HU218897B - Növényi parazita nematódokra csökkentett fogékonyságú növények és eljárás az előállításukra - Google Patents
Növényi parazita nematódokra csökkentett fogékonyságú növények és eljárás az előállításukra Download PDFInfo
- Publication number
- HU218897B HU218897B HU9401451A HU9401451A HU218897B HU 218897 B HU218897 B HU 218897B HU 9401451 A HU9401451 A HU 9401451A HU 9401451 A HU9401451 A HU 9401451A HU 218897 B HU218897 B HU 218897B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plant
- gene
- promoter
- nematode
- expression
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
A találmány tárgyát növényi parazita fonalférgek ellen csökkentett érzékenységgel rendelkező növények, valamint az említett növények rekombináns DNS-technikával történő előállítására szolgáló módszerek képezik.
A növényi parazita fonalférgek világszerte megbetegedéseket okoznak szinte az összes gazdasági jelentőséggel rendelkező növényben, az okozott kár a becslések szerint egyedül az Amerikai Egyesült Államokban 5,8 milliárd dollár évente [Sasser and Freckman, World prospective on nematology, in: Vistas on Nematology, Eds. Veech & Dickson. Hyatts Will, Maryland, 7-14 (1987)]. Míg a trópusi területeken a fonalférgek által okozott veszteségeket főleg a gyökércsomó-fonalférgek okozzák (Meloidogyne), Európában a Globodera és Heterodera cisztafonalférgeket tekintik súlyos kórokozóknak és fontos korlátozó faktoroknak például a burgonya, repcemag és cukorrépa termesztésében. Csak kisszámú rezisztens variánst sikerült a különböző nemesítési programok révén előállítani, például a burgonya-, cukorrépa-, paradicsom-, szójabab- és olajretekfajoknál [Dropkin, Ann. Rév. Phytopath., 26, 145-161 (1988); Trudgill, Ann. Rév. Phytopath., 29, 167-192 (1991)]. A rezisztencia gyakran egyetlen R-génen alapul [Rick & Fobes, Tomato Gén. Coop., 24, 25 (1974); Barone et al., Molecular and General Genetics, 224, 177-182 (1990)], és ez azt eredményezi, hogy a rezisztencia néhány generáció után eltűnik [Shidu & Webster, in: Plánt Parasitic Nematodes, 111 (1981); Zuckerman et al. (eds.) Acad Press, New York, 61-87; Tumer, Ann. Appl. Bioi., 117, 385-397 (1990)].
A növényi parazita fonalférgek obiigát paraziták. Az olyan fonalférgek, mint a ciszta- és gyökércsomó-fonalférgek teljesen a növényi gyökérben levő megfelelő táplálóstruktúrák kialakulásától függnek. Ezek a táplálóstruktúrák egyedi gyökérsejtekből származnak, amelyeket a fonalférgek választanak ki a gyökér elözönlése után. A cisztafonalférgek esetében az IFC (initial feeding cell, azaz a kezdeti táplálósejt) szincíciummá alakul a sejtfalak emésztése és a hipertrófia következtében. Egy gyökércsomó-fonalféreggel való elözönlés után az IFC egy óriássejtté alakul, számos, citokinézis nélküli sejtmagosztódás után, és metabolikusan nagyon aktívvá válik. A táplálóstruktúrák létrejötte során a fertőző, fiatal fonalféreg immobillá válik, és elveszti azt a képességét, hogy más táplálóterületre mozogjon, illusztrálva ezzel azt a tulajdonságát, hogy az indukált fonalféreg-tápláló struktúrától (NFS) függ.
Az világos, hogy nagy szükség van olyan növényekre, amelyek csökkent érzékenységgel rendelkeznek a fonalférgekkel szemben. A patogének és kártevők leküzdésének jelenlegi stratégiája olyan rekombináns DNS expresszióján alapul, amely a patogénnel vagy a kórokozóval közvetlen kapcsolatba lép.
