JPH07500970A - 植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方法技術分野 本発明は植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物及び組換えＤＮＡ 技術を伴うその植物の生産方法に関する。

発明の背景 世界中の植物寄生線虫は、米国だけで年間約５８億ドルの推定の損失で経済的に 重要なほぼ全ての作物の病気を生じる（Ｓａｓｓｅｒ及びＦｒｅｃｋｍａｎ著、 　１９８７．　”線虫学に関する世界の展望”　、　Ｖｉｓｔａｓ　ｏｎ　Ｎｅ ｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｖｅｅｃｈ＆Ｄｉｃｋｓｏｎ編集、　ＨｙａｔｔｓＷｉｌｌ 、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　？−１４頁）。熱帯地域では、線虫により生じる損失 は主として根ヤガイモ、ナタネ及びビートの培養の夫々において重大な有害生物 及び重要な制限因子として見なされている。わずかの少数の耐性作物変種が、例 えば、ジャガイモ、ビート、トマト大豆及びオイル・ラディッシュの育種プログ ラムから出現した（Ｄｒｏｐｋｉｎ著、　１９８Ｂ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙ ｔｏｐａｔｈ、　２６．１４５−１６１；　Ｔｒｕｄｇｉ１１著、　１X９１゜ Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｔｏｐａｊｈ、　２９．１６７−１９２）　。その耐性 はしばしば単−Ｒ遺伝子に基いており（Ｒｉｃｋ　＆Ｆｏｂｅｓ著、　１９７４ ．　Ｔｏｗａｔｏ　Ｇｅｎ、Ｃｏｏｐ、　２４．２５；　Ｂａｒｏｎｅら著、　 １９９０゜Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２２４．１７７−１８２）、数世代 後に耐性の衰弱をもたらす（Ｓｈｉｄｕ＆Ｗｅｂ−ｓｔｅｒ著、　Ｐｌａｎｔ　 Ｐａｒａｓｉｔｉｃ　Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ、　ＩＩＩ巻、　１９８１．　Ｚｕｃ ｋｅｒｍａｎら編集、　ＡｃａпB Ｐｒｅｓｓ、ニュＥ−り、　６１−８７頁；　Ｔｕｒｎｅｒ、　＋９９０．　Ａ ｎｎ、Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｌ、　１１７．３８５−３９７）。

植物寄生線虫は強制寄生虫である。包嚢線虫及び根こぶ線虫の如き線虫は、植物 根中の適当な給餌構造の形成に完全に依存する。これらの給餌構造は、根の侵入 後に線虫により選択される単一の根細胞から生じる。包嚢線虫の場合、ＩＦｃ（ 初期給餌細胞）が細胞壁の消化及び肥大により融合細胞に発達する。根こぶ線虫 による感染後に、ＩＦＣは細胞分裂によらないで数回の核分裂により巨大細胞に 発達し、代謝上非常に活性になる。給餌構造の樹立中に、感染性幼虫の線虫が動 かなくなり、その他の給餌部位に移動する能力を失い、誘導線虫給餌構造（ＮＦ Ｓ）に対するそれらの依存性を示す。

明らかに、植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物に対する至大な 要望がある。病原体及び有害生物と闘う現在のストラテジーは、病原体または有 害生物との直接の相互作用を有する産生物をコードする組換えＤＮＡの発現を伴 う。

欧州特許出願第１５９８８４号は、バチルス・スｉルギエンシス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇ−ｉｅｎｓｉｓ）の殺虫毒素をコードする遺伝子の植物中 の発現を教示している。タンパク質が昆虫により消化されると、それは胃腸道中 でレセプターに結合し、最終的に昆虫の死亡をもたらす。毒素と昆虫中のレセプ ターの相互作用は毒性作用にきわめて重要であり、これは毒素に対する獲得抵抗 性の比較的頻繁な例を説明し得る。

欧州特許出願第３０３４２６号は、幾つかのバチルス・スリンギエンシス株が線 虫に対して作用することを報告している。それ故、その示唆は、これらの殺線虫 毒素をコードする遺伝子を同定し、これらの遺伝子を植物中で発現してそれらを 線虫から保護するためになされていることは、驚くべきことではない（欧州特許 出願第３５２０５２号）。

しかしながら、毒素と有害生物の直接の相互作用が、バチルス・スリンギエン＞ ７内毒素につき報告されていたように（Ｐｅｆｅｒｏｅｎ　Ｍ、著（＋９９１） Ａｇｒｏｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｈｉ−ｇｈ−Ｔｅｃｈ、　５−９頁）、耐性を非常 に速く発達させる傾向があることは、若干重要である。

それ故、本発明の目的は、獲得抵抗性の問題を全く回避する、病原体及び有害生 物に対する低下された感受性を有する植物を提供することである。

発明の要約 本発明は、組換えＤＮＡの発現の結果として、植物寄生線虫に対する低下された 感受性を有する植物を提供する。好ましい実施態様によれば、前記組換えＤＮＡ は線虫給餌構造の崩壊を生じる。別の好ましい実施態様において、前記組換えＤ ＮＡの発現は線虫給餌構造の形成を少なくとも遅延している。更に好ましい実施 態様によれば、前記組換えＤＮＡは、 ｌ）発現後に、線虫給餌構造（ｎｅｍａｔｏｄｅ　ｆｅｅｄｉｎｇ　５ｔｒｕｃ ｔｕｒｅ）の崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を生起する遺伝子Ａ（前記遺伝子Ａ は少なくとも線虫給餌構造中で発現を誘導するプロモーターＡの制御下に置かれ ている）、及び２）発現後に、遺伝子Ａの崩壊作用を中和する遺伝子Ｂ（前記遺 伝子Ｂは遺伝子Ａが発現される植物の細胞の実質的に全部中で発現を誘導するプ ロモーターＢの制御下に置かれており、但し、前記プロモーターは線虫給餌構造 中の遺伝子Ｂの発現を有効に誘導しないことを条件とする）を含む。好ましい遺 伝子Ａはバーナーゼ（ｂａｒ’ｎａｓｅ）をコードし、一方、遺伝子Ｂはバース ター（ｂａｒｓｔａｒ）をコードし、プロモーターＡはレジデント植物プロモー ターであり、プロモーターＢはＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターまたはｒｏｌ　Ｄ プロモーターから得られる。別の実施態様において、プロモーターＡは植物から 単離されるプロモーター、または前記プロモーターからの誘導体である。この実 施態様の好ましいプロモーターは、デルタ−〇、　３ＴｏｂＲＢ７−５Ａプロモ ーターまたはトランケート（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）　ｒｏｌｃプロモーターから 得られるプロモーターＡである。

本発明の別の局面によれば、前記組換えＤＮＡは、線虫給餌構造の形成または維 持に必須であるタンパク質またはポリペプチド産生物をコードする内在性遺伝子 に対し抑制性の遺伝子を含む。本発明のこの局面によれば、線虫給餌構造の形成 または維持に必須のタンパク質またはポリペプチド産生物をコードする内在性遺 伝子転写産物、特に細胞生存度に必須である遺伝子に相補性であるＲＮＡ転写産 物を産生ずる遺伝子Ａが好ましく、そして前記遺伝子Ｂは前記内在性遺伝子によ りコードされたタンパク質またはポリペプチドの機能を置換するタンパク質また はポリペプチド産生物をコードする。前記中和遺伝子は、異なる種、例えば、植 物種、動物種または微生物種、好ましくは異なる植物種の異種遺伝子から得られ ることが好ましい。本発明の細胞生存度に必須である非常に好ましい遺伝子はＡ ＴＰシンターゼ、アデニンヌクレオチドトランスロケータ−、トリカルボキシレ ートトランスロケータ−、ジカルボキシレートトランスロケータ−１２−オキソ −グルタレートトランスロケータ−、シトクロムＣ１ピルベートキナーゼ、グリ セルアルデヒド−３Ｐ−デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＩ（−シトクロムレ４５０ レダクターゼ、脂肪酸シンターゼ複合体、グリセロール−３Ｐ−アシルトランス フェラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ、アミノアシルト ランスフェラーゼ、転写開始因子、及び転写延長因子からなる群から選ばれるタ ンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子である。

本発明の好ましい植物は、ファミリーソラナセアエ（Ｓｏ　Ｉａｎａｓｅａｅ） 、更に好ましくはソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ＬｕｂｅｒｏｓｕＩ ｌｌ）　、ジャガイモからの植物であり、ジャガイモ包嚢線虫に対する低下され た感受性を有するジャガイモ植物が更に好ましい。

また、本発明は、本発明の植物から得ることができる植物材料、例えば、花、果 実、葉、花粉、種子、または塊茎を含む。

また、本発明は、 （１）レシピエンド植物細胞を、（ａ）線虫給餌構造中で発現される場合にその 崩壊を生じる遺伝子及び（ｂ）植物選択マーカー遺伝子を含む組換えＤＮＡで形 質転換する工程、 （２）形質転換細胞から選択圧力のもとに植物を生産する工程、（３）植物寄生 線虫に対する低下された感受性を有する形質転換植物を選択する工程 を含むことを特徴とする植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の 生産方法を提供する。

更に、本発明は、 （１）レシピエンド植物細胞を、（ａ）発現後に、線虫給餌構造の崩壊を生起す る遺伝子Ａ（前記遺伝子Ａは少なくとも線虫給餌構造中で発現を誘導するプロモ ーターＡの制御下に置かれている）、及び（ｂ）発現後に、遺伝子Ａの崩壊作用 を中和する遺伝子Ｂ（前記遺伝子Ｂは遺伝子Ａが発現される植物の細胞の実質的 に全部中で発現を誘導するプロモーターＢの制御下に置かれており、但し、前記 プロモーターは線虫給餌構造中の遺伝子Ｂの発現を有効に誘導しないことを条件 とする）、及び（Ｃ）植物選択マーカー遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換す る工程、（２）形質転換細胞から選択圧力のもとに全植物を生産する工程、（３ ）植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する形質転換植物を同定する工程 を含むことを特徴とする植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の 生産方法を含む。

わずかに異なる実施態様によれば、 （１）レシピエンド植物細胞を、（ａ）発現後に、工程（３）で導入される遺伝 子Ａの崩壊作用を中和する遺伝子Ｂ（前記遺伝子Ｂは遺伝子Ａが発現される植物 の細胞の実質的に全部中で発現を誘導するプロモーターＢの制御下に置かれてお り、但し、前記プロモーターは線虫給餌構造中の遺伝子Ｂの発現を有効に誘導し ないことを条件とする）、及び（ｂ）植物選択マーカーを含む組換えＤＮＡで形 質転換する工程、 （２）形質転換細胞から選択圧力のもとに全植物を生産する工程、（３）工程（ ２）で得られた植物、またはその子孫（これは少なくとも遺伝子Ｂを含む）のレ シピエンド細胞を、（ｃ）発現後に、線虫給餌構造の崩壊を生起する遺伝子Ａ（ 前記遺伝子Ａは少なくとも感染植物の根の線虫給餌構造中で発現を誘導するプロ モーターＡの制御下に置かれている）を含む組換えＤＮＡで形質転換する工程、 （４）工程（３）で形質転換された細胞から適当な選択圧力のもとに植物を生産 する工程、 （５）植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物を同定する工程を含 むことを特徴とする植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産 方法が提供される。

レシピエンド植物細胞を形質転換するのに好ましい方法は、前記組換えＤＮＡを 含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株で前記細胞をコイン キュベートすることによる。

更に、本発明は、配列中に、 一線虫給餌構造中の下流遺伝子の発現を誘導するプロモーターＡ、−線虫給餌構 造中で発現される場合に、その崩壊を生起する遺伝子Ａ、及び必要により 一転写ターミネータ−及びポリアデニル化シグナル配列を含み、こうして前記遺 伝子Ａが前記線虫給餌構造中で発現されるように連結されている植物発現遺伝子 を含む組換えＤＮＡを提供する。本発明の好ましい組換えＤＮＡにおいて、前記 プロケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）からのバースー遺伝子から得られる遺伝子Ａが好ましい。

別の好ましい実施態様によれば、前記遺伝子Ａが宿主植物から得られ、かっＡＴ Ｐシンターゼ、アデニンヌクレオチドトランスロケータ−、トリカルボキシレー トトランスロケータ−、ジカルボキシレートトランスロケータ−１２−オキソ− グルタレートトランスロケータ−、シトクロムＣ、ピルベートキナーゼ、グリセ ルアルデヒド−３Ｐ−デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ−シトクロムレ４５０レダ クターゼ、脂肪酸シンターゼ複合体、グリセロール−３Ｐ−アシルトランスフェ ラーゼ、ヒドロキシメチル−グルタリルＣｏＡレダクターゼ、アミノアシルトラ ンスフェラーゼ、転写開始因子、及び転写延長因子をコードする遺伝子からなる 群から選ばれ、前記遺伝子が宿主植物中の自然配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ） に対し逆の配向て前記プロモーターに融合されている組換えＤＮＡが提供される 。

更に、本発明は、本発明の組換えＤＮＡを含む植物形質転換ベクターを提供する だけでなく、前記植物形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム株を提供する 。

本発明の方法に使用するのに特に好ましいベクターは、ｐＭＯＧ７１６　、ｐＭ ＯＧ７１９、ｐＭＯＧ５８９　、ｐＭＯＧ６９９　、ｐＭＯＧ７１７　、ｐＭＯ Ｇ７１１　、ｐＭＯＧ７１２　、ｐＭＯＧ７１３　、ｐＭＯＧ７１４、ｐＭＯＧ ７１５　、ｐＭＯＧ７１８及びｐＭＯＧ７２０　、並びに本発明に必須ではない 方法で修飾されたこれらの誘導体からなる群から選ばれてもよい。

更に、本発明は、本発明の植物を生育することにより植物寄生線虫による作物へ の損傷を低減する方法を提供する。

本発明の別の局面によれば、遺伝子Ａが発現される植物の根細胞の実質的に全部 中で発現されるプロモーターＢ（但し、それはＮＦ３中の発現を有効に誘導しな いことを条件とする）の制御下に置かれた除草剤抵抗性遺伝子を含む植物を生育 することを含む植物寄生線虫による作物への損傷を低減する方法であって、ｌ） 前記植物を生育する工程、 ２）前記植物の根を除草剤と接触させる工程を含むことを特徴とする植物寄生線 虫による作物への損傷を低減する方法が提供される。

本明細書に使用される表現の意味、並びに本発明の適用及び利点は、下記の本発 明の詳細な説明から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１２　本発明で概説される２成分抵抗性ストラテジーの略図図２．　クローニ ング目的で構築された中間ベクターであるプラスミド９Ｍ００７０７図３．　Ｔ ｉ−プラスミドｐＴｉＢ６からのフラグメントの制限地図図４．　中間ベクター ｐＭＯＧ５７９ 図５．２成分ベクターｐＭＯＧ２３ 図６．２成分ベクターｐＭＯＧ２２ 図７．２成分ベクターｐＭＯＧ２５、Ｔ−ＤＮＡの左側境界と右側境界の間に３ ５Ｓ−ＨＰＴ及び３５Ｓ−ＧＵＳを含むプラスミド 図８．２成分ベクターｐ胚４５２　、ｐ躾６３０及びｐＭＯＧ６７９゜これらの プラスミドはｐＭＯＧ２３またはｐＭＯＧ２２の誘導体であり、無プロモーター ＧＵＳ構造物、ｒｏｌＤ−プロモーター／ＧＵＳ構造物またはトランケートｒｏ ｌ　Ｃ−プロモーター／ＧυＳ構造物のいずれかと植物選択マーカー（ＮＦｒｒ ｌまたは）ＩＰＴ）を含む。

図９．２成分ベクターｐＭＯ０５８３，このプラスミドはｐＭＯＧ２２の誘導体 であり、バースター遺伝子に融合された３５３−プロモーターを含む。

図１０．　２成分ベクターｐＭＯＧ７１６．　このプラスミドはｐＭＯＧ２２の 誘導体であり、バースター遺伝子に融合された「０１Ｄ−プロモーターを含む。

図１１．　２成分ベクターｐＭＯＧ７１８．　このプラスミドはｐＭＯＧ２２の 誘導体であり、二つのバースター遺伝子を含み、一つは３５Ｓプロモーターによ り調節され、一つはｒｏｌ　Ｄプロモーターにより調節される。

図１２゜　プラスミドｐＭＯＧ５８７．　バーナーゼ遺伝子の挿入のために調製 され、かつ細菌プロモーター及びｎｏｓ−ターミネータ−と共にバースター遺伝 子を含む中間ベクター 図１３．２成分ベクターｐ躾５８９　、ｐＭＯＧ５９１　、９戦７１７及びｐＨ に１Ｇ６９９．　これらのプラスミドはｐＭＯＧ２３の誘導体であり、右側の境 界の直後の無プロモーターバーナーゼ遺伝子（ｐＭＯＧ５８９）　、所定の範囲 の異なるプロモーターＡ型調節配列（ｐｎ５９１）、トランケートｒｏｌ　Ｃプ ロモーター及びバーナーゼ遺伝子（１匹７１７）またはトランケートΔ０．３　 ＴｏｂＲＢ７プロモーター及びバーナーゼ遺伝子（ｐＭＯＧ６９９）のいずれか を含む。細菌中のクローニング操作中のバーナーゼ遺伝子の可能な有害な作用を 防止するために、細菌プロモーターを含むバースター遺伝子がＴ−ＤＮＡ境界の 外部に挿入でき、或いはまた、イントロンがバーナーゼ遺伝子のコード領域中に 挿入し得る。

後者の場合、ｐＭＯＧ番号は追加されたｉを有する（例えば、ｐＭＯ０６９９ｉ ）。

図１４．２成分ベクターｐＭＯＧ７１１−ｐｌ［信１５．　これらのプラスミド はｐＭＭ２Ｂ５誘導体であり、トランケートΔ０．３　ＴｏｂＲＢ７プロモータ ーと、細胞生存度に必須である遺伝子のアンチセンス構造物とを含む。

図１５，２成分ベクターｐＭＯＧ７１９．　この図面は、プロモーター型Ｂによ り調節された異種生体遺伝子を導入するのに使用し得るプラスミドの一般図であ る。

図１６．２成分ベクターｐＭＯＧ７２０．　この図面は、線虫抵抗性を得るため に植物中の発現のための完全アンチセンス／センス２成分系を含むプラスミドの 一般図である。

発明の詳細な説明 驚くことに、植物が、ＮＦＳ内部で活性であるプロモーターの制御下のバーナー ゼ遺伝子の発現により線虫給餌構造を崩壊することにより植物寄生線虫に対し感 受性ではないようにし得ることがわかったが、一方、ＮＦＳの外部の植物細胞に 対する潜在的な崩壊活性はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でバースターの 同時発現により有効に弱められることが示された。これらの植物は、植物寄生線 虫が防御のために使用される毒性物質に対し抵抗性を獲得し得るという欠点を有 しない。

何となれば、病原体または有害生物と毒素の直接の相互作用は植物の防御に役割 を果たさないからである。

下記の驚くべき知見は、本発明が幾つかの別の方法で作用し得る方法を説明する 。

ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙら著、　１９８２．　Ｃｅ１ｌ　 ３０．７６３−７７３）（これは健全な植物中で根細胞、特に錐管円筒中でＧＵ Ｓ遺伝子の高度の発現を生じる（Ｂｅｎｆｅｙら著、　（１９９０）　ＥＭＢＯ Ｊ、　９．１６７７−１６８４））が線虫感染植物中でＧＵＳ遺伝子の発現を誘 導するのに使用される場合、ＧＵＳ活性の顕著な不在が線虫給餌構造（ＮＦＳ） 内で観（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）　、タバコ及びジャガイモにつき試験された 。表皮細胞及び根毛を含む根組織中で高度のＧＵＳ発現を生じるその他のプロモ ーター化ｅａｃｈ＆Ａｏｙａｇｉ著。

プロモーター配列（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら著、＋９８６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、　２６１．１０８−１２１における、夫々、読み取り枠１２及び１５の５゛ フランキング領域）である。また、これらのプロモーターを使用して、ＧＵＳ活 性の驚くべき程強い抑制がＰＰＮによる感染後にＮＦＳ内で観察された。

上記の知見とは対照的に、アグロバクテリウム・リゾゲネスプラスミドｐＲｉＡ ４（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら著、１９８６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１． １０８−１２１）からのＴＬ−ＤＮＡの読み取り枠内で活性のままである。明ら かに、そのプロモーターの部分はＮＦＳ発達中にダウンレギュレーションに対し 感受性であり、そしてこの部分が一旦除去されると、そのプロモーターはＮＦＳ 中で最早抑制されない。

植物が、右側の境界から離れた方に向いている方向にＴ−ＤＮＡ内で右側の境界 に直接隣接してクローン化された無プロモーターＧＵＳ遺伝子を含むアクロバク テリ２ムからの２成分ベクターと、第二選択マーカーに基く組換えＤＮＡ構造物 で形質転換された。再生体（ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔ）が選択培地で生育され、成 熟まで生育され、種子を植付けられた。その種子から得られた植物が生育され、 感染及びＮＦＳの形成後に、根がＧＵＳ活性につき分析された。かなりの予測さ れない数の植物系がＮＦＳ内のＧＵＳ活性により検出された。しかしながら、Ｎ ＦＳ中のみにＧＵＳ活性を含む植物系は見られなかった。全ての植物系は非ＮＦ Ｓ部分中で少なくとも若干のＧＵｓ活性を示した。更に、健全な根の雄管円筒内 でＧＵＳ活性を示した無プロモーター遺伝子構造物を含む植物系の殆どがまたＮ ＦＳの発達中にＧＵＳ活性のダウンレギュレーションを示した。

本発明者らは、かなりの頻度で、無プロモーターＧＵＳ遺伝子で示された方法を 使用して感染植物のＮＦＳ内で無プロモーター遺伝子を発現する植物系を得るこ とができるものと結論する。また、これらの実験から、ＮＦＳに対し真に特異的 であるプロモーターが少なくとも非常に稀であることが推論し得る。

更に、ＮＦＳ中のＧＵＳ酵素活性の欠如はＮＦＳ内のＣａＭＶ　３５Ｓプロモー ターのダウンレギュレーションにより必然的に引き起こされる。

上記の知見、即ち、ＮＦＳ内で活性であるプロモーターが無プロモーター遺伝子 構造物を使用してかなりの頻度で標識し得るという知見、及び３５Ｓプロモータ ーがＮＦＳ内でダウンレギュレーションされることが示されたという事実から、 モザイク発現パターンが以下に概説される方法によりＰＰＮに対する低下された 感受性を有する植物を得るのに使用し得るものと結論された。

工桿上　植物が、（ａ）プロモーターＢが一般に構成的であるが、給餌構造の発 達中にダウンレギュレーションされる性質を有するプロモーターＢの後に融合さ れた中和物質、例えば、バースターをコードする遺伝子Ｂと、（ｂ）植物選択マ ーカーとを含む組換えＤＮＡで形質転換される。選択培地の再生体が、例えば、 ウェスタン検出技術を使用して遺伝子Ｂの発現にっきスクリーニングし得る。遺 伝子Ｂを発現する植物が成熟まで生育され、種子を植付けられ、これから植物の 第二世代が生産し得る（Ｔ２）。

工ｉｌｌ　７２世代が、右側の境界から離れた方に向いている方向にＴ−ＤＮＡ 内で右側の境界に直接隣接してクローン化された、本発明の細胞生存度に必須の 遺伝子に対して抑制性の遺伝子またはバーナーゼのような崩壊性物質をコードす る無プロモーター遺伝子Ａと、第二選択マーカーとを含む組換えＤＮＡによる形 質転換の第二ラウンドに使用される。その植物選択マーカー遺伝子は、その遺伝 子がπ中に依然として存在するか、または機能性であるかに応じて、形質転換の 第一ラウンドに使用されたものと異なっていてもよく、また異なっていなくても よい。植物選択マーカーを除去または不活化する方法は当業界で公知である（例 えば、ＷＯ９２１０１３７０に開示されている）。再生体が選択培地で育成され 、成熟まで生育され、種子を植付けられ、これから植物の次の世代が生育される （Ｔ３）。

工程Ｉ１１　次の世代（Ｔ３）が、ＰＰＮに対する低下された感受性並びに、必 要により、逸脱した成長及び発達の不在につきスクリーニングされる。組み込み の無秩序さのために、形質転換の第二ラウンドは、ＮＦＳ内で遺伝子Ａの転写を 活発に促進し得る植物ゲノムの領域への無プロモーター遺伝子Ａの組み込みを時 折生じる。

ＰＰＮ感染後のスクリーニングは、給餌構造内で遺伝子Ａを充分に発現してこれ らの構造の完全な発達を防止し、ＰＰＮの完全な生活環を維持できない植物をも たらし、一方、給餌構造以外のその他の領域中の遺伝子Ａの可能な発現が遺伝子 Ｂの同時発現により中和される。

更に一般的な用語で、本発明は、 ■）発現後に、線虫給餌構造の崩壊を生起する遺伝子Ａ（前記遺伝子は少なくと もＮＦＳ中で発現されるプロモーターＡの制御のもとに置かれている）、及び２ ）発現後に、遺伝子Ａの崩壊作用を中和する遺伝子Ｂ（前記遺伝子Ｂは植物細胞 の実質的に全部中で発現を誘導するが、ＮＦＳ中では有効に発現を誘導しないプ ロモーターＢの制御のもとに置かれている）の前記植物のゲノムへの組み込みを 行う工程、及び３）ＰＰＮに対する低下された感受性を示す植物を選択する工程 を含むことを特徴とするＰＰＮに対する低下された感受性を示す植物の生産方法 を提供する。

本発明を実施することの利点及び本発明を実施する多数の方法が、以下の発明の 詳細な説明から理解されるであろう。

本発明の目的のために、プロモーターＡ及びプロモーターＢの夫々につき絶対的 な要件がなく、即ち、プロモーターＢは発達の全ての段階でＮＦＳの外部のあら ゆる植物細胞で活性である必要がないが、崩壊遺伝子の発現が線虫給餌構造の外 部の領域で植物生存度を損なっているような程度にプロモーターＡが漏出活性を 示す給餌構造の外部で少なくともこれらの植物細胞中で活性である必要があるこ とを注目することは重要である。同様に、プロモーターＡは、植物発達のあらゆ る段階におけるその他の植物細胞中の活性がこれらの細胞中の遺伝子Ｂ産物の同 時の活性により相殺される限り、ＮＦＳにつき全く特異的である必要がない。プ ロモーターＢは、遺伝子Ｂの発現がＮＦＳ内の遺伝子Ａ産物の有害な作用を可能 にするのに充分に低い限り、ＮＦＳ内で成る程度の漏出活性を示すこともある。

ＮＦＳ内で活性であるが、できるだけ多くのその他の組織中で不活性である適当 なプロモーターＡは、本件出願に記載されたような技術を使用して同定し得る。

このようなプロモーターＡの同定及び単離後に、それは崩壊遺伝子Ａの前に融合 でき、そしてフェーズＩＩに記載されたような形質転換の第二ラウンドに使用し 得る。プロモーターＡ／遺伝子Ａ及びプロモーターＢ／遺伝子Ｂの両方につきト ランスジェニックの得られる植物系が、本明細書に記載されるようにしてＰＰＮ に対する低下された感受性につき分析し得る。

また、構成的プロモーターＢ／遺伝子Ｂ及びＮＦＳプロモーターＡ／遺伝子Ａ構 造物の両方は同じベクターに置くことができ、そして植物形質転換の単一ラウン ドに使用し得る。選択培地の再生体が成熟まで生育される。植物の次の世代が、 ＰＰＮに対する低下された感受性及び逸脱した成長及び発達の不在につき直接ス クリーニングし得る。

本発明の別の局面によれば、本発明の構成的プロモーターＢのＮＦＳ特異的抑制 が植物を除草剤または抗生物質に対し耐性にするのに使用でき、除草活性または 抗生物質活性を有する化合物に対し局所で、即ち、ＮＦＳ内で感受性である植物 を生じることができる。除草効果を中和できる好適な除草剤耐性遺伝子（これら は本発明のプロモーターＢに融合されるべきである）は、当業者により容易に選 択し得る。それらとして、以下に選択マーカーとして記載される除草剤耐性遺伝 子が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換細胞を選択またはスクリー ニングするのに使用し得る適当な選択マーカー遺伝子は、下記の非限定的リスト のいずれか一つから選択し得る：カナマイシンに対する抵抗性を与えるネオマイ シンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（欧州特許公告第１３１６２３号）、ハイ グロマイシン耐性遺伝子（欧州特許出願第１８６４２５号）、グルタチオン誘導 除草剤に対する抵抗性を与えるラット肝臓からのグルタチオン−８−トランスフ ェラーゼ遺伝子（欧州特許出願第２５６２２３号）、過剰発現後にグルタミンシ ンセターゼインヒビター、例えば、ホスフィノトリシンに対する抵抗性を与える グルタミンシンセターセチルトランスフエラーゼ遺伝子（欧州特許出願第２７５ ９５７号）、Ｎ−ホスホノメチルグリシンに対する寛容性を与える５−エノール レキメート−３−ホスフェートシンセターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子 、ビアラホスに対する抵抗性を与えるｂａｒ遺伝子（例えば、ＷＯ９１１０２０ ７１）　、等。マーカーの実際の選択は、それが特別な植物細胞と組み合わせて 機能的（即ち、選択的）である限り、重要ではない。

マーカー遺伝子及び関係する遺伝子は必ずしも連鎖されていなくてもよい。何と なれば、連鎖されていない遺伝子の同時形質転換（米国特許第４．３９９．２１ ６号）がまた植物形質転換における有効な方法であるからである。

また、本発明は、 （ａ）プロモーター活性を研究し、そして適当なプロモーターＡ及び／またはプ ロモーターＢを単離するためのスクリーニング可能な遺伝子（ｐＭＯＧ４５２） 、（ｂ）プロモーターＢの制御下の本発明の適当な中和剤遺伝子（ｐ［ル５８３ 、ｐＭＯＧ７１６、ｐＭＯＧ７１９）、 （Ｃ）それ自体でプロモーターを有しないで、形質転換の第二ラウンドに使用さ れて中和剤遺伝子を既に含む植物のゲノム中に内在する本発明の適当なプロモー ターＡの下流に組み込まれるようになる本発明の崩壊剤遺伝子（ｐＭＯ０５８９ ）　、または（ｄ）本発明のプロモーターＢの制御下で形質転換の第二ラウンド または中和剤遺伝子を含むベクターによる同時形質転換に使用し得る、本発明の 単離プロモーターＡの制御下にある本発明の崩壊剤遺伝子（ｐＭＯＧ６９９　、 ｐＭＯＧ７１７　、ｐ肛７１１、ｐ戦７１２　、ｐｌｉｌＯＧ７１３　、ｐ！Ｅ ７１４　、ｐＭＯＧ７１５）、（ｅ）本発明の崩壊剤遺伝子と中和遺伝子の適当 な組み合わせ（その崩壊剤遺伝子は無プロモーターであってもよ＜　（ｐ！１！ ０Ｇ７１Ｂ）、または単離プロモーターＡの下流にあってもよ＜　（ｐｌｆｆｉ ７１８；　ｐＭＯＧ７２０及び誘導体）、これらは形質転換の単一ラウンドで植 物を形質転換するのに使用でき、またそのうちの幾つかは植物寄生線虫に対する 低下された抵抗性を有する） を含む植物の安定な形質転換のための組換えＤＮＡを含むベクターを提供する。

本発明の状況内で、ＮＦＳ崩壊物質及び中和物質という用語は、ＤＮＡ　［その 遺伝子産物（タンパク質もしくはＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）がＮＦＳま たはその中のオルガネラの代謝及び／または機能及び／または生存度に有害であ り、かつそれに関して、同じ細胞中で崩壊物質として同時に発現される場合に、 崩壊物質の活性を抑制できる中和物質が知られている］によりコードされる一連 の選択された化合物を含む。崩壊物質と中和物質の好ましい組み合わせは、例え ば、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑ ｕｅｆａｃｉｅｎｓ）からのバーカーゼ／バースター（Ｈａｒｔｌｅｙ著、　１ ９８８．　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　２０２．９１３−９１５）　、制限エンド ヌクレアーる概説（Ｗｉｌｓｏｎ著、　１９９１．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ｓ、　１９．２５３９−２５６６）に記載されたような同様の組み合わせ、バク テリオシン及び相当する免疫タンパク質、例えば、コリシンＥ３／Ｅ、ｃｏｌｉ からの免疫タンパク質（Ｌａｕら著、　１９８５．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ｓ、　１２．８７３３−８７４５）またはプロモーターＢの制御下てアンチセン スＲＮＡの同時産生により中和し得るあらゆる崩壊物質コード遺伝子、例えば、 ジフテリア毒素路ＡをコードするＤＮＡ（Ｃｚａｋｏ　＆Ａｎ著、　１９９１． 　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９５．６８７−６９２）　、ＲＮアーゼ、例 えば、ＲＮアーゼＴｌ、リボヌクレアーゼまたはプロテアーゼ、植物毒性タンパ ク質をコードするｍＲＮＡに対するリホザイムである。

本発明の別の局面によれば、崩壊物質と中和物質の組み合わせは、細胞生存度に 必須であるタンパク質またはポリペプチド産生物をコードする内在性遺伝子に対 し抑制性の遺伝子と、中和遺伝子としての、内在性タンパク質またはポリペプチ ド産生物の機能を置換できるタンパク質またはポリペプチド産生物をコードする 遺伝子とを夫々含む。このような崩壊遺伝子は、（ａ）内在性ＲＮＡ転写産物に 対するリボザイムをコードする遺伝子、（ｂ）転写された場合に、細胞生存度、 遺伝子発現のアンチセンス抑制として知られている方法（欧州特許出願第２４０ ２０８号に開示されている）に必須である内在性遺伝子のＲＮＡ転写産物に相補 性または少なくとも部分相補性であるＲＮＡ転写産物を産生ずる遺伝子、または （Ｃ）転写された場合に、細胞生存度、同時抑制と称される遺伝子発現の抑制の 未だ知られていない方法（Ｎａｐｏｌｉ　Ｃ，ら著、　１９９０．　Ｔｈｅ　Ｐ ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　２．２７９−２８９に開示されている）に必須である内在 性遺伝子の転写産物と同一であり、または少なくとも非常に似ているＲＮＡ転写 産物を産生ずる遺伝子からなる群から選ばれてもよい。

本発明の好ましい実施態様によれば、細胞生存度に必須の内在性遺伝子の発現を 抑制するアンチセンス遺伝子が使用され、これらの遺伝子は前記アンチセンス遺 伝子の上流に融合されたプロモーターＡにより線虫給餌構造中で発現される。

生存内在性遺伝子に対し抑制性のアンチセンス遺伝子により生じた崩壊作用は本 発明のプロモーターＢの制御下の中和遺伝子Ｂの発現により中和され、前記遺伝 子Ｂは発現された場合に内在性生体遺伝子によりコードされたタンパク質または ポリペプチドと同一であり、または似ており、かつ宿主植物中で内在性遺伝子産 物の機能を置換し得るタンパク質またはポリペプチド産生物を産生ずる。本発明 の中和遺伝子によりコードされたＲＮＡ転写産物のヌクレオチド配列は、可能な 同時抑制作用を避けるために内在性生体遺伝子ＲＮＡ転写産物から分゛岐してい ることが好ましい。それ故、中和遺伝子は内在性生体遺伝子と実質的に同し機能 を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするが、分岐しているＲＮＡ転 写中間体を介してコードすることが好ましい；この記載に適合する中和遺伝子は 、異なる植物種、または異なる非植物種、例えば、酵母、動物真核生物または原 核生物から得ることができる遺伝子に関するデータベースをスクリーニングする ことにより適当に得ることができる。崩壊アンチセンストランスジーン及び中和 センストランスジーンによりコードされた転写産物のヌクレオチド配列同一性は ９０％未満、好ましくは８０％未満であることが好ましく、前記センストランス ジーンは崩壊遺伝子産物とはアミノ酸配列の点て同一ではないタンパク質または ポリペプチド遺伝子産物をコードすることが更に好ましく、この場合、中和トラ ンスジーンによりコードされた転写産物のヌクレオチド配列同一性は７５％未満 である。

アンチセンス崩壊剤遺伝子の標的遺伝子は、細胞生存度に必須である酵素（また 、ハウスキーピング酵素と称される）をコードする遺伝子から選ばれ、好ましく は単一コピー遺伝子として核コードされるべきであるが、小サイズ遺伝子ファミ リーがまた本発明の目的に適するであろう。更に、前記遺伝子のアンチセンス発 現の作用は、このような酵素により通常合成される酵素産生物のその他の細胞ま たはオルガネラから拡散またはトランスロケーションにより無効にされてはなら ない。膜トランスロケーション酵素をコードする遺伝子が選ばれることが好まし い。何となれば、これらはオルガネラ膜を横切る化学的勾配を樹立するのに関与 しているからである。アンチセンス発現によるこのようなタンパク質の抑制は、 定義によれば、これらのタンパク質が存在する膜中の物質の拡散により相殺し得 ない。トランスロケーションされる化合物は有機分子に限定されないが、無機の 性質のもの、例えば、Ｐ、■］、０］１または電子であってもよい。

膜トランスロケーション酵素は、寄生中に数を増大するオルガホラ中に存在する ことが好ましく、それにより、このようなオルガネラがＮＦＳを含む細胞中で有 する必須の役割を説明する。このようなオルガネラの特別な例は、ミトコンドリ ア、小胞体及びプラスモデスマタＱｌｕｓｓｅｙら著、　１９９２　Ｐｒｏｔｏ ｐｌａｓ＋ｎａ　１６７；５５−６５、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　＆Ｇｏｌｉｎｏｗ ｓｋｉ著、　１９９１　Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｏｔａｎｙ　６９：４４−５２）である 。標的酵素のリストが例として表１に示されるが、本発明はこの表に記載された 酵素に限定されない。更に詳細なリストが、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　 Ｐｌａｎｔｓ（Ｓｔｕｍｐｆ　＆Ｃｏｎｎ編集。

１９８８−１９９１．１−１６巻Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）またはＥｎｃ ｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏ■■ （Ｎｅｗ　５ｅｒｉｅｓ、　１９７６、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベ ルリン）のようなシリーズから集められる。

幾つかの場合のみにおいて、これらの酵素をコ、−ドする遺伝子が単離されてお り、それ故、遺伝子コピーの数は知られていないが、満足されるべき基準が本発 明において記載される。

酵素　経路／オルガネラ ＡＴＰシンターゼ　ミトコンドリア アデニンヌクレオチドトランスロケータ−ミトコンドリアホスフェートトランス ロケータ−ミトコンドリアトリカルボキシレートトランスロケータ−ミトコンド リアジカルボキシレートトランスロケータ−ミトコンドリア２−オキソ−グルタ レートトランスロケータ−ミドコントリアントクロムＣミトコンドリア ピルベートキナーゼ　解糖 グリセルアルデヒド−３Ｐ−デヒドロゲナーゼ　解糖ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ ４５０レダクダーゼ　脂質代謝脂肪酸シンターゼ複合体　脂質代謝 グリセロール−３Ｐ−アシルトランスフェラーゼ　脂質代謝ヒドロキシメチル− グルタリルＣｏＡレダクダーゼ　メバロン酸経路アミノアシルトランスフェラー ゼ　核酸代謝植物宿主中のアンチセンス作用を最大にするため、同種遺伝子の使 用が好ましい。同種は、植物宿主と同じ植物種から得られることを意味する。本 明細書の目的のために、異種は、異なる植物種または非植物種から得られること を意味する。

また、異種は、宿主遺伝子の少なくとも５％を異にするために核酸配列をコード するそれらのｌｌｌＲＮＡにおいて修飾された遺伝子の合成類縁体を含むべきで ある。ハウスキーピング遺伝子は一般に高度に保存されるので、その他の（植物 ）種からの異種プローブが、耐性にされるべき作物種からの相当する遺伝子を単 離するのに使用し得る。このような遺伝子単離は当業者の理解範囲内にあ頃本発 明の教示に鑑みて、無用の実験を必要としない。

可能な標的遺伝子間で分化し、好ましい候補を選択して線虫抵抗性を巧みに操作 するために、下記の操作が当業者により適用し得る：関係する遺伝子により、プ ロモーター配列がゲノムＤＮＡから単離でき、ＧＵＳ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら著 、　１９８７　ＥＭＢＯＪ、　６；３９０１−３９０７）の如きマーカー遺伝子 の前のクローニングに使用し得る。次い染され、全植物及び特に給餌構造の組織 化学的ＧＵＳ分析に使用し得る。使用されるプロモーター配列が線虫発達に必須 である遺伝子を最初に調節していた場合、それは植物の大部分中で活性であるべ きであるだけでなく　（それがハウスキーピング遺伝子を調節するため）、周囲 の組織中よりも給餌構造内で更に活性であり得る。一つのこのような例が、ヒド ロキシ−メチル−グルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）のプロモーターに 関してＣｒａｍｅｒ（１９９２，Ｐｒｏｃ、第３１年度会議Ａｍｅｒ、　Ｓａｃ 、　Ｎｅ−ｍａｔｏｌｏｇｉｓｔｓ、バンク−バー、カナダ）により発表されて いる。このプロモーターは感染根組織、特に線虫に給餌するのに関与する細胞中 で更に活性になる。ＩＩＭＧＲは、テルペン及びステロールの如き多数の化合物 につき主要な（律速）酵素である。ＰＰＮはそれら自体のステロールを合成でき ないので（Ｃｈｉ　ｔｗｏｏｄ　＆Ｌｕ５ｂｙ著。

１９９１、　Ｌｉｐｉｄｓ　２６：６１９−６２７）、それらは植物供給に完全 に依存し、こうして高１１ＭＧＲが寄生線虫に有利である。逆に、本発明の記載 におけるような、給餌細胞中のアンチセンス発現によるこの酵素のダウンレギュ レーンコンは、線虫の発達に関して厳しい作用を有するであろう。

特別な酵素に関して、多数の変異体が利用可能である場合、この酵素は過剰であ り、多重コピー遺伝子ファミリーとして存在しそうてあり、または別の経路が突 然変異酵素を閉じ込めるのに利用できそうである（Ｓけａｔｈｅｒｎ、　Ｊｏｎ ｅｓ　＆Ｂｒｏａｃｈ編Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ニーニーヨーク）。このような遺伝子は、本発明に記 載された方法にそれ程適しない。対照的に、レシピエンド細胞に通常致死性であ り、それ故、めったに利用できない酵素の突然変異は、このような遺伝子のアン チセンス・デレギュレーシコンがその細胞の適当な発達を抑制し、本発明に開示 されたようなＰＰＮに対する低下された感受性を巧みに操作する方法に使用し得 ることを示す。遺伝子崩壊方法は、遺伝子が細胞生存度に必須である（その場合 、崩壊イベントが致死性であろう）かどうかを試験するのに利用できる（Ｒｏｔ ｈｓｔｅｉｎ、　１９８３　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ、１０１；　２０２− ２１１）。異種遺伝子は、その後、プローブとして酵母遺伝子を含む標的作物か ら単離し得る。

本発明の適用は、例示のために示される植物種に限定されない。植物種の選択は 、農業において起こると推定されるＰＰＮ感染による損傷の量及び植物種の形質 転換の受け易さにより主として決定される。ＰＰＮにより農業の実施中に損傷さ れ、本発明によりＰＰＮに対しかなり小さい感受性にし得る植物属として、表２ に記載された属が挙げられるが、これらに限定されない。

るが、これらに限定されない。

好適なプロモーターＡは、ＮＦＳの代謝及び／または機能及び／または生存度に 有害であるのに充分なレベルで、ＮＦＳ内で下流の遺伝子の発現を誘導するプロ モーターと定義されるが、このプロモーターはＮＦＳの外部の組織中で不活性で あることが好ましいが、必ずしもそうである必要はない。少なくとも、それは、 遺伝子Ａによりコードされた崩壊物質の活性が遺伝子Ｂの産生物により充分に中 和し得ないようなレベルでＮＦＳの外部で活性であるべきではない。

好適なプロモーターＡは、好適なプロモーターＢの制御下で遺伝子Ｂを発現する 植物のスクリーニング［前記植物は、無プロモーター遺伝子Ａ構造物と、好まし くは第二選択マーカー（プロモーターＢ／遺伝子Ｂ構造物に関するものとは異な る）を有する組換えＤＮＡ構造物による形質転換の第二ラウンド後に再生されて いた］、そして前記植物をＰＰＮに対する低下された感受性につき分析すること により同定し得る。プロモーター活性を有する領域中の無プロモーター遺伝子Ａ 構造物のランダム組み込みは、形質転換された再生体のＰＰＮによる感染後に、 ＮＦＳの外部の組織中の遺伝子Ｂの中和作用の結果として全てのその他の植物部 分中の正常な表現型を維持しながら、ＮＦＳ中の充分な遺伝子へ発現による植物 の選択を可能にするであろう。本発明者らの実験により示されるように、原則と して、本発明に記載されたような性質を有するプロモーターＡを単離する必要が ない。何となれば、組み込み操作は比較的高い頻度で作用するからである。

Ｋｅｒｔｂｕｎｄｉｔら著、　１９９１．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　８８．５２１２−５２１６により異なる状況において説明されたよ うなこの方法は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の場合に特に 適する。何となれば、小さいゲノムは、そのゲノムの転写活性領域中で組み込み の比較的高い頻度を生じるからである。

また、好適なプロモーターＡは、線虫感染中にＮＦＳ内で増大されたレベルで発 現される遺伝子により単離し得る。このような遺伝子は、ジャガイモにつき実証 されたように（Ｇｕｒｒ　Ｓ、　Ｊ、ら著、　１９９１．　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇ ｅｎｅｔ、　２２６．３６１−３６６）、感染された根及び健全な根から抽出さ れたｍＲＮＡからつくられたｃＤＮＡクローンの判別スクリーニングにより単離 し得る。このようなプロモーターは詳細に記載されていなかったが、それらは １、主として（必ずしも排他的ではないが）感染された根組織中に存在するｍＲ ＮＡに関して研究し、 ２、このｍＲＮＡを単離し、 ３、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、４、このｃＤＮＡをプローブとして使 用してこの特異的ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む植物ゲノム中の領域を同定 し、 ５、この特異的ｍＲＮＡをコードし、プロモーター領域を含むＤＮＡからの上流 の（５′）配列を同定し、単離することにより、植物から公知の方法で選択し、 単離し得る。

ｍＲＮＡ単離に使用される感染された根は、例えば、同調感染（ｔｌａｎｗｎｏ ｎｄ−Ｋｏｓａｃｋら著。

１９８９　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｍ吐円ａｎｔ、Ｐａｔｈｏｌ、３５．４９５−５０ ６）またはＮＦＳが低倍率で目視できる植物からの給餌構造の直接の単離により ＮＦＳにつき濃縮されることが好ましい。

例えば、アラビドブラスの機中て発達する給餌構造は低倍率で見られ、最小の汚 染細胞で単離し易い（ＳｉＪｍｏｎｓら著、　１９９１．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ、　 ！、　２４５−２５４）。これは、好ましくはこれらのＲＮＡに相当する遺伝子 の分子濃縮操作（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら著、　１９９１　Ａｄｖ。

Ｍｏ１．Ｇｅｎ、ＰＩａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ、　１．２７ ６−２７９）及び上流のプロモーター要素のその後の単離を使用する単離を可能 にする。一旦同定されると、同定された遺伝子が工程４におけるようなプローブ として使用される場合に、同様の遺伝子がその他の植物種から単離し得る。次い で種特異的な上流の配列が、本発明において記載されたような同様のストラテジ ーに使用するためにこれらのその他の植物種から単離し得る。同定されたゲノム クローンの下流の配列が、植物形質転換に適した発現ベクター、例えば、ｐＭＯ Ｇ２２またはｐＭＯＧ２３中の挿入のために遺伝子Ａに融合し得る。

また、遺伝子Ａの発現に適したプロモーターはインターボシン・タッキング（ｉ ｎｔｅｒｐｏｓｏｎ　ｔａｇｇｉｎｇＸＴｏｐｐｉｎｇら著、　１９９１．　Ｄ ｅｖｅｌｏｐａ　１１２．１００９−１０１９）により単離し得る。この方法に おいて、幾つかの異なるトランスジェニック植物が、Ｔ−ｏｐｐｉｎｇら（１９ ９１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍ、　１１２．１００９−１０１９）により記載されたよ うな無プロモーターＧＵＳ構造物または実施例に記載されたような１１Ｍ０Ｇ４ ５２を有するアゲロバクチ界２充からのＴ−ＤＮＡによる形質転換後に再生され る。根こぶ線虫または包嚢線虫で感染させ、ＮＦＳを若干発達させた後に、根が ＧＵＳ活性につき染色し得る。Ｔ−ＤＮＡのランダム組み込みは、主としてＮＦ Ｓ中で活性であり、または、例えば、根特異的であるがＮＦＳ内で活性のままで あるプロモーター配列の同定を可能にする。プロモーター配列のこの型のインタ ーボシン・タッキングがアラビドプシス（Ｋｅｒｔ−ｂｕｎｄｉ　ｔら著、　１ ９９１．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８．５２１２−５ ２１６）及びタバコ（Ｔｏｐｐｉ獅■ ら著、　１９９１．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍ、　１１２．１００９−１０１９）で特 に良く樹立されている。ＧＵＳ発現の原因となる５゛上流配列が、逆ポリメラー ゼ連鎖反応（逆ＰＣＲ）　（Ｄｏｅｓら著、　１９９１゜Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、　１７．１５１−１５３）で単離し得る。適当な調節配列またはＮＦ Ｓ内で転写される遺伝子が一旦同定されると、それらはその他の植物種からの同 種配列の単離用のプローブとして使用し得る。順に、その他の種からのこれらの 配列が、植物形質転換に適したベクター中で挿入のための遺伝子Ａに融合し得る 。また、適当なプロモーターＡが、アグロバクテリウム・リゾゲネスプラスミド 　ｐＲｉＡ４（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら著、　１９８６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、　２６１．１０８−１２１）からのＴＬ−ＤＮＡの読み取り枠ＩＩ及び１２の 間のヌクレオチド１１２８６〜１２１３２から誘導されたｒｏｌｃプロモーター のトランケート変種からつくられる。同様に、根維管組織に対し特異性を示すが 、ＮＦ３発達中に抑制される、上記のインターボシン・タッキング技術により同 定されたプロモーターは、ｒｏｌ　Ｃプロモーターのトランケート変種で示され るようなダウンレギュレーションの原因であるプロモーターの部分を除去するこ とによりＮＦＳ抑制に対し非感受性にし得る。このような突然変異プロモーター 配列がその後プロモーターＡとして使用するのに適するようになる。

また、下記のプロモーター配列がプロモーターＡとして使用し得る。タバコ根特 異的プロモーターΔ０．３ＴｏｂＲＢ７（Ｙａｍａｍｏｔｏら著、　１９９１　 Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　３；３７１−３８２）のトランケート変種。ＴｏｂＲＢ ７プロモーターの完全長配列はＮＦＳ内で非常に活性であり、この活性は、その プロモーターのトランケートΔ０．３変種が使用される場合にＮＦＳに対し更に 特異的になる（Ｔａｙｌｏｒら著、　１９９２．　Ｐｒｏｃ、３１ｓｔ　Ａｎｎ 、Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ａ−ｍｅｒ、　Ｓｏｃ、　Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｉｓｔｓ、バ ンク−バー、カナダ）。

また、根維管組織またはその他の植物部分中で活性であり、そしてＮＦＳ中で特 異的に更に活性になるプロモーター（例えば、ヒドロキシ−メチル−グルタリル ＣｏＡレダクターゼプロモーター；　Ｃｒａｍｅｒ　１９９２．　Ｐｒｏｃ、３ １ｓｔ　Ａｎｎ、Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ａｍｅｒ、５−ｏｃ、　Ｎｅｍａｔｏｌｏｇ ｉｓｔｓ、バンク−バー、カナダ）は、ＮＦＳの外部の活性がプロモーターＢの 活性よりも決して高くない限り、プロモーターＡとして使用し得る。

適当なプロモーターＢは、遺伝子Ａが発現される実質的に全ての細胞中で発現を 誘導するプロモーター（但し、それが線虫給餌構造内で発現を誘導しないか、ま たは有効に誘導しないことを条件とする）と定義される。（“実質的に全ての細 胞”は、正常な植物成長及び／またはこのような植物の商用の利用に必要とされ る発達を得るために成育可能であるべきである細胞を少なくとも意味する。崩壊 作用か宿主植物の正確に全ての細胞中で中和されないが、それにもかかわらず、 成育可能であり、かつ商用の利用に適している植物の例示として、おしべ細胞中 で本発明の崩壊剤遺伝子を発現する植物がある；これは雄性不ねん植物を生じる ことができ、これは確かに幾つかの作物で商業上魅力的な特徴と見なされる）。

プロモーター配列は植物中で転写を誘導するのに活性な調節配列であり、植物ま たは植物ウィルスから得ることができ、または化学的に合成し得る。また、調節 配列として、Ｃａ１ｉｌＶ　の３５Ｓプロモーター（Ｋａｙら著、　１９８７． ５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．１２９９−１３０２）に見られるようなエンハンサ− 配列、及びｍＲＮＡ安定化配列、例えば、アルファルファ・モザイク・ウィルス ＲＮＡ４のリーダー配列（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅら著、　１９８０゜Ｎｕｃｌ、Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８．２２１３−２２２３）または同様に機能するあらゆる その他の配列が挙げられる。

また、全部または有効に全部の植物組織中の発現を与えるために、プロモーター Ｂ／遺伝子Ｂは、プロモーターＢまたはプロモーターＢ°のいずれもがＮＦＳ中 で発現を誘導しないことを条件として、プロモーターＢ／遺伝子Ｂに相補的な発 現パターンを有する第二のプロモーターＢ’　／遺伝子Ｂで補足し得る。また、 本明細書で特定されるような必要とされる発現パターンを与えるように組み合わ された異なるプロモーター（の部分）を含むハイブリッドプロモーターが本発明 の範囲内にある。

プロモーターＢはカリフラワー・モザイク・ウィルス３５Ｓプロモーターまたは その誘導体であることが好ましく、これは一般に植物組織中の強い構成的プロモ ーターであると考えられる（Ｏｄｅｌｌら著、　１９８５　Ｎａｔｕｒｅ　３１ ３．８１０−８１２）、ブロモ−７６）　；０ＲＦ１５の５“フランキング領域 （Ｓｌｉｇｈｔｏｍら著、　１９８６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−２６１゜１ ０８−１２１）である。プロモーターＢとしての使用につきその他の構成的プロ モーター、例えば、ツバリン・シンターゼプロモーター（Ｂｅｖａｎ著、　１９ ８４．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１２．８７１１−８７２１）またはゴ マノハグサ・モザイク・ウィルスプロモーター（ＥＰ−Ａ　４２６６４１）の適 性が、ＧＬＩＳの如きマーカー遺伝子への融合（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　１９８ ７゜Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　５．３８７−４０５） 　、植物へのこれらの構造物の移入及びＰＰＮによる感染後のこのようなトラン スジェニック植物の組織化学分析により試験し得る。

その他の調節配列、例えば、ターミネータ−配列及びポリアデニル化シグナルは 植物中でこのようなものとして機能するあらゆるこのような配列を含み、その− ゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３°フランキング領域（Ｂｅｖａｎ、　１９８４．　Ｎｕ ｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２゜８７１１−８７２１）である。

本発明の別の実施態様によれば、植物寄生線虫による作物への損傷を低減する方 法が提供され、この方法は、少なくとも植物の機中で発現されるが、線虫給餌構 造中で有効に発現されないプロモーターＢの制御下に置かれた除草剤抵抗性遺伝 子を含む植物を生育することを含み、ｌ）前記植物を生育する工程、 ２）前記植物の根を除草剤と接触させる工程を含む。本発明のこの実施態様に関 して、遺伝子Ｂの発現の要件は更に厳格であり、即ち、それはＮＦＳ以外の、除 草剤と接触される全ての細胞中で発現される必要がある。この目的のために、プ ロモーターＢは、プロモーターＢ°がまだＮＦＳ中で発現されないことを条件と して、第二の構成的プロモーターＢ’（遺伝子Ｂの別のコピーまたは同じコピー に連鎖されている）で補足し得る。本発明のこの実施態様に適した例として、除 草剤、例えば、スルホニル尿素と称される化合物の類（Ｍａｚｕｒ＆Ｆａｌｃｏ 、　１９８９．　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、ＰＩａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　４０．４４ １−４７０）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に使用された例（ ３５ｓプロモーターの制御下のハイグロマイシン抵抗性遺伝子並びにハイグロマ イシンを含む培地中のその後の生育及び感染）は、この方法の実現可能性を単に 実証するためである。農業用途のための除草剤の選択は、主として、除草剤抵抗 性遺伝子の利用可能性、除草剤のコスト及び環境上の効果、土壌注入または噴霧 用の配合に対するその適性、土壌中の移動度及びＮＦＳを含む細胞に到達し、影 響を及ぼす能力、植物組織中の移動度並びに土壌に噴霧された場合にＮＦＳ細胞 に到達する能力により決められる。

幾つかの線虫種は広い宿主範囲を示し、また多数の異なる植物種に寄生でき、ま た異なる植物種中の給餌構造が高度の類似性を示すので、ＣａＭＶ　３５Ｓまた はその他のプロモーター（これらは本発明に記載された構成的プロモーターの説 明に適合する）の如きプロモーターのダウンレギュレーション（即ち、活性の不 在）が本発明に示された例以外の広範囲の植物種中で生じるであろう。本発明は 、例示のために示される種に限定されない。植物種の選択は、主として、農業で 起こると概算されるＰＰＮ感染による損傷の量及び植物種の形質転換の受け易さ により決められる。ＰＰＮにより農業の活動中に損傷され、カリ本発明によりＰ ＰＮに対しがなり感受性ではないようにし得る植物属として、表２に記載された 属が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の背景で特定されたような線虫種として、宿主細胞を移動性外部寄生生物 （例えば、キシフィネマ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ）ｓｐｐ、　）から更に進化した 定住性内部寄生生物（例えば、ヘテロプリダニ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒｉｄａｅ） 　、メロイドギナ！（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎａｅ）またはロチレンチュリナエ（ Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌ　１ｎａｅ））までの範囲である特に適した給餌構造に 変更するあらゆる植物寄生線虫が挙げられる。寄生線虫のリストが表２に示され るが、本発明はこの表に記載された種に限定されない。更に詳細なリストがＺｕ ｃｋｅｒｍａｎら（編集、円ａｎｔ　Ｐａｒａｓｉｔｉｃ　Ｎｅ＋ｎａＬｏｄｅ ｓ、　Ｉ巻１９７１．−ニーヨーク。

＋３９−１６２頁）に示されている。

線虫侵入による作物の損傷と闘う本発明の方法は、病原体または非線虫有害生物 が外寄生の部位（例えば、菌類誘発吸器またはアブラムシ誘発虫こぶ（ｇａｌｌ ｉｎｇ）中）で植物プロモーターを局所でダウンレギュレーションする時はいつ も非線虫有害生物及び病原体に同様に適用できる。外寄生されていない植物部分 の全部または殆ど中で中和物質の産生を行って細胞崩壊物質（その産生は少なく とも外寄生の部位で行われる）を中和する原理は、病原体または有害生物の型ま たは種に独立である。

線虫種 一一−−−−−−−−−−−」！モ徒彎艶−−−−一−−メロイドギン 隨バプラ（ｈａｐｌａ）　広範囲 にインコグニタ（ｉｎｃｏｇｎｉ　ｔａ）　広範囲にエキシグア（ｅｘｉｇｕａ ）　コーヒー、ティー、トウガラシ、ントラス にインシカ（ｉｎｄｉｃａ）　シトラス隨ジャバニがｊａｖａｎｉｃａ）　広範 囲随アフリカーナ（ａｆｒｉｃａｎａ）　：Ｉ−ヒー隨グラミニス（ｇｒａｍｉ ｎｉｓ）　穀物、イネ科牧草類随グラミニコラ（ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）　米 隨アレナリア（ａｒｅｎａｒ　ｉａ）　広範囲ヘテロデラ（ｔ（ｅｔｅｒｏｄｅ ｒａ）＆グロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）Ｈ，メキシカーナ（ｍｅｘｉｃａｎ ａ）　リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙ−ｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃ ｕｌｅｎｔｕｍ）、ソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）ｓｐｐ。

（１，ブンクタタ（ｐｕｎｃｔａｔａ）　穀物、イネ科牧草類Ｇ、ｏストチェン シス（ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）　ソラナム・ツベロサム（ｔｕｂｅｒｏｓ ｕｍ）、ソラナムｓｐｐ　、　リコペルシコン・エスクレンタム Ｇ、バリダ（ｐａｌｌｉｄａ）　ソラナム・ツベロサムＧ、タバカム（ｔａｂａ ｃｕｍ）　＝−ｒチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａ−ｂａｃｕｍ） 、ニコチアナｓｐｐ。

Ｈ，カシ＋＝（ｃａｊａｎｉ）　カジャナス・カジャン（Ｃａｊａｎｕｓ　ｃａ ｊａｎ）ビグナ・ノネンシスｆｆｉｇｎａ　５ｉｎｅｎｓｉｓ）表２（続き） ■、グリシネス（ｇｌｙｃｉｎｅｓ）　グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　 ｍｘ）、グリシンｓｐｐ。

Ｈ，オリザｘ（ｏｒｙｚａｅ）　オリザ・サチバ（Ｏｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ） ■、スチャチイ（ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）　ベータ（口ｅｔａ）ｓｐｐ　、ブラシ カ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ｓｐｐ Ｈ，トリフォリイ（け１ｆｏｌｉｉ）　トリフオリラム（Ｔｒｉ　ｆｏｌ　ｉｕ ｍ）ｓｐｐ。

１１、アベナエ（ａｖｅｎａｅ）　穀物、イネ科牧草類Ｈ，力ｏタエ（ｃａｒｏ ｔａｅ）　’ｌつｈ７．−　力ｏり（Ｄａｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ）Ｈ，クルシ フエラエ（ｃｒｕｃｉ　ｆｅｒａｅ）　クルシフエラエＨ，ゴエチンギアナ（ｇ ｏｅｔｔｉｎｇｉａｎａ）　ピサム・サチバム（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ） 、ビシア（Ｖｉｃｉａ）ｓｐｌ）。

本発明の背景内で、植物根の表面で発達する成熟した雌の数の統計上有意な減少 が対照植物と比較して観察し得る場合に、植物はＰＰＮに対する低下された感受 性を示すと言われる。成熟ししている雌の数による感受性／抵抗性の分類は、包 嚢線虫及び根こぶ線虫の両方につき標準の慣例である（例えば、ＬａＭｏｎｄｉ ａ著。

１９９１、　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ　７５．４５３−４５４ＨＯｍｗｅｇ ａら著、　１９９０．　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、−８０，V４５− ７４８）。

本発明の植物寄生線虫に対する植物の感受性を低下する基本原理は、線虫給餌構 造の操作である。本発明のこの説明の目的のための線虫給餌構造の操作は、ＮＦ Ｓ形成の防止または遅延と、ＮＦＳの形成が進化した段階にある時の崩壊の両方 を含むべきである。

例えば、線虫侵入の最初の段階中のＮＦＳの形成を防止または遅延することが好 ましい。その目的のために、ＮＦＳ崩壊遺伝子Ａは、ＮＦＳ形成の開始時に発現 を誘導するプロモーターＡの制御下にある必要がある。

しかしながら、原則として、崩壊遺伝子ＡはＮＦＳ形成の更に進んだ段階で崩壊 遺伝子Ａの発現を誘導してＮＦＳを減少または崩壊させるプロモーターＡの制御 下にあることがまた許されるであろう。これらの二つの両極端のいずれもが感染 植物に侵入線虫に対する低下された感受性を与えるであろう。本発明の目的のた めに、“ＮＦＳの崩壊”という表現は、ＮＦＳ形成の遅延、一旦形成されたＮＦ Ｓ形成のの減少、または形成されているプロセス中のＮＦＳ形成の減少、並びに 形成されたＮＦＳの完全な崩壊を含むべきである。

植物寄生線虫に対する低下された感受性は、感染された植物根のＮＦＳの数の減 少、ＮＦＳ形成の増進の低下、または両方の効果の組み合わせの結果であり得る 。

本発明の線虫給餌構造は初期の給餌細胞を含むべきであり、これは侵入線虫の誘 発後に線虫給餌構造になる予矛の細胞または非常に制限された数の細胞を意味す べきである。

本発明のＮＦＳ崩壊効果はＮＦＳのみに対する不利な効果に限定されない。また 、直接の相互作用により線虫発達に対して不利な効果を更に有する崩壊効果が意 図されている。

幾つかの技術が、植物宿主への本発明に記載されたＤＮＡ配列を含む組換えＤＮ Ａの導入に利用できる。このような技術として、カルシウム／ポリエチレングリ コール方法、電気穿孔法及びマイクロインジェクションまたは（被覆）粒子衝撃 （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ著、　１９９０．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．８．５３５− ５４２）を使用する原形質体の形質転換が挙げられるが、これらに限定されない 。

これらの所謂直接ＤＮＡ形質転換方法の他に、ベクターを伴う形質転換系、例え ば、ウィルスベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウィルス（ＣａＭＶ ）からのウィルスベクター）及び細菌ベクター（例えば、属アグロバクテリウム からの細菌ベクター）　（Ｐｏ　Ｌ　ｒｙｋｕｓ著、　１９９０．　Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏ１．８．５３５−５４２）が広く利用できる。

選択及び／またはスクリーニング後に、形質転換された原形質体、細胞または植 物部分が、当業界で知られている方法（ｔＩｏｒｓｃｈら著、　１９８５．５ｃ ｉｅｎｃｅ　２２５．１２２９−１２３１）を使用して全植物に再生し得る。形 質転換技術及び／または再生技術の選択は本発明に重要ではない。

本発明の好ましい実施態様によれば、毒性遺伝子を含むヘルパープラスミドと、 移入される遺伝子構造物を含む適合性プラスミド、即ち、２成分ベクターとを含 １２０５１６号明細書に開示されている）が使用される。このベクターはζｃｏ ｌｉ及び１−Ｂｉｏｌ９（Ｂｅｖａｎ著、　１９８４．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　１２．８７１１−８７２１）から誘導される。この例に使用される ２成分ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの左側境界配列と右側境界配列の間に、カナマイ シン抵抗性をコードする同一のＮＰＴ１１遺伝子（Ｂｅｖａｎ著、　１９８４． 　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．８７１１−８７２１）と、必要とされる遺伝子構 造物中でクローン化する多重クローニング部位とを含む。

単子葉植物作物の形質転換及び再生は標準操作ではない。しかしながら、最近の 科学の進歩は、原則として、単子葉植物が形質転換を受け易いこと、及びねん性 トランスジェニック植物が形質転換細胞から再生し得ることを示す。これらの作 物に関する再現性の組織培養系の開発は、植物細胞への遺伝子物質の導入に強力 な方法と一緒になって、形質転換を促進した。現在、単子葉植物の形質転換に好 ましい方法は外植体または懸濁細胞のマイクロプロジエクティル（ｍｉｃｒｏｐ ｒｏｊｅ−ｃｔｉｌｅ）衝撃、及び直接ＤＮＡ取り込みまたは電気穿孔法（Ｓｈ ｉ罠前ｔｏら著、　１９８９゜Ｎａｔｕｒｅ　３３８．２７４−２７６）である 。トランスジェニックトウモロコシ植物が、微粒子衝撃（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｕ ａ　１９９０．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、　２．６０３−６１８）によりストレ プトミセ７．−ハイグロスコピクス（ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓ ｃｏｐｉｃｕｓ）バー遺伝子［これはホスフィノトリンンアセチルトランスフエ ラーゼ（除草剤ホスフィノトリシンを失活する酵素）をコードする］をトウモロ コシ懸濁培養物の胚形成細胞に導入することにより得られた。その他の単子葉植 物作物、例えば、小麦及び大麦のこ粉原形質体への遺伝子物質の導入が報告され ていた（Ｌｅｅ著、　１９８９．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１３．２ ｌ−３０）。小麦植物が胚形成懸濁培養物の樹立に関して老化した緻密かつ結節 性の胚形成カルス組織のみの選択により胚形成懸濁培養から再生された（Ｖａｓ 　ｉ　Ｉ著、　１９９０Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．８．４２９−４３４）。これ らの作物に関する形質転換系との組み合わせは単子葉植物への本発明の適用を可 能にする。また、これらの方法は双子葉植物の形質転換及び再生に適用し得る。

以下の実施例は説明の目的のためのみに示されるものであり、本発明の範囲を限 定することを目的とするものではない。実施例において特にことわらない限り、 組換えＤＮＡの全ての操作方法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ第２編、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９９０））に記 載された標準操作を使用することにより行った。

発現ベクターｐＭＯＧ１８の構築に関する詳細な記載がＰｅｎらの（１９９１） 欧州特許出願第０４４９３７５号明細書に示されている。これは、二重エンハン サ−配列、アルファルファ・モザイク・ウィルス（ＡＩＭＶ）からのＲＮＡ４の リーダー配列、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（プラスミドｐＲＡＪ ２７５に由来する；（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ著。

１９８７、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　５．３８７− ４０５））、続いてツバリン・シンターゼ（ｎｏｓ）転写ターミネータ−を含む カリフラワー・モザイク・ウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓントとして存在する。

ｂ）ｐＭＯＧ１８０の構築 発現ベクターｐＭＯＧＩ８ｏは、ＧＵＳをコードする遺伝子が除去されているｐ ＭＯＧ１８の誘導体である。その他の遺伝子がＡＩＭＶ　ＲＮＡ４リーダーとＢ ａｍＩＩＩフラグメントとしての３’　ｎｏｓターミネータ−の間に挿入し得る 。

この目的のために、３５Ｓプロモーター及びＡＩＭＶ　ＲＮＡ４リーダー配列を 含むＩ）ＭＯＧらの制限部位の間でっなく。これらのプロモーター配列中のＰＣ Ｒ誘発ランうム突Ｂａｍ　ＩＩＩフラグメントを、配列決定により突然変異につ き調べる。得られる発現ベクターがプラスミドｐｎ１８０である。

ｃ）ｐｌｉｌＯＧ７０７の構築 右側境界Ｔ−ＤＮＡ配列、多重クローニング部位及び適当なフラグメントに異な るプロモーター／遺伝子の組み合わせをクローン化する目的のためのターミネー タ−を含むクローニングベクターｐＭＯＧ７０７を構築する。このベクターを下 記の方法で構築する。クローニングベクターｐＭＴＬ２６　（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ら著、　１９８８　Ｇｅｎｅ　６Ｂ、　１３９−１４９）中で、Ｘｈｏ　１部位 をＸｈｏ　ｌ消化により除去し、クレノーポリメラーゼで平滑断端し、続いて再 連結してｐ■Ｌ２６／２を得る。この修飾ｐＭＴＬベクターを使用して、多重ク ローニング部位及び右側境界配列を含むｐＭＯＧ２３からのＥｃｏ　Ｒ１−Ｂｇ ｌ　ＩＩフラグメントをクローン化してｐＭＯＧ５８４ｂｉｓを得る。そのポリ リンカー配列を、合成リンカ−をＢａｍ８１部位とＸｈｏ　１部位の間に挿入し 、こうして付加的なＮｃｏ　１部位、沖謬１部位及びＸｂａ　１部位をつくるこ とにより延長する。続いて、ツバリン・シンターゼ転写ターミネータ−をプラス ミドＲＯＫＩ　（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅら著、　１９８６．　Ｎａｔｕｒｅ匣旧− Ｅｃｏ　Ｒ１フラグメントとして延長ｐＭＯＧ５８４ｂｉｓにクローン化してプ ラスミドｐＭＯＧ７０７を得る（図２）。

クトピンＴｉ−プラスミドｐＴｉＢ６から誘導した。ＭＯＧＩＯＩは、非発癌性 Ｔｉプラスミド（これから全Ｔ領域が欠失され、トランスポゾンＴｎ　１８３１ （ｌ（ｏｏｙｋａａｓら著、　１９８０Ｐｌａｓｍｉｄ　４．６４−７５）から の細菌スペクチノマイシン抵抗性マーカーにより置換されていた）を有するアグ ロバクテリウム・ツメファシェンス株である。

Ｔｉ−プラスミドｐＴｉＢ６は二つの隣接Ｔ領域、即ち、ＴＬ（Ｔ−左側）及び ＴＲ（Ｔ−右側）を含む。ＴＬ領領域びＴＲ領域を欠いている誘導体を得るため に、本発明者らは中間体ベクターｐＭＯＧ５７９を構築した。プラスミドｐＭＯ Ｇ５７９はｐＢＲ３２２誘導体であり、これはＴ領域の外部で左及び右に配置さ れている二つのＴｉ−プラスミドフラグメントを含む（図３）。その二つのフラ グメント（濃い陰で示されている）を、スペクチノマイシン抵抗性マーカー（図 ４）を有するトタンスボゾンＴｎ　１８３１（Ｈｏｏ−ｙｋａａｓら著、　１９ ８０　ＰｌａｓＩＩｔｄ　４，６４−７５）からの２．５ｋｂのＢａｍ　Ｈｌ− Ｈｉｎｄｌ１１フラグメントによりｐＭＯＧ５７９　（図４）中で分離する。そ のプラスミドを、ｐＲＫ２０１３をヘルパーとして含むＨＢＩＱＩを使用して、 Ｅ、ｃｏｌｉから三親交配により、アグロバクテリウム・ツメファシェンス株Ｌ ＢＡ　１０１０　［Ｃ５９−Ｃ９（ｐＴｉＢ６）＝ｐＴｉＢ６が導入された治療 Ｃ５８株（Ｋｏｅｋｍａｎら著、　１９８２．　Ｐｌａｓｍｉｄ　７．１１９− １３２）　］に導入した。トランスコンシュガント（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａ ｎｔｓ）をリファムビシン（２０ｍｇ／ｌ）及びスペクチノマイシン（２５＋ｎ ｇ／Ｉ）に対する抵抗性につき選択した。ｐＭＯＧ５７９とｐＴｉＢ６の間の二 重組換えはカルベニシリン抵抗性　（ｐＢＲ３２２マーカー）の損失及び全Ｔ領 域の欠失を生じた。カルベニシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含む培地に塗布された ５０００のスペクチノマイシン耐性トランスコンシュガントのうち、二つが感受 性であることがわかった。サザン分析は、二重交さイベントが全Ｔ領域（図示さ れていない）を欠失したことを示した。得られる株をＭＯＧｌＯｌと称した。こ の株及びその構築は株ＧＶ２２６０（Ｄｅｂｌａｅｒｅら著、　１９８５．　Ｎ ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３．４７７７−４７８８）に似ている。

この実施例において、２成分ベクターｐＭＯＧ２３　（１９９０年１月２９日に セントラル・ビューロウ・ポールＱシメルーカルチャーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌ　 ［］ｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌ−ｃｕｌ　Ｌｕｒｅｓ）に受理番 号ＣＢ３１０２．９０として寄託されたＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株ＤＨ５アルフ ァ中）の構築を記載する。

２成分ベクターｐＭＯＧ２３はベクターＢｉｎ＋９　（Ｂｅｖａｎ著、　１９８ ４．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２゜８７１１−８７２１）の誘導体 である。ｐＭＯＧ２３を得るために、ベクターＢ１ｎ１９を、分子生物学の当業 者に良く知られている技術を使用して、本発明に必須ではない方法で変化させる 。

第一に、左側境界（ＬＢ）及び右側境界（ＲＢ）の位置を、ネオマイシンホスホ トランスフェラーゼ遺伝子１１（ＮＰＴＩ＋遺伝子）を基準として切り換える。

第二に、ＮＦｒ１１遺伝子の配向を逆にして、ＬＢの方向に転写を得る。最後に 、Ｂ１ｎ１９のポリリンカＳｍａ　Ｉ　、Ｂａｍ　Ｈｌ、Ｘｂａ　Ｉ　、　Ｓａ ｃ　Ｉ　、　Ｘｈｏ　Ｉ及びＨｉｎｄｌｌｌ　（図５）。

ｂ）ｐｌＡＯＧ２２の構築 ２成分ベクターｐＭＯＧ２２は、ＮＰＴ１１遺伝子が、分子生物学の当業者に良 く知られている技術を使用して、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ＨＰＴ、プラ スミドＰＬＧ９０゜Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎら著、　１９８５．　Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　５．２９９−３０２）から採取されたハイグロマイシ ン・ホスホトランスフェラーゼ）により置換されているｐｌｆｆ；２３の誘導体 である。ｐＭＯＧ２２構築はＣｏｒｎｅｌ　１ｓｓｅｎら（１９９１，欧州特許 出願箱０４４０３０４　Ａ１号明細書）に詳細に記載されており、１９９０年１ 月２９日にセントラル・ビューロウ・ポーｃ）ｐＭＯＧ２５＆ｐＭＯＧ２８　； 　３５Ｓプロモーター及びＧＵＳ遺伝子を含む２成分ベクターの構築 ｐＭＯＧ１８からの怪ｏ　Ｒ１／　Ｈｉｎｄｌｌ＋フラグメントをｐＭＯＧ２２ 及びｐＭＯＧ２３のポリリンカーにクローン化して、夫々、２成分プラスミドｐ ＭＯＧ２５　（図７）及びｐＭＯＧ２８を得る。

ｄ）ｐＭＯＧ４５２　；無プロモーターＧＵＳ遺伝子を含む２成分ベクターの構 築３’　ｎｏｓターミネータ−配列に融合されているが、５°調節プロモーター 配列を含まないＧＵＳをコードする遺伝子を、ｐＢＩＩｏ１プラスミドＣＪｅｆ ｆｅｒｓｏｎ著、　１９８７．　Ｐｌａ−ｎｔ　Ｍｏ１．口ｉｏ１．Ｒｅｐｏｒ ｔｅｒ　５．３８７−４０５）からのＥｃｏ　Ｒ１−Ｂａｍ　Ｈｌフラグメント として２成分ベクターｐＭＯＧ２３の多重クローニング部位にクローン化して２ 成分プラスミドｐＭＯＧ４５２　（図８）を得る。

ｅ）ｐＭＯＧ６３０　：　ｒｏｌＤプロモーター及びＣＵＳ遺伝子を含む２成分 ベクターの構築３７３ｂ１１の５°フランキング領域を、通常のクローニング技 術を使用してプラスミドｐＭＯＧ４５２のＧＵＳ遺伝子の前にクローン化して、 ２成分プラスミドｐＭＯＧ６３０（図８）る。

アグロバクテリウム・リゾゲネスプラスミドｐＲｉＡ４　（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら 著、　１９８６．　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｕ　２６１．１０Ｂ−１２１）からのＴＬ−ＤＮＡの読み取り 枠１１と１２の間のヌクレオチド幅されるような方法で標準ＰＣＲ技術を使用し てプラスミドｐＲｉＡ４から単離する。

次いで、この増幅フラグメントをプラスミドｐＭＯＧ４５２のＧＵＳ遺伝子に融 合して２ｇ）ｐＭＯＧ５８３．３５Ｓプロモーター及びバースター遺伝子を含む ２成分ベクターの構！ バチルス・アミロリケファシエンスからのバースター遺伝子をプラスミドｐＶｒ ３１６０１ａｒｔｌｅｙ著、　１９８８．　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　２０２． ９１３−９１５）から誘導する。プラスミドｐｌＩｒｒ３１６をＨｉｎｄｌｌｌ で線状にし、続いて合成アダプターの存在下で連結し、こうしてｌ１ｉｎｄｌｌ ｌ制限部位をＢａｍＨＩ制限部位で置換する。次いで、バースター遺伝子をｔ（ ｉｎｄｌｌ＋フラグメントとしてクローン化して、プラスミドｐＭＯ０５８３（ 図９）を得る。

ｈ）ｐＭＯＧ？＋６　：　ｒｏｌＤプロモーター及びバースター遺伝子を含む２ 成分ベクターの構バチルス・アミロリケファシエンスからのバースター遺伝子を プラスミドｌ）ＭＴ３１６　（Ｈａｒｔｌｅｙ著、　１９８８．　Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、　２０２．９１３−９１５）から誘導する。プラスミドｐＭＴ３１６ を１ｌｉｎｄｌｌｌで線状にし、続いて合成アダプターの存在下で連結し、こう してｔ（ｉｎｄｌｌ＋制限部位をＢａｍ　ＩＩ＋制限部位で置換する。次いで、 バースター遺伝子をＢａｍ旧フラグメントとして単離し、ｐ）ｆｆ＋７ｏ７の１ ｅａｎ　８１部位にツバリンシンターゼターミネータ−の前にクローン化する。

次いで、プラスミドｐＲｉＡ４　（Ｓｌｉｇｈｔｏ＋ｎら著、　１９８６．　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１．１０８−１２１中の０ＲＦ１５）のｒｏｔ　 Ｄの３７３ｂｐの５′フランキング領域をバースター遺伝子の前にクローン化し 、その後、全カセットをｐ臘℃２２に移入し、２成分ベクター９Ｍ０Ｇ７Ｌ６　 （図１０）を得る。

ｉ）ｐＭＯ０７１８、夫々、３５Ｓ及びｒｏｌＤプロモーターにより調節された 二つのバースター遺伝子を含む２成分ベクターの構築 夫々、実施例１１１ｇ＆ｈに記載された３５３−バースターフラグメント及び「 ０１Ｄ−バースターフラグメントをまた使用して、夫々、型Ｂの異なるプロモー ターにより調節され、両方とも、植物細胞中のターミネータ−官能基に融合され た二つのバースター遺伝子を含む２成分ベクターを構築することができる。この 目的のために、プロモーター−バースターークーミネーターフラグメントをｐＨ ４０Ｇ２３のタンデムクローニングのために当業者により使用して、２成分ベク ターｐ肛７１Ｂ　（図１１）を得ることができる。

ｊ）ｐＭＯ０５８９、無プロモーターバーナーゼ遺伝子を含む２成分ベクターの 構築ｐＭＯＧ２３から、多重クローニング部位及び右側境界配列を含むμｓｏ　 Ｒ１−Ｂｇｌ　ＩＩｌフラグメント単離し、ｐＭＴＬ２６／２　（実施例１ｃ） にクローン化してｐＭＯ０５８４を得る。

ン化して、ｐＭＯ０５８５を得る。

細菌中のバースー遺伝子の潜在的な漏出活性を解消するために、細菌プロモータ ーの制御下のバースターをコードする遺伝子を、２成分ベクターの場合にはＴ− ＤＮへの外部でベクターにクローン化する。この目的のために、プラスミドｐＭ Ｔ３１６　（ｔ（ａｒｔｌｅｙ著、　１９８８．　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　２ ０２．９１３−９１５）をＥｃｏ　Ｒ１で線状にし、Ｅｃ。

Ｒ１部位が回収されず、かつＨｉｎｄｌ１１部位が導入されるように合成アダプ ターをつなぐ。次いで、この修飾フラグメントをベクターｐＨｒｒＬ２４　（Ｃ ｈａｍｂｅｒｓら著、　１９８８゜Ｇｅｎｅ　６８．１３９−１４９）に財回Ｉ １１フラグメントとしてクローン化し、こうしてｐ庸℃５８６を生じる。ｔａｃ プロモーター領域に存在するＸ１１０１部位及びＢａｍ８１部位を、の却厖１部 位でプラスミドｐＭＯＧ５８５に挿入して、プラスミドｐＭＯＧ５８７を得る（ 図１２）。

バチルス・アミロリケファンエラスからのバーナーゼ遺伝子をプラスミドｌ）Ｍ Ｔ４１６　（Ｈａｒｔｌｅｙ著、　１９８８．　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　２０ ２．９１３−９１５）から誘導する。成熟バーナーゼをコードする遺伝子を、バ ーナーゼの５°部位でＸｈｏ　Ｉ制限部位及びＡＴＧを導入し、３°部位でＢａ ｍ　８１を導入するプライマー組を用いるＰＣＲ技術を使用して増幅する。この フラグメントを配列決定してバーナーゼの正確なコード配列につき調べ、Ｂａｍ 　Ｈｌ及びＸｈｏ　１て線状にされたＩＩＭＯＧ５８７につないてｐＭＯＧ５８ ８を得る。ｐｌ＋１ＯＧ２３及びｐＭＯＧ５８８の両方をＥｃｏ　Ｒ１及びＢｇ ｌｌｌで消化し、得られるフラグメントをつなぎ、Ｂｇｌ　Ｉ＋で再度線状にす る。正確なサイズのフラグメントをＢｇｌ　１１で消化したｐＭＯＧ２３につな いで２成分ベクターｐＭＯＧ５８９を生成する（図１３）。

また、細菌中のバーナーゼ遺伝子の潜在的な漏出活性を解消するために、イント ロンを、以下に記載されたようにしてバーナーゼコード配列に導入し得る。バー ナーゼ遺伝子を、下記のプライマー組み合わせ；５“プライマｍ：５’　ＣＴＧ ＣＴＣＧＡＧＣＣＴＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧｍＧ　３′（配 列番号：３）３′プライマー：　５’　ＣＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡ ＡＧＴＧ　３’　（配列番号・４）を使用し、それにより遺伝子の５′末端でＸ ｈｏ　１部位及びＡｖｒ１１部位の両方を導入し、３′末端でＢａｍ　Ｉｌｌを 導入するＰＣＲによりプラスミドｐＭＴ４１６から単離する。このフラグメント をＸｈｏ　ｌ／　Ｂａｍ　ＨｌフラグメントとしてｐＭＯＧ７０７にサブクロー ン化する。ソラナム・ツベロサムからの５Ｔ−ＬＳＩの第二のイントロンをプラ スミドｐ３５３ＧＵＳ　ＩＮＴ　（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔら著、　１９９０．　 Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　２２０：２４５−２５０）に対するＰＣＲにより 単離し、それによりイントロンの両端でＡｖｒ１１部位を導入する。このイント ロンをＡｖｒｌｌフラグメントとしてバーナーゼ遺伝子に挿入する。そのイント ロンを含むバーナーゼ遺伝子を、下記のプライマー；５゛プライマー・５°ＣＴ ＴＡＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧｍＣＴＧＣ３’（配列番号＝５） ３゛プライマー：５°ＣＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＡＧＴＧ　３’　 （配列番号：６）を使用し、それにより５Ｔ−ＬＳＩイントロン配列の上流の開 始コドンを導入するＰＣＨし、Ｘｈｏ　ｌで部分切断しくこうして、Ｘｂａ　’ 　１部位がポリリンカー配列中に保持さサイズのフラグメントをＢｇｌ　１１で 消化した１圓２３につないで２成分ベクターｐ躾５８９１を生成する（図１３） 。“ｐＭＯＧ−−−４”表記法は、バースー遺伝子中のイントロンの存在を示す ために本件出願中に使用される。

この実施例において２成分ベクターの構築のためにＴ−ＤＮＡの境界の外部にイ ントロンまたはバースター遺伝子を含むバーナーゼを使用することの選択は、本 発明につき重要ではない。

ｋ）ｐ寵５９１ｉ　；無プロモーターバーナーゼ遺伝子の前に多重クローニング 部位を含む２成分ベクターの構築 この構造物を使用して実施例Ｘｌｌで同定された成る範囲の異なる調節配列を挿 入する。この目的のために、５′バ一ナーゼ配列とＴ−ＤＮＡの右側境界の間の ｐＭＯ０５８８１の合成多重クローニング部位を延長することができる。得られ るプラスミド９Ｍ０Ｇ５９０　ｉを２成分ベクターｐＭＯＧ５９１ｉの構築のた めに使用する（図１３）。次いでこのベクターを使用して、バーナーゼをコード する遺伝子による転写融合でプロモーターＡ調節配列を導入する。

１）ｐＭＯＧ７１７ｉ　；　トラフケ−１−ｒｏｌｃプロモーター及びバーナー ゼ遺伝子を含む２成分ベクターの構築 ｐＲｉＡ４　（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら著、　１９８６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、　２６１．１０８−１２１）から単離でき、５°末端で生じたＸｂａ　１部位 及び３′末端で生じたＮｃｏ　１部位で増幅する。このフラグメントをｐ）ＪＯ Ｇ５８８ｉにクローン化してトランケーｔ−ｒｏｌｃプロモーターとバーナーゼ 遺伝子の間に転写融合をもたらす。このプラスミドを２成分ベクターｐＭＯＧ７ １７ｉの構築のために使用する（図１３）。

ｍ）ｐＭＯＧ（ｉ９９　；　トランケートプロモーター（Δ０．３ＴｏｂＲＢ７ −５Ａ）及びバーナーゼ遺伝子を含む２成分ベクターの構築 Δ０．３ＴｏｂＲＢ７−５Ａプロモ一ター配列（Ｙａｍａｍｏｔｏら著、　１９ ９１．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　３：　３７１−３８２）を、タバコから単離さ れたゲノムＤＮＡに対する２工程ＰＣＨにより単離した。

第−ＰＣＲ反応において、ＴｏｂＲＢ７−５Ａ遺伝子の部分を、下記のプライマ ーを使用して単離する。

５′プライマー：　５’　ＣＴＣＣＡＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣ３’ 　（配列番号ニア）３“プライマー・５°ＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＡＧＴＴ ＣＴＣ３°（配列番号＝８）得られるＰＣＲ産生物を使用して、下記のプライマ ーを使用してΔ０．３ＴｏｂＲＢ７−５八フラグメントを単離する。

５°プライマー＝５°ＣＴＴＧＭＴｒＣＴＡＧＡＴＭＧＣＴＴＡＴＣＴＭＡＣ３ ’（配列番号・９） ３゛プライマー・５°ＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴｒＡＧＩＴＣＴＣ３’　（配列 番号：　１０）得られるＰＣＲ産生物をゲルから精製し、平滑断端し、ｐＬＩｃ ９　ｆｆ１ｅｉｒａ＆Ｍｅｓｓｉｎｇ著１９８２　Ｇｅｎｅ　１９；　２５９− ２６８）にサブクローン化し、次いでこれをＳ隠１で線状にする。

得られるプラスミドをＸｂａ　Ｉで消化し、Ｎｅｏ　Ｉて部分消化して正確なΔ ０．３ＴｏｂＲＢ７−５Ａフラグメントを得、これをｐＭＯ０５８８ｉにサブク ローン化することができる。このプラスミドを２成分ベクターｐＭＯＧ６９９ｉ の構築のために使用する（図１３）。

ｎ）ｐＭＯＧ７１１　；　トランケートプロモーター（八〇、　３ＴｏｂＲＢ７ −５Ａ）及びアンチセンスＮＡＤＰ）Ｉ−ＣｙｔＰ４５０レダクターゼＡＴＲＩ 遺伝子を含む２成分ベクターの構築ＮＡＤＰＩＩ−ントクｏ　ムＰ４５０　Ｌ／ ダクターゼＡＴＲＩ　（ＥＭＢＬ受理番号Ｘ６６０１６）　（７）クローンをこ の種からのｍＲＮＡからつくられたｃＤＮＡに対しＰＣＲ技術を使用してアラビ ドプシス・クリアーナｖａｒ、ランズベルグ・エレクタ（Ｌａ口ｄ５ｂｅｒｇ　 ｅｒｅｃｔａ）から単離する。プライマー組５°ＧＧＣＧＧＡＴＣＧＧ八ＧＣＧ ＧＧ［、ＡＧＣＴＧＡＡＧ　３°（配列番号＝１１）及び５’　ＧＡＴＡＣＣＡ ＴＧＧＡＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧ　３°　（配列番号＝１２）を使用 して関係する配列ゼターミネーターの前にｐＭＯＧ７０７にクローン化する。次 いで、実施例１１１ｍに記載されたようにして単離されたトランケートプロモー ター配列Δ０．３ＴｏｂＲＢ７−５Ａ　（Ｙ−る消化後に２成分ベクターｐＭＯ Ｇ２３にクローン化して、２成分ベクターｐＭＯＧ７１１を得る（図１４）。

ｏ）ｐＭＯＧ７１２　；　トランケートプロモーター（Δ０．３ＴｏｂＲＢ７− ５Ａ）及びアンチセンスＮＡＩ）ＰＨ−ＣｙｔＰ４５０レダクターゼ八ＴＲ２遺 伝子を含む２成分ベクターの構築ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０　Ｌ／ダクタ ーゼＡＴＲ２（ＥＭＢＬ受理番号Ｘ６６０１７）　ツクローンをこの種からのｍ ＲＮＡからつくられたｃＤＮＡに対しＰＣＲ技術を使用してアラビドプシス・ク リアーナｖａｒ、ランズベルグ・エレクタから単離する。プライマー組５’　Ｇ ＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣＧＴＧＴＣＧＡＧ　３’　（配列番号＝ １３）及び５’　ＧＧＣ’ｌ″ｒＣＣＡＴＧＧｍＣＧＴＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＣ ３°（配列番号＝１４）を増幅ツタめに使用する。

ンターゼターミネーターの前にｐＭＯＧ７０７にクローン化する。次いで、実施 例１１１ｍに記載されたようにして単離されたトランケートプロモーター配列Δ ０．３ＴｏｂＲロア一ターｐＭＯＧ２３にクローン化して、２成分ベクターｐＭ ＯＧ７１２を得る（図１４）。

ｐ）ｐＭＯＧ７１３　；　）ランケートプロモーター（Δ０．３ＴｏｂＲＢ７− ５Ａ）及びアンチセンスグリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラ ーゼ遺伝子を含む２成分ベクターの構築 グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼＡＳＴＩ　（ＥＭＢ Ｌ受理番号ＤＯＯ６７３）のクローンをこの種からのｍＲＮＡからつくられたｃ ＤＮＡに対しＰＣＲ技術を使用してアラビドプシス・クリアーナから単離する。

プライマー組５’　ＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧｍＡＴＣＣＡＣＴＣＧ　３’　 （配列番号：１５）及び５°ＧＡＧＴＡｍＴＣＣＡＴＧＧＡＴｒＧＴＧｍＧＴＧ 　３°　（配列番号＝１６）を増幅ノタメニ使用する。

これはＡＴＳ　ｌクローンに側面を接するＳｍａ　Ｉ　、Ｂａｍ　Ｈｌ及びト凱 １部位の両方を導入する。続いて、ＰＣＲフラグメントをＳｍ　Ｉ−Ｎｃｏ　ｌ で消化し、そのままでｐＭＯＧ４４５にサブクローン化する。（ｐＭＯＧ４４５ は、多重クローニング部位中のオリゴアダプターの挿入により、Ｅｃｏ　Ｒ１と Ｓｓｔ　Ｉの間に特別な制限部位Ｃ１ａ　Ｉ　、Ｎｅｏ　Ｉ及びＢｇｌ　１１を 含むｐｕｃｔｓ誘導体である。）続いて、ＡＴＳ　１クローンを性勉１消化及び 部分Ｂａｍ　ＩＩＩ消化消化車離し、アンチセンスをツバリンシンターゼターミ ネータ−の前にｐＭＯＧ７０７にサブクローン化する。次いで、実施例１１１ｍ に記載されたようにして単離されたトランケートプロモーター配列Δ０．３Ｔｏ ｂＲＢ７−５Ａ　（Ｙａｍａｍｏｔｏら著１９９１゜Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ＋　３ ；　３７１−３８２）をＸｂａ　１−Ｎｅｏ　Ｉフラグメントとして挿入する。

次いで全配列を、Ｅｃｏ　Ｒ１及び残りの特異な制限酵素の一つによる消化後に ２成分ベクターｐ躾２３にクローン化して、２成分ベクターｐＭＯＧ７１３を得 る（図１４）。

ｑ）ｐＭＯＧ７１４　；　トランケートプロモーター（Δ０．３ＴｏｂＲ［１７ −５Ａ）及びアンチセンスアデニンヌクレオチドトランスロケータ−遺伝子を含 む２成分ベクターの構築ミトコンドリアアデニンヌクレオチドトランスロケータ −（ＰＡＮＴＩ、　ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５７５５７；　Ｗｉｎｎｉｎｇら著＋９ ９２　Ｐｌａｎｔ　Ｊ、　２；　７６３−７７３）のクローンをこの種からのｍ ＲＮＡからつくられたｃＤＮＡに対しＰＣＲ技術を使用してソラナム・ツベロサ ムから単離する。プライマー組 ５°ＧＣＴＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＡＧ　３°（配列番号 ：１７）及び５°ＧＡＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＴｒＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣ Ｇ　３’　（配列番号：１８）を増幅ツタめに使用する。これはＰＡＮＴＩクロ ーンに側面を接するＢａｍＨｌ及びＮｃｏ　Ｉの両方を導入する。

シンターゼターミネータ−の前にｐｎ７０７にクローン化する。次いで、実施例 １１１ｍに記載されたようにして単離されたトランケートプロモーター配列Δ０ ．３ＴｏｂＲＢよる消化後に２成分ベクターｐＭＯＧ２３にクローン化して、２ 成分ベクターｐｎ７１４を得る（図１４）。

ＡＴＰシンターゼ（Ｂｏｕｔｒｙ＆Ｃｈｕａ著１９８５８ＭＢＯＪ、　４．２１ ５９−２１６５）のβサブユニットのクローンを、この種からのｍＲＮＡからつ くられたｃＤＮＡに対しＰＣＲ技術を使用してタバコにコチアナ・プラムバギニ フオリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ））から単離 する。プライマー組 ５°ＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴｒＣＴＣＧＧＡＧＧＣＴｒＣ３’　（配列 番号＝１９）及び５’　ＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＴＧＧＭＣＴＴＴＡＴＭＴ Ｃ３’　（配列番号：２０）を増幅のために使用する。

リンシンターゼターミネータ−の前にｐＭＯＧ７０７にクローン化する。次いで 、実施例ｆｉ１ｍに記載されたようにして単離されたトランケートプロモーター 配列Δ０．３一つによる消化後に２成分ベクターｐＭＯＧ２３にクローン化して 、２成分ベクターｐＭＯＧ７１５を得る（図１４）。

ｓ　）ｐＭＯＧ７１９　；プロモーター型Ｂ及びセンス異種生体遺伝子の組み合 わせを含む２成分プラスミドの記載 この記載は一般的な例示のために示される。ｐＭＯＧ７１９は９Ｍ０Ｇ２２の誘 導体であり、植物形質転換の第一ラウンド、続いて実施例＋１１ｎ−ｒに記載さ れた２成分ベクターによる形質転換に使用される。ｐＭＯＧ７１９構造物は、実 施例１１１ｎ−ｒからのアンチセンス遺伝子に機能上類似しているが、ヌクレオ チド配列において異種であるタンパク質またはポリペプチドをコードするセンス 遺伝子に融合されたプロモーターＢを含む（図１５）。アンチセンストランスジ ーン及びセンストランスジーンによりコードされた転写産物のヌクレオチド配列 同一性は９０％未満、好ましくは８０％未満、更に好ましくは７５％未満である ことが好ましい。センストランスジーン番よ標的種とは異なる種から得ることが できる。このような異種遺伝子の例として、下記の構造物がつくられる。

−ｐＭＯＧ１８０（実施例■、３５Ｓプロモーター／ｎｏｓターミネータ−）の 発現カセ’ソトをＥｃｏ　Ｒ１−１１ｉｎｄ１１１フラグメントとしてｐｕｔ） Ｇ２２に移入して、ｐＭＯＧ２２ｂ　ｉ　ｓを得る。

−ｐＭＯＧ７１９−１　：グリセロールー３Ｐ−アシルトランスフェラーゼ（Ｉ ｓｈｉｚａｋｉら著＋９８８　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２３８；　４２４−４３ ０．　ＥＭＢＬ受理番号ＹＯＯ７７１）をコードする遺伝子を、下記のプライマ ー ５°ＧＣＴｒＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧ　３°　（配列番号；２１） 及び５’　ＧＡＴＴＡＣＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＴＴＧ　３°　（配列番 号＋　２２）　ニヨルＰＣＲ増幅を使用シテカボチャｃＤＮＡから単離する。増 幅されたフラグメントをＢｇｌ　ＩＩで消化し、２成分ベクターｐＭＯＧ２２ｂ 　ｉ　ｓにクローン化し、これをＢａｍ　ＩＩＩで線状にし、２成分ベクターｐ ＭＯＧ７ｉ９−ｔを得る。このベクターを制限分析によりＧ３ＰＡＴの正確なセ ンス配向（こつき調べる。

−１）ＭＯＧ７１９−２　：アデニンヌクレオチドトランスロケーター（Ｂａｋ ｅｒ＆Ｌｅａｖｅｒ　１９８５Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３；　５８ ５７−５８６７、　ＥＭＢＬ受理番号Ｘ０２８４２）をコードする遺伝子を５° ＧＧＡＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴｒＧ　３’　（配列番号＝２ ４）！、：：よるＰＣＲ増幅を使用してトウモロコシｃＤＮＡから単離する。増 幅されたフラグメントをＢａｍ旧で消化し、２成分ベクターｐＭＯＧ２２ｂｉｓ 　（これはＤａｍ　Ｈｌで線状にされていた）にクローン化し、２成分ベクター ｐＭＯＧ７１９−２を得る。このベクターを制限分析によりＡＮＴインサートの 正確なセンス配向につき調べる。

−ｐ！１４０Ｇ７１９−３　：　ＡＴＰシンターゼ（Ｗｉｎｎｉｎｇら著＋９９ ０　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８；　５８８５゜ＥＭＢＬ受理番号Ｘ ５４２３３）のβサブユニットをコードする遺伝子を下記のプライマー５°ＣＣ ＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣ３’　（配列番号＝２５）及び ５’　ＣＭＧＣＭＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＧＡＡＧＣ３’　（配列番号：２ ６）によるＰＣＲ増幅を使用して−ｐＭＯＧ２２ｂｉｓにクローン化して、２成 分ベクターｐＭＯＧ７１９−３を得る。このベクターを制限分析によりへ■シン ターゼインサートの正確なセンス配向につき調べる。

ドＲＫ２０１３を含むＸＤｉｔｔａら著、　１９８０．　Ｐｒｏｃ、ＮａＬ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７、７３４７−７３５１）による二親交配で、アグ ロバクテリウム・ツメファシェンス株ＭＯＣＩＯＬ　（実施例ＩＩ）またはＬＢ Ａ４４０４　（Ｈｏｅｋｅｍａら著１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３０３．１７９ −１８０）（これは植物へのＴ−ＤＮＡ移入に必要な毒性遺伝子を含むプラスミ ドを含む）に可動化する。

実施例■ ａ）アラビドプシス・クリアーナの形質転換タバコする。形質転換を、Ｖａｌｖ ｅｋｅｎｓら（１９８８，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８ ５゜５５３６−５５４０）に記載されたアラビドプシス・クリアーナ（生態型Ｃ ２４）根セグメントの共存培養を使用して行う。トランスジェニック植物を、選 択培地（夫々、由来する２成分プラスミドｐＭＯＧ２３またはｐＭＯＧ２に応じ て、カナマイシンまたはＩｓイグロマイシンを含む）で成長する苗条から再生し 、根付づかせ、発芽培地または土壌に移す。幼植物を成熟まで生育して、自家受 粉させて、種子を植えつける。

ｂ）ジャガイモ（ソラナム・ツベロサムｓｓｐ、　）の形質転換ジャガイモを、 実施例Ｉ１１に記載された２成分ベクターの一種を含む−ｒｙｏｔ＜クチ１功ム ・ツメファシェンス株ＬＢＡ４４０４による植物組織の共存培養により形質転換 する。形質転換を、Ｈｏｅｋｅｍａら（１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ、　７． ２７３−２７８）により記載されたジャガイモ（ソラナム・ツベロサムｖａｒ、 デジリー（Ｄｅｓｉｒｅｅ））塊茎円板の共存培養を使用して行う。トランスジ ェニック植物を、選択培地（由来する２成分プラスミドｐＭＯＧ２２またはＩ） ＭＯＧ２３に応じて、カナマイシンまたは／１イグロマイシンを含む）で成長す る苗条から再生し、根付づかせ、分裂組織切断により無菌増殖させ、土壌に移す 。幼植物を成熟まで生育して、塊茎を発達させる。

Ｃ）タバコにコチアナ・タバカム５ＲＩ）の形質転換タバコを、実施例ＩＩ＋に 記載された２成分ベクターの一種を含むアグロノ（クテリウム・ツメファシェン ス株ＬＢＡ４４０４　（ｔｌｏｅｋｅｍａら著１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３０ ３．１７９−１８０）による植物組織の共存培養により形質転換する。形質転換 を、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５゜５ｃｉｅｎｃｅ　２２７．１２２９−１２３１ ）により記載されたタバコ仁コチアナ・タノくカム５ＲＩ）葉盤の共存培養を使 用して行う。トランスジエニ・ツク植物を、選択培地（由来する２成分プラスミ ドｐＭＯＧ２２またはｐＭＯＧ２３に応して、カナマイシンまたは）１イグロマ イシンを含む）で成長する苗条から再生し、根付づかせ、土壌に移す。幼植物を 成熟まで生育して、自家受粉させ、種子を植えつける。

内分析に関して、種子を表面滅菌し、生育させ、Ｓｉｊｍｏｎｓら（１９９１， Ｐｌａｎｔ　Ｊ、　ｌ；２４５−２５４）により記載されたようにして接種する 。感染２週間後に、根系を成功した感染の数につき目視でスコアーを付け、野生 型アラビドプシス植物と比較することができる。植物系は、それらがＰＰＮに対 してかなり低下された感受性（即ち対照根で見られる雌の数のかなりの減少）を 示す場合に耐性と考えられる。土壌生育植物に関して、苗を選択培地（１０ｍｇ ／ｌのハイグロマイシンまたは５ｏｌＩｇ／　ｌのカナマイシン）で発芽させる 。耐性の苗を１ｘｌｙ６　ｃｍの透明なプラスチック管中の土壌／砂混合物（１ ：３　ｖ／ｖ）に移す。ロゼツト（ｒｏｚｅｔｔｅ）を良く発達させた後（約１ ４日）、容器に夫々１１．スチャチイの約３００の酢化したＪ２を接種する。Ｈ ，スチャチイの酢化を、包嚢を約２０℃の温度で３ミリモルのＺｎＣ１ｚ溶液中 に数日浸漬することにより刺激する。接種の１８日後に、根を土壌／砂混合物か ら注意して除去し、酸ツクシン（Ｄｒｏｐｋｉｎ著、　１．９８９“Ｉｎｔｒｏ ｄｕｃｌｉｏｎ　ｔｏ　ｐｌａｎｔ　ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ”、第２編、　Ｗｉ ｌ| ｅｙ＆５ｏｎｓ、ニューヨーク）で染色する。このアッセイにおいて、感受性植 物は根系当たり平均】７の包嚢のスコアー（根系当たり４〜４０の範囲の包嚢） である。包嚢の平均数が根系当たり２に減少される場合に遺伝子型は耐性と考え られる。同様に、植物にＭ、コングニタの瞬化したＪ２または卵塊（これらは土 壌／砂混合物に混合されている）を接種することができる。次いで、植物を、土 壌／砂混合物が根から除去された後に明らかに目視できる虫こぶの存在につきス コアーをつける。

す植物（アビウム・グラベオレラス（八ｐｉｕｍ　ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ））て 維持することによりを注意して取り出して土壌を除去し、ウェアリング（Ｗａｒ ｉｎｇ）ブレングー中で短時間（２秒）均一にし、６０ｇの部分て計量した。こ れらの根試料を砂：鉢植え土壌（１：１）混合物１ｋｇと混合し、６週間にわた ってトランスジェニックタバコ植物の生育に使用する。夫々の遺伝子型に関して 、少なくともｌＯＯの個々の植物を夫々の試験に使用する。次いで、土壌／砂混 合物を注意して洗い去り、虫こぶ／根系の数を両眼でカウントする。このアッセ イにおいて、対照植物は平均２５±１５の虫こぶを有する。虫こぶの平均数が根 系当たり２に減少される場合に遺伝子型は耐性と考えられる。

ってその土壌混合物中で生育し、土壌を除去した後、根系の虫こぶの発達数をカ ウントして、Ｍ、インコグニタに対する抵抗性につき分析する。また、グロポデ ラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）ｓｐｐ、に対する抵抗性に関するアッセイのために、 密閉容器を使用すされている土壌に移す。末梢根糸を発芽後７〜８週にわたって 包嚢の存在につき目視で分析する。三つの複製のいずれもが包嚢を有していなか った場合には、遺伝子型が耐性とスコアーされ、また三つの復製の少なくとも一 つが包嚢を示す場合には感受性とスコアーされる。

構築物ｐＭＯＧ２５またはｐＭＯＧ２８　（３５３／ＧＵＳ）のＴ−ＤＮＡに対 しトランスジェニックの植物系を包嚢線虫または根こぶ線虫による感染、続いて 給餌構造内のＧＵＳ活性（Ｊｅ−ｆ　ｆｅｒｓｏｎ著、　１９８７．　Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　５．３８７−４０５）の分析に使用 する。

使用されるからである（Ｓｉｊｍｏｎｓら著１９９１　Ｐｌａｎｔ　Ｊ、　１． ２４５−２５４）。給餌構造の発達は、寒天プレート中で生育された時にこの植 物種で格別に良く目視できる。感染された根部分を含む寒天片を、線虫−植物相 互作用を乱さないでペトリ皿から直接切断し、下記の成分を含む緩衝液中の基質 ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グルクロニド（Ｘ−Ｇｕ）による３ ７℃における組織化学ＧＵＳ染色に直接使用する。１００　ミリモルのＮａＰｉ 　ｐＨ７，ｏ、ｌＯミリモルのＮａＪＤＴＡ　、　Ｏ，１％のトリトン（Ｔｒｉ 　ｔｏｎ）Ｘ１００．２．１　μｇ／ｍｌのフェリシアニド、１．６　μｇ／ｍ ｌのフェロシアニド。このモデル植物系を使用して、３５Ｓプロモーター活性の ダウンレギュレーションを細胞レベルで明らかに実証する。Ｘ−Ｇｕによる延長 された染色後でさえも、給餌構造を含む細胞のいずれにも検出可能なＧＵＳ活性 がない（それ故、３５Ｓプロモーター活性がない）。逆に、感染されていない根 では、ＧＵＳ活性が全ての根部分に見られ、幼根組織及び維管円筒中で特に高い 。ｋインコグニタによるアラビドプシスの感染の後の段階では、３５Ｓプロモー ターのダウンレギュレーションが給餌構造を越えて広がる。

トランスジェニックタバコ植物に、グロポデラ・タバカムまたは隨インコグニタ を土壌接種し、給餌構造の適当な発達後に分析する。この目的のために、土壌の 除去のために根を注意して洗浄し、Ｘ−Ｇ１　ｕアッセイ緩衝液でインキュベー トし、酸ツクシン染色による線虫の検出（Ｄｒｏｐｋｉｎ、　１９８９）のため に二重染色する。

に、ＧＵＳ活性が給餌構造内で検出されず、一方、感染されていない根部分は３ ５Ｓプロモーターにつき予想された発現を示した。こうして、ＣａＭＶ３５Ｓプ ロモーターは型Ｂのプロモーターにつき本件出願で説明された要件に適合する。

キメラのｒｏｌＤ／ＧＵＳ構築物に対しトランスジェニックの植物の給餌構造内 のＧＵＳ活性の分析 構築物ｐＭＯＧ６３０（ｒｏｔ　Ｄ／ＧＵＳ）のＴ−ＤＮＡに対しトランスジェ ニックの植物系を包嚢線虫または根こぶ線虫による感染、続いて先の実施例に記 載されたＧＵＳ活性の分析に使用する。ここで再度、ｒｏｔ　Ｄプロモーター活 性のダウンレギュレーションを細胞レベルで明らかに実証する。Ｘ−Ｇｕによる 延長された染色後でさえも、給餌構造を含む細胞のいずれにも検出可能なＧＵＳ 活性がない（それ故、ｒｏｌ　Ｄプロモーター活性がない）。逆に、感染されて いない根では、ＧＵＳ活性が全ての根部分に見られ、錐管円筒、表皮及び根毛を 含む幼根組織中で特に高い。こうして、ヱグロバクテリウム・リゾゲネス　ｒｏ ｌ　Ｄプロモーターは、型Ｂのプロモーターにつき本件出願で説明された要件に 適合する。

実施例Ｘ！ キメラのトランケートｒｏｌｃ／ＧＩＪＳ構築物に対しトランスジェニックの植 物の給餌植物系を包嚢線虫または根こぶ線虫による感染、続いて実施例Ｖｌに記 載されたＧＵＳ活性の分析に使用する。３５３またはｒｏｌ　Ｄプロモーターと は対照的に、また同様の条件下で試験された幾つかのその他のプロモーターとは 対照的に、５゛トランケートｒｏｌ　Ｃプロモーター／ＧＵＳ融合は、適当な基 質が添加される場合に給餌構造内に青色の沈殿を生じる。こうして、アグロバク テリウム・リゾゲネス５゛トランケートｒｏｌ　Ｃプロモーターは、型Ａのプロ モーターにつき本件出願で説明された要件に適合する。

実施例Ｘｌｌ トランスジェニック植物のＮＦＳ中のプロモーターＡ型調節配列の同定ａ）ｐＭ ＯＧ４５２によるアラビドプラスの形質転換アラビドブラスを、実施例Ｖに記載 された操作を使用して、２成分ベクターチリウム株ＭＯＧＩＯＩで形質転換する 。

ｂ）無プロモーターＧＵＳ構築物に対しトランスジェニックの植物の給餌構造内 のＧＵＳ活性の分析 トランスジェニック植物系（ｐＨ１００４５２、πまたはその後の世代）を、Ｐ ＰＮによる感染、続いて実施例ＩＸに記載されたＧＵＳ分析に使用する。Ｈ，ス チャチイによる接種後のこのようなスクリーニング実験からの結果は、融合細胞 内でＧＬＩ５活性を有し、その他の植物部分中で低ＧＵＳ活性を有し、またはＧ υＳ活性を有しない驚く程多数の植物を示し、こうしてＮＦＳ中で遺伝子活性を 誘導する調節配列がＧＵＳ遺伝子で標識され、それ故、このような調節配列の迅 速な単離を受け易いことを示した。１３の独立のトランスジェニック植物系中の 一つは、機中のみで活性であり、かつＮＦＳ内で活性のままである標識プロモー ターを示した。これを、Ｔｏｐｐｉｎｇら著、　１９９１．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍ 、−１１２，１００９−１０１９により記載された無プロモーターＧＵＳ構築物 に対しトランスジェニックのアラビドプシス植物で確認できた。２５のトランス ジェニック植物系中の二つが、ＮＦＳを含む細胞中でＧＵＳ活性を示した。この 高頻度は、プロモーターＡの要件を満たす調節配列を標識し、それ故、単離する 実現可能性を説明する。逆の状況（健全な維管円筒中でＧＵＳ活性であるが、発 達している給餌構造内でダウンレギュレーションされる）が高頻度でさえも観察 され、それ故、その方法はまた原則としてプロモーターＢ型の要件に適合する調 節配列の同定に適する。

ＮＦＳ内でＧＩＪＳ活性を発現し、好ましくはその他の組織中で低活性を発現し 、または活性を発現しないトランスジェニック植物系を選択し、ゲノムＤＮＡの 単離に使用する。組み込まれたＧＵＳ遺伝子の上流（５゛）の調節配列を、プラ イマー５’　ＣＣＡ　ＧＡＣＴＧＡ　ＡＴＧ　ＣＣＣＡＣＡ　ＧＧＣ３’　（配 列番号：２７）及び５°ＧＧＴ　ＧＡＣＧＣＡ　ＴＧＴ　ＣＧＣＧＣＡ　ＡＧ　 ３’　（配列番号：２８）を用いる逆ＰＣＲ（Ｄｏｅｓら１９９１、　Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１７．１５１−１５３）を使用して、下記の工程で単 離する。増幅フラグメントを使用して、プロモーターＡの要件に適合する調節配 列を含むゲノムクローンの単離のためのアラビドプシスのゲノムライブラリーを スクリーニングする。また、Ｇ［ＩＳ遺伝子の最初の２００ｂｐを使用して選択 植物からつくられたゲノムバンクを探査することができる。

バースクー遺伝子を発現する植物のウェスタン分析のために、下記の方法で産生 されるバースターの抗血清を使用する。

バースタータンパク質の殆どの抗原決定基を、親水性、可撓性及びβ回転に基く 三つの異なる予想方法で決定する。この分析に基いて、下記のアミノ酸配列を用 いて自動化ペプチド合成装置を使用して３種のペプチドを合成する。

ａ）Ａｌａ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｖａｔ−Ｐｈｅ−Ａｒ ｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　（z列番号： ｂ）Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅ ｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ　（z列番号： Ｃ）Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　（z列番号： ３１）。

これらのペプチドを精製し、夫々１．５ｍｇを、グルタルアルデヒドを使用して ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　７．５ｍｇにカップリングする。得られる接合 体を分析し、ＢＳＡ　１モル当たり７．５モルのペプチド（ａ）　、ＢＳＡ　１ モル当たり１０．０モルのペプチド（ｂ）及びＢＳ八へモル当たり６．７モルの ペプチド（Ｃ）を含んでいた。これらの接合体をｌ　ｍｇ／ｍｌの最終濃度で５ ０ミリモルのＨｅｐｅｓ　、　１００　ミリモルのＮａＣｌに溶解し、混合する 。ウサギにフロイント完全アジュバント中の混合接合体０．１５ｍ１を注射し、 不完全フロインドアジュバント中の混合接合体０．１５ｍ１を３回ブースター注 射する。

得られる血清を抗体フラクションにつき部分精製し、−８０℃で貯蔵する。この 血清を食塩加リン酸緩衝液、１％のトイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０．０．５％のト リトン−ｘ１００中の５％の脱脂ドライミルクの存在下の５．０００〜１０．０ ００希釈液中で使用する。ウェスタン分析のために、粗植物エキスを１０〜２７ ％勾配５ＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてニトロセルロースに対するエレクトロブロッテ ィングで分離する。バースター抗体をヤギ抗ウサギーペルオキシダーゼ接合体で 検出し、アメ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　（ＵＫ）ＥＣＬ−検出系で視覚化 する。

びジャガイモに関して利用可能な優れた形質転換プロトコルに基いており、本発 明が適用する植物種の範囲を何ら限定しない。

アラビドプラスを、実施例Ｖａに記載された操作を使用して、２成分ベクターｐ ＭＯＧ５８３もしくはｐＭＯ０７１６またはｐＭＯ０７１８（全て、実施例１１ １に記載されている）を含むアグロバクテリウム株ＭＯＧＩＯＩで形質転換する 。形質転換体を、１０　ｍｇハのハイグロマイシンを含む選択培地で再生する。

全てのハイグロマイシン耐性植物を自家受粉させ、得られる種子バッチをハイグ ロマイシンで発芽させ、ＢＳＡ−バースター接合体の抗体を使用してウェスタン 分析によりバースター遺伝子の発現につき試験する。高発現、中間発現及び低発 現に代表的な植物系を形質転換の第二ラウンドに使用する。

タバコ及びジャガイモを、実施例ｖｂ及びＶｃに記載された操作を使用して、２ 成分ベクターｐＭＯＧ５８３もしくはｐＭＯＧ７１６またはｐｌｆｆ＋７１８（ 全て、実施例■に記載されている）を含むアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４ で形質転換する。形質転換体を選択培地で再生し、耐性植物を自家受粉またはク ローン繁殖させる。タバコの場合、得られる種子バッチを選択培地で発芽させ、 バースターの抗体を使用してウェスタン分析によりバースター遺伝子の発現につ き試験する。クローン繁殖されたジャガイモクローンを、植物を土壌に移した後 のバースター発現につき分析する。高発現、中間発現及び低発現に代表的な植物 系を形質転換の第二ラウンドに使用する。

ＤＮＡ配列の導入及びＰＰＮに対する低下された感受性の分析ａ）ｐＭＯ０５８ ９ｉによるアラビドプシスの形質転換子を発現する）を、実施例ｖ１に記載され た操作を使用して、２成分ベクターｐｚ５８９ｉ　（実施例ｌ１１）を含むアグ ロバクテリウム株ＭＯＧＩＯＩによる形質転換に使用する。

形質転換体の再生を、５（ｍｇハのカナマイシンを含む培地で行う。全てのカナ マイシン耐性再生体を成熟まで生育し、自家受粉させ、異常表現型につき分析す る。

正常な表現型を有する全ての植物からの種子をカナマイシンで発芽させ、生育し て種子の次世代を生産する。カナマイシンを含む培地における発芽の次のラウン ドは、ＮＦｒ１１遺伝子に対しホモ接合の植物系の同定を可能にする。

ｂ）ＰＰＮに対する感受性に関するトランスジエニックアラビドプシスの分析実 施例ＸＩＶａに記載された操作で生産された植物を使用して、実施例ｖ１に記載 されたようにしてＰＰＮに対する感受性のそれらの程度を確かめる。これらの分 析から、ＰＰＮに対する低下された感受性（即ち、根系当たり平均１０未満の包 嚢を有する包嚢の数の減少）を示す幾つかの植物系を同定し、特に、実施例ＸＩ ＩＩ中でバースターのそれらの高発現に選択された系の中でユニの系が耐性（即 ち、根系当たり平均２未満の包嚢）であることがわかった。また、幾つかの異常 表現型（例えば、低下された生存度、不ねん、非開花、小板系）が、おそらく、 バーナーゼ遺伝子の局所発現の結果として、観察される。組み込まれたバーナー ゼ遺伝子の上流（５°）の調節配列を、逆ＰＣＲ（Ｄｏｅｓら著＋９９１．　Ｐ ｌａｎｔ　Ｍｏ１．口ｉｏ１．１７．１５１−１５３）を使用して単離する。増 幅された遺伝子を使用して、プロモーターＡの要件に適合する調節配列を含むゲ ノムクローンの単離のためのアラビドブラスのゲノムライブラリーをスクリーニ ングする。また、バーナーゼ遺伝子を使用して、選択された植物からつくられた ゲノムバンクを探査する。

ｃ）ｐＭＯＧ５９１ｂｉｓによるタバコ及びジャガイモの形質転換この実施例に 記載された操作により同定される調節配列を、ｐＭＯＧ５９１ｉ　（実施例１１ １）の多重クローニング部位中の挿入に使用し、こうして２成分ベクターｐＭＯ Ｇ５９１ｂｉｓをつくることができる。次いでこのベクターを植物、例えば、実 施例Ｘ１ｌｌで高バースター発現に選択されるタバコまたはジャガイモ植物の形 質転換の第二ラウンドに使用する。得られる二重形質転換体を、実施例Ｖ１１及 びＶｌｌｌに記載されたようにＰＰＮに対する低下された感受性につき分析する ことができる。

実施例Ｘｌｌ＋からの選択された植物系を、実施例Ｖｌの操作を使用して、２成 分べ生を、カナマイシンを含む培地で行う。全てのカナマイシン耐性再生体を成 熟まで生育し、自家受粉させ、または塊茎を形成させ（種に応じて）、異常表現 型につき分析する。自家受粉種に関して、正常な表現型を有する全ての植物をカ ナマイシンで発芽させ、生育して種子の次世代を生産する。カナマイシンを含む 培地における発芽の次のラウンドは、ＮＰＴＩ＋遺伝子に対しホモ接合の植物系 の同定を可能にする。ジャガイモの場合、トランスジェニック植物系をクローン 繁殖させる。

ｂ）ＰＰＮに対する感受性に関する二重トランスジェニック植物系の分析バース ター遺伝子（ｐＭＯＧ５８３もしくはｐＭＯＧ７１６またはｐｌＪＯ０７１８に より与えられる）及びバーナーゼ遺伝子（ｐＭＯＧ７１７ｉ）に対しトランスジ ェニックである植物を、実施例ｖ１〜Ｖｌｌ＋に記載されたようにしてＰＰＮに 対する感受性のそれらの程度を分析する。これらの分析から、特に、実施例ｘ１ １］中でバースターのそれらの高発現に選択された系の中で、ＰＰＮに対するか なり低下された感受性（即ち、対照根と比較して包嚢または虫こぶの数のかなり の減少）を示す植物系を同定する。

実施例Ｘ１１１からの選択された植物系を、実施例Ｖに記載された操作を使用し て、２成分ベクターｐＭＯＧ６９９ｉ　（実施例ＩＩＩ）を含むアグロバクテリ ウム株ＭＯＧＩＯＩまたはＬＢＡ４４０４による形質転換に使用する。形質転換 体の再生を、カナマイシンを含む培地で行う。全てのカナマイシン耐性再生体を 成熟まで生育し、自家受粉させ、または塊茎を形成させ（種に応じて）、異常表 現型につき分析する。自家受粉種に関して、正常な表現型を有する全ての植物を カナマイシンで発芽させ、生育して種子の次世代を生産する。カナマイシンを含 む培地における発芽の次のラウンドは、ＮＦｒ１１遺伝子に対しホモ接合の植物 系の同定を可能にする。ジャガイモの場合、トランスジェニック植物系をクロー ン繁殖させる。

ｂ）ｒ’ＰＮに対する感受性に関する二重トランスジェニック植物系の分析バー スター遺伝子（ｐ肛５８３もしくはｐＭＯＧ７１６またはｐｌｉｌＯ０７１８） 及びバーナーゼ構築物（ｐＭＯＧ６９９ｉ）の両方に対しトランスジェニックで ある植物を、実施例Ｖｌ〜Ｖｌ１１に記載されたようにしてＰＰＮに対する感受 性のそれらの程度を分析する。

これらの分析から、特に、実施例Ｘ１ｌｌ中でバースターのそれらの高発現に選 択さと比較して虫こぶの数のかなりの減少）を示す植物系を同定する。

実施例ＸＶ１１ 形質転換の単一ラウンドによるＰＰＮに対する低下された感受性の操作また、バ ースター及びバーナーゼの調節された発現のための両方の発現カセットを含む２ 成分ベクターを、図１に示されるようなこの特許の一般的な記載に適用できる方 法で実施例１１１（ｇ）−（ｍ）に記載されたＤＮＡフラグメントから構築する ことができる。次いで、このような２成分ベクターを使用して形質転換の単一ラ ウンドで叩Ｎに対する低下された感受性を有する植物を操作でき、また実施例Ｖ ＋−Ｖｌｌｌに記載された植物の分析に使用できる。

種生体遺伝子２成分構築物を使用するＰＰＮに対する低下された感受性の操作こ れらの実施例は、図１に一般に示されるような２成分系につき同じ概念に基いて いる。それは、植物細胞代謝及び第ニドランスジーン（これは、発現される時に 第一トランスジーンにより生じた効果を中和または部分中和でき、実際には異種 遺伝子のセンス構築物であり、給餌構造の外部の細胞中で発現される）の発現に 不可欠である同種遺伝子（好ましくは標的種から単離される）の局所（給餌構造 ）アンチセンス発現を伴う。

型Ｂプロモーター及びＮＡＤＰＨ−Ｃｙ　ＬＰ４５０レダクターゼの異種遺伝子 の構築物に対植物組織の共存培養による形質転換の第二ラウンドに使用する。ト ランスジェニック植物を、選択培地で成長する苗条から再生し、根づけし、発芽 培地または土壌に移す。幼植物を成熟まで生育し、自家受粉させ、種子を植え付 ける。センス構築物及びアンチセンス構築物の両方に対しトランスジェニックの 植物を、記載されたようにしてＰＰＮに対する低下された感受性につき分析する 。

型Ｂプロモーター及びＮＡＤＰＨ−ＣｙｔＰ４５０レダクターゼの異種遺伝子の 構築物に対植物組織の共存培養による形質転換の第二ラウンドに使用する。トラ ンスジェニック植物を、選択培地で成長する苗条から再生し、根づけし、発芽培 地または土壌に移す。幼植物を成熟まで生育し、自家受粉させ、種子を植え付け る。センス構築物及びアンチセンス構築物の両方に対しトランスジェニックの植 物を、記載されたようにしてＰＰＮに対する低下された感受性につき分析する。

ｃ）３５３プロモーター及びグリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフ ェラーゼをコードするカポチャ遺伝子のキメラＤＮＡ配列の導入アラビドプシス 植物を、実施例Ｖに記載された２成分ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメ リファシエンス株ＭＯＧ　ｌｏｔによる植物組織の共存培養により四囲７１９− １で形質転換する。トランスジェニック植物を、選択培地で成長する苗条がら再 生し、根づけし、発芽培地または土壌に移す。幼植物を成熟まで生育し、自家受 粉させ、種子を植え付ける。ホモ接合系を、選択培地の発芽による子孫の分析に より選択する。異種遺伝子の発現レベルをノーザンブロッティングで分析する。

ｄ）アラビドプシス中の線虫誘発給餌構造の特異的抑制のためのΔ０．３Ｔｏｂ ＲＢ７プロモーター及びアンチセンスグリセロール−３−ホスフェートアシルト ランスフェラーゼ遺伝子のキメラＤＮＡ配列の導入リファシエンス株ＭＯＧＩＯ Ｉによる植物組織の共存培養による形質転換の第二ラウンドに使用する。トラン スジェニック植物を、選択培地で成長する苗条がら再生し、根づけし、発芽培地 または土壌に移す。幼植物を成熟まで生育し、自家受粉させ、種子を植え付ける 。センス構築物及びアンチセンス構築物の両方に対しトランスジェニックの植物 を、記載されたようにしてＰＰＮに対する低下された感受性につき分析する。

ｅ）３５３プロモーター及びアデニンヌクレオチドトランスロケータ−をコード するトウモロコシ遺伝子のキメラＤＮＡ配列の導入タバコ植物を、実施例Ｖに記 載された２成分ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメリファ４丑ど３株ＬＢ Ａ４４０４による植物組織の共存培養によりｐＭＯＧ７１９−２で形質転換する 。トランスジェニック植物を、選択培地で成長する苗条がら再生し、根づけし、 発芽培地または土壌に移す。幼植物を成熟まで生育し、自家受粉させ、種子を植 え付ける。ホモ接合系を、選択培地の発芽による子孫の分析により選択する。異 種遺伝子の発現レベルをノーザンブロッティングで分析する。

ｒ）ジャガイモ中の線虫誘発給餌構造の特異的抑制のためのΔ０．３ＴｏｂＲＢ ７プロモーター及びアンチセンスアデニンヌクレオチドトランスロケータ−遺伝 子のキメラＤＮＡ配列の導入 構築物ｐ１ｆｆ７１９−２のＴ−ＤＮＡに対しトランスジェニックのジャガイモ 植物を、実施例Ｖに記載された２成分ベクターｐＭＯＧ７１４を含むアグロバク テリウム・ツメリファシエンス株ＬＢＡ４４０４による植物組織の共存培養によ る形質転換の第二ラウンドに使用する。トランスジェニック植物を、選択培地で 成長する苗条がら再生し、根づけし、クローン繁殖させ、土壌に移す。センス構 築物及びアンチセンス構築物の両方に対しトランスジェニックの植物を、記載さ れたようにしてＰＰＮに対する低下された感受性につき分析する。

ｇ）３５Ｓプロモーター及びＡＴＰシンターゼのβ−サブユニットをコードする トウモロコシ遺伝子のキメラＤＮＡ配列の導入７１９−３で形質転換する。トラ ンスジェニック植物を、選択培地で成長する苗条がら再生し、根づけし、土壌に 移し、または試験管内でクローン繁殖させる。異種遺伝子の発現レベルをノーザ ンブロツティングで分析する。

ｈ）タバコ中の線虫誘発給餌構造の特異的抑制のためのΔ０．３ＴｏｂＲＢ７プ ロモーター及びアンチセンスＡＴＰシンターゼ遺伝子のキメラＤＮＡ配列の導入 構築物ｐＭＯＧ７１９−３に対しトランスジェニックのタバコ植物を、実施例Ｖ に記載された２成分ベクターｐＭＯＧ７１５を含むアグロバクテリウム・ツメリ ファシエンス株ＬＢＡ４４０４による植物組織の共存培養による形質転換の第二 ラウンドに使用する。

トランスジェニック植物を、選択培地で成長する苗条から再生し、根づけし、発 芽培地または土壌に移す。幼植物を成熟まで生育し、自家受粉させ、種子を植え 付ける。センス構築物及びアンチセンス構築物の両方に対しトランスジェニック の植物を、記載されたようにしてＰＰＮに対する低下された感受性につき分析す る。

ＧＵＳ及びＩＩＰＴをコードする遺伝子（両方とも、Ｃａ１ＪＶ　３５Ｓプロモ ーターの制御下にある）を有する構築物ｐＭＯＧ２５に対しトランスジェニック の実施例ＸＩから選択された植物系を、ｌＯ〜２０μｇ／ｍｌのハイグロマイシ ン（ｌμｇ／ｍｌの増分）で補給した線虫−寒天培地（Ｓｉ　ｊｍｏｎｓら著１ ９９１．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ、　ｌ、　２４５−２５４）で発芽させて夫々の植物 系につき最高の亜致死ハイグロマイシン濃度を確立する。何となれば、Ｔ−ＤＮ Ａの組み込み部位の位置効果がＩＩＰＴ−遺伝子の発現のレベル、ひいてはハイ グロマイシンに対する抵抗性のレベルに影響するからである。次いで、選択され た系からの新しい種子を、最高の亜致死ハイグロマイシン濃度て線虫−寒天培地 を含む新しいペトリ皿中で発芽させ、ＰＰＮ　（Ｓｉ　ｊｎ＋ｏｎｓら著１９９ １．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ、　ｌ、　２４５−２５４）を接種する。線虫の挙動を倒 立顕微鏡で毎日追跡し、機中の正常な貫入及び挙動をハイグロマイシンの存在下 で初期の感染段階で観察する。感染のその後の段階では、かなり減少した数の雌 が、ハイグロマイシン中で生育された場合に根に発生する。ＮＦＳの発達は、３ ５Ｓプロモーターのダウンレギュレーションの結果としてハイグロマイシンに対 する局所感受性により妨げられる。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：モーゲン・インターナショナルＮＶ（Ｂ）通り・アインンユタイン ベーグ９７（Ｃ）都市：ライデン （Ｄ）州：ズイドーオランダ （Ｅ）国：オランダ （Ｆ）郵便番号：　ＮＬ−２３３３ＣＢ（Ｇ）電話：　０７１−２５８２８２ （１１）テレファックス：　０７１−２２１４７１（ｉｉ）発明の名称・植物寄 生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方法 （ｉｉｉ）配列の数＝２５ （ｉｖ）コンピュータ読み取り可能形態：（Ａ）媒体型　フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）操作システム：　ＰＣ −ＤＯ５／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０ 、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）（ｖｉ）先行出願データ・ （Ａ）出願番号：　ＥＰ　９１２０３０４１．８（Ｂ）出願日：１９９１年１１ 月２０日（ｖｉ）先行出願データ （Ａ）出願番号：　ＥＰ　９２２０００４６．８（Ｂ）出願日：　１９９２年１ 月ＩＯ日（２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー−１線状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセテイカル：　ＹＥＳ（ｘｌ）配列の記載：配列番号１； ＧｍＣＴ八ＣＡへ　ＧＡＣＧＧＡＧＧ八Ｔ　ＣＣＴへＧＡＡＧＴＡ　ｍＧＡＡＡ ＧＡ（２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号２： ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧ（２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載、配列番号３： ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＡＧＧＣＡＣＡＧ　ＧＴＴＡＴＣＭＣＡ　ＣＧｍＧ（ ２）配列番号４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （ｏ）トポロジー、直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号４： ＣＧＧＡＣＴＣＴＧＧ　八ＴＣＣＧＧＡＡＡＧ　ＴＧ（２）配列番号５の情報　 。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号５： ＣＴＴＡＣＴＣＧＡＧ　ＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧ　ｍｃＴＧｃ（２）配列番号６の 情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号６： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２塩基対 （ロ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル：ＹＥＳ　’（ｘｉ）配列の記載：配列番号７゜ ＣＴＣＣＡＡＡＴ八ＣＴＡＧへＴＣＭＡＡ　ＣＣ（２）配列番号８の情報 （Ｄ配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ＝２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー　直線状 （１１）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉＤハイポセティカル：　ＹＥＳ （ｘｉ）配列の記載：配列番号８： ＣＣＴＣ八ＣＣへＴＧ　ＧＴＴＡＧＴｒＣＴＣ（２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル　ＹＥＳ （ｘｉ）配列の記載：配列番号９： ＣＴｒＧＡＡＴＴＣＴ　ＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴ　ＡＴＣＴＭＡＣ（２）配列番号 １０の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （１１）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル：　Ｙ［！５（ｘｉ）配列の記載：配列番号ｌＯ： ＣＣＴＣ八ＣＣ八ＴＧへ　ＧへＴＡＧＴＴＣＴＣ（２）配列番号１１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さコ２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー−１線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号ｌｌ： ＧＧＣＧＧＡＴＣＧＧ　ＡＧＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧ（２）配列番号１２の 情報 （ｉ）配列の特徴： （八）配列の長さ＝２７塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号１２： ＧＡＴＡＣＣ八ＴＧＧ　へＡＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧ（２）配列番号 Ｉ３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー−直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号１３： ＧＧＴｒＣＴＧＧＧＧ　ＡＴＣＣＡＡＡＡＣＧ　ＴＧＴＣＧＡＧ（２）配列番号 １４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号１４； ＧＧＣＴＴＣＣＡＴＧ　ＧＩＴｒＣＧＴＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＣ（２）配列番号 １５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （１１）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号Ｉ５゜ ＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧｍＡＴＣＣＡＣＴＣＧ（２）配列番号１６の情報 （ｉ）配列の特徴− （Ａ）配列の長さ＝２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　Ｙｅｓ（ｘｉ）配列の記載：配列番号１６： ＧＡＧＴＡＴＩＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＴ　ＧｍＧＴＧ（２）配列番号１７の 情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｊｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載、配列番号１７： ＧＣＴＡＧＣＣＧＧＡ　ＴＣＣＡＴＣＴＧＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ（２）配列番号１ ８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　Ｙｌ！Ｓ（ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号２４： （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ＝２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル：　ＹＥＳ（ｘｔ）配列の記載・配列番号２５： ＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡ　ＴＧＧＣ（２）配列番号２６の情 報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号２６： ＣＡＡＧＣＡＡＧＧＡ　ＴＣＣＴＣＣＴＴＡ丁　ＧＡＡＧＣ（２）配列番号２７ の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数・−水路 （Ｄ）トポロジー：直線状 （１１）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｆ！ｉ）　ハイポセティヵ／ｌ／　：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号 ２７： （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｆ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）　ハイホセｙ−ｒ　ｈル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号２ ８： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１５アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド Ｏｆ＋ンハイポセティカル：　ｙｇｓ （ｘｉ）配列の記載：配列番号２９： Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　 Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５アミノ酸 （８）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティヵル・ＹＥＳ （ｘｉ）配列の記載：配列番号３ｏ： Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｈａ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１５ （２）配列番号３Ｉの情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （１１）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティヵル：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列の記載：配列番号３１： Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐｌ　５　１０　１５ ＮＦＳ崩壊遺伝子 中和遺伝子 ＢａｍＨＩ　Ｎｃｏｌ　Ｘｈｏｌ　Ｘｂａｌ　Ｘｈｏｌ　ＨｉｎｄｌｌｌＦｉｇ ｕｒｅ　２ Ｈｉｎｄｌｌｌ ｐＭＯＧ４５２＝無プロモーター ｐＭＯＧ６３０＝ｒｏｌＤプロモーターｐＭＯＧ６７９＝　トランヶーテノドｒ ｏｌｃプロモーターＦｉｇｕｒｅ　８ Ｆｉｇｕｒｅ　９ Ｆｉｇｕｒｅ　１２ ｐＭＯＧ５８９＝　無プロモーター ｐＭＯＧ５９１　＝多重クローニング部位ｐＭＯＧ６９９＝Δ０．３ＴｏｂＲＢ ７　プｏモー９−Ｆｉｇｕｒｅ　１３ ｐＭｏＧ７１１＝ＮＡＤＰＨ−ＣｙｔＰ４５０レダクターゼＡＴＲ１ｐＭｏＧ７ １２＝ＮＡＤＰＨ−Ｃｙ′ｔＰ４５０　レダクターゼＡＴＲ２ｐＭＯＧ７１３　 ＝　Ｇ３Ｐ　アシルトランスフェラーゼＡＴＳＩｐＭＯＧ７１４　＝　７デニン ヌクレオチドトランスロケ一ターｐＭＯＧ７１５　＝　１３　サブユニットＡＴ ＰシンターゼＦｉｇｕｒｅ　１４ Ｆｉｇｕｒｅ　１５ プロモーター型Ａ Ｆｉｇｕｒｅ　１６ 、　、４．　ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０２５５９フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／Ｃｌ２Ｎ　５／１０ （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０１） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，Ｆ Ｉ、　ＨＵ。

ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ Ｏ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＡ、　ＵＳＩ （７２）発明者　ファン　デン　エルゼン　ペーテル　イーエム オランダ　エヌエル２２１５　ベーパー　フォールハウト　ケイエンネホフ　２ ６ （７２）発明者　ファン　デル　リー　フレデリック　マリアンヌ オランダ　エヌエル２２６３　セーセー　レイドジエンダム　プリラス　ヨハン 　ライ−レム　フリソラーン　１８１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組換えＤＮＡの発現の結果として、植物寄生線虫に対する低下された感受性 を有することを特徴とする植物。 ２．前記組換えＤＮＡの発現が線虫給餌構造の崩壊を生じる請求の範囲第１項に 記載の植物。 ３．前記組換えＤＮＡの発現が線虫給餌構造の形成を少なくとも遅延している請 求の範囲第２項に記載の植物。 ４．前記組換えＤＮＡが、 １）発現後に、線虫給餌構造の崩壊を生起する遺伝子Ａ（前記遺伝子Ａは少なく とも線虫給餌構造中で発現を誘導するプロモーターＡの制御下に置かれている） 、及び ２）発現後に、遺伝子Ａの崩壊作用を中和する遺伝子Ｂ（前記遺伝子Ｂは、遺伝 子Ａが発現される植物の細胞の全部中で発現を誘導するプロモーターＢの制御下 に置かれており、但し、前記プロモーターが線虫給餌構造中で遺伝子Ｂの発現を 有効に誘導しないことを条件とする） を含む請求の範囲第２項または第３項に記載の植物。 ５．遺伝子Ａがバーナーゼをコードし、遺伝子Ｂがバースターをコードし、プロ モーターＡがレジデント植物プロモーターであり、プロモーターＢがＣａＷＶ３ ５ＳプロモーターまたはｒｏｌＤプロモーターから得られる請求の範囲第４項に 記載の植物。 ６．遺伝子Ａが、植物から単離されるプロモーター、または前記プロモーターか らの誘導体である請求の範囲第５項に記載の植物。 ７．前記組換えＤＮＡが、線虫給餌構造の形成または維持に必須であるタンパク 質またはポリペプチド産生物をコードする内在性遺伝子に対し抑制性の遺伝子を 含む請求の範囲第２項または第３項に記載の植物。 ８．前記遺伝子Ａが、線虫給餌構造の形成または維持に必須のタンパク質または ポリペプチド産生物をコードする内在性遺伝子転写産物に相補性であるＲＮＡ転 写産物を産生し、前記遺伝子Ｂが、前記内在性遺伝子によりコードされたタンパ ク質またはポリペプチドの機能を置換するタンパク質またはポリペプチド産生物 をコードする請求の範囲第４項に記載の植物。 ９．前記遺伝子Ｂが、宿主植物種とは異なる植物から得られる請求の範囲第８項 に記載の植物。 １０．前記遺伝子Ｂが、ＡＴＰシンターゼ、アデニンヌクレオチドトランスロケ ーター、トリカルボキシレートトランスロケーター、ジカルボキシレートトラン スロケーター、２−オキソーグルタレートトランスロケーター、シトクロムＣ、 ピルベートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３Ｐ−デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ Ｈ−シトクロムｐ４５０レダクターゼ、脂肪酸シンターゼ複合体、グリセロール −３Ｐ−アシルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルーグルタリルＣｏＡレダ クターゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ、転写開始因子、及び転写延長因子 からなる群から選ばれるタンパク質またはポリペプチドをコードする請求の範囲 第８項または第９項に記載の植物。 １１．プロモーターＡが△−０．３ＴｏｂＲＢ７−５Ａプロモーターから得られ る請求の範囲第４項〜第１０項のいずれか一項に記載の植物。 １２．植物がファミリーソラナセアエに属する請求の範囲第１項〜第１１項のい ずれか一項に記載の植物。 １３．植物がソラナム・ツベロサムである請求の範囲第１２項に記載の植物。 １４．ジャガイモ包嚢線虫に対する低下された感受性を有する請求の範囲第１３ 項に記載の植物。 １５．請求の範囲第１項〜第１４項のいずれか一項に記載の植物から得ることが できる植物材料、例えば、花、果実、葉、花粉、種子、または塊茎。 １６．（１）レシピエント植物細胞を、（ａ）線虫給餌構造中で発現された時に その崩壊を生じる遺伝子及び（ｂ）植物選択マーカー遺伝子を含む組換えＤＮＡ で形質転換する工程、 （２）形質転換された細胞から選択圧力のもとで全植物を生産する工程、（３） 植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する形質転換された植物を同定する 工程 を含むことを特徴とする植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の 生産方法。 １７．（１）レシピエント植物細胞を、（ａ）発現後に、線虫給餌構造の崩壊を 生起する遺伝子Ａ（前記遺伝子Ａは少なくとも線虫給餌構造中で発現を誘導する プロモーターＡの制御下に置かれている）、及び（ｂ）発現後に、遺伝子Ａの崩 壊作用を中和する遺伝子Ｂ（前記遺伝子Ｂは、遺伝子Ａが発現される植物の細胞 の全部中で発現を誘導するプロモーターＢの制御下に置かれており、但し、前記 プロモーターが線虫給餌構造中で遺伝子Ｂの発現を有効に誘導しないことを条件 とする）、並びに（ｃ）植物選択マーカー遺伝子、 を含む組換えＤＮＡで形質転換する工程、（２）形質転換された細胞から選択圧 力のもとで全植物を生産する工程、（３）植物寄生線虫に対する低下された感受 性を有する形質転換された植物を同定する工程 を含むことを特徴とする植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の 生産方法。 １８．（１）レシピエント植物細胞を、（ａ）発現後に、工程（３）で導入され る遺伝子Ａの崩壊作用を中和する遺伝子Ｂ（前記遺伝子Ｂは、遺伝子Ａが発現さ れる植物の細胞の実質的に全部中で発現を誘導するプロモーターＢの制御下に置 かれており、但し、前記プロモーターが線虫給餌構造中で遺伝子Ｂの発現を有効 に誘導しないことを条件とする）、及び（ｂ）植物選択マーカーを含む組換えＤ ＮＡで形質転換する工程、 （２）形質転換された細胞から選択圧力のもとで全植物を生産する工程、（３） 工程（２）で得られた植物、または少なくとも遺伝子Ｂを含むその子孫のレシピ エント細胞を、（ｃ）発現後に、線虫給餌構造の崩壊を生起する遺伝子Ａ（前記 遺伝子Ａは少なくとも感染植物の根の線虫給餌構造中で発現を誘導するプロモー ターＡの制御下に置かれている）を含む組換えＤＮＡで形質転換する工程を含む ことを特徴とする植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方 法。 １９．レシピエント植物細胞を形質転換する工程が、前記細胞を前記組換えＤＮ Ａを含むアグロバクテリウム株でコインキュベートすることにより行われる請求 の範囲第１６項〜第１８項のいずれか一項に記載の方法。 ２０．配列中に、 一線虫給餌構造中で下流の遺伝子の発現を誘導するプロモーター、一線虫給餌構 造中で発現された時に、その崩壊を生起する遺伝子Ａ、及び必要により 一転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナル配列を含み、前記遺伝子Ａが 前記線虫給餌構造中で発現されるように連結されている植物発現可能遺伝子を含 む組換えＤＮＡ。 ２１．前記プロモーターが△−０．３ＴｏｂＲＢ７−５Ａまたはトランケートｒ ｏｌＣプロモーターから得られる請求の範囲第２０項に記載の組換えＤＮＡ。 ２２．前記遺伝子がバーナーゼ遺伝子から得られる請求の範囲第２０項または第 ２１項に記載の組換えＤＮＡ。 ２３．前記遺伝子が宿主植物から得られ、かつＡＴＰシンターゼ、アデニンヌク レオチドトランスロケーター、トリカルボキシレートトランスロケーター、ジカ ルボキシレートトランスロケーター、２−オキソーグルタレートトランスロケー ター、シトクロムＣ、ピルベートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３Ｐ−デヒド ロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ−シトクロムｐ４５０レダクターゼ、脂肪酸シンターゼ 複合体、グリセロール−３Ｐ−アシルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルー グルタリルＣｏＡレダクターゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ、転写開始因 子、及び転写延長因子をコードする遺伝子からなる群から選ばれ、前記遺伝子が 宿主植物中の自然配向に対し逆の配向で前記プロモーターに融合されている請求 の範囲第２０項〜第２２項のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。 ２４．請求の範囲第２０項〜第２３項のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡを含 む植物形質転換ベクター。 ２５．請求の範囲第２４項に記載の植物形質転換ベクターを含むアグロバクテリ ウム株。 ２６．請求の範囲第１項〜第１５項のいずれか一項に記載の植物を生育させるこ とにより植物寄生線虫による作物への損害を減少する方法。 ２７．少なくとも植物の根中で発現されるが、線虫給餌構造中で有効に発現され ない、プロモーターＢの制御下に置かれた除草剤抵抗性遺伝子を含む植物を生育 することを含む植物寄生線虫による作物への損害を減少する方法であって、１） 前記植物を生育する工程、 ２）前記植物の根を除草剤と接触させる工程を含むことを特徴とする植物寄生線 虫による作物への損傷を減少する方法。 ２８．プロモーターＡがカリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター から得られる請求の範囲第２７項に記載の方法。