンピシリン、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、カ
ナマイシン、メトトレキサート、０４１８およびネオマ
イシンに対する耐性を包含する。
本発明の範囲内の適当な宿主細胞は、原核生物であり、
細菌宿主、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　、大腸菌（Ｅ、
ｃｏＬｉ）　、ニス、・チフイムリウム（Ｓ、　ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕａ）およびセルラチア・マルセッセンス
（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ａａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびシ
アノバクテリアを含む。真核生物宿主、例えば酵母、菌
糸体形成菌および植物細胞も本発明の範囲内で使用でき
る。
本発明に係るハイブリッド遺伝子構築物の適当なりロー
ニングベクター内へのスプライシングは、例えばＭａｎ
ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａＬ、　（１９８２）に記載された
標準法を用いて行われる。
一般的に、スプライシングされるべきベクターおよびＤ
ＮＡ配列をまず最初に適当な制限酵素で切断する。適当
な制限酵素は、例えばプラント末端を有する断片を生じ
るもの、例えばＳｍａ　Ｉ、Ｈｐａ　ＩおよびＢｃｏＲ
Ｖ、または粘着端を形成する酵素、例えばＢｃｏＲｌ、
Ｓａｃ　ＩおよびＢａｍ旧である。
プラント末端を有する断片と互いに相補的である粘着端
を有する断片の両方を、適当なＤＮＡリガーゼにより再
び連結し、連続的で均一なＤＮＡ分子を形成することが
できる。
突出する粘着端を有するＤＮＡ断片を大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼのフレノウ断片と処理して、相当する相補的ヌ
クレオチドで空隙を充填することによりプラント末端を
製造することもできる。
他方、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを用いて所望のＤＮＡ配列および切断されたベ
クター分子の端部に相補的ホモポリマー足部を添加する
か、または制限切断部位を有する合成オリゴヌクレオチ
ド配列（リンカ−）を添加し、そして次に適当な酵素で
切断することにより、粘着端を人工的に製造することも
できる。
クローニングベクターおよび該ベクターで形質転換され
た宿主細胞は、一般にベクターのコピー数を増やすため
に使用される。増加したコピー数によって、ハイプツト
遺伝子構築物を有するベクターを単離すること、そして
例えばキメラ遺伝子配列を植物細胞内に挿入するために
前記ベクターを使用することが可能となる。
その他の操作段階において、所望の遺伝子産物をコード
する構造遺伝子または制御機能を有する非コードＤＮＡ
配列、例えばアンチセンスＤＮＡを植物細胞内に挿入し
、そして場合によってはそれを植物ゲノム内に組み込む
ために上記プラスミドを使用することができる。
本発明はそれ故に、構造遺伝子またはその他の望ましい
遺伝子または遺伝子断片またはそれらのゲノム内に含ま
れるその他の有用なＤＮＡ配列を含む受容性植物細胞の
作成にも関する。
キメラ遺伝子構築物の挿入は公知の遺伝子導入方法を用
いて植物プロトプラスト中で行われるのが好ましい。
多くの非常に有効な方法が植物細胞中にＤＮＡを導くた
めに存在しており、該方法は遺伝子導入ベクターの使用
または直接遺伝子導入方法に基づいている。
一つの可能な方法は、例えば植物細胞をウィルスまたは
アグロバクテリウムと接触させることからなる。これは
、感受性植物細胞を感染させるか、または該植物細胞か
ら誘導されたプロトプラストを共培養することにより達
成され得る。本発明の範囲内でカリフラワーモザイクウ
ィルス（ＣａＭＶ）が植物内への本発明に係るキメラ遺
伝子構築物の挿入のためのベクターとして使用されても
よい。ＣａＭ’Ｖの全ウイルスＤＮＡゲノムが細菌親プ
ラスミド内に組み込まれ、細菌中で増殖され得る組換え
ＤＮＡ分子を形成する。クローニングが行われた後、組
換えプラスミドは制限酵素を用いて無作為にまたは該組
換えプラスミドのウィルス部分、例えばアフィドにより
ウィルスの移動性をコードする遺伝子内の非常に特異的
な非必須部位で切断し、そしてハイブリッド遺伝子構築
物が切断部位中にクローン化される。
単一の特定の制限認識部位を有する小さいオリゴヌクレ
オチド、いわゆるリンカ−もまた組み込まれ得る。その
ようにして変形された組換えプラスミドは再びクローン
化され、そしてハイブリッド遺伝子構築物をたった一度
出現する制限部位中にスプライシングさせることにより
さらに変形される。
組換えプラスミドの変形ウィルス部分は次いで細菌の親
プラスミドから切り出され、そして植物細胞または全体
の植物の接種のために使用される。
キメラ遺伝子構築物を細胞中に挿入するもう一つの方法
は、該遺伝子構築物を用いて形質転換されたアグロバク
テリウム・チュメファシエンスおよび／またはアグロバ
クテリウム・リゾゲネスでの植物細胞の感染を利用する
。トランスジェニック植物細胞は次に当業者には公知の
適当な培養条件下で培養され、その結果それらは苗条お
よび根を形成し、そして全体の植物が最終的に形成され
る。
′植物材料を形質転換するもう一つの可能な方法は、Ｐ
ｅｔｉｔ　ｅｔ　ａＬ　（１９８６）にニンジンの形質
転換のために記載されたように、アグロバクテリウム・
リゾゲネスおよび形質転換されたアグロバクテリウム・
チュメファシエンスの両方を用いる混合感染からなる。
混合比率は、アグロバクテリウム・リゾゲネスの形質転
換に基づいて形成された根コロニーが高比率のアグロバ
クテリウム・チュメファシエンスＴｉプラスミドを含む
ようでなければならない。このことは、例えば、アグロ
バクテリウム・リゾゲネスおよびアグロバクテリウム・
チュメファシエンスを一緒に植物材料に公知方法により
混合比率１：１ないしｌ：１００で、好ましくは１：ｌ
Ｏで適用することにより達成され得る。トランスジェニ
ック植物は次に当業者には公知の適当な培養条件下で培
養され、その結果それらは苗条および根を形成し、そし
て全体の植物が最終的に形成される。２つのアグロバク
テリウム種は、形質転換されるべき植物材料の実際の接
種直前に混合されるのが有利である。
本発明に係るキメラ遺伝子構築物は、それ故に、例えば
アグロバクテリウム・チュメファシエンスのＴｉプラス
ミドまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスのＲｉプラ
スミドにより適当な植物細胞内に形質転換され得る。Ｔ
ｉプラスミドまたはＲｉプラスミドはアグロバクテリウ
ムによる感染を介して植物に導入され、そして適当な様
式で植物ゲノム内に組み込まれる。
ＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドの両方は形質転換
された細胞の産生に必須である２つの領域を有する。そ
れらの領域の１つ、トランスファーＤＮＡ　（Ｔ−ＤＮ
Ａ）領域は植物に導入され、そして腫瘍の誘導を導く。
その他の領域、毒性付与（ｖ　ｉ　ｒ）領域は、腫瘍の
維持のためでな（、腫瘍形成のためにだけ必要である。
トランスファーＤＮＡ領域の大きさは移動性を損傷する
ことな（キメラ遺伝子構築物の組み込みにより大型化さ
れ得る。腫瘍誘導遺伝子を除去し、そして選択性マーカ
ーを組み込むことにより、変形されたＴｉプラスミドま
たはＲｉプラスミドは適当な植物細胞内への本発明に係
る遺伝子構築物の導入のためのベクターとして使用され
る得る。
ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ領域およびｖｉｒ領域が同一
アグロバクテリウム細胞内の同一ベクターに存在するか
、または異なるベクターに存在するかに関係なく植や細
胞のゲノムに、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡの導入
を引き起こす。染色体上のｖｉｒ領域はまた、ベクター
から植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移動を誘導する。
それ故に本発明の範囲内で、植物細胞内にアグロバクテ
リウムのＴ−ＤＮＡ領域を導入するための系が好ましく
使用されるが、該系においてｖｉｒ領域およびＴ−ＤＮ
Ａ領域は異なるベクターに位置している。そのような系
は［二元ベクター系」として知られており、そしてＴ−
ＤＮＡを含むベクターは二元ベクターと呼ばれる。
植物細胞内に形質転換され得、そして形質転換された細
胞の選択を可能にするあらゆるＴ−ＤＮＡ含有ベクター
は本発明の範囲内での使用に適している。
左側境界配列（ＬＢ）と右側境界配列（ＲＢ）との間に
クローン化された本発明に係るキメラ遺伝子横築物を含
み、そして大腸菌およびアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスの両方で安定に複製可能であるシャトルベク
ターが本発明の範囲内で特に好ましい。
新規に開発された形質転換技術を用いて、アグロバクテ
リウムの天然の宿主植物でない植物種を試験管内で形質
転換することが可能となった。例えば、単子葉植物、特
に穀類の種および種々のグラス類はアグロバクテリウム
の天然の宿主ではない。
しかしながら、単子葉類はアグロバクテリウムを用いて
形質転換され得ることが徐々に明らかになってきており
、その結果、現在利用可能である新規実験方式を用いて
、穀類およびグラス類の種もまた形質転換されやすい［
ＧｒｉｍｓｌｅｙＮＨｅｔ　ａＥ（１９８７）］。
アグロバクテリウムを用いるいわゆる葉ディスク形質転
換［Ｈｏｒｓｃｈ　　ｅｔ　ａＬ（１９８５）］が本発
明の範囲内で好ましい。適当な標的植物からの滅菌葉デ
ィスクを本発明に係るキメラ遺伝子横築物の一つを含有
するアグロバクテリウム細胞と培養し、そして次に適当
な栄養培地中または該培地上に移す。それ故に、本発明
の範囲内では、寒天の添加により固化され、そして慣用
の植物生長調節剤、特にα−ナフト酢酸、ビクロラム、
２．４．５−１リクロロフエノキシ酢酸、２゜４−ジク
ロロフェノキシ酢酸、インドール−３−酪酸、インドー
ル−３−乳酸、インドール３−コハク酸、インドール−
３−酢酸およびｐ−クロロフェノキシ酢酸からなるオー
キシンの群、カイネチン、６−ベンジルアデニン、２−
イソペンテニルアデニンおよびゼアチンからなるサイト
カイニンの群から選択されるもの１種またはそれ以上で
富化されたＬＳ培地が特に適当である。オーキシンおよ
びサイトカイニンの好ましい濃度は０．１■／ｌないし
ｌＯ■／！の範囲内である。
２０℃ないし４０℃、好ましくは２３℃ないし３５℃、
特に２５℃の温度および散光下で、数日間、しかし好ま
しくは２ないし３日間の培養後、葉ディスクを苗条誘導
のために適当な培地に移す。本発明の範囲内では、オー
キシンを含有しないが、形質転換体の選択のための選択
物質を含有するＬＳ培地が特に好ましい。培養物は光の
中に保持され、適当な間隔で、しかし好ましくは１週間
の間隔で新鮮培地に移される。
発生する未熟苗条が切り取られ、モして苗条を誘導する
培地中でさらに培養されて根を形成する。本発明の範囲
内では、オーキシンまたはサイトカイニンを含有しない
が、形質転換体の選択のだめの選択物質を含有するＬＳ
培地が特に好ましい。
アグロバクテリウム介在形質転換の他に、本発明の範囲
内では、植物材料内に本発明に係る遺伝子構築物を挿入
するための直接形質転換法を用いることも可能である。
例えば、ベクター内に包含された遺伝物質は、純粋な物
理的方法、例えば細く引き伸ばされたマイクロピペット
を用いるマイクロインジェクションｔＮｅｕｈａｕｓ　
ｅｔ　ａｔ（１９Ｂ？）］または形質転換性ＤＮＡで被
覆されているマイクロプロジェクタイルでの細胞の砲撃
ドＭｉＣｒＯｐｒＯｊｅＣｔｉｌｅＢｏｍｂａｒｄｍｅ
ｎｔ”；Ｗａｎｇ　Ｙ−Ｃｅｔ　ａｔ　（１９８８）］
により、植物細胞内に直接挿入され得る。
植物細胞内への遺伝物質の直接導入のその他の可能な方
法は、原形質膜を変性する操作、例えばポリエチレング
リコール処理、熱シヨツク処理もしくはエレクトロポレ
ーションまたはそれらの組合せ［５ｈｉｌｌｉ１０　ｅ
ｔ　ａＬ　（１９８５）］を用いるプロトプラストの処
理からなる。
エレクトロポレーション技術において、植物プロトプラ
ストはハイブリッド遺伝子構築物を含むプラスミドと共
に高電圧の電気パルスに晒される。これは生体膜の透過
性に可逆的増加をもたらし、そしてプラスミドの挿入を
可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロト
プラストはそれらの細胞壁を新たに作り、分化し、モし
てカルス組織を形成する。形質転換された植物細胞の選
択は上記の表現型マーカーを用いて行われ得る。
植物細胞への遺伝物質の直接導入のその他の方法は、純
粋に化学的な方法に基づき、形質転換が非常に効率良く
そして迅速に行われることを可能にするものであり、Ｎ
ｅｇｒｕｔｉｕ　Ｉ　ｅｔ　ａＬ（１９８７）に記載さ
れている。
共形質転換を用いる直接遺伝子導入（Ｓｃｈｏｃｈｅｒ
ｅｔ　ａＬ　１９８６）は植物材料の形質転換に適当で
ある。
共形質転換は植物ゲノム内への種々のＤＮＡ分子（非選
択性および選択性遺伝子）の同時取り込みおよび組み込
みに基づいており、そしてそれ故に非選択性遺伝子で形
質転換された細胞の検出を可能にする方法である。
例として上に挙げた可能な形質転換法のリストは完全で
あると主張するものでな（、そして本発明の対象をなん
ら制限するものでもない。
それらのゲノム内に組み込まれたハイブリッド遺伝子構
築物を含む細胞クローンは通常の選択、スクリーニング
および検出を用いて選択され、そしてトランスジェニッ
ク植物の再生のために使用される。
全体の植物を形成するために培養液中に保持されたプロ
トプラストの再生は、例えばＰｏｔｒｙｋｕｓＩ　ａｎ
ｄ　５ｈｉｌｌｉ１０　ＲＤ（１９８６）に記載されて
いる。
再生方法は植物の種によって異なる。しかしながら、一
般的に、公知の培養培地の一つにおいてプロトプラスト
が分化しそして細胞壁を形成するように刺激される。特
定の活性剤、例えばオーキシンおよびサイトカイニンと
の処理により根または苗条を形成するように誘導され得
るカルス培養物が最終的に形成される。
そのようにして得られた小植物は土壌に移され、そして
通常の実生と同様にさらに栽培され得る。
効率的な再生は培地、遺伝子型およびこれまでの培養層
に特に依存する。これらの３つの変数が適当に制御され
る場合、再生は完全に再現および反復可能である。
植物ゲノムの組み込み成分として上記のハイブリッド遺
伝子構築物の植物細胞内で発現可能な構造遺伝子を含む
再生されたトランスジェニック植物は、好ましくは滅菌
苗条培養体の形態で、活発に増殖させることができる。
再生されたトランスジェニック植物の植物ゲノム内への
操作上の発現性遺伝子の安定な組み込みは、組み込まれ
た遺伝子の有糸分裂安定性との関係により、モして有糸
分裂の間のメンデル形質としてのふるまいに基づいて、
さらにサザンプロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ＢＭ、
　１９７５）を用いて変更される。
それ故に本発明の広い概念は、上記方法により形質転換
され、そして発現可能な形態で本発明に係る組換えＤＮ
Ａを含むプロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、
種子、胚、花粉、胚珠、接合子および全体の植物、特に
全体の稔性植物からなる群から選択されるトランスジェ
ニック植物材料ならびに該トランスジェニック植物材料
の製造方法を包含する。
本発明に係る組換えＤＮＡ分子の一つを細胞の少なくと
もいくつかに含有する形質転換された植物材料の作出方
法は、 （ａ）　　まず最初に適当な供給源から過剰発現に関す
るＤＮＡ配列を単離するか、または該配列を公知方法を
用いて合成し、 ら）前記ＤＮＡ配列を発現性ＤＮＡ配列の５＋末端内に
操作可能な様式で挿入し、 （Ｃ）　　生成した構築物を植物発現ベクターにおいて
植物内で活性な発現シグナルの制御下にクロニングし、 （ｄ）　　前記発現ベクターを植物材料に公知方法によ
り形質転換し、そしてそれをその中で発現させる、 ことから実質的になる。
それ故に、本発明の広い概念は、本発明の上記の方法を
用いて形質転換されたトランスジェニック植物、特別に
はトランスジェニック活性植物、および新規でそして望
ましい特性または親植物の形質転換から生じる特性を依
然として有する無性および／または有性の後代をも包含
する。
「トランスジェニック植物の無性および／または有性の
後代」という本発明の範囲内で定義されたような表現は
それ故に、公知方法、例えば細胞融合または突然変異選
択により得られ、そして形質転換された出発植物体の特
徴的な特性を依然有するあらゆる突然変異体および変種
を含み、そして形質転換された植物材料を用いて得られ
る全てのハイブリッド形成体および融合産生物をも包含
する。
野生型と比較して高められたタンパク質含量を示すトラ
ンスジェニック植物、特に活性トランスジェニック植物
、形質転換された細胞および／または組織、さらにはそ
れらの有性および無性の後代が本発明の範囲内で好まし
い。
本発明に係る調節ＤＮＡ配列がキチナーゼおよび／また
はグルカナーゼをコードする構造遺伝子および植物細胞
内で活性なその他の発現シグナルに操作可能に連結され
て、そのため結合された構造遺伝子の非常に高められた
発現レベルの結果として、植物におけるキチナーゼおよ
び／またはグルカナーゼ含量が野生型と比較して著しく
高められているキメラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ
分子で形質転換されたトランスジェニック植物、特に活
性トランスジェニック植物が本発明の範囲内で好ましい
。
乾燥重量（ＦＷ）４００μｇ／ｇないし１２００μｇ／
ｇのキチナーゼ含量を有するトランスジェニック植物、
特に活性トランスジェニック植物が特に好ましい。乾燥
重量（ＦＷ）２０μｇ／ｇないし１３０μｇ／ｇのグル
カナーゼ含量を有するトランスジェニック植物、特に活
性トランスジェニック植物もまた特に好ましい。
本発明はまたトランスジェニック植物の増殖材料に関す
る。
本発明の範囲内で、トランスジェニック植物の増殖材料
とは、生体内または試験管内で有性的にまたは無性的に
増殖され得るあらゆる植物材料であると理解されるべき
である。本発明の範囲内で特に好ましいとみなされるべ
きである植物増殖材料は、特にプロトプラスト、細胞、
カルス、組織、器官、種子、胚、花粉、胚珠および接合
子、ならびにトランスジェニック植物から得ることがで
きるあらゆるその他の増殖材料である。
本発明はまた植物の部分、例えば本発明の方法を用いて
予め形質転換され、それ故に少なくとも一部はトランス
ジェニック細胞からなるトランスジェニック植物または
それらの後代から生じる花、茎、果実、葉および根にも
関する。
本発明の方法は、全ての植物、特に被子植物西門および
裸子植物西門の体系的な群に属するものの形質転換に適
当である。
裸子植物西門の中では球果植物綱の植物が特に興味深い
。
被子植物西門の中では落葉樹および潅木に加えて、ナス
科、ジュウジバナ科、キク科、ユリ科、ブドウ科、アカ
ザ科、マツカゼソウ科、アリアセアエ科、ヒガンバナ科
、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、アナナス科、
アカネ科、ツバキ科、バショウ科、アオイ科またはホモ
ノ科、およびマメ目、および特にパビリオナセアエ科の
植物が特に興味深い。ナス科、ジュウジバナ科およびホ
モノ科の代表種が好ましい。
本発明の範囲内の標的作物は、例えばフラガリア（Ｆｒ
ａｇａｒｉａ）、ロータス（Ｌｏｔｕｓ）　、メディケ
−ゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、オノブリイキス（Ｏｎｏｂ
ｒｙｃｈｉｓ）、トリホリウム（ＴｒｉｆｏＬｉｕｍ）
、トリゴネラ（ＴｒｉｇｏｎｅｌＬａ）、ビグナ（Ｖｉ
ｇｎａ）　、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）、リナム（Ｌｉ
ｎｕａ）　、ゼラニウム（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、マニホ
ット（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ドーカス（Ｄａｕｃｕｓ）、
アラビトブシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）　、ブラッ
シカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ラファヌス（Ｒａｐｈａｎ
ｕｓ　）、シナビス（Ｓｉｎａｐｉｓ）、アトロバ（Ａ
ｔｒｏｐａ）、カブシカム（（：ａｐｓｉｃｕｍ）、ダ
チュラ（Ｄａｔｕｒａ）、ハイオシアムス（Ｈｙｏｓｃ
ｙａａｕｓ）、リコペルシコン（Ｌ”）ＣＯｐｅｒＳｉ
ＣＯｎ）、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ソラヌ
ム（Ｓｏｔａｎｕｍ）　、ペチュニア（Ｐｅｎｔｕｎｉ
ａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）　、マジョラ
ナ（Ｍａｊｏｒａｎａ）、シコリウム（Ｃｉｃｈｏｒｉ
ｕｍ）　、へりアンラス（ＨｅＬｉａｎｔｈｕｓ）、ラ
クチュカ（Ｌａｃｔｕｃａ）　、ブロムス（Ｂｒｏｍｕ
ｓ）、ゴツシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｒａ）　、アス
パラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）　、アンチリヌム（Ａ
ｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）　、ヘメロカリス（Ｈｅａｅｒ
ｏｃａＬＬｉｓ）、ネメシア（Ｎｅｍｅｓｌａ）　、ベ
ラゴニウム（Ｐｅｌａｇｏｎｉｕｍ）、バニカム（Ｐａ
ｎｉｃｕｔｔｒ）　、ペンニセタム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔ
ｕｍ）、ラヌンクルス（ＲａｎｕｎｃｕＬｕｓ）、セネ
シオ（Ｓｅｎｅｔ１０）　、サルビグロツシス（Ｓａｌ
ｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）、ククミス（Ｃｕｃｕｒｎｔｓ）
　、ブロワリナ（ＢｒｏｗａＬｌｉａ）　、グリシン（
Ｇｔｙｃｉｎｅ）　、ロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）、ゼア
（Ｚｅａ）　、）リチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ツル
ガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、イボモニア（Ｉｐｏａｏｅａ
）　、パッジフローラ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）、シク
ラメン（ＣｙｃＬａｍｅｎ）、マルス（ＭａＬｕｓ）、
プルナス（Ｐｒｕｎｕｓ）、ローザ（Ｒｏｓａ）、ルブ
ス（Ｒａｂｕｓ）、ボブラス（ＰｏｐｕＬｕｓ）　、サ
ンタラム（Ｓａｎｉａｌｕｒｎ）、アリウム（ＡＬＬｉ
ｕｍ）、リリウム（Ｌｉｌｉｕｍ）、ナルシサス（Ｎａ
ｒｃｉｓｓｕｓ）、アナナス（Ａｎａｎａｓ）、アラキ
ス（Ａｒａｃｈｉｓ）　、ファセオルス（Ｐｈａｓｅｏ
ｌｕｓ）およびピサム（Ｐｉｓｕｍ）からなる群から選
択されるものを含む。
植物の試験管内培養の分野、特に植物再生の分野におけ
る新しい発展によって、ホモノ科の代表種でさえも、植
物プロトプラストから出発して全体の植物を再生するこ
とが今可能となった。ホモノ科での再生実験の成功の例
は、イネのプロトプラストに対してＹａｍａｄａ　Ｙ　
ｅｔ　ａＬ（１９８６）に、トウモロコシのプロトプラ
ストに対してＲｈｏｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ（１９８６）お
よび５ｈｉｌｌｉ１０　ＲＤ　ｅｔａＬ　（１９８９）
に、ダクチリス・グロメラタ（ＤａｃｔｙＬｉｓ　ｇＬ
ｏｍｅｒａｔａ）のプロトプラストに対してＨｏｒｎ　
ｅｔ　ａＬ（１９８Ｂ＞に特に記載されている。
それ故に本発明の範囲内で、以下の植物：ロリウム、ゼ
ア、トリチカム、ツルガム、サッカラム（Ｓａｃｃｈａ
ｒｕす、ブロムス、オリザエ（Ｏｒｙｚａｅ）、アベナ
（Ａｖｅｎａ）　、ホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）　、
セカーレ（ＳｅｃａＬｅ）およびセタリア（Ｓｅｔａｒ
ｉａ）を使用することも可能である。
形質転換された植物細胞から得られた成熟植物はそれ自
体交雑され種子を生じる。種子のい（つかは遺伝学の確
立された法則に正確に従う比率でもって有用で望ましい
特性をコードする遺伝子を含有する。これらの種子はト
ランスジェニック植物の作出のために使用され得る。
ホモ接合系は繰り返し自家受粉により、および通交系の
作出により得ることができる。これらの通交系は順に雑
種の発生のために使用され得る。この操作において、上
記外来遺伝子を含む通交系は繁殖のためにもう一つの通
交系と交雑される。
〔実施例・発明の効果〕
本発明に関する一般的な説明をした後に、本発明のより
よい理解のために次に実施例を記載するが、これは説明
のためだけのものであり、特記しない限り本発明を制限
するものではない。
一般的な組換えＤＮＡ技術 本発明において用いられる組換えＤＮＡ技術の多くは当
業者にとって一般的なものであるので、それらが出現す
る度に記載するよりもむしろ通常用いられる技術に関し
てここで簡潔に記載してお（方がよい。別に特記したこ
とを除いて、これらの全ての操作はＭａｎｉａｔｆｓ　
ｅｔ　ａｔ（１９８２）の参考文献に記載されている。
Ａ、制限エンドヌクレアーゼでの切断 反応バッチは典型的には、マサチューセッツ州ビバリー
のニュー・イングランド・パイオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）により推奨される緩衝溶
液中に約５０ないし５００μｇ／−のＤＮＡを含む。制
限エンドヌクレアーゼ２ないし５単位をＤＮＡ１μｇに
つき添加し、そして反応バッチを上記の会社により推奨
される温度で１ないし８時間保温する。６５℃で１０分
間加熱するか、またはフェノールでの抽出により反応を
終結させ、エタノールでＤＮＡを沈澱させる。この方法
はＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａＬｃ１’ａ８２’）の文
献の第１０４ないし１０６頁にも記載されている。
Ｂ、プラント末端を製造するためのＤＮＡのポリメラー
ゼでの処理 ＤＮＡ断片５０ないし５００μｇ／−を、製造会社ニュ
ー・イングランド・バイオラプスにより推奨される緩衝
液中の反応バッチに添加する。反応バッチは全４種のデ
オキシヌクレオチド三リン酸を０．２　ｍＭの濃度で含
有する。反応は１５℃で３０分間の期間に起こり、次い
で６５℃で１０分間加熱することにより終結される。
５′突出末端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例えば
ＢｃｏＲＩおよびＢａｍＨ［で切断することにより得ら
れる断片のためには、ＤＮＡポリメラーゼの大断片また
はフレノウ断片が使用される。
３１突出末端を製造するエンドヌクレアーゼ例えばＰｓ
ｔｌＩおよび５ａｃｌにより製造される断片のためには
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが使用される。これらの２つ
の酵素の使用はＭａｎｔａｔｔｓｅｔ　ａｌ（１９８２
）の文献の第１１３ないし１２１頁に記載されている。
Ｃ，アガロースゲル電気泳動およびゲルからのＤＮＡ断
片の精製 アガロースゲル電気泳動をＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
Ｌ（１９８２）の文献の第１５０ないし１６３頁に記載
のように水平型装置で行う。使用される緩衝液はその中
に記載されているトリス−ホウ酸塩緩衝液である。ＤＮ
Ａ断片は、電気泳動の間にゲルまたはタンク緩衝液に存
在するか、または電気泳動の後に添加されるいずれかの
０．５■／−臭化エチジウムを用いて染色される。ＤＮ
Ａを曇波長の紫外線の照射により視覚化する。断片をゲ
ルから分離する場合には、使用されるアガロースは低い
ゲル化温度のものであり、これはミズーリ州セントルイ
スのシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
）から入手できる。電気泳動後、望ましい断片を削り取
り、プラスチック管内に入れ、６５℃で約１５分間加熱
し、次いでフェノールで３回抽出し、そしてエタノール
で２回沈澱させる。この操作はＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ
　ａＬｃ１９８２）の文献の第１７０頁の記載とはわず
かに異なっている。
変法として、ＤＮＡはジェネクリーンパキッ）　（Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ　ｋｉｔ）［米国カリフォルニア州う・
ジョラのバイ第１０１社（Ｂｉｏ　１０１１ｎｃ、）］
を用いてアガロースから単離され得る。
Ｄ、ＤＮＡ末端への合成リンカ−断片の付加ＤＮＡ分子
末端へ新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を添加するこ
とが望ましい場合、上の項に記載されているように、プ
ラント末端を製造するために、場合によってはこの分子
をまずＤＮＡポリメラーゼで処理する。この断片的０．
１ないし１．０μｇを、二ニー・イングランド・バイオ
ラプスから得られるホスホリル化リンカ−ＤＮＡ約１０
ｎＨに、同社のＴ４ＤＮＡリガーゼ２μ！および同社に
より推奨される緩衝液中の１ｍＭＡＴＰを含有する２０
ないし３０μ！容量中で添加する。１５℃で一晩保温後
、６５℃で１０分間加熱することにより反応を終結させ
る。反応バッチを次に、合成リンカ−配列で切断する制
限エンドヌクレアーゼに適当な緩衝液中に約１００μｌ
に希釈し、そしてこのエンドヌクレアーゼ約５０ないし
２００単位を添加する。混合物を適温で２ないし６時間
保温し、次に断片をアガロースゲル電気泳動に供し、そ
して上記Ｃのように断片を精製する。精製した断片は今
では制限エンドヌクレアーゼでの切断により製造された
終端を有するであろう。これらの終端は通常粘着性であ
り、その結果、精製断片は同じような粘着端を有するそ
の他の断片に容易に連結され得る。
Ｅ、ＤＮＡ断片からの５′末端ホスフエートの除去 プラスミドクローニング工程の間に、ベクタープラスミ
ドのホスファターゼでの処理はベクターの再環状化を減
少させる（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ（１９Ｂ２）
の文献の第１３頁に記載されている）。
正しい制限エンドヌクレアーゼでのＤＮＡの切断の後、
ベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｆｎｇｅｒ−Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）から得られる子ウシ消化管のアルカリ
ホスファターゼ１単位を添加する。ＤＮＡを３７℃で１
時間保温し、次にフェノールで２回抽出し、そしてエタ
ノールで沈澱させる。
Ｆ、ＤＮＡ断片の連結 相補的な粘着端を有する断片を互いに結合させる場合、
各々の断片的１１００ｎは、ニュー・イングランド・バ
イオラプスからのＴ４ＤＮＡリガーゼ約０．２単位をこ
の会社により推奨される緩衝液中に含有する２０ないし
４０μｌの反応混合物中で保温される。保温は１５℃で
１ないし２０時間行われる。プラント末端を有するＤＮ
Ａ断片が結合される場合、それらはＴ４ＤＮＡリガーゼ
の量を２ないし４単位に増加させる以外は上記と同様に
保温される。
Ｇ、ＤＮＡの大腸菌内への形質転換 大腸菌ＨＢＩＯＩ株がほとんどの実験において使用され
るｏ　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ（１９８２）の文
献の第２５０および２５１頁に記載されているように、
塩化カルシウム法を用いてＤＮＡが大腸菌内に導入され
る。
Ｈ，プラスミドのための大腸菌のスクリーニング 形質転換の後に、大腸菌の生成したコロニは迅速プラス
ミド単離法により所望のプラスミドの存在が試験される
。２種の慣用の方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａＬ
＜１’Ｊ８２”）の文献の第３６６ないし３６９頁に記
載されている。
■、プラスミドＤＮＡの大規模な分離 大腸菌からプラスミドを大規模に分離する方法はＭａｎ
ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ（１９Ｂ２’）の文献の第８８
ないし９４頁に記載されている。
Ｊ、Ｍ１３ファージベクターにおけるクローニング 以下の記載においてファージＭ１３誘導体の二重鎖複製
体は決まりきった操作、例えば制限エンドヌクレアーゼ
での切断、連結その他のために用いられることが理解さ
れるべきである。
特記しない限り、酵素はベーリンガー・バイオラプス［
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｂｉｏｌａｂｓ（ＢＲＬ）］
から入手できる。それらはことわらない限り製造会社の
指示に従って使用される。
Ｋ、サザンプロット分析 抽出したＤＮＡを最初に制限酵素で処理し、次いで０．
８％ないし１％のアガロースゲル中で電気泳動し、ニト
ロセルロース膜に移し［５ｏｕｔｈｅｒｎ　ＢＭ（１９
７５）］　、そして予めニック−トランスレーションに
供された検出されるべきＤＮＡ　ＣＤＮＡ比活性５　Ｘ
　ｌ　Ｏ”　ナイシｌ　Ｏｘｌ　０Ａｃ、ｐ、ｍ、／μ
ｇ）とハイブリッド形成させる。
この場合には、「ランダムブライマー」標識用キット〔
ベーリンガー・マンハイム〕を用いて１！Ｐ標識され得
るタバコキチナーゼｃ　ＤＮＡクローンｐ　ＣＨＮ　５
０　［５ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　ａＥ（１９８７）］の３
　’　Ａｌｕｌ−Ｐｓｔｌ　ｔ！ｊｒ片をハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いる。フィルターを各回１
時間３回６５℃で０．０３　Ｍクエン酸ナトリウムと０
，３Ｍ塩化ナトリウムの水溶液を用いて洗浄する。ハイ
ブリッド形成したＤＮＡはＸ線フィルムを２４ないし４
８時間黒化することにより可視化される。
Ｌ、ウェスタンプロット分析 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、タンパク
質をニトロセルロースまたはナイロンフィルターに電気
泳動で移す。このフィルターを次にブロック剤（例えば
ＰＢＳ中の５％スキムミルク粉末；以下ミルク／ＰＢＳ
と記載する）で前処理する。フィルターを次に検出され
るべき化合物と反応する抗血清（今回の場合、ウサギ抗
タバコキチナーゼＩｇＧ）と数時間保温する。このよう
にして前処理したフィルターをミルク／ＰＢＳで数回洗
浄し、次いで酵素と結合している市販の第２の抗体〔例
えばパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体〔バイオラ
ッド（ＢｒＯＲＡＤ））　、ミルク／ＰＢＳ中に希釈１
：２０００）と保温する。フィルターを再０ＰＢＳ中で
洗浄し、次に製造会社（バイオラッド）の指示に従って
クロロナフトールおよび過酸化水素で染色する。さらに
詳しい記載はＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ　ａｌｃ１９８９＞
にされている。
Ｍ、ノーザンプロット分析 全体のＲＮＡはＬｏｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａＬ　（１９
８７）　ニ記載された方法に従って調製され得るが、し
かし混入ＤＮＡのあらゆる残渣を解消するために２Ｍの
ＬｉＣ１での付加的な沈澱段階を導入することが有利で
ある。ＲＮＡ（０，４■または４■）を次に６．７％ホ
ルムアルデヒド含有の１％アガロースゲル中での電気泳
動により分画する［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ　（
１９８２）］　ｏ個々の画分を「ゼータ−プローブＪＩ
！（バイオラッド）に移し、モしてタバコキチナーゼｃ
ＤＮＡクローンｐＣＨＮ４７からのｓｔｐ標識されたｐ
ｓｔ　Ｉ挿入物とハイプツト形成させる。ハイプツト形
成するＤＮＡの大きさは同時に標準の移動距離を参照し
て概算され得る。
Ｎ、酵素活性の測定 酵素活性は基質として”Ｈ標識キチン〔比活性４．９３
　Ｘ　１０　ｙｄｐｍ／ｍｏｌＮ−アセチルグルコサミ
ン〕を用いて放射線測定により決定される［Ｂｏｌｌｅ
ｒ　ｅｔ　ａｔ　（１９８３）］　ｏ　（Ｘ−マンノシ
ダーゼ活性は基質としてｐ−ニトロフェノールを用いる
マイクロタイタープレート中で決定される［Ｂｏｌｌｅ
ｒ　ａｎｄ　Ｋｅｎｄｅ（１９７９）］。
パーオキシダーゼ活性は基質としてグアイアコールを用
いて決定される［Ｓｉｅｇｅ　ａｎｄ　Ｇａ１ｓ１０ｎ
（１９６７）］。
かなり一般的な記載を説明するために、そして本発明の
よりよい理解のために、特定の実施例を記載するが、特
記しない限り本発明はこれらに限定されない。同様のこ
とが上記の例示にも当てはまる。
１、ｃＤＮ人およびゲノム遺伝子ライブラリィの作成 実施例１：植物材料 ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハバナ４２５植物を温
室中で、または表面滅菌種子から出発して生長させる。
種子の表面滅菌は以下のように行われる：種子２０ない
し３０個を約２００μｍの孔径を有するふるいに通し、
そして市販の１０％漂白液（ＮａＯＣｌ）１０−中で保
温する。次いで種子を滅菌蒸留水で繰り返しすすぐ。
以下の実施例において、Ｂｉｃｈｈｏｌｚ　ｅｔ　ａｌ
（１９８３）に従ってニコチアナ・ツバカムの園芸品種
ハバナ４２５植物から分離され得る柔細胞髄組ａ　（Ｎ
）のクローン化系列を用いることが好ましい。
実施例２：組織培養 Ｌｉｎｓｍｅｉｅｒ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ（１９６５）
による塩およびチアミン−ＭＣＩ濃度を含有し、１０．
ｇ／ｌの寒天の添加により固化された基本培地（ＬＳ）
上でタバコ組織を培養する。その他の添加剤としてこの
基本培地はｐＨ指示剤例えばクロロフェノールレッド５
■／ｌを含有する。このＬＳ基本培地を基にし、そして
引き続く実施例において使用されるその他の培地はその
他の添加剤として、例えばカイネチン（１，４μＭ）（
サイトカイニン培地）またはα−ナフチル酢酸（ｌＯ０
７μＭ）（オーキシン培地〕またはカイネチンおよびα
−ナフチル酢酸の混合物〔オーキシン／サイトカイニン
培地（培地Ａ））を含有する。
選択培地ＢおよびＣはα−ナフチル酢酸を含有しないが
、その代わりにその物質により形質転換体が大量の非形
質転換細胞および組織から選択され得るような選択物質
を含有する。これらの選択培地の正確な組成は１項（培
地）に示しである。
ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハバナ４２５植物から
分離された貯蔵系列（２７５Ｎ）はオーキシン／サイト
カイニン培地（１０ｄ）上で２１日間隔で継代培養され
る。すなわち、それらは各同断しい培地（１０ｍｊ）上
に接種され、そして明所２５℃で培養される。
培養組織中に高レベルのキチナーゼの誘導のために、組
織はオーキシン／サイトカイニン培地から無ホルモン基
本培地上に接種される。植物組織の培養およびキチナー
ゼ誘導に関するその他の詳細はＦｅ１ｉｘ　ａｎｄ　Ｍ
ｅｉｎｓ（１９８５）に記載されている。
実施例３：タバコプロトプラストの作成実施例１による
２日令のタバコ細胞懸濁液１００−を等量の２倍濃厚酵
素溶液と混合する。
該酵素溶液は以下の成分： Ｃａ　ＮＯｓ　　・　４　Ｈ！　　Ｏ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・　７Ｈ１Ｏ ＮＨ，Ｈ，ＰＯ。
Ｎ０ｓ １．４５ｇ／ｆ Ｏ，５ｇ／Ｉ！ ０．２８ｇ／７ １．２　　　ｇ／ｆ を含有する。
上記酵素溶液を遠心分離し、そして０．２μｍフィルタ
ーを通して滅菌する。タバコ懸濁培養液と酵素溶液から
なるバッチをロータリーシェーカー上（４０ｒｐｍ）室
温で５時間注意深くかきまぜる。特定の時間間隔で、試
料をこのバッチから採取し、そして顕微鏡で分析する。
細胞の約８０％が球形のプロトプラストに変化するまで
酵素消化を続ける。次に保温容器をシェーカーから取り
出す。細胞／プロトプラスト懸濁液を静置し、そして細
胞およびプロトプラストを含まない培地の上半分をピペ
ットで吸い上げて除き、それを廃棄する。残部を５〇−
遠心管に移し、臨床用遠心分離機（ＨＮ−３ｎ型、１Ｅ
Ｃ）内５００　ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
プロトプラスト含有ペレットはすすぎ溶液Ｉ（■項参照
）中に再懸濁され、そして次に１１００Ｏｒｐで１０分
間再び遠心分離する。
プロトプラストを含有するバンドは遠心管の上端部に位
置する。プロトプラスト画分を集め、次にすすぎ溶液Ｉ
で再びすすぐ。プロトプラストを遠心管に戻し、そして
次の使用のために必要となるまで水中に保存する。
実施例４　：　ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリィの横築ｃＤ
ＮＡ遺伝子ライブラリィは、ニコチアナ・ツバカムの園
芸品種ハバナ４２５植物の柔細胞様組織のクローン化系
列（実施例１参照）から得ることができるポリ（Ａ）＋
ＲＮＡから出発して作成される。タバコ組織は、無ホル
モンＬＳ基本培地上で組織を培養することにより実施例
２に記載したように高レベルのキチナーゼを産生ずるよ
うに最初に刺激される。
４．１．全ＲＮＡの単離 全ＲＮＡの調製はＬａｇｒｉｍｉｎｉ　ＬＭ　ｇｔ　ａ
ｌ（１９８７）に記載された方法に実質的に従って行わ
れる。
液体窒素で急速冷凍されたタバコ組織を乳鉢中で最初に
粗く粉末化し、次に適当なホモジナイザー緩衝液中に入
れる（組織１ｇあたり緩衝液ｚ５−）。該緩衝液は（１
）７．５６　ＭグアニジンＨＣＩ、０．７３Ｍメルカプ
トエタノール、１８、９　ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５，
０、（２）４％（Ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１ＭトリスＨＣ
ｌｐＨ７，８（１容量）＋８０％（ｖ　／　ｖ　）フェ
ノール、０、１％（ｗ　／　ｖ　）ヒドロキシキノリン
、０．１ＭトリスＨｅ１ｐＨ７，８（１容量）または（
３）Ｌａｇｒｉｍｉｎｉ　ＬＭ　ｅｔ　ａＬ（１９８１
”）に準拠したもノノイずれかである。等量のフェノー
ルを添加した後、バッチを例えばポリトロンホモジナイ
ゼーションでホモジナイズする。半容量のクロロホルム
を次に添加し、そしてエマルジョンを約１５分間注意深
（混合する。次に遠心分離（１０４００ｇで１０分間）
により様々な相に分け、水相を廃棄する。この時点で所
望するならば、さらに抽出段階を加えることも可能であ
るが、これは例えば付加的なフェノール／クロロホルム
抽出またはフェノール：クロロホルム：イソアミルアル
コール（２５：　２４　：　１）の混合物での抽出２回
の形態で行われる。
抽出の次は沈澱工程が行われる。これは０．３Ｍ酢酸ナ
トリウムおよびエタノール２．５容量部の添加により行
われる。沈澱物を遠心分離（１０４００ｇで１５分間）
により集め、そして滅菌水２ｍＮ’中に再懸濁させる。
塩化リチウムを最終濃度３Ｍに添加した後、全体のバッ
チを４℃で一晩保温する。沈澱を次に遠心分離により再
び集め、そして形成されたペレットを水冷エタノールで
洗浄する。ペレットを次に乾燥させ、そして滅菌水５０
０μ！中に再懸濁させる。
この沈澱物中の全ＲＮＡの濃度は分光分析により決定さ
れる。
上記方法の変法として、全ＲＮＡはカルス組織から単離
され得る。この場合もまた、上記の工程段階が使用され
るが、使用される出発材料は立方体（約８１１Ｉ＋）に
切断されたカルス組織であり、これはホモジナイゼーシ
ョン段階の前にまず液体窒素での急速冷凍を行い、次に
予め冷却された乳鉢中で微粉末に粉砕される。
４．２．ポリアデニル化ＲＮＡの単離 ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはそれ自体公知の方法（Ｍｏｈｎｅ
ｎ（１９７９）参照）に従って、オリゴ−ｄ（Ｔ）セル
ロースクロマトグラフィー〔米国マサチューセッツ州レ
キシントンのコラボラティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂ
ｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ））により単離され
る。
オリゴ−ｄ　（Ｔ）セルロースを最初に２．０ＭのＮａ
Ｃｌ２０容量中で１５分間洗浄し、次に滅菌水中に懸濁
し、モしてカラム（直径１．５　ａｍ　。
長さ２０Ｃ１１＋）中に充填する。カラムを次に緩衝液
（４４０ｍＭＮａＣ１，０，９ｍＭＥＤＴＡ、　９ｍＭ
トリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５、またハ０．５Ｍ（７）Ｎ
ａＣ１，１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５）で、溶
出液のｐＨが７．０ないし７．６になるまで洗浄する。
４．０−の容量中のＲＮＡ含量が０．６■ないし６．０
■のＲＮＡ溶液を、最終濃度ＥＤＴＡが１　ｍＭ、そし
てピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）
が１０ｍＭ１ｐＨ７，５に調整する。ＲＮＡを７０”Ｃ
で５分間加熱することにより変性させ、そして氷上で冷
却する。
全体の緋液を次に４ＭのＮ　ａ　Ｃ１０，１容量部で０
、３６　ＭのＮａＣ１の値に調整する。ＲＮＡ溶液をカ
ラムに入れ、そして非ポリアデニル化ＲＮＡ（ポリ（Ａ
）＋ＲＮＡ）を上記緩衝液で溶出させる。溶出液の吸光
度は分光光度計（日立１００−４０型）およびそれに連
結されたＷ＋Ｗレコーダー〔スイス国バーゼルのサイエ
ンティフィック・インストルメンツ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））により決定される。吸
光度が基底状態に達したらすぐに、カラムに結合されて
いるポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ）
リス−ＨＣ１ｐＨ７，５で溶出させる。溶出液を０．５
ｍＭＥＤＴＡおよび０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐ　Ｈ５，
０の溶液中に導入し、そしてエタノールｚ５容量部の添
加により沈澱させる。次に８３０００Ｘｇ（３０ないし
４５分）の遠心分離によりＲＮＡを集め、窒素下で乾燥
させ、そして１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ）リス−Ｈｅｌ
ｐＨ７，５または水中に再懸濁させる。
４、３．　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの構築および選択５
−２５％（ｗ／ｖ）ショ糖グラジェント（１ｍＭＥＤＴ
Ａ　；　１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５）上での
調製超遠心分離（５７０００ｇで１７時間）によりポリ
（Ａ）＋ＲＮＡを個々の両分に分離する。キチナーゼに
対する情報を含有する画分は抗キチナーゼ抗体による試
験管内での翻訳の後に同定され得る。これらの両分を次
に一緒にし、そしてさらに仕上げのために使用する。
抗キチナーゼ抗体作成の操作は当業者には公知であり、
そして例えば５ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　ａＬ　（１９８５
）およびＭｏｈｎｅｎ（１９８５）に記載された方法に
従って実施され得る。その方法において、完全フロイン
トのアジュバント中の精製キチナーゼ調製物を含む実質
的なエマルジョンは３力月令のメスウサギにュージーラ
ンド白色ウサギ）に注射される。さらに１週間後および
２週間後そしてその後１カ月間隔で注射を行う。血液は
各注射の７ないし１０日後に採取され、血清試料を一２
０℃で保存する。免疫グロブリンＧはプロティンＡ−セ
ファロースＣＩ　　４７カラム〔）アルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）　）上のアフィニティクロマトグラフィ
ーにより精製され、次いで凍結乾燥され、そして−２０
℃で保存される。
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡマトリックスから出発する二重鎖Ｄ
ＮＡの合成、ｐＢＲ３２２内での該二重鎖ＤＮＡのクロ
ーニング、分別コロニーハイブリダイゼーションおよび
プラスミドの分離は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａＬ　
（１９８２）の指示および記載に実質的に従って行われ
る。
二重鎖ＤＮＡ約０．８μｇの合成のために、予め単離さ
れ、そしてキチナーゼｍＲＮＡで富化されたポリ（Ａ）
＋ＲＮＡ３μｇを逆転写酵素（フロリダ州すンペテルス
ブルクのライフ・サイエンセズ（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎ
ｃｅｓ）　）およびＤＮＡポリメラーゼＩ（マサチュー
セッツ州ビバリーの二ニー・イングランド・バイオラプ
ス）と保温する。生成するｃＤＮＡをホモポリマーｄＣ
−ｄＧテーリングによりｐＢＲ８２２のＰｓｔｌ切断部
位内にスプライシングさせる。該テーリングはｃＤＮＡ
とベクターＤＮＡに相補的な粘着端を付与することを可
能にし、そしてＭａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａＬ　（１９８
２）［２１７−２１９頁］に記載されている。
オリゴ−ｄＣ末端を有するＰｓｔｌ直線化ベクターｐＢ
Ｒ３２２は市販されている。
生成する組換えプラスミドは次にコンピテント大腸菌Ｄ
ＨＩ細胞の形質転換のために使用される。プラスミド内
でのクローニングはＭａｎｉａｔｉＳｅｔ　ａＬ　（１
９８２）の２４２−２４６頁および３９１頁に記載され
ている。
寒天プレート上の細菌コロニーの形態にあるこのように
して構築されたｃＤＮＡライブラリィはまず最初に放射
活性標識ｃＤＮＡを用いる分別コロニーハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングされる。
分別コロニーハイブリダイゼーションにおいて、細菌コ
ロニーの複製は寒天プレート上にフィルターを置き、次
にそれらを再び注意深（取り除−（ことにより、ニトロ
セルロースフィルターで行われる。最初の寒天プレート
は陽性コロニーの後の同定のために保存される。細菌コ
ロニーを付着しているフィルターを次に栄養培地上に置
き、そしてコロニーが約２ｍｇ＋の大きさに成長するま
で放置する。フィルターを次に、細菌細胞の溶解および
フィルター上の細菌ＤＮＡの変性および固定を導く水酸
化ナトリウム溶液で処理する。ｐＨを中和した後、フィ
ルターを繰り返し洗浄し、乾燥し、そして最後に真空中
８０℃の温度で［黒化Ｊし、その結果ＤＮＡをフィルタ
ーに共有結合させる。
フィルターを放射標識（非クローン化）ｃＤＮＡプロー
ブと順番に２回ハイプツト形成させる。これらのｃＤＮ
Ａプローブは、キチナーゼを産生ずるように予め誘導さ
れた（ホルモンを添加しない基本培地で７日間の保温）
タバコ組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡおよび非誘導化タ
バコ組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ　（オーキシン／サ
イトカイニン上で７日間の保温）である。
非誘導化組織からの対照ＤＮＡと反応するよりも、誘導
化組織からのｃＤＮＡとより強く反応する有望ｃＤＮＡ
クローンはＭｏｈｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ（１９８５）およ
びＭｏｈｎｅｎ（１９８５）に記載された方法に従う「
ハイブリッド選択」翻訳法を用いるその他の分析に供さ
れる。プラスミドＤＮＡを０．２Ｍないし０．３ＭのＮ
ａＯＨ，３ＭのＮａＣ１中で１分間煮沸することにより
変性させ、そして氷上で冷却させる。ハイブリダイゼー
ション反応はフィルターあたり２００μｇないし２５０
μｇの全ＲＮＡを用いて、スクエアＢＡ／８５ニトロセ
ルロースフィルター〔西ドイツ国ダッセルのシュライヒ
ャー・ラント・シューエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ｕ
ｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ））上で行われる。フィルター上
でハイプツト形成されたＲＮＡを溶出させ、エタノール
で沈澱させ、そして水１０μ！中に溶解させ、試験管内
翻訳（市販の小麦麦芽抽出物を用いる）により分析され
る。放射標識された生成物は所望のタンパク質に対する
抗体と沈澱し、モしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析される。
４、４．　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡクローンｐＣＨＮ４８ｃＤＮ
Ａ遺伝子ライブラリィはコロニーまたはプラークハイブ
リダイゼーションを用いてＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
ｔ　（１９８２）に従ってスクリーニングされる。ＤＮ
Ａプローブとして、成熟タンパク質をコードする全体の
ＤＮＡ配列を含むが完全なＮ末端シグナルペプチド配列
を欠いている５ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　ａＬ　（１９８７
）に記載されたｃＤＮＡクローンｐｃＨＮ５０が用いら
れている。このようにして異なる長さを有する種々のク
ローンが得られる。これらのクローンの最長のものが選
択され、そしてヌクレオチド配列分析に供される。ｐＣ
ＨＮ４８と記載されるこのクローンは１．１４　ｋｂか
らなり、そしてポリ（Ａ）末端に７個のアデノシン、３
２９個のアミノ酸からなるポリペプチドに相当する単一
の大きな読み枠（読み取り可能枠）長さ９８７ヌクレオ
チド、および５１非翻訳領域からのヌクレオチドを有す
る挿入物を有する。コード領域のＤＮＡ配列から誘導可
能なアミノ酸配列は、タバコからの公知キチナーゼの２
０個の最初のＮ末端アミノ酸に対する配列に一致する。
実施例５ニゲツム遺伝子ライブラリイの構築プロトプラ
ストの溶菌のために、水冷プロトプラスト懸濁液１００
−を氷冷ＴＥＮＰ緩衝液（１項参照）４００−と混合す
る。ＩＥＣ臨床用遠心分離機中２００　Ｏｒｐｍで１０
分間遠心分離することによりこの溶菌物から核を分離す
る。
そのように得られるペレットを水冷ＴＥＮＰ緩衝液緩衝
液５００中ｔ’中濁し、そして上記のように再びペレッ
ト化する。次いでＣｓＣ１グラジェント試験管８本を準
備し、各試験管中のプロトプラスト懸濁液約ＩＺ５−を
含む細胞ペレットを１０倍濃厚ＴＥ緩衝液（１項参照）
２６−に添加する。細胞核を溶菌するために、２０％（
Ｗ／Ｖ）ナトリウムラウリルサルコシン溶液５−および
ＣＣｓＣ１３Ｚ２および臭化エチジウム溶液（Ｅ　ｔ　
Ｂ　ｒ　；　１０ｍｇ／ｉ）　Ｚ　８９ｒＩｄ！をバッ
チに添加する。全体のバッチをゆっ（りかきまぜ、Ｃｓ
Ｃ１を溶解させる。
このようにして得られた溶菌物をポリアロマ−試験管（
ベックマンＶＴｉ５０，３９ｍ１試験管）に移し、そし
て４５０００　ｒｐｍおよび２０℃で１６時間ＶＴｉ５
０ローター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　）中で遠
心分離する。紫外線で蛍光性であるバンドが１６ゲージ
の針を付けた３−のシリンジによりグラジェントから除
去され、そして集められる。さらにＤＮＡの仕上げが上
記のＣｓ　Ｃ１／　Ｂ　ｔ　Ｂ　ｒ平衡遠心分離の反復
により行われる。蛍光性バンドが再び集められ、付着す
るＥｔＢｒが２０ＸＳＳＣ（１項参照）で飽和されたイ
ソプロパツール（等量）を用いる６回の連続抽出段階で
除去される。ＤＮＡがグラジェント溶液から沈澱され、
そして蒸留水２容量、＆ＯＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，
４）０゜１容量およびごタノール２容量を連続的に添加
することにより上記のように精製される。フィラメント
状のＤＮＡをパスツールピペットにより溶液から巻き取
り、７０％エタノールで洗浄し、そしてさらに等量のク
ロロホルムで抽出する。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，
４）０．１容量およびエタノール２．０容量を添加する
ことによりＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡフィラメントを
再び巻き取り、７０％エタノールで洗浄し、そして５分
間風乾する。これを次に全量７１ｎｌのＴＥ緩衝液（１
項参照）中に溶解し、そして次の使用まで４℃で保存す
る。
翫Ｚゲノムλ遺伝子ライブラリィの構築予め単離された
タバコＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａで消化し、ＳＷ４１
０−ター（ベックマン）内２００００　ｒｐｍでの１０
％−４０％ショ糖グラジェントにより２０時間分離する
。グラジェントから得られる画分をゲル電気泳動（ＴＢ
Ｅ緩衝液中０．５％のアガロースゲル）により分析する
。正しい大きさの断片を有する画分を貯める。
３Ｍ酢酸ナトリウム（１）Ｈ４，８）０．１容量および
エタノール２容量を用いてＤＮＡを沈澱させ、そしてＢ
ａｍＨＩ　（カリフォルニア州う・ジヨウのストラタゲ
ン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）　）で消化されたホスファタ
ーゼ処理されたλＥＭＢＬ３ＤＮＡと連結させる。連結
反応は製造会社の指示に従って行われ、λベクターＤＮ
Ａ１　ｕｇおよび組み入れられるべきタバコＤＮＡ０．
１μｇを含有する５μ！の反応バッチが使用される。こ
の連結反応から生じるＤＮＡのλファージの頭部への組
入れはストラタゲンによるギガパック・プラス・キット
を用い、製造会社の指示に従って行われる。大腸菌ＣＥ
　３２０１　（Ｇｌｏｖｅｒ　ＤＭ）の感染後に得られ
たファージは挿入されたＤＮＡ１μｇあたり約２×１０
・ファージである。
ゲノム遺伝子ライブラリィはコロニーまたはプラークハ
イブリダイゼーションを用いてＭａｎｆａｔｉｓ　ｅｔ
　ａＬｃ１９８２＞に従ってスクリーニングされるｏ　
５ｈｉｎｓｌｔｉ　ｅｔ　ａｔ　（１９８７）に記載さ
れたＣＤＮＡクローンｐｃＨＮ５０および４．４０項で
単離されたクローンｐＣＨＮ４８がＤＮＡプローブとし
て使用される。
この方法で得られる組換え体は精製され、モしてサザン
プロット分析を用いて部分的に特徴づけられる。これら
のクローンの一つはｃＤＮＡプローブ分子ｐｃＨＮ５０
およびｐ　ＣＨＮ　４８との非常に強いハイブリダイゼ
ーションシグナルを示し、モしてサザンプロット分析に
従って完全なキチナーゼ遺伝子を含有するが、さらに試
験のために選択され、そしてλＣＨＮ１７と記載される
。
制限酵素Ｈ３ｎｄｌｌＩでの消化の後、完全なキチナー
ゼ遺伝子を含有し、そしてタバコＤＮＡからの同様の大
きさの断片に関連する５、４ｋｂＤＮＡ断片が得られる
。３８５０ｂｐからなり、そして全体のコード配列を含
むこの断片の一部を次に配列決定する。
制限断片を適当なりローニングベクター、例えばＭｌ　
ａｍｐ　１８またはＭ１３ｍｐ１９［Ｙａｎｉｓｃｈ−
Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｔ　（１９８５）］内にクロー
ン化し、ジデオキシヌクレオチド法〔「ジデオキシヌク
レオチド鎖停止法Ｊ　；　Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ　
（１９７７）］により両方の開始部位の配列決定を行う
。
決定されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列はジェネテ
ィクス・コンピューター−グループ・ソフトウェア［Ｄ
ｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａＬ　（１９８５）］を用いて
コンピュータによりさらに分析される。
遺伝子４８と命名されるタバコからの塩基性キチナーゼ
遺伝子の完全なＤＮＡ配列は上に示されているとおりで
ある。
ｃＤＮＡクローンｐＣＨＮ４８とｐＣＨＮ５０との配列
比較は、遺伝子４７のコード領域内に２か所の介在配列
部位（イントロン）があることを明らかにしている。こ
れらのイントロンの最初のものは２７４ｂｐからなり、
そしてグリシンをコードするコドン１４．８の第一ヌク
レオチドと第二ヌクレオチドとの間に位置する。
第二のイントロンは長さ２６９ｂｐであり、ヒスチジン
をコードするコドン１９９の第二ヌクレオチドと第三ヌ
クレオチドとの間に位置する。
両方のイントロンは、公知のその他の公知植物および動
物イントロンと一致して、ドナーおよびアクセプター配
列（ＧＴＡＡＧＴＣおよびＡＣＡＧ）を有するコンセン
サススプライシング部位を有する。さらに、両方のイン
トロンは配列ＣＴ　（Ｇ／Ａ）Ａ　（Ｃ／Ｔ）　、動物
コンセンサス配列（ＰｙＴＰｕＡＰｙ）と類似性を有す
る３１境界からの３３ヌクレオチドを有する。
これらのコンセンサス配列は切除における投げなわ中間
体の形成に関与する。
遺伝子４８のエキソンのヌクレオチド配列はクリーンｐ
ＣＨＮ４８のコード領域のＤＮＡ配列と同一である。
予め単離された全ＲＮＡ５０１ｇを５００μｌのエッペ
ンドルフチューブ中で凍結乾燥させる。次いでＲＮＡを
放射標識されたプローブ分子を含む溶液３０μ！中に再
懸濁し、そして７０℃で１０分間加熱する。チューブを
水浴中３７℃の温度ま′でゆっくり冷却し、そして−晩
保温する。３７℃の水浴からチューブを取り出さずに、
以下の溶液および試薬： ウシ血清アルブミン　　　　　　　５■／１ｎＩジチオ
トレイトール（１００ｍＭ）　　　　　５μ１Ｈ８０８
μ１ ＲＮａｓｉｎ（８０単位）　　　　　　２μｍ逆転写酵
素（４００単位）　　　　　２μｌを添加する。
この反応バッチは３７℃の温度で３０分間保温される。
反応は３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）５μｌおよび無水
エタノール１５０μｌの添加により停止される。試験管
を次に一２０℃で３０分間放置した後に、遠心分離によ
り沈澱を得る。次に洗浄（８０％エタノール）および乾
燥（風乾）を行う。得られた沈澱を染料含有溶液（９０
％ホルムアミド、０．０５％ブロモフェノールブルー、
０．０５％キシレンシアツール、１ｍＭＥＤＴＡ）１０
μｌないし２０μｍ！中に再懸濁する。伸長物を６％配
列決定用ゲル［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａＬ　（１９
８２）］上で分離し、そしてオートラジオグラフィーに
より可視化する。
７、ＺＳｌマツピング ｍＲＮＡの転写開始部位の分析はＭａｎｉａｔｉＳｅｔ
　ａＬ　（１９８２）における記載に実質的に基づいて
いるＳ１マツピングにより行われる。
全体の５１非翻訳領域を含むゲノムクローンλＣＨＮ１
７を５ａｕ３Ａ／Ｐｓｔｌで切断し、モして５フランキ
ング領域の一部およびコード配列の短い部分を含む０．
３ｋｂからなる断片をＭｌｌベクター内にサブクローン
化する。このサブクローニング段階から得られた一本鎖
ＤＮＡは次に引き続くブライマー伸長のための鋳型とし
て使用される。生成する５ｔｐ−標識ＤＮＡ試料をＳｓ
ｔ■およびＰｓｔｌで切断する。伸長されたＤＮＡ鎖を
次に変性させ、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離する。ＤＮＡ試料を次いでポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａ３μｇと共に５２℃で１６時間保温し、次に８１ヌク
レアーゼ（約４００単位／−）により３０℃で消化する
。最適Ｓ１ヌクレア一ゼ濃度は前試験により決定され得
る。
消化産物を次に６％配列決定用ゲルで分離する。
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、高レベルのキチナーゼを産生ず
るように予め誘導された培養タバコ組織から上の記載に
従って単離される。
消化産物の長さはサイズ比較マーカーにより決定される
。適当なサイズ比較マーカーは、−重鎖ＤＮＡでの配列
決定反応を行い、そして電気泳動前にＰＳｔｌで反応物
を消化することにより得られる。この方法において、ジ
デオキシ末端を有する異なる長さの断片が得られ、該断
片はマツピングされるべき保護断片として同一の５１末
端を有する。
Ｓｌヌクレアーゼマツピングを用いると、全体で２本の
バンドを検出することが可能であり、これは種々の開始
部位がキチナーゼ遺伝子上に存在するという予測を導く
。当該バンドの強度を根拠とすれば、主要転写開始部位
はＣＴＡＣＴ配列内の１９６９位にあるＡと同一である
。
第１の可能性のある開始シグナルは上記転写開始部位の
１１ｂｐＴ流の１９８０位にある、塩基配列ＴＡＡＡＡ
ＴＧＡＧ内に見出され、これは植物遺伝子のその他の翻
訳開始部位と並んでおり、コンセンサス配列と呼ばれる
。
５１フランキング領域はその他の真核遺伝子と同様に調
節機能に直接連結され得る以下の多（の塩基配列： （ａ）　　翻訳開始部位の上流で、５ｆフランキング領
域の−２８ないし一２３位にＴＡＡＡＴＡ配列（ＴＡＴ
Ａボックスと予想される） （ｂ）ＴＡＴＡボックスの上流で動物遺伝子にときどき
見出されるＣＡＡＴボックスに類似している、−１１４
位にＣＣＡＡＴＴ配列 （Ｃ）　　動物遺伝子の調節熱シヨツクコンセンサスエ
レメントに類似している、−１４０位に６ｂｐからなる
不完全逆方向反復配列（ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣ） （ｄ）　　−１５２位と一２２８位に１０ｂｐからなる
完全反復配列（ＡＴＧＴＣＣＡＡＡＣ）（ｅ）−１６６
位と一５６９位に２０ｂｐからなるげ）　　−１９１位
と一２１７位に２５ｂｐからなる（ｇ）−２８９位に２
０ｂｐからなるパリンドローム（ＴＡＡＡＡＴＡＴ（）
ＡＩＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡ） （ｈ）　−４３５位と一４８０位にｔｔｂｐからなる完
全直接反復配列（ＴＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣ）（ｉ）　　
−５１４位と一６４４位に１５ｂｐからなる不完全直接
反復配列（ＴＡＡＡＡＴＡＣＡＣＧＴＣＧＡ） により特徴づけられる。
３１フランキング領域は、翻訳停止配列ＴＡＡの下流で
、５２位と１２０位に２個のＡＡＴＡＡＡ配列により特
徴づけられる。
列の連結 ＆　１．プラスミド　ＧＹＩの構築 プラスミドｐＧＹ１はＰｉｅｔｒｚａｋ　ｅｔ　ａＬ　
（１９８６）に記載された植物発現ベクターｐＤＨ５１
から誘導される。プラスミドｐＧＹ１では出発プラスミ
ドｐＤＨ５１のＮｃｏｌ切断部位がＸｈｏｌ切断部位に
置換されていた。
プラスミドｐＤＨ５１がＮｃｏｌで切断され、そして突
出末端がクレノウボリメラーゼを用いて充填される。こ
のときプラントである末端はＸｈｏｌリンカ−（ＣＣＴ
ＣＧＡＧＧ）と連結される。
＆２プラスミド　ＣｌＢ２００の構築 この二元ベクターの構築は、ＰＫ２（ＡｎＧｇｔａＬ、
　１９８５）の誘導体であるＳｃｈｍｆｄｈａｕｓｅｒ
　ｇｎｄＨｅｌｉｎｓｋｉ（１９８５）に記載されたプ
ラスミドｐＴＪＳ７５を基にしており、該二元ベクター
は広い宿主範囲を有し、そしてテトラサイクリン耐性遺
伝子を有する。このプラスミドを制限酵素Ｎａｒｌで切
断し、そして次にＮｐｔｔ遺伝子を有するｐ　Ｕ　Ｃ４
Ｋ　［Ｖｉｅｒｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９８
２）］のＡｃｅＩ断片に連結される。この方法で形成さ
れたプラスミドｐＴＪ３７５ｋａｎはこのときテトラサ
イクリン耐性遺伝子の他にＮ１）ｔ［遺伝子を含み、次
に制限酵素５ａｉｌで消化される。
同時に、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　ＳＪ　ｅｔ　ａｌ　（１
９８７）に記載されているプラスミドｐｃＩＢ７をＢｃ
ｏＲＶで切断し、そしてアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのＴｉプラスミドからの左側および右側のＴ
−ＤＮＡ境界配列ならびにキメラＮｏｓ／Ｎ１）ｉｆｆ
遺伝子およびｐＵＣポリリンカー領域を含む生成りｃｏ
ＲＶ断片をＸｈｏｌリンカ−と連結する。
生成する構築物は次にＸｈｏ［で消化され、そしてプラ
スミドｐＴＪｓ７５ｋａｎの５ａｉｌ切断部位にクロー
ン化される。遺伝子地図が第２図に示される生成するプ
ラスミドをｐｃＩＢ２００と記載する。
＆３プラスミド　５ＣＨＩＯの構築 プラスミドｐｓｃＨ１０はキチナーゼをコードする配列
、５１の転写される非コード性配列（転写開始部位の上
流に位置するキチナーゼ遺伝子４８１７）２１塩基対）
おＪ：びＣａＭＶ８５Ｓ植物発現ベクター１）ＧＹＩの
ＢａｍＨＩ／ＰＳｔｌクローニング部位内にスプライシ
ングされた３′の転写される非コード性配列を含む。
ｐｓｃＨｌｏの作成に必要な工程段階は第３図に示され
、そして以下にさらに詳細に記載される： （１）　　キチナーゼ遺伝子４８を含むゲノムクローン
λＣＨＮ１７をＨｉｎｄｌｌ［で切断する。生成する５
、８ｋｂのＨｉｎｄＩ［断片を単離し、そしてプラスミ
ドＩ）ＵＣ８の旧ｎｄｌｌＩクローニング部位内にスプ
ライシングし、プラスミドｐＣＨＮ６５を形成する。
（２）　　プラスミドｐＣＨＮ６５をｆ！ｃｏＲＩで切
断し、キチナーゼコード化領域の５１末端を含む生成す
るＺ５ｋｂ断片を同様にｐＵＣ８にクローン化する。生
成するプラスミドをｐｃＨＮ６８と記載する。
（３）　　プラスミドｐｃＨＮ６ＢをＰｓｔｌで消化し
、そして０．５　ｋｂＰｓｔｌ／　ＢｃｏＲＩ断片を失
って再び連結する（それ自体に連結する）。生成するプ
ラスミドをｐＣＨＮ７４と記載する。
（４）遺伝子４８の転写の５を非コード領域をＢａｍＨ
Ｉ切断部位の後方にクローン化するために、プラスミド
ｐＣＨＮ７４を最初にＨｐｈ［で消化し、次に７４ＤＮ
Ａポリメラーゼの作用によりプラント末端を付与し、そ
して最後にＰＳｔ［で切断する。Ｈｐｈｌ／Ｐｓｔｌ断
片を単離し、そしてＨ３ｎｃｌｌ／Ｐｓｔｌ［Ｖｉｅｉ
ｒａ　＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９８２）］で消化された
プラスミドｐＵＣａ内にスプライシングし、ｐＣＨＮ８
７を形成する。
配列決定の後、最後の工程段階の間に１／２Ｈｉｎｃｌ
ｌ切断部位の塩基が失われたことをＤＮＡ配列に対する
参照により見ることができる。
（５）　　１）ＣＨＮ８７をＢｃｏＲ［およびＨｉｎｄ
ｌ［で消化し、そしてクローニングベクターｐＵＣ９［
Ｖｉｅｉｒａ　＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９８２）］内に
スプライシングする。生成するプラスミドはｐＣＨＮ８
Ｂと記載される。
（６）　　タバコｃＤＮＡクローン４８（ｐＣＨＮ４８
）の１　ｋｂＰｓｔｌ断片をプラスミドｐＵＣ８のＰＳ
ｔ［クローニング部位内にスプライシングし、ｐＣＨＮ
７８を形成する。
（７）プラスミドｐＣＨＮ７８のＰｓｔｌ挿入物を制限
酵素ＰＳｔｌでプラスミドを切断することにより外し、
そしてｐｃＨ１？８８のＰｓｔ１部位にスプライシング
し、結果としてキチナーゼをコードする完全なＤＮＡ配
列を再構築する。生成するプラスミドはｐＣＨＮ８９と
記載される。
（８）　　プラスミドｐＣＨＮ８９を次にＢａｍＨＩで
完全に消化し、そしてＰｓｔｌで部分的に消化する。
生成する１、　５　ｋｂ断片を、同様にＢａｍＨＩおよ
びＰＳｔｌで予め切断された植物発現ベクターｐＧＹｌ
内にクローン化し、ｐｓｃＨｌＧを形成する。
このクローニング段階の結果として、キチナーゼをコー
ドするＤＮＡ配列はＣａＭＶプロモーターとＣａＭＶ終
結配列との間に位置している。
８．４．プラスミド　５ＣＨ１２の構築プラスミドｐＳ
ＣＨ１２は、その構造のために大腸菌およびアグロバク
テリウム・チュメファシエンスの両方で安定に複製可能
であるいわゆるシャトルベクターである。
ｐｓｃＨ１２の構築のために、まず上記のプラスミドｐ
ｓｃＨ１０をＢｃｏＲ［で切断し、そして二元ベクター
ｐｃＩＢ２０Ｇ内にスプライシングする。所望のプラス
ミドｐＳＣＨ１２がこのようにして構築される。
二元ＴｉプラスミドベクターｐｓｃＨ１２は、ＡＴＧＲ
始コドンからの３１ｂｐ５”、コード配列およびタバコ
キチナーゼ遺伝子４８の３マ非コード領域１４５ｂｐを
含み、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｐＧＹｌのターミ
ネータ−との間のポリリンカー領域内にスプライシング
する。
このベクターはまた、ツバリンシンターゼ発現シグナル
の調節制御下にあり、そして形質転換された細胞にカナ
マイシン耐性を付与するＴｎ５ＮＰＴＩ［遺伝子を含む
。
連結 ９．１．プラスミド　５ＧＬ４の構築 （ａ）　　５ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　ａｔ　（１９８８）
に記載されているツバ：ＩｃＤＮＡクローンＩ）ＧＬ３
６を制限酵素Ｐｓｔｌで切断し、そしてプラスミドｐＵ
Ｃ８にクローン化する。生成するプラスミドをｐＧＬＮ
１２と記載する。
伽）　タバコからの第２のｃＤＮＡクローンｐＧＬ　８
１　［５ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　ａｔ　（１９８８）］を
ＡｃｃｌおよびＰＳｔｌで消化し、そしてグルカナーゼ
をコードする配列の３１部分を含む０．８５　ｋｂ断片
を単離する。
（Ｃ）　　段階（ａｌからのｐＧＬＮ１２をＡｃｃｌお
よびＰｓｔｒで消化する。グルカナーゼをコードする配
列の５１部分を含む０．５　ｋｂ断片を単離する。
（ｄ）　　段階ら）および（Ｃ）からの断片を、前もっ
てＰｓｔｒで切断したプラスミドｐＵＣ８に一緒にクロ
ーン化し、グルカナーゼをコードする完全な配列を再構
築する。生成するプラスミドをｐＧＬＮ１３と記載する
。
（ｅ）　　ＣＤ　Ｎ　Ａの５’Ｇ付加物を削除し、そし
て同時にグルカナーゼをコードする配列の５１側上のＢ
ａｍＨＩ切断部位を付加するために、５’Ｇ付加物がｃ
ＤＮＡの最初の２個の塩基と共にＨａｅｍ切断部位を形
成するという事実が利用される。それ故にｐＧＬ１２が
Ｈａｅｌｌ［で切断され、そして０．３ｋｂ断片がｐＵ
Ｃ９の旧ｎｄｌＩ部位にクローン化され、ｐＧＬＮ１６
を形成する。
（ｆ）　　１）ＧＬＮ１６をＣ１ａｌおよびＰＳｔｌで
消化し、０．２５ｋｂ断片がプラスミドｐＧＬＮ１３の
Ｃ１ａ１／ＰＳｔｌ断片により置換され、その結果グル
カナーゼのコード配列が再構築される。生成するプラス
ミドをｐＧＬＮ１７と記載する。
（ｇ）　　ｐＧＬＮ１７をＢａｍＨＩおよびＰｓｔｌで
消化する。このようにして得られるＢａｍ旧／Ｐｓｔｌ
断片を、予めＢａｍＨ［およびＰＳｔｌで切断されたベ
クターｐＧＹＩ内にスプライシングし、グルカナーゼを
コードする配列は、ＣａＭＶの８５３プロモーターとそ
の終結配列との間に位置している。生成するプラスミド
をｐＳＧＬ２と記載する。
（ｈ）　　ｐＳＧＬ２のＢｃｏＲＩ断片を二元ベクター
ｐＣＩＢ２００内にスプライシングし、ｐＳＧＬ４を形
成する。
グルカナーゼをコードする配列の直前にキチナーゼ遺伝
子の５１非コ一ド配列を位置させるために、オリゴヌク
レオチド介在突然変異誘発が使用される。
プラスミドｐＳＧＬ２のＢｃｏＲＩ断片をクローニング
ベクターＭ１８ｍｐ１９内にクローン化し、ｍ５ＧＬ　
１を形成する。次にｍ５ＧＬ１をＸｈｏｌで切断し、そ
して再連結する。挿入物の部分が失われている。ｍ５Ｇ
Ｌ５が形成される。
Ｅ、ｃｏｌｉｄ　ａ　ｍ−株〔例えばＥ、ｃｏｌｉＧＭ
　１６７４〕上でのｍ５ＧＬ１の増殖により産生された
一本鎖ＤＮＡを、ｄａｍ”株（例えばＥ、ｃｏＬｉＨＢ
ＩＯＩ）からのＸｈｏｌで切断されたｍ５ＧＬ５ＤＮＡ
とハイブリッド形成させ、−重鎖ギャップにより中断さ
れた二本鎖ＤＮＡ　（二重らせん）を形成する。これを
以下の塩基配列＝５　’ＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡ
ＣＴＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＣ
Ａ３’０ を有する突然変異させたオリゴヌクレオチドと塩基対合
（「アニーリングＪ）により連結させる。ＢａｍＨＩお
よびＳｍａ　Ｉの両方の切断部位を失った突然変異させ
たクローンを同定し、そして分離する。それをｍ５ＧＬ
７と記載する。
突然変異させた配列を含有するｍ５ＧＬ７からのＡｃｃ
ｌ／Ｃ１ａｌ断片を次いでＩ）ＳＣｌ２からのＡｃｃｌ
／Ｃ１ａｌ切断部位にクローン化し、ｐＳＧＬ２／９を
形成する。
ｐＳＧＬ２／９を制限酵素ＢｃｏＲＶおよびＰｓｔｌで
消化し、そして突然変異させた配列を含有するＢｃｏＲ
Ｖ／Ｐｓｔｌ断片をｐＳＧＬ２からのＢｃｏＲＶ／Ｐｓ
ｔｌ切断部位にスプライシングし、ｐＳＧＬ６を形成す
る。
それ故に、突然変異誘発において存在していた全ての配
列は、ＢｃｏＲ’／切断部位とＣ１ａｌ切断部位との間
の配列の短い部位を除いて、置換される。
最後に、ｐｓｃｔ、ａをＢｃｏＲＩで消化し、モしてＢ
ｃｏＲＩ断片を二元ベクターｐｃＩＢ２００内にクロー
ン化する。生成するプラスミドをｐＳＧＬ７と記載する
。
このキメラ構策物は、 １、５１末端で切断され、そして＋８４位の開始コドン
ＡＴＧで始まるβ−１，３−グルカナーゼ Ｚ　　−１４位ないし一１位（ＡＴＧ＝０）ｌ：伸び、
モしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに連結されているク
ローンＣＨＮ１７からの調節配列から構成される装 ＋３４（ＡＴＧ）　　Ａｃｃｌ　　　１１１１　１２９
４対照として、１）ＳＣｌ２と記載されるキチナーゼク
ローンＣＨＮ１７からの調節配列のない相当する構築物
が使用される。
キチナーゼ構築物を含有しない、いわゆる空のベクター
（ｐｃＩＢ２００）がその他の対照として使用される。
■、形質転換およびトランスジェニック植物の作出 上の実施例８および９に記載された二元ベクターを以下
の方法に従ってアグロバクテリウム・チュメファシエン
スＬＢ４４０４株内に形質転換する。アグロバクテリウ
ム・チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株はＴ−ＤＮＡ
領域を欠いているが、完全なりｉｒ領領域依然として有
する欠失Ｔｉプラスミドを含む［Ｈｏｅｋｅｍａ　ｅｔ
　ａｔ（１９８３）］。
アグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢ４４０４
株をＭＧ／Ｌ培地〔■項参照）　５ｍＩ中の一晩培養液
中３０℃の温度で培養する。ＭＧ／Ｌ培地２５０ｒｎＩ
をこれらの５１ｎＩの一晩培養液中に添加し、そして全
体のバッチを光学密度０Ｄ＝０．６　（６００ｎｍ）が
得られるまで十分に混合する。次いで細胞を８０００Ｘ
ｇでの遠心分離により集め、そしてＭＧ／Ｌ培地５−中
に再懸濁する。この細胞懸濁液２００μｌをＭＧ／Ｌ培
地中の二元プラスミドＤＮＡ０．２μｇないし１μｇと
保温し、モしてゆっ（り混合した後、バッチをすぐにド
ライアイス／エタノール洛中で急速冷凍する。５分後、
試験管を３７℃の水浴中に置き、そこに５分間放置する
。ＭＧ／Ｌ培地２ｒｄを次に添加する。この懸濁液を次
に３０℃の水浴で２ないし３時間保温する。
細胞を次に遠心分離により集める。細胞を少量のＭＧ／
Ｌ培地に再懸濁し、次に選択培地（ゲンタマイシン１０
０μｇ／−を含むＭＧ／Ｌプレート）上に置く。最初の
コロニーは３０”Ｃで２ないし３日後に現れる。
別の実施態様において、上の実施例Ｂおよび９に記載さ
れた二元ベクターを、ｔｒａ機能を備えたプラスミドを
有するＥ、ｃｏｌｉヘルパー株を用いて三親交雑法［Ｒ
ｏｇｅｒｓ　ＳＧ　ｅｔ　ａＥ（１９８６）］によりア
グロバクテリウム・チュメファシェンスＬＢＡ４４０４
株内に導入する。使用されるＥ。
ｃｏＬｉヘルパー株は、例えば二元ベクターの導入に必
要なｔｒａ機能を有するプラスミドｐＲＫ２０１３をを
含むＥ、ｃｏＬｉＢ　ＨＢ　１０１１であってよい。
アグロバクテリウム・チュメファシェンスＬＢＡ４４０
４株はりファムビシン２０■／！およびストレプトマイ
シン５００■／ｌを含むＬＢＢ地中２８℃で一晩培養さ
れる。Ｅ、ｃｏＬｉＢＨＢＩＯＩＩおよび二元ベクター
を存するＥ、ｃｏＬｉ株はカナマイシン２５■／Ｅを含
むＬＢ培培地中子７℃一晩培養される。
これらの培養液各１−を８０００Ｘｇで遠心分離し、１
ｍｊの滅菌水または１０ｍＭＭｇＳＯ４で洗浄し、再び
遠心分離し、そして１００μ！の水またはＭ　ｇ　Ｓ　
Ｏｓ溶液中に再懸濁する。ＬＢＢ体培地を含むプレート
を４区画に分ける。
これらの４区画のうちの３区画において２つの培養液か
らなる３種の可能な組合せが混合されるように、３つの
細菌培養液の滴を前記区画に載せる。これらは対照とし
て作用する。しかしながら第４の区画では３つの培養液
全てが一緒に混合される。滴が乾燥した後、プレートを
２８℃で一晩保温する。次に試料を各区画から採取し；
そして水またはＭ　ｇ　Ｓ　Ｏａ溶液中に懸濁する。こ
れらの懸濁液の希釈物を調製し、そしてリファムビシン
２０■／Ｉ！、ストレブトマイシン５００■／ｉおよび
カナマイシン２５■／ｌを含むＬＢ培地にブレーティン
グし、そして約２８℃で２ないし３日培養する。高希釈
の二親ハイブリッド〔同様の希釈の対照ハイブリッドで
は何も増殖しない〕で増殖するコロニーは個々のコロニ
ーのブレーティングを繰り返すことにより依然として存
在し得る親細菌が除去される。
葉ディスク形質転換はＨｏｒｓｈ　ｅｔ　ａｔ　（１９
８５）に記載された方法に従って実質的に行われる。
アグロバクテリウム・チュメファシェンスＬＢＡ４４０
４株（１）ＳＣＨＩ２；ｐｓＧＬ７）をリファムビシン
２０■／１１ストレプトマイシン５００■／ｌおよびカ
ナマイシン２５■／ｌで富化され、ｐＨ５，６に調整さ
れたグルタミン酸塩培地中２８℃で一晩培養する。約３
．３×１０”細胞を含有するこの一晩培養液中で、ニコ
チアナ・シルベストリスまたはニコチアナ・ツバカムの
園芸品種ハバナ４２５の滅菌葉ディスク（直径５」ない
し１０ｍｍ）が５分間培養される。
ディスクを次に培養液から除去し、滅菌ペーパータオル
で軽くたたいて乾燥させ、その後栄養培地を含む直径１
００ｍのペトリ皿に移す。
この栄養培地は、１％寒天（Ｄ　Ｉ　ＦＣＯ）で固化さ
れ、そしてその他の添加剤としてｐＨ指示剤（クロロフ
ェノールレッド；５■／Ｉりおよび植物生長剤カイネチ
ン（０，３■Ａ０およびα−ナフチル酢酸（２■／Ｉり
を含有するＬｉｎｓｍｅｉｅｒ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ（
１９６５）による基本培地（３０１ｎＩ）からなる。こ
の寒天培地（培地Ａ）はニコチアナ・ツバカムの園芸品
種ハバナ４２５　（Ｂｉｃｈｈｏｌｚ　ｅｔ　ａｔ、１
９８３）の髄組織から誘導された３２７５Ｎ細胞の２週
令懸濁培養液！−ないし２−の層で覆われており、そし
て口紙（Ｎα１ホワットマンロ紙）で覆われている。上
記のように前処理した葉ディスクを次に口紙上に載せる
。
４８時間後、苗条誘導のために、同一組成を有するがセ
フォタキシム３５０■／ｌおよびカナマイシン１００■
／！を含有する選択培地（培地Ｂ）上に載せ、２５℃お
よび散光（８０ないし１００μアインシユタイン）中で
外植片を培養する。共培養された対照組織はカナマイシ
ンを含まない同様の培地上に接種される。外植片は１週
間間隔で新鮮な培地Ｂに移される。
４ないし８週の共培養後、外植片から発生する未熟苗条
を収穫し、そして５０ｒｄの容器中の培地Ｃ（０，６％
フィトアガーを含有する固体地）２５ｍｔ’上に移す。
全体の組織を２４℃ないし２８℃の温度、８０ないし１
００μアインシユタインの光強度で培養する。１ないし
２週間後苗条は根を形成する。
種々の形質転換方法から得られる小植物が異なる２つの
方法により形質転換に対して試験され得る。
ｌ）ベクター特異的カナマイシン耐性マーカーが形質転
換の成功の基準として作用する。予め形質転換された小
植物の菜の外植片（直径的５Ｂ）はカナマイシン５０■
／ｌを含有するオーキシン／サイトカイニン培地（培地
Ａ）上で継代培養される。選択マーカーを含まないオー
キシン／サイトカイニン培地（培地Ａ）上で培養された
同様の植物の外植片が対照として使用される。菜の外植
片をＭｅｉｎｓ　＆　Ｌｕｔｚ（１９７９）の記載に従
って２１日の期間培養する。カナマイシン培地および対
照培地の両方で生長する小植物がカナマイシン耐性であ
ると推定される。
２）形質転換に対する第２の試験はキチナーゼおよびβ
−１，３−グルカナーゼの過剰発現を検出する目的を有
する。精製された抗タバコキチナーゼまたはグルカナー
ゼＩｇＧ抗体［５ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　ａＬ、　１９８
７］を用いる「ロケット」、免疫電気泳動［Ｌａｕｒｅ
ｌｌ　ａｎｄ　ＭｃＫａｙ（１９８１）］によって葉内
のキチナーゼまたはグルカナーゼ含量を測定することに
より過剰発現が検出され得る。
抽出緩衝液（０，ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭ
ジチオトレイトール、１ｍＭフェニルメチルスルホニル
フルオリドおよび２００ｍＭ２−アミノ−２−（ヒドロ
キシメチル）−１，！３−プロパンジオール、ｐＨ８，
０）２ないし５容量中に最初に葉組織をホモジナイゼー
ションする。可溶性タンパク質画分が６℃での遠心分離
（１０ｏｏｏｘｇで１５分）により得られる。
キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼの含量は、
抗タバコキチナーゼまたはβ−１゜３−グルカナーゼＩ
ｇＧを用いる「ロケット」免疫電気泳動によって決定さ
れる。キチナーゼまたはβ−１，３−グルカナーゼを含
有する試料は、抗タバコキチナーゼまたはβ−１，３一
グルカナーゼＩｇＧを最終濃度１０μｇ／ｍｌで含有す
る１％（Ｗ／Ｖ）の低ｍ１アガロースゲル（バイオラッ
ド）により最大２００Ｖおよび１５ｍＡで１２ないし１
６時間分離される。乾燥ゲルをクーマシーブルーで染色
し、そしてキチナーゼまたはβ−１，３−グルカナーゼ
の含量が決定される。
標準としてハバナ４２５タバコ組織から直接分離された
正確な酵素試料が使用される。
３）キチナーゼ活性は基質としてＩＨ標識キチン〔比活
性４．９３　ｘ　１０　＠ｄｐｍ／ｍｏｌ　Ｎ−アセチ
ルグルコサミン〕を用いて放射線計測で決定される［Ｂ
ｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９８３）］。
実施例１２．２：細胞内液（ＩＣＦ）の抽出植物組織か
ら細胞内液の抽出は、Ｐａｒｅｎｔ　ａｎｄＡｓｓｅｌ
ｉｎ（１９８４）に記載された方法に従って行われ得る
。
この方法において再生されたトランスジェニック植物の
葉は最初に集められ、そして４ないし５ｃｏｆの小片に
切断され、そしてゆっくりかきまぜながら大過剰の冷緩
衝液（約４℃）に各々３０秒間真空下で浸漬する。該緩
衝液は以下の組成： Ｍ　ｇ　Ｃ１＊ ＣａＣ１＊ １　０、０　ｍＭ １　０、０　ｍＭ ２−メルカプトエタノール　　　　５．０ｍＭを有する
ことが有利である。
また、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５，５）を使用す
ることも可能である。操作は室温で行われてもよい。
真空を解除すると緩衝液は葉を貫通する。葉片を次に注
意深く乾燥し、そして２０−のシリンジに移す。シリン
ジは遠心管内で懸濁され、そして低速（約１０１００Ｏ
ｘおよび低温（４℃）で１０分間遠心分離される。
実施例ＩＺ３：細胞内細胞内タンパ分質画分順ＩＺ２に
従って処理された葉片を次に同様の緩衝液中でホモジナ
イゼーションする。粗い粒子を遠心分離により除去する
。
実施例１３ニドランスジ工ニツクホモ接合Ｓｌ植物の生
長 カナマイシン耐性組織を含み、そして高められたレベル
のキチナーゼまたはグルカナーゼを有する８０世代の小
植物を土壌に移し、そして自家受粉の後、放置して温室
で種子を形成させる。種子を表面殺菌し、そして培地Ｄ
（カイネチンおよびα−ナフチル酢酸を含まず、カナマ
イシン４００■／１を添加した）３０ｍｔｌを含有する
ベトリ皿中で二次的な混入なしに発芽させろ。カナマイ
シン耐性実生が温室で生長して成熟しくＳ１世代）、そ
して同様に種子を形成する。
８１世代内の種々の植物の種子が上記の方法でカナマイ
シン耐性に対して試験される。Ｓ１植物の１００個の被
試験種子の全てがカナマイシン耐性の特徴を有していれ
ば、そのとき植物は抗生物質耐性マーカーに関してホモ
接合であると考えられる。形質転換されたニコチアナ・
シルベストリス植物（ＳＳＣ２，３）からのホモ接合性
Ｋｍ’／Ｋｍ’種子を次に生物学的試験のために使用す
る。
使用される対照は、（ａ）非形質転換の非処理葉ディス
クから再生される植物および（ｂ）前もってベクターｐ
ｃＩＢ２００　（ＳＣＩＢ２）で形質転換された葉ディ
スクから出発して再生される植物である。
形質転換された植物および対照植物の８１世代の種子を
発芽させる。菓組織をカナマイシン耐性、キチナーゼま
たはグルカナーゼ含量（ｒロケット」免疫電気泳動）お
よびキチナーゼまたはグルカナーゼ活性に対して試験す
る。
キチナーゼ活性は、Ｂｏｉｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９
８３）の記載に従ってトリチウム化されたキチナーゼを
用いて放射線計測検定でもって決定される。グルカナー
ゼ活性は、基質としての還元ラミナリンとで形成される
非還元糖の生成率に基づいて決定される［Ｐｅ１ｉｘ　
Ｇ　ａｎｄ　Ｍｅｉｎｓ　ＦＪｒ（１９８５）］。
■、結果 レベル） 第１表および第５図に示された結果は以下のことを示す
。
（１）　　Ｓ　Ｉ　　Ｓ　Ｓ　ＣＺ　３植物からの葉組
織は、ベクターで形質転換された対照（ＳＣＩＢ２）の
キチナーゼ含量に比し４００倍まで高いキチナーゼ含量
を有する。
（２）キチナーゼの過剰発現とカナマイシン耐性マーカ
ー（Ｋｍ’　）の発生との間に絶対的な相関関係がある
。
（３）カナマイシン耐性およびキチナーゼの過剰発現の
特徴は無性のメンデル形質に予想されるような様式で分
離する。
（４）形質転換された植物におけるキチナーゼ活性およ
びキチナーゼ抗原の含量は明らかに互いに相関する。こ
のことは、挿入されたキチナーゼ遺伝子が転写され、そ
して酵素的に活性なタンパク質に翻訳されることを明ら
かに示す。
キチナーゼの塩基性イソ酵素がストレスホルモンである
エチレンで処理された葉内にかなりの範囲まで誘導され
ることは知られている。第２表はホモ接合性５ＳＣ２１
植物および対照植物におけるエチレン誘導を行ったもの
、および行わなかったもののキチナーゼタンパク質分布
の比較を示す。結果は、試験された全ての組織および器
官におけるキチナーゼ含量が対照と比較して劇的に増加
していたことを示す。キチナーゼ遺伝子は構造性のプロ
モーターの制御下にあるけれども、それにもかかわらず
いくつかの場合において高められたキチナーゼレベルが
エチレン誘導の後に測定され得る。
著しく高められたキチナーゼレベルにもかかわらず、形
質転換されたトランスジェニック植物は通常の生長およ
び生長態様を示す。
（５）対照植物および形質転換された植物の葉抽出物か
らのキチナーゼは５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画され、ニ
トロセルロース紙に移され、そして−次抗体として抗タ
バコキチナーゼＩｇＧを用いて染色される。参考として
精製されたタバコキチナーゼは、キチナーゼＡ（約３４
ｋＤ）およびキチナ゛−ゼＢ（約３２ｋＤ）に相当する
［５ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　ａｊ（１９８７）］　２本の
バンドを与える。
各列に等量のキチナーゼ抗原が載置されるゲルのプロッ
トは非形質転換ニコチアナ・シルベストリス植物の抽出
物では約８２ｋＤの単一バンド、そして５Ｓ（４３形質
転換体の抽出物では約３４ｋＤの単一バンドを与える。
ＳＳＣ形質転換体の場合、著しく過剰載置したゲルから
生じるプロットは、さらにニコチアナ・シルベストリス
キチナーゼに相当する約３２ｋＤに弱いバンドを示す。
混合試験は、５Ｓ（４３植物の抽出物中のキチナーゼが
形質転換に使用される遺伝子４８の発現産物であるタバ
コキチナーゼとほぼ同じ分子量を存する。
それ故に、この結果は、本発明に係るキメラであるタバ
コキチナーゼ遺伝子がニコチアナ・シルベストリス植物
に発現され、そして遺伝子産物が成熟キチナーゼ遺伝子
の大きさを有するポリペプチドに正確にプロセシングさ
れることを明示する。
ＲＮＡ含最の測定（ＲＮＡレベル） ＲＮＡ含量はノーザンプロット分析により測定される。
低いキチナーゼレベル（１５’３．０μｇ／ｇＦＷ）を
有する８種のホモ接合性対照植物および高いキチナーゼ
レベル（８２７マ６６μｇ／ｇＦＷ）を有する３種のホ
モ接合性キチナーゼ形質転換体の下方の葉から全ＲＮＡ
が単離され、そして分析される。タバコからのキチナー
ゼ配列およびニコチアナ・シルベストリスからのキチナ
ーゼ配列の両方とハイブリッド形成するキチナーゼｃＤ
ＮＡクローンｐ　ＣＨＮ４７のＰｓｔｌ挿入物がプロー
ブとして使用される。
対照植物からの全ＲＮＡは約１．２ないし１．３ｋｂの
バンドを与える。一方、５ＳＣ２，３植物からのＲＮＡ
の相当量は２本のハイブリダイゼーションバンドを与え
、それらは対照のものに比べ少なくとも１０倍高い強度
である。それらの大きさに関しては、２本のバンドが、
ＣａＭＶ３５Ｓ転写開始部位、タバコキチナーゼをコー
ドするＤＮＡ配列およびＣａＭＶターミネータ−からな
るキメラキチナーゼ遺伝子の転写に予測され得る１、１
９８ｋｂおよび１．４１　ｋｂに相当する。２本のバン
ドはほぼ同等の強度であり、これはタバコ遺伝子が使用
されるターミネータ−に関係なくほぼ同じ効果で転写さ
れるという結論を導く。
正しい区画における発現産物の局在 一般に塩基性キチナーゼは細胞内区画に局在する。トラ
ンスジェニックニコチアナ・シルベストリス植物におけ
る遺伝子４８によりコード化されたキチナーゼの位置を
決めるために、無傷の組織のキチナーゼ含量が高い塩濃
度を有する緩衝液を用いて葉の真空浸漬により得られる
細胞内洗浄液（ＩＷＦ）のものと比較されるされる。こ
れらの条件下で、間質の液体に見出されるタンパク質と
細胞壁にゆるく結合したタンパク質とを主として含有す
るＩＷＦが得られることが確認される。対照として中央
の液胞のマーカーである［Ｂｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｋｅ
ｎｄｅ（１９７９）］　ａ　−マンノシダーゼおよび中
央の液胞にも細胞内区画にも見出されるペルオキシダー
ゼが使用される。
第５表は非形質転換および５Ｓ（４３の葉からの葉組織
のＩＷＦｉｉ分における上記酵素の％を示す。１％未満
のα−マンノシダーゼマーカー酵素がＩＷＦ画分に見出
され、このことは、上記のＩＷＦｌｉ製方法が用いられ
たとき、液胞に局在する酵素が容易に感知できる量で抽
出されないことを示す。一方、約３０％のペルオキシダ
ーゼ活性はＩＷＦ画分に見出される。５ＳＣ２，３植物
の葉中のキチナーゼ抗原の濃度は対照植物におけるもの
の２０倍高い。しかしながら、両方の場合、ＩＷＦにお
けるキチナーゼ濃度は２％未満である。
これらの結果は、本発明に係るキメラ構築物により作出
されるようなニコチアナ・シルベストリスの葉の細胞区
画において非常に高いキチナーゼレベルでさえもキチナ
ーゼが正しく局在していることを示す。
（Ｂ）β−１，３−グルカナーゼ形質転換独立に処理さ
れた２つの形質転換（Ｓ　Ｓ　Ｇ　７゜１およびＳ　Ｓ
　Ｇ　７．２　）の結果は第３表に示されている。形質
転換された植物はそれらの葉組織に対照に比べ１００倍
まで高いβ−１，３−グルカナーゼ濃度を有する。対照
植物は対照プラスミドｐＳＧＬ５（９，，２項参照）を
用いて形質転換された。このｐＳＧＬ５はキチナーゼ遺
伝子の５１非翻訳領域からの本発明に係る配列がグルカ
ナーゼ構造遺伝子に連結されていない遺伝子構築物を含
む。
（Ｃ）表 １１．＊：　１）ＳＣＨＩ　Ｏで形質転換されたニコチ
アナ・シルベストリス植物（Ｋｍ’／Ｋｍ’；　Ｋｍ“
／Ｋｍ’）と対照（Ｋｍ’／Ｋｍつのキチナーゼ活性（
ｎＫａｔ／ｇ）の比較 被試験　　　　β−１，３−グルカナーゼ　　　　キチ
ナーゼＳＯ植物　　　　〔μｇ／ｇ抗原〕 Ｋｍ’／Ｋｍ’　　１８．７＋０．２　（３）Ｋｍ’／
にｍ’　　１５．８＋２．１７（８）Ｋｍ’／Ｋｍ’　
　１９．９＋２．３３（３）４５、７＋１．６４ ５５９、０＋７８．４ ７５０、０＋２２．５ キチナーゼ ［ｎＫａｔ／ｇ］ ２２．４＋２．５８ １４９、０＋１７．３ ３１２、０＋４６．０ 夏至産：エチレン処理した場合（２０ｐｐｍで４日〕お
よびエチレン処理をしなかった場合の、ｐＳＣＨＩＯで
形質転換されたニコチアナ・シルベストリス植物と対照
の種々の組織におけるキチナーゼ濃度〔μｇ／ｇ新鮮重
量（ＦＷ））の比較形質転換体　組織 ベクター （ＳｒＢ２） 上方の葉 下方の葉 無傷 表皮 除去した 下側表皮 茎 根 キチナーゼ （ＳＳｅ２．３） 上方の葉 下方の葉 無傷 表皮 除去した 下側表皮 茎 根 キチナーゼ［μｇ／ｇＦＷ］ 一エチレン　＋エチレン １０．４ １０．０ ９０．８ ９．８ ８．４ ５８．８ ４５２、０ ５２０、０ ７５６、０ ６５２、０ １６１、０ １２００、０ ５３．２ ４２．８ １０４、０ ３８．８ １４．０ １４８、０ ７０４、０ ７６０、０ ８２８、０ １１１６．０ １２００、０ １２００、０ １３！Ｅ：形質転換されたニコチアナ・シルベストリス
Ｓ１植物と対照（ＳＹＬ３）の葉組織におけるβ−１，
３−グルカナーゼ濃度〔μｇ／ｇ新鮮重量（ＦＷ））の
比較 植物　　　　　　上方の葉　　　　　下方の葉グルカｔ
−ゼ　　　キチナーゼ ５ＳＧ７．１−Ｉ ＳＳＧ７．１−４ 【μｇ／ｇＦＷ］ １２８　　　　１１．４ ９３．９　　　２１．９ ＳＳＧ７．２−２３ ＳＳＧ７．２−２４ ９３．９　　１５．０ １００．８　　　１３．５ グルｈｔ−ゼ　　　キチナーゼ ［μｇ／ｇＰＷ］ ７４．１　　　５４．６ ９０．３　　　５１．０ ５．４　　　４６．５ ０．０　　　４１．７ ＹＬ３ １．２ ６．３ ３．０ １５．６ Ｌ！ｊ！：　Ｓ　１世代のニコチアナ・シルペストリス
Ｋｍ”植物と空のベクター（ｐｃＩＢ２００）を用いて
形質転換された対照におけるβ−１，３−グルカナーゼ
濃度の比較 植　　物　　　　上方の葉中のキチナーゼ濃度【μｇ／
ｇＦＷ］ ５ＣＩＢ　（対照）１．５±１．５”（４）’５ＳＧ７
．１　　　　　　　７７．０±６．４　　（２０）ＳＳ
Ｇ７．２　　　　　　６３．４±１．０　　（２０）１
５青：対照植物および形質転換されたニコチアナ・シル
ベストリス植物の葉内の細胞外区画と細胞内区画との間
のキチナーゼ分布 植物 ｔｗｐ＠中の％ ベルオキシダーゼ　　　　α−マンノシダーゼキチナー
ゼ ５ＣＺ３ ３０、５＋６．２ ０、８９＋０．１６ １．７８＋０．６５ ｂ＝４回の独立した試験の平均値士ＳＥＭ■、培地およ
び緩衝液 培地Ａ ＮＨ４Ｎｏｔ Ｋ　Ｎ　Ｏ５ ＣａＣ１ｔ　・２Ｊ　Ｏ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　　・７Ｈ８Ｏ ＫＨ，ＰＯ。
Ｎ　ａ　ｔ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏａ　　・７　Ｈ２０ Ｈｚ　Ｂ　Ｏ５ ＭＴｌＳＯ４・４Ｈ＊　０ ＺｎＳＯ４・７Ｈｘ　Ｏ Ｉ Ｎ　ａ　ｚ　ＭＯ０４・２　Ｈｏ　０ ＣｕＳＯｎ　　−５Ｈｚ　０ ＣｏＣＬ　”　６８！　０ ショ糖 チアミンＨＣＩ ミオイノシトール カイネチン α−ナフチル酢酸 クロロフェノールレッド 寒天 １６５０■／１ １９００■／１ ４４０■／１ ３７０■／Ｉｔ １７０■／１ ３７．３■／１ ２７．８■／１ ６．２■／！ ２Ｚ３■／！ ＆６■／１ ０．８３■／１ ０．２５■／１ ０、０２５■／Ｉ！ ０、０２５■／１ ３０、Ｏｇ／Ｉ！ ０、４００■／１ １００．０■／１ Ｏ０３■／１ ２、Ｏ■／１ ５、θ■／１ １０．０ｇ／ｆ 培地Ｂ 培地Ａと同じ組成であるが、α−ナフチル酢酸を含まず
、以下の追加の成分を含む。
セファタキシム　　　　　　　　５００■／１カナマイ
シン　　　　　　　　　　７５■／！培地Ｃ 培地Ｂと同じ組成であるが、 ない。
カイネチンを含ま アグロバクテリウム用のＭＧ／Ｌ培地 Ｌ−ブロス マンニトール−グルタメート培地 （Ｈｏｌｓｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ　１９７８）５０％ ５０％ Ｗ５塩溶液 ａＣＩ ＣａＣ１＊　・２Ｈｚ　Ｏ ＣＩ ブドウ糖 ｐＨ５，６−６，０ ５４ｍＭ ２５ｍＭ ５ｍＭ ５ｍＭ すすぎ溶液■ ショ糖 ＥＳ Ｋ　Ｎ　Ｏｓ ＮＨ，Ｎ０Ｉ ＮａＨ，ＰＯ４”Ｈｚ　０ ＣａＣ１ｔ　＠　２Ｈｔ　Ｏ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　・７Ｈ８０ （ＮＨ，）！　５Ｏａ １５４、０　ｇ／ｆ Ｏ，５９ｇ／／ ２５０、０■／Ｉ！ ２５．０■／１ １５．０■／１ ９０．０■／Ｉ！ ２５．０■／！ １＆４■／Ｉ！ ＴＢＮＰ緩衝液 トリスＨＣＩ　　（ｐＨ８，０） ＤＴＡ ＮＰ−４０（シグマ・ケミカル） ００ｍＭ ０ｍＭ １％（Ｖ／Ｖ） ＴＨＥ緩衝液 トリス−ホウ酸塩 ＤＴＡ ９ｍＭ ５ｍＭ ＴＥ緩衝液 トリスＨＣＩ　　（ｐＨ８，０） ＤＴＡ ０ｍＭ ５ｍＭ ＳＣ ａＣ１ クエン酸ナトリウム （ｐＨ７，０） １．５４ｍＭ ０．１５４ｍＭ 狸キ刈Ｅ紅′ Ａｆｌ　Ｇ　ｅｅ　ａｌ、　　ＥＭＢΩムム、」ユ２７
７−２８４　　＋１９８５１　。
１１Ｌｒｋ　ｙ　ｅｅ　ａｌ、　　　　　　　Ｂｉ　　
　　、　Ａｃｔａ　　６７・３２６−３２８　　＋１９
６３１゜Ｒｏｌｌｅｒ　ａｔ　ａｌ、　Ｐｌａｎｔａ、
ユＱ　２２−３１　　（１９８３１。
Ｒｏｌｌｅｒ　Ｔ　ｍｄ　　Ｋｅｎｄｅ　　Ｈ，Ｐ　　
ａ　　　　ｈ　　ｓ　　ｏｌ、　　　　３・　１１２３
−１１３２　　（１９７９１Ｃａｓｈｍｏｒｓ　Ａ、　
釦□迄江Ｅｎａ”　　　ｆ　Ｐｉ　　ｓ　　ａｎ　酌ワ
工蝕以ｍハカ工舵紐工斂シＰ１ｅｎｕｍ、　ＮｅｗＹｏ
ｒｋ１９８３．　ｐｐ、２９−３８゜Ｄａｖａｒ＊ｕｘ
　　ａｔ　　ａｌ、　　Ｎｕｃｌ、Ａｃ　　ｄｓ　　Ｒ
ｅｓ　　　　１２：　　３８７−３９５　　（１９８４
１゜ｆｆ１ｉｃｈｈｏｌｚ　Ｒｅｔ　ａｉｒ　因１ｍ徂
、ユ５８−４１０−４１５　　＋１９８３１゜Ｔａｃｃ
ｉＯｔｔｉ　ａｎｄ　Ｐｉｌｅｔ＋　Ｐ　　　　　　　
　　Ｌｅｔｔ　　　　　：　１−７　　＋１９７９１゜
Ｔ＠ｕｘ　Ｇ　ａｎｄ　Ｍｅｉｎｓ　ＦＪｒ、　因１ｍ
諺、ユ６４−　４２３−４２８　　＋１９８５１゜Ｆｒ
ａｎｋ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ、　化１Ｌ、ηユ２８５−２９
４　　＋１９８０１　。
Ｇａｔｄｎ＠ｘ　ＲＣａｔ　ａｌ、　邑二り１層違錘触
五ユ」狂２８７１−２．８８［１（１９１１１１。
Ｇａｒｆｉｎｋ＊ｌ　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ、　　　　
ａｃ　、　　１４４：　　７３２−７４３　１１９８０
１゜ＧｌｏｖｅｒＤＭ、　ＤＮＡ　　　　　　　ｖｏｌ
ｕｍｅ　　：　ａ　ｏｒａ　　１ｃａｌ　ａｔ＋ｏｒｏ
ａｃｈ；　ＤＭＧｌｏｖａｒｅｄ、、　ＩＲＬ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｗａｓｈｉｎｇ１０ｎ
　ＤＣ，ｐ、　３３　　（１９８１Ｏｒｍｓｌ＊ｙＮＨ
ｅｔ　ａｌ、　ル圓扛シ」ｚ江１７７−１７９　＋１９
８７１−１ａｙｍ＊ｓ　　ＢＴ　　ａｔ　ａｌ、　　　
　　　ｅ　　　　　　　ｄ　　　　　　　　　　ｔｉｏ
ｎ　　ａ　　Ｐｒａ　　　　ｃａｌトｗ匹４±、　　Ｘ
ＲＬＰＩ：Ｌａ５ｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎ
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ｍ１１ｄ＠ｒ　ａｔ　ａｌ、　Ｎ山ｍ鼾、ユニ狂１６０
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１ｏ＠ｋａｍ　ａｔ　ａｌ、　脳１思罎、ユ乞）Ｈ１７
９−１１１０＋１９８３１゜ｉｏ−テｍｅ　ａｌ、　ｉ
ｎ：　ユ位ｖ匹シ扛Ｂ　　Ｏｏｆ　Ｐｌａｎ　　Ｔｕｍ
ｏｒｓ”。
入ｅａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐ
ｐ、５４９−５６０　　＋１９８２１　。
Ｈｏｒｎ　ａｔ　ａｌ、　　　ｌａｎ　　　Ｃｅ　　　
　Ｒｅ　　ｏｒｔ　　　　７：　４６９−４７２　　＋
１９８８１゜１ｏｒｓｅｈ　ａｔ　ａｌ、　Ｌ（１肋」
！」ｚ■１２２９　（１９８５１゜ｍｏｗａｒｄａｔ　
ａｌ、　Ｐｌａｎｔａ　　１７０：　５３５　（１９８
７１。
Ｌｉｎ５ｍ＠ｉｅｒ　　ａｎｄ　　Ｓｋｏｏｇ、　　Ｌ
ｈｙ且１９１１Ｐ１」工ｌ−、ニーＬジＬ　１０１−１
２］　（１９６５１。
Ｌｏｇａｍａｎｎ　Ｊ　６ｅ　ａＬ　Ａｎａｌ　　、　
ＢｌｏＣｈｅｍ−１６３・１６−２０　＋１９８万Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１
ｏｎ　　　　ＡＬａｂＯｒａｔＯｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ１０
ｒｙ、　　１９８２゜４９９−５６０．Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＬＯｎｄＯｎ、＋
１９８０１゜Ｍｅｍｓ＆　Ｌｕｔｚ、　Ｄｉｆｆｅｒ　
ｎ　１ａｔｉｏｎ　　１　　：　　１−６　　（１９７
９１。
Ｍｏｈｎｅｎ、　二迫四シ迄オｍ！ＱｆＧｌ　　　　　
　　１ａｓｅｓ　ｉｎ　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａしａｂａｃ
ｕｍｏｎ　ｔｈｅ　煕ｙ旦逸肛ＲＮＡ　１ｅｖｅｌこ、
　Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ　ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
　ｏｆｌｌｌｌｎｏｉｓ　ａｔ　ｔｌｒｂａｎａ−Ｃｈ
ａｍｐａｉｇｎ、　　１９８５゜Ｍｏｈｎｅｎ　ｅｔ　
ａｌ、　ＥＭＢＯＪ、、　　４：　　１６３１−１６３
５　　＋１９８５１　。
Ｍｏｒｅ工１ｉ　ｅｔ　ａｌ、　述ル旦匹工ユ襲工２０
０　　（１９８５１。
Ｍｕｒａｓｈｉｇａ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ、　Ｐｈ　５
ｉｏ１．　Ｐｌａｎｔ、　　１５：　４７３−４９７　
　（１９６２１゜Ｎａｇｒｕｔｉｕ　１　ｅｔ　ａｌ、
　ＰＩＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　　８：　３６３−３７３
　＋１９８力。
Ｎａｕｈａｕｓ　ａｔ　ａｌ、　　　　　　　ｌ　　　
　　、　　７４：　３０−３６　＋１９８刀。
Ｐａｒ＠ｎｔ　ＪＧ　ａｎｄ　Ａｓ５ｅｌｉｎ　Ａ、　
　Ｃａ　　　、　Ｂｏ　、　　６２：　５６４−５６９
　　＋１９１１４１゜Ｐ＊ｔｉｔ　ａｔ　ａｌ、　　　
ｌ　　　　、　　Ｇｅｎｅｔ、　　２０２：　３ＢＢ　
　（１９８６１゜Ｐｉ＊ｔｒｚａｋ　ｅｔ　ａｌ、　小
コＬ」ＹＬ銚シ狙、１νｌ：　５８５７−５８６８　　
＋１９８６１゜Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｘ　ａｎｄ　５ｈｉ
ｌｌｉ１０　ＲＤ、　Ｍｅ　　　　　ｉｎ　Ｅｎｚ　　
　Ｉ　　　　Ｖｏ　　１１８ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ、Ａ　ａｎｄ　）ｌＷｅｉ
ｓｓｂａｃｈ、ＡＣａｄｅｍｉＣＰｒｅＳＳＩＯｒｌａ
ｎｄｏ、１９８６゜ Ｒｈｏｄａｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、　　６：　　５６−６０　　＋１９８８１゜Ｒｏ
ｇ＊ｒｓ　ＳＧ　ｅｔ　ａｌ、　　　　　　　ｉｎ　Ｅ
ｎｚ　　　ｌ　　　　１１１１：　６３０−６３３１１
９８６１Ｒｏｔｈｓｔ＊ｉｎ　ＳＪ　ａｔ　ａｌ、　Ｇ
ｇ３ｇ、　５３：　１５３−１６１　（１９［１７１。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｏｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ１０ｒｙ　Ｍａｎ
ｕａｌ、　５ｅｃｏｎｄ　Ｅ山ｔｉｏｎ　（１９８９）
。
Ｓａｎｇ＠ｒ　ｅｔ　ａｌ、　ム交う」旭Ｃ２Ａｃａｄ
、　８沫、−μ５Ｌ７４−５４６３−５４６７＋１９７
７）　。
Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓａｒ　ａｎｄ　Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ
、　　　　Ｂａｃｈｅｒｉｏｌ、　　１６４：　　４４
６−４５５（１９８５）。
５ｃｈｏｃｈ＊ｒ　ＲＪ６ｅ　ａｌ、Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏａ　　　４：　１０９３−１０９６（１９８６
）。
５ｈｉｌｌｉ１０　ＲＤ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　　１：　　５８１−５８７　　（
１９８９）　。
５ｈｉｎｓｈｉｅｅａｕ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　　、　　　
　ｄ、Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　Ｂ４・　８９−９３（１９
８７１゜５ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｌａ広旦、ユ
６４：　　４２３−４２８　　＋１９８５１゜５ｈＬｎ
ｓｂＬ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　Ａｃａ
ｄ　　　　　、　　ｔｌｓＡ　８５：　　５５４１−５
５４５（１９８８１゜ ５ｈｉｌｌｉ１０ｅｅａｕ、　　ｉ　　　　　ｎｏｌｏ
　　　　：　　１０９９−１１０３＋１９８５）；Ｓｉ
＊ｇ＠ｌＢＺｌｎｄＧａｌｓ１０ｎＡｗ、ＰｌａｎｔＰ
ｈｓｉｏ１４２：２２１−２２６＋１９６７１Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ　ＥＭ、　　　　Ｍ　１．Ｂｉ　　１　　８：
　５０３−５１７　　（１９７５）−８ｐａｎａ　ｅむ
ａｌ、　　ＥＭＢＯ≦Ｔ、　　４−　２７３６　　＋１
９８５１゜Ｖｉｅｒｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　
ΩＪＫ１」Ｊ土２５９−２６８　　＋１９８２１　。
賛ａｎｇ　Ｙ−Ｃｅｔ　ａｌ、　Ｐｉ　　　Ｍｏｌ　　
Ｂｉｏｌ、　　１１・４３３−４３９　　＋１９８８１
゜ＹａｍａｄａＹｅｔａｌ、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅ、
５二８５−８８ｆ１９８６１゜Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐ＠ｒ
ｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　ＱｍシーΣ■１０３−１１９　
　＋１９８５１゜
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐｓｃＨ１２の特徴的領域およびそ
れらの開始点を示すｐｓｃＨ１２の遺伝子地図を示す。 （図中、Ｐ３５Ｓ→ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；Ｔ３
５Ｓ−”ＣａＭＶ終結配列、ＴＮＯ８→ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子の終結配列、ＰＮＯ３→
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のプロモ
ーター；ＬＢ、ＲＢ→アグロバクテリウム・チュメファ
シエンスのＴｉプラスミドからの左側または右側境界配
列） キチナーゼをコードするキメラ遺伝子構築物の５ｖ領域
の関連部分はヌクレオチド配列により詳細に示されてい
る。 第２図はｐｃＩＢ２００の制限地図を示す。 第３図はプラスミドｐｓｃＨ１２構築の概略図である。 詳細は実施例８に示されている。 第４図はプラスミドＩ）ＳＧＬ７構築の概略図である。 詳細は実施例９に示されている。 第５図はニコチアナ・シルベストリス５１（Ｎｉｃｏｔ
ｉａｎａ　５ｙＬｖｅｓｔｒｉｓ　Ｓｌ）植物（Ｋｍ”
／Ｋｍ”）の葉中のキチナーゼ濃度を対照（Ｋｍ”／Ｋ
ｍ”）と比較して一般的方法で示すグラフである。 には下から上へ番号を付す。 葉 特許出願人　チバーガイギー　アクチェンゲゼルシャフ
ト代　理　人　弁理士　萼　優美（ほか２名）第 図 ５′ま福俳分 第 図 第 図 Ｅｃ＠ＲＶ　＆４ｔｐ−ＰｓｔＩ　ＪＺ　ｔηｊｉ第 図 塵、ｌミラ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）植物キチナーゼ遺伝子の５′非翻訳領域から得ら
    れる調節ＤＮＡ配列であって、該配列が発現性ＤＮＡお
    よび植物細胞内で活性な発現シグナルに操作可能に連結
    されている場合に、植物宿主への形質転換で操作可能に
    結合された発現性ＤＮＡの発現レベルにおける著しい増
    加を導く、前記調節ＤＮＡ配列。 （２）塩基性タバコキチナーゼ遺伝子の５′非翻訳領域
    から得られる請求項１記載の調節ＤＮＡ配列。 （３）配列のこの部分が少なくとも５５％の範囲までＡ
    ／Ｔを含むＡ／Ｔに富んだ領域である請求項２記載の調
    節ＤＮＡ配列。 （４）配列のこの部分が少なくとも７０％の範囲までＡ
    ／Ｔを含むＡ／Ｔに富んだ領域である請求項２記載の調
    節ＤＮＡ配列。 （５）ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５植
    物の塩基性キチナーゼ遺伝子の５′非翻訳領域から得ら
    れ、そして以下のＤＮＡ配列：【遺伝子配列があります
    】 を実質的に有するか、または１個またはそれ以上の塩基
    の突然変異に基づいているがしかし依然として上記配列
    に実質的に相同であり、そして出発配列の特定の調節発
    現増加特性を依然として有する上記ＤＮＡ配列の全ての
    誘導体である請求項２記載の調節ＤＮＡ配列。 （６）ＤＮＡ配列が実質的に純粋な形態にある請求項１
    ないし５のいずれか１項に記載の調節ＤＮＡ配列。 （７）請求項１ないし６のいずれか１項に記載の調節Ｄ
    ＮＡ配列の１つから、または該調節ＤＮＡ配列の誘導体
    から得られ、そして出発配列の特定の調節発現増加特性
    を依然として有する断片または部分配列。 （８）以下のＤＮＡ配列： 【遺伝子配列があります】 を有するか、または１個またはそれ以上の塩基の突然変
    異に基づいているがしかし依然として上記配列に実質的
    に相同であり、そして出発配列の特定の調節発現増加特
    性を依然として有する上記ＤＮＡ配列の全ての誘導体で
    ある請求項７記載の部分配列。 （９）５′非翻訳領域に以下の特定の構造的特徴： （ａ）１９６７ないし１９７１位のＣＴＡＣＴ配列内に
    転写開始部位 （ｂ）該転写開始部位の１１ｂｐ下流１９８０位に第１
    の可能な開始コドン （ｃ）転写開始部位の上流で、５′フランキング領域の
    −２８ないし−２３位にＴＡＡＡＴＡ配列（ＴＡＴＡボ
    ックス） （ｄ）−１１４位にＣＣＡＡＴＴ配列 （ｅ）−１４０位に６ｂｐからなる不完全逆方向反復配
    列（ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣ） （ｆ）−１５２位と−２２８位に１０ｂｐからなる完全
    反復配列（ＡＴＧＴＣＣＡＡＡＣ） （ｇ）−１６６位と−５６９位に２０ｂｐからなる不完
    全直接反復配列（ＴＴＴＴＡＡＣＴＡＡＡＴＣＴＡＴＧ
    ＴＣＣ） （ｈ）−１９１位と−２１７位に２５ｂｐからなる不完
    全直接反復配列（ＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴ
    ＴＴＴＴＴＡＡＡ） （ｉ）−２８９位に２０ｂｐからなるパリンドローム（
    ＴＡＡＡＡＴＡＴＧＡ｜ＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡ） （ｊ）−４３５位と−４８０位に１１ｂＰからなる完全
    直接反復配列（ＴＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣ）（ｋ）−５１
    ４位と−６４４位に１５ｂｐからなる不完全直接反復配
    列（ＴＡＡＡＡＴＡＣＡＣＧＴＣＧＡ） （ｌ）３′フランキング領域内の翻訳停止配列ＴＡＡの
    下流で、５２位と１２０位に２個のＡＡＴＡＡＡ配列 を有するニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５
    植物から得られる塩基性キチナーゼ遺伝子。 １０）以下のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 を有するニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５
    植物から得られる塩基性キチナーゼ遺伝子。 （１１）請求項１ないし８のいずれか１項に記載の調節
    ＤＮＡ配列が発現性ＤＮＡおよび植物細胞内で活性なそ
    の他の発現シグナルに操作可能に連結され、その結果、
    植物宿主への形質転換で操作可能に結合された発現性Ｄ
    ＮＡの発現レベルにおける著しい増加が得られる、キメ
    ラ遺伝子構築物である組換えＤＮＡ分子。 （１２）スペーサー配列がプロモーター配列と隣接調節
    ＤＮＡ配列との間に挿入され、プロモーター配列と隣接
    調節ＤＮＡ配列との間の距離が結合された構造遺伝子の
    発現に対して最適な距離であるように前記スペーサー配
    列の長さが選択される請求項１１記載の組換えＤＮＡ分
    子。 （１３）スペーサー配列が１ｂＰないし１００ｂｐから
    なる請求項１２記載の組換えＤＮＡ分子。 （１４）発現シグナルが植物または植物ウィルスの遺伝
    子に由来する請求項１１記載の組換えＤＮＡ分子。 （１５）発現シグナルが細菌の発現シグナルである請求
    項１１記載の組換えＤＮＡ分子。（１６）発現シグナル
    がカリフラワーモザイクウイルス遺伝子（ＣａＭＶ）の
    プロモーターおよび／または終結シグナルである請求項
    １４記載の組換えＤＮＡ分子。 （１７）発現シグナルがアグロバクテリウム・チュメフ
    ァシエンスのＴｉプラスミドからのノパリンシンターゼ
    遺伝子（ｎｏｓ）および／またはオクトピンシンターゼ
    遺伝子（ｏｃｓ）の発現シグナルである請求項１５記載
    の組換えＤＮＡ分子。 （１８）誘導または抑制の意味において、植物組織内で
    、結合されたＤＮＡ配列の転写を調節し得る追加的な調
    節ＤＮＡを含む請求項１１記載の組換えＤＮＡ分子。 （１９）前記調節ＤＮＡ配列が、植物ホルモン、熱ショ
    ック、化学物質、病原体、酸素不足および光からなる群
    から選択される種々の内部および／または外部要因によ
    り誘導される請求項１８記載の組換えＤＮＡ分子。 （２０）調節ＤＮＡ配列に結合された発現性ＤＮＡが、
    形質転換された植物細胞およびまたそれらから生長する
    組織に、そして特に植物に、病原体、化学物質および環
    境の悪要因に対する保護作用を付与する構造遺伝子であ
    る請求項１１記載の組換えＤＮＡ分子。 （２１）前記構造遺伝子が植物細胞内にキチナーゼを発
    現する遺伝子である請求項２０記載の組換えＤＮＡ分子
    。 （２２）前記構造遺伝子が植物細胞内にグルカナーゼを
    発現する遺伝子である請求項２０記載の組換えＤＮＡ分
    子。 （２３）前記構造遺伝子が植物細胞内にプロテアーゼイ
    ンヒビターを発現する遺伝子である請求項２０記載の組
    換えＤＮＡ分子。 （２４）前記構造遺伝子が除草剤耐性遺伝子である請求
    項２０記載の組換えＤＮＡ分子。（２５）前記構造遺伝
    子が植物細胞内にバチラス・スリンギエンシスからのｄ
    −エンドトキシンを発現する遺伝子である請求項２０記
    載の組換えＤＮＡ分子。 （２６）調節ＤＮＡ配列に結合された構造ＤＮＡが、形
    質転換された植物細胞自体または組織、器官、カルス、
    胚および植物全体からなる群から選択されるより高度な
    オーガナイゼーションの単位の部分における発現で、望
    ましくそして有用な化合物の産生における増加を導く請
    求項１１記載の組換えＤＮＡ分子。 （２７）前記発現性ＤＮＡ配列がアンチセンスＤＮＡで
    ある請求項１１記載の組換えＤＮＡ分子。 （２８）選択性表現型マーカーをコードするＤＮＡ配列
    をさらに含む請求項１１記載の組換えＤＮＡ分子。 （２９）前記選択性表現型マーカーが、アンピシリン、
    テトラサイクリン、ヒグロマイシン、カナマイシン、メ
    トトレキセート、Ｇ４１８およびネオマイシンからなる
    群から選択される抗生物質に対する耐性である請求項２
    ８記載の組換えＤＮＡ分子。 （３０）微生物中での複製を可能にする複製の開始点を
    さらに含む請求項１１記載の組換えＤＮＡ分子。 （３１）複製の開始点が大腸菌、アグロバクテリウムま
    たはそれらの両方において機能し得る請求項３０記載の
    組換えＤＮＡ分子。 （３２）請求項１１ないし３１のいずれか１項に記載の
    組換えＤＮＡ分子を含むクローニングベクター。 （３３）請求項１１ないし３１のいずれか１項に記載の
    組換えＤＮＡ分子を含む形質転換ベクター。 （３４）大腸菌およびアグロバクテリウム・チュメファ
    シエンスの両方において安定に複製し得る請求項３１記
    載の組換えＤＮＡ分子を含むシャトルベクター。 （３５）キメラ遺伝子構築物が左側境界配列（ＬＢ）と
    右側境界配列（ＲＢ）との間にクローン化されている、
    アグロバクテリウム・チュメファシエンスのＴｉプラス
    ミドから得られる請求項３４記載のシャトルベクター。 （３６）請求項１１ないし３１のいずれか１項に記載の
    組換えＤＮＡ分子を含む宿主有機体。 （３７）請求項３２ないし３５のいずれか１項に記載の
    ベクターを含む宿主有機体。 （３８）前記宿主有機体が細菌である請求項３６または
    ３７記載の宿主有機体。 （３９）前記宿主有機体が、プロトプラスト、細胞、カ
    ルス、組織、器官、種子、胚、花粉、胚珠、接合子その
    他からなる群から選択される植物材料である請求項３６
    または３７記載の宿主有機体。 （４０）請求項１１ないし３１のいずれか１項に記載の
    組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物なら
    びにそれらの有性および無性の後代。 （４１）野生型に比べ著しく増加されている形質転換さ
    れた細胞および／または組織におけるタンパク質含量を
    有する、トランスジェニック植物ならびにそれらの有性
    および無性の後代。 （４２）野生型に比べ著しく増加されているキチナーゼ
    含量を有する、請求項４１記載のトランスジェニック植
    物ならびにそれらの有性および無性の後代。 （４３）野生型に比べ著しく増加されているグルカナー
    ゼ含量を有する、請求項４１記載のトランスジェニック
    植物ならびにそれらの有性および無性の後代。 （４４）請求項３９記載の形質転換された植物材料から
    再生されたトランスジェニック植物。 （４５）トランスジェニック植物が稔性植物である請求
    項４０ないし４４のいずれか１項に記載のトランスジェ
    ニック植物。 （４６）請求項４０ないし４５のいずれか１項に記載の
    トランスジェニック植物の増殖材料。 （４７）請求項４０ないし４５のいずれか１項に記載の
    トランスジェニック植物の部分。（４８）請求項１記載
    の調節発現増加性ＤＮＡ配列を塩基性キチナーゼ遺伝子
    の５′非翻訳領域から単離するか、または公知方法を用
    いて前記配列を合成することからなる前記配列の調製方
    法。 （４９）前記調節ＤＮＡ配列が実質的に以下のヌクレオ
    チド配列： 【遺伝子配列があります】 であるか、または１個またはそれ以上の塩基の突然変異
    に基づいているがしかし依然として上記配列に実質的に
    相同であり、そして出発配列の特定の調節発現増加特性
    を依然として有する上記ＤＮＡ配列の全ての誘導体であ
    る請求項４８記載の方法。 （５０）以下の工程手段： （ａ）キチナーゼを発現し得る組織からのゲノムＤＮＡ
    の抽出および精製 （ｂ）抽出および精製されたＤＮＡ調製物の、クローニ
    ングベクター中への引き続く挿入に適当な大きさの断片
    への切断 （ｃ）断片化されたＤＮＡのクローニングベクター内で
    のクローニングおよび遺伝子ライブラリィの作成 （ｄ）プローブ分子によるキチナーゼ遺伝子またはそれ
    らの一部を含むクローンの選択 （ｅ）プローブ分子との強いハイブリダイゼーションシ
    グナルを示すクローンの単離 （ｆ）（ｅ）において単離されたクローンの生化学的操
    作による特徴づけ （ｇ）発現の増加に関与する調節ＤＮＡ配列の同定およ
    び単離 からなる請求項４８記載の方法。 （５１）発現ベクターがゲノム遺伝子ライブラリィの作
    成のために使用される請求項５０記載の方法。 （５２）公知キチナーゼクローンまたはそれらの一部が
    プローブ分子として使用される請求項５０記載の方法。 （５３）前記調節ＤＮＡ配列およびそれらから誘導され
    た同様の機能を有する誘導体が化学的操作により合成さ
    れる請求項４８記載の方法。 （５４）請求項１記載の調節ＤＮＡ配列を所望の構造遺
    伝子の開始コドンの前に直接挿入し、そしてその構築物
    を植物細胞内で活性な発現シグナルに操作可能な様式で
    連結することからなる請求項１１記載の組換えＤＮＡ分
    子の作成方法。 （５５）スペーサー配列がプロモーターと調節ＤＮＡ配
    列との間に挿入されている請求項５４記載の方法。 （５６）前記構造遺伝子がキチナーゼまたはグルカナー
    ゼ遺伝子である請求項５４記載の方法。 （５７）前記構造遺伝子がプロテアーゼインヒビターを
    コードする遺伝子である請求項５４記載の方法。 （５８）前記構造遺伝子が除草剤耐性遺伝子である請求
    項５４記載の方法。 （５９）前記構造遺伝子がバチラス・スリンギエンシス
    からのｄ−エンドトキシン遺伝子である請求項５４記載
    の方法。 （６０）以下の工程： （ａ）所望の発現性ＤＮＡの開始コドンの前に直接、調
    節ＤＮＡ配列を挿入し、 （ｂ）植物細胞内で活性な発現シグナルの間に形質転換
    体選択に適当なマーカー遺伝子を含んでいてよい公知植
    物発現ベクター内に（ａ）の構築物を操作可能な様式で
    スプライシングする、 ことからなる請求項１記載の調節ＤＮＡ配列と操作可能
    に連結されて植物細胞内で発現可能なＤＮＡを含む発現
    ベクターの作成方法。 （６１）前記構築物が植物発現ベクターのポリリンカー
    領域にスプライシングされ、該領域がプロモーターとタ
    ーミネーターとの間に位置している請求項６０記載の方
    法。 （６２）請求項１１ないし３１のいずれか１項に記載の
    組換えＤＮＡ分子を用いて公知方法により植物を形質転
    換することからなる、野生型と比較して増加されている
    形質転換された細胞および／または組織におけるタンパ
    ク質含量を有するトランスジェニック植物の作出方法。 （６３）請求項２１記載の組換えＤＮＡ分子を用いて植
    物を形質転換し、そして挿入されたキチナーゼ遺伝子を
    発現させることからなる、野生型と比較して著しく増加
    されているキチナーゼ含量を有する請求項６２記載のト
    ランスジェニック植物の作出方法。 （６４）請求項２２記載の組換えＤＮＡ分子を用いて植
    物を形質転換し、そして挿入されたグルカナーゼ遺伝子
    を発現させることからなる、野生型と比較して著しく増
    加されているグルカナーゼ含量を有する請求項６２記載
    のトランスジェニック植物の作出方法。 （６５）請求項２１記載の組換えＤＮＡ分子を用いて植
    物を形質転換し、そしてキチン含有病原体を死滅させる
    か、または該病原体を制御下に保つのに十分な量で挿入
    されたキチナーゼ遺伝子を発現させることからなる、キ
    チン含有病原体から植物を保護する方法。 （６６）請求項２２記載の組換えＤＮＡ分子を用いて植
    物を形質転換し、そしてキチン含有病原体を死滅させる
    か、または該病原体を制御下に保つのに十分な量で挿入
    されたグルカナーゼ遺伝子を発現させることからなる、
    キチン含有病原体から植物を保護する方法。（６７）請
    求項２１または２２記載の組換えＤＮＡ分子を用いて形
    質転換され、そしてキチン含有病原体を死滅させるか、
    または該病原体を制御下に保つのに十分な量で挿入され
    たキチナーゼ遺伝子またはグルカナーゼ遺伝子を発現す
    るトランスジェニック植物またはそれらの一部とキチン
    含有病原体を接触させることからなるキチン含有病原体
    を制御する方法。 （６８）以下の工程手段： （１）キチナーゼを発現し得る組織からのゲノムＤＮＡ
    の抽出および精製 （２）抽出および精製されたＤＮＡ調製物の、クローニ
    ングベクター中への引き続く挿入に適当な大きさの断片
    への切断 （３）断片化されたＤＮＡのクローニングベクター内で
    のクローニングおよび遺伝子ライブラリィの作成 （４）プローブ分子によるキチナーゼ遺伝子またはそれ
    らの一部を含むクローンの選択 （５）プローブ分子との強いハイブリダイゼーションシ
    グナルを示すクローンの単離 （６）（５）において単離されたクローンの生化学的操
    作による特徴づけ からなる請求項９記載の塩基性キチナーゼ遺伝子の作成
    方法。 （６９）発現ベクターがゲノム遺伝子ライブラリィの作
    成のために使用される請求項６８記載の方法。 （７０）予め単離されたｃＤＮＡクローンをプローブ分
    子として用いるか、または特有の翻訳産物の同定に基づ
    いた免疫学的検出方法を用いる、プラークハイブリダイ
    ゼーションまたは分別コロニーハイブリダイゼーション
    によりゲノム遺伝子ライブラリィがスクリーニングされ
    る請求項６８または６９記載の方法。 （７１）前記ｃＤＮＡクローンがｐＣＨＮ４８もしくは
    ｐＣＨＮ５０またはそれらの機能的同等物である請求項
    ７０記載の方法。 （７２）最初にゲノムまたはｃＤＮＡ遺伝子ライブラリ
    ィを作成し、そして調節ＤＮＡ配列をプローブ分子とし
    て使用して該プローブ分子とハイブリダイゼーションし
    得る相同ＤＮＡ配列の存在に関して前記ライブラリィを
    調べることにより、同様の機能を有する相同ＤＮＡ配列
    を同定するために請求項１ないし８のいずれか１項に記
    載の調節ＤＮＡ配列またはそれらの部分配列を使用する
    ことからなる、新規調節ＤＮＡ配列の同定方法。 （７３）植物材料において遺伝子発現を増加させるため
    に請求項１記載の調節ＤＮＡ配列を使用する方法。 （７４）ゲノム遺伝子ライブラリィを作成し、そして調
    節ＤＮＡ配列をプローブ分子として使用して該プローブ
    分子とハイブリダイゼーションし得る相同ＤＮＡ配列の
    存在に関して前記ライブラリィを調べることからなる、
    同様の機能を有する相同ＤＮＡ配列を同定するために請
    求項１記載の調節ＤＮＡ配列を使用する方法。
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