Az EP-A 159884 számú bejelentésben leírják egy olyan gén expresszióját növényekben, amely a Bacillus thuringiensis inszekticid toxinját expresszálja. Ha a fehérjét megemészti a rovar, akkor az emésztőszervében levő receptorhoz kötődik, és végeredményben ezzel a rovar pusztulását okozza. A toxin és a rovarban levő receptor kölcsönhatása lényeges a toxikus hatás szempontjából, amely megmagyarázhatja azt, hogy viszonylag gyakran jön létre a toxinnal szembeni rezisztencia.
Az EP-A 303426 számú közzétett bejelentésben leírják, hogy számos Bacillus thuringiensis törzs hat a fonalférgekre. Ennélfogva célul tűztük ki, hogy azonosítjuk azokat a géneket, amelyek ezeket a fonalféregtoxinokat kódolják, és expresszáljuk ezeket a géneket növényekben, hogy megvédjük őket a fonalférgekkel szemben (EP-A 352-052).
Az a tény azonban megfontolásra int, hogy a toxin és a kártevő közötti direkt kapcsolat a rezisztencia gyors kifejlődéséhez vezethet, amint azt a Bacillus thuringiensis endotoxin esetében már leírták [Peferoen, M., Agroindustry High Tech, 5-9 (1991)].
A találmány tárgya tehát olyan növények előállítása, amelyek patogénekkel és kártevőkkel szemben csökkentett érzékenységgel rendelkeznek, és ezzel el lehet kerülni a megszerzett rezisztencia problémáját.
A jelen találmány tárgyát olyan növények képezik, amelyek egy rekombináns DNS expressziója következtében csökkent érzékenységgel rendelkeznek növényi parazita fonalférgekkel szemben. Az előnyös megvalósítási mód szerint az említett rekombináns DNS a fonalférgek táplálóstruktúrájának roncsolását okozza. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint az említett rekombináns DNS expressziója legalább csökkenti egy fonalférgeket tápláló struktúra kialakulását. Egy még előnyösebb megvalósítási mód szerint az említett rekombináns DNS a következő elemeket tartalmazza:
1) egy A-gént, amely expressziója során hatással van egy fonalféreg-tápláló struktúra elroncsolódására, és az említett A-gén egy A-promoter szabályozása alatt áll, amely az A-gén expresszióját legalább a fonalféreg-tápláló struktúrában vezérli, és
2) egy B-gént, amely expressziója során semlegesíti az A-gén roncsolóhatását, és az említett B-gén a Bpromoter szabályozása alatt áll, amely az expressziét lényegében az összes olyan növényi sejtben szabályozza, ahol az A-gén is expresszálódik azzal a feltétellel, hogy az említett promoter nem szabályozza hatékonyan a Bgén expresszióját a fonalféreg-tápláló struktúrában.
Egy előnyös A-gén bamase-t kódol, míg a B-gén barstart kódol, és az A-promoter egy rezidens növényi promoter, míg a B-promotert a CaMV 35S promoterből vagy a ro/D promoterből állítható elő. Egy másik megvalósítási mód szerint az A-promoter egy olyan promoter, amelyet egy növényből lehet izolálni, illetve az említett promoter egy származéka. A jelen megvalósítási mód szerint egy előnyös promotert a A-0,3TobRB7~5A promoterből vagy egy csonkított rolC promoterből állítunk elő.
A találmány egyéb szempontjai alapján az említett rekombináns DNS egy olyan endogén gént gátló gént tartalmaz, amely endogén gén olyan fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely lényeges egy fonalféreg-tápláló struktúra képződéséhez vagy fenntartásához. A találmány ezen szempontja alapján egy olyan A-gén előnyös, amely egy olyan RNS-transzkriptumot kódol, amely komplementer egy olyan endogén gén transzkriptumával, amely egy fonalféreg-tápláló struktúra képző2
HU 218 897 Β déséhez vagy fenntartásához szükséges fehérjét vagy polipeptidet kódol, különösen ha egy olyan génről van szó, amely lényeges a sejt életképessége szempontjából, és egy olyan B-gén előnyös, amely egy olyan fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely helyettesíti az említett endogén gén által kódolt fehérje vagy polipeptid funkcióját. Az említett semlegesítőgént előnyösen egy más fajhoz tartozó heterológ génből vesszük, azaz például egy növényfajból, állatfajból vagy mikroorganizmusból; előnyösen egy másik növényfajból.
A nagyon előnyös, a sejt életképessége szempontjából lényeges gének a találmány szerint azok a gének, amelyek egy olyan fehérjét vagy polipeptidet kódolnak, amelyet az alábbi csoportból választhatunk: ATPszintetáz, adenin-nukleotid-transzlokátor, trikarboxiláttranszlokátor, dikarboxiláttranszlokátor, 2-oxo-glutarát-transzlokátor, citokróm C, piruvát-kináz, gliceraldehid-3P-dehidrogenáz, NADPH-citokróm p450-reduktáz, zsírsav-szintetáz komplex, glicerin-3P-acil-transzferáz, hidroxi-metil-glutaril-CoA-reduktáz, amino-aciltranszferáz, transzkripciós iniciációs faktor és transzkripciós elongációs faktor.
Egy, a találmány szerinti előnyös növény a Solanaceae családba tartozik, még előnyösebb, ha Solanum tuberosum, burgonya, még előnyösebb, ha egy olyan növény, amely a burgonya-cisztafonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkezik.
A találmány tárgyát képezik továbbá a növényi részek, azaz a virágok, a gyümölcsök, a levelek, a virágpor, a magvak vagy a gumók, amelyek a találmány szerinti növényből kaphatók és a találmány szerinti DNS-t tartalmazzák.
A találmány tárgyát képezik továbbá azok az eljárások, amelyek segítségével növényi parazita fonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkező növényeket lehet előállítani, amely eljárások az alábbi lépéseket tartalmazzák:
(1) egy befogadósejtet rekombináns DNS-sel transzformálunk, amely tartalmaz (a) egy olyan A-gént, amely amikor expresszálódik egy fonalférget tápláló struktúrában, akkor annak lebomlását okozza, és (b) egy növényi szelekciós bélyeget, (2) a transzformált sejtből szelekciós nyomás alatt egy növényt nevelünk fel, és (3) egy olyan transzformált növényt szelektálunk, amely egy növényi parazita fonalféreggel szemben csökkent érzékenységgel rendelkezik.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás növényi parazita fonalféreggel szemben csökkent érzékenységgel rendelkező növény előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket tartalmazza:
(1) egy befogadó növényi sejtet egy olyan rekombináns DNS-sel transzformálunk, amely tartalmaz (a) egy A-gént, amely expressziója következtében elroncsol egy fonalféreg-tápláló struktúrát, és az említett Agént egy A-promoter vezérlése alá helyezzük, amely az expressziót legalább a fonalféreg-tápláló struktúrákban biztosítja, és (b) egy B-gént, amely expressziója révén semlegesíti az A-gén roncsolóhatását, és az említett B-gént egy B-promoter vezérlőhatása alá helyezzük, amely a B-gén expresszióját a növénynek lényegében minden olyan sejtjében biztosítja, amelyekben az Agén expresszálódik, azzal a feltétellel, hogy az említett promoter nem biztosítja a B-gén expresszióját a fonalféreg-tápláló struktúrákban, és (c) egy növényben szelektálható markergént, (2) a transzformált sejtből szelekciós nyomás alatt egy teljes növényt hozunk létre, (3) azonosítjuk azokat a transzformált növényeket, amelyek az említett parazita fonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkeznek.
Egy kissé eltérő megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás növényi parazita fonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkező növények előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:
(1) egy befogadó növényi sejtet egy olyan rekombináns DNS-sel transzformálunk, amely tartalmaz (a) egy B-gént, amely expressziója révén semlegesíti egy, a (3) lépésben beviendő A-gén roncsolóhatását, és az említett B-gént egy B-promoter vezérlőhatása alá helyezzük, amely a B-gén expresszióját a növénynek lényegében minden olyan sejtjében biztosítja, amelyekben az A-gén expresszálódik, azzal a feltétellel, hogy az említett promoter nem biztosítja a B-gén expresszióját a fonalféreg-tápláló struktúrákban, és (b) egy növényben szelektálható markergént, (2) a transzformált sejtből szelekciós nyomás alatt egy teljes növényt hozunk létre, (3) a (2) lépésben kapott növényből vagy annak utódjából származó befogadósejtet, amely legalább a B-gént tartalmazza, egy olyan rekombináns DNS-sel transzformáljuk, amely tartalmaz (c) egy A-gént, amely expressziója következtében elroncsol egy fonalféreg-tápláló struktúrát, és az említett A-gént egy A-promoter vezérlése alá helyezzük, amely az expressziót legalább egy fertőzött növényi gyökérben levő fonalféreg-tápláló struktúrákban biztosítja, (4) a (3) lépésben transzformált sejtből növényt nevelünk fel, a megfelelő szelekciós nyomást alkalmazva, (5) azonosítjuk azokat a transzformált növényeket, amelyek az említett parazita fonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkeznek.
Egy befogadó növényi sejt transzformálására egy előnyös módszer szerint az említett sejtet együtt inkubáljuk egy Agrobacterium törzzsel, amely az említett rekombináns DNS-t tartalmazza.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan rekombináns DNS-molekula, amely az alábbi sorrendű elemekkel leírható, növényben expresszálható gént tartalmazza:
- egy A-promotert, amely egy utána álló gén expresszióját vezérli egy fonalféreg-tápláló struktúrában,
- egy A-gént, amely ha egy fonalféreg-tápláló struktúrában expresszálódik, akkor annak elroncsolódását okozza, és adott esetben,
- egy transzkripciós terminátort valamint egy poliadenilezési szignálszekvenciát, úgy egymáshoz kapcsolva, hogy az említett A-gén expresszálódjon az említett fonalféreg-tápláló struktú3
HU 218 897 Β rákban. Egy, a találmány szerinti előnyös rekombináns DNS-ben az említett promotert a A-0,3TobRB7-5A vagy a csonkított rolC promoterből állítjuk elő. Egy, a találmány szerinti rekombináns DNS-ben előnyösen a Bacillus amiloliquefaciensből származó bamase gén szerepel A-génként.
Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint egy olyan rekombináns DNS-t állítunk elő, amelyben az említett A-gént egy gazdanövényből állítjuk elő, és az alábbi csoportból választjuk: ATP-szintetáz, adenin-nukleotid-transzlokátor, trikarboxiláttranszlokátor, dikarboxiláttranszlokátor, 2-oxo-glutarát-transzlokátor, citokróm C, piruvát-kináz, gliceraldehid-3P-dehidrogenáz, NADPH-citokróm p450-reduktáz, zsírsav-szintetáz komplex, glicerin-3P-acil-transzferáz, hidroxi-metilglutaril-CoA-reduktáz, amino-acil-transzferáz, transzkripciós iniciációs faktor és transzkripciós elongációs faktor, és az említett gént az említett promoterhez fuzionáltatjuk, de a gazdanövényben előforduló természetes orientációval ellentétes orientációban.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti növényi transzformációs vektorok, valamint az említett növényi transzformációs vektorokat tartalmazó Agrobacterium törzsek.
A találmány szerinti eljárásban különösen előnyösen használható vektorokat az alábbi csoportból választhatjuk: pMOG716, pMOG589, pMOG699, pMOG717, pM0G711, pMOG712, pMOG713, pMOG714, pMOG715, pMOG718 és pMOG720, valamint ezek származékai, oly módon módosítva, amely nem lényeges a találmány szempontjából.
A találmány tárgyát képezik továbbá azok az eljárások, amelyekkel a parazita fonalférgek által a terményekben okozott kárt lehet csökkenteni oly módon, hogy a növényeket a találmány szerint növesztjük.
A találmány tárgya továbbá eljárás a növényi parazita fonalférgek által a terményben okozott kár csökkentésére, ami abban áll, hogy a növényt, amely a B-promoter vezérlése alá helyezett herbicidrezisztencia-gént tartalmaz, amely gén ennek következtében a növény összes olyan gyökérsejtjében expresszálódik, amelyben az A-gén is expresszálódik, azzal a feltétellel, hogy nem expresszálódik jól az NFS-ben, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket tartalmazza :
(1) az említett növényt felneveljük, (2) az említett növény gyökereit egy herbiciddel hozzuk érintkezésbe.
Az expresszió szakkifejezés jelentése, valamint a találmány alkalmazása és előnyei a találmány alábbi, részletes leírásából világos lesz.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
1. ábra: egy kétkomponenses rezisztenciastratégia sematikus ismertetése, a szabadalmi leírás szerint.
2. ábra: a pMOG707-es plazmid, klónozási célokra készített intermedier vektor.
3. ábra: a Ti-plazmidból származó pTiB6 plazmid restrikciós térképe.
4. ábra: a pMOG579 intermedier vektor.
5. ábra: a pMOG23 intermedier vektor.
6. ábra: a pMOG22 intermedier vektor.
7. ábra: a pMOG25 bináris vektor. A T-DNS bal és jobb oldali karja között 35S-HPT-t és 35S-GUS-t tartalmazó plazmid.
8. ábra: a pMOG452, pMOG630 és pMOG679 bináris vektorok. Ezek a plazmidok a pMOG23 vagy a pMOG22 plazmidok származékai, és vagy egy promoter nélküli GUS-konstrukciót, egy ro/D promoter/GUS konstrukciót vagy csonkított rolC promoter/GUS konstrukciót és egy növényi szelekciós bélyeget tartalmaznak (NPTII vagy HPT).
9. ábra: pMOG583 bináris vektor. Ez a plazmid a pMOG22 plazmid származéka, és egy 35S promotert tartalmaz egy barstar génhez fuzionáltatva.
10. ábra: pMOG716 bináris vektor. Ez a plazmid a pMOG22 plazmid származéka, és egy rolD promotert tartalmaz egy barstar génhez fuzionáltatva.
11. ábra: pMOG718 bináris vektor. Ez a plazmid a pMOG22 származéka, és két barstar gént tartalmaz, az egyiket egy 35S promoter szabályozza, a másikat egy rolD promoter.
12. ábra: pMOG587 plazmid. Intermedier vektor, azzal a céllal készítve, hogy a bamase gént juttassuk be vele, tartalmazza a barstar gént egy bakteriális promoterrel és egy nos-terminátorral.
13. ábra a pMOG589, pMOG591, pMOG717 és a pMOG699 bináris vektorok. Ezek a plazmidok a pMOG23 származékai, és vagy egy promoter nélküli bamase gént tartalmaznak, közvetlenül a jobb kar után beépítve (pMOG589), egy többszörös klónozóhelyet számos különböző A-promoter típusú szabályozószekvenciák beépítése céljából (pMOG591), egy csonkított rolC promotert és egy bamase gént (pMOG717), vagy egy csonkított A-0,3TobRB7 promotert és egy bamase gént (pMOG699). Hogy megelőzzük a bamase génnek a klónozás során a baktériumokban esetleg megnyilvánuló káros hatását, ezért vagy a bakteriális promoterrel rendelkező barstar gént illesztjük be a T-DNS-határokon kívüli pontba, vagy egy másik lehetőség, hogy egy intront építünk be a bamase gén kódolórégiójába. Az utóbbi esetben a pMOG-számok egy további i betűt is tartalmaznak (például pMOG699i).
14. ábra: a pMOG711-pMOG715 bináris vektorok.
Ezek a plazmidok a pMOG23 származékai, és egy csonkított A-0,3TobRB7 promotert, valamint egy olyan génnek az antiszensz konstrukcióját tartalmazzák, amely a sejt életképessége szempontjából lényeges.
15. ábra: a pMOG719 bináris vektor. Ez az ábra egy általános illusztrációja egy olyan plaz4
HU 218 897 Β midnak, amelyet arra lehet használni, hogy egy életképesség szempontjából fontos gént, B-promoter által szabályozva, be tudjunk juttatni a kiválasztott helyre.
16. ábra: a pMOG720 bináris vektor. Ez az ábra egy általános illusztrációja egy olyan plazmádnak, amely teljes antiszensz/szensz kétkomponensű rendszert tartalmaz, növényekben való expresszió céljára, hogy fonalférgekre rezisztens növényeket kapjunk.
Meglepő felismerés volt, hogy egy növény kevésbé érzékennyé tehető egy növényi parazita fonalféreggel szemben, ha a fonalféreg-tápláló struktúrát elroncsoljuk, egy bamase gén expressziója révén, amely olyan promoter szabályozása alatt áll, amely az NSF-en belül aktív, míg a génnek az NFS-en kívüli növényi sejtekkel szembeni roncsolóhatásáról kimutatható, hogy ezzel egy időben CaMV 35S promoter szabályozása alatt álló barstart expresszálunk. Ezeknek a növényeknek nincs meg az a hátrányuk, hogy a növényi parazita fonalférgek rezisztensekké válhatnak a védekezésre használt toxikus anyaggal szemben, mivel a patogén vagy a kórokozó közötti közvetlen kapcsolat nem játszik szerepet a növény védekezésében.
Az alábbi meglepő kísérleti eredmények illusztrálják, hogy a találmány miként használható ki, számos különböző módon.
Ha a CaMV 35S promotert [Guilley et al., Cell, 30, 763-773 (1982)], amely az egészséges növényekben a GUS-gén magas szintű expresszióját biztosítja gyökérsejtekben, főleg a vaszkuláris cilinderekben [Benley et al., EMBO 9, 1677-1684 (1990)], használjuk a GUS-gén expresszálására a fonalférgekkel fertőzött növényekben, akkor a fonalféreg-tápláló struktúrákon belül a GUS-aktivitás hiánya figyelhető meg. Ezt a jelenséget három növényfajban is vizsgáltuk, azaz Arabidopsisban, dohányban és burgonyában, amely növényeket a növényi parazita fonalférgek jellemző fajaival (H. schachtii, M. incognita, G. tabacum, G. rostochiensis) fertőztünk, és hagytuk, hogy az NFS kialakuljon. Más promoterek, amelyek magas GUS-expressziót biztosítanak a gyökérszövetben [Leach and Aoyagil, Plánt Sci., 79, 69-76 (1991)], beleértve az epidermiszsejteket és a gyökérszőröket is, a rolC és a rolD promoter-szekvenciák, amelyek az Agrobacterium rhizogenes pRiA4 plazmidjából származnak [a 12-es és 15-ös nyitott leolvasási keretek 5’ határolórégiói; Slightom et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 108-121 (1986)]. Ugyancsak ezekkel a promoterekkel a GUS-aktivitás meglepően erős szuppressziója figyelhető meg az NFSen belül, a növényi parazita fonalférgekkel való fertőzés után.
A fenti kísérleti eredményekkel szemben a rolQ promotemek egy csonkított verziója, amely az Agrobacterium rhizogenes pRiA4 plazmid TL-DNS-e 11-es és 12-es nyitott leolvasási keretei közötti 11 286-os és 12 132-es nukleotidszekvenciájából származik [Slightom et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 108-121 (1986)], aktív marad az NFS-en belül, amint az megfigyelhető volt a csonkított rolC promotemek a GUS-génhez való fúziója, és a konstrukciónak Arabidopsisba való transzformációja után. A promoter egy része láthatólag érzékeny az NFS fejlődése során megnyilvánuló gátlószabályozás iránt, és ha egyszer ezt a részt eltávolítottuk, akkor a promoter aktivitása nem nyomódik el az NFS-en belül.
A növényeket egy olyan rekombináns DNS-konstrukcióval transzformáljuk, amely egy Agrobacteriumból származó bináris vektorban van, és egy promoter nélküli GUS-gént tartalmaz, amelyet közvetlenül klónoztunk a T-DNS-en belüli jobb kar mellé, olyan irányban, hogy a jobb kartól elfelé mutasson, valamint tartalmaz egy második szelekciós markert. A regenerált növényeket szelektív táptalajon növesztjük, érettségig felneveljük, majd hagyjuk, hogy magot hozzanak. A magokból származó növényeket felneveljük, majd fertőzés és az NFS kialakulása után a gyökerekben vizsgáljuk a GUS-aktivitást. Meglepően nagy számú növényi vonalban mutatható ki GUS-aktivitás az NFS-en belül. Nem találtunk azonban olyan növényeket, amelyeknél a GUS-aktivitás csak az NFS-en belül mutatható ki; mindegyik növényben található legalább valamennyi GUS-aktivitás a nem NFS növényi részekben is. Továbbá a legtöbb növényvonal, amely promoter nélküli GUS-konstrukciót tartalmaz, és GUS-aktivitást mutat az egészséges gyökerek vaszkuláris cilindereiben, a GUS-aktivitás leszabályozását is mutatja az NFS fejlődése során.
Azt a következtetést vontuk le, hogy elfogadható gyakorisággal képesek vagyunk olyan növényvonalak előállítására, amelyek bármely promoter nélküli gént expresszálnak egy fertőzött növény NFS-én belül, a promoter nélküli GUS-génnel illusztrált megközelítést alkalmazva. Ezekből a kísérletekből az is következik, hogy azok a promoterek, amelyek valóban specifikusak az NFS-re, legalábbis nagyon ritkák.
Emellett a GUS-enzim-aktivitás hiányát az NFSben kétségtelenül a CaMV 35 S promoter leszabályozása okozza az NFS-en belül.
Az előzőkben ismertetett kísérleti eredmények, azaz hogy egy promotert, amely az NFS-en belül aktív, ésszerű gyakorisággal jelezni lehet egy promoter nélküli génkonstrukció alkalmazásával, és az a tény, hogy a 35S promoterről kimutattuk, hogy az NFS-en belül leszabályozott, annak a következtetésnek a levonását tették lehetővé, hogy mozaik-expressziósmintázat használható olyan növények előállítására, amelyek a növényi parazita fonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkeznek, az alábbiakban ismertetett megközelítés alkalmazásával.
1. lépés. A növényeket olyan rekombináns DNS-sel transzformáljuk, amely tartalmaz (a) egy B-gént, amely egy semlegesítőanyagot, például barstart kódol, egy Bpromoter mögé füzionáltatva, azzal a tulajdonsággal, hogy általában konstitutív, de a fonalféreg-tápláló struktúra fejlődése során leszabályozott, és (b) egy növényi szelekciós markert. A szelekciós táptalajon kapott regeneránsokat átvizsgálhatjuk, hogy expresszálódik-e, például Westem-blot kimutatási technika alkalmazásá5
HU 218 897 Β val. A B-gént expresszáló növényeket érettségig neveljük, és hagyjuk, hogy magot hozzanak, amelyekből a növény második generációja (T2) létrehozható.
2. lépés. A T2 generációt használjuk egy második transzformációs kísérletben, most olyan rekombináns DNS-sel, amely egy roncsolóanyagot, például bamase-t kódoló, promoter nélküli A-gént tartalmaz, vagy egy olyan gént, amely gátlóhatással van egy olyan génre, amely a találmány szerint lényeges a sejt életképessége szempontjából, közvetlenül a T-DNS-en belül a jobb kar mellé klónozva, a jobb kartól elfelé mutató irányban beépítve, valamint egy második szelekciós markert is tartalmaz. [A növényi szelekciós marker vagy különbözik, vagy nem attól, amelyet az első transzformációs kísérletben használtunk, attól függően, hogy az a gén vajon még jelen van-e vagy működik-e a T2-ben. Ismertek azok a módszerek, amelyek segítségével az inaktív növényi szelekciós markereket el lehet távolítani (lásd például a W092/01370 számú leírást).] A regeneránsokat szelektív táptalajon növesztjük, teljes érettségig felneveljük, és hagyjuk, hogy magot hozzanak, amelyből a növények következő generációját lehet felnevelni (T3).
3. lépés. A következő generációt (T3) átvizsgáljuk, hogy csökkent érzékenységgel rendelkezik-e a növényi parazita fonalférgekkel szemben, és adott esetben azt is vizsgáljuk, növekedésük, fejlődésük nem mutat-e devianciát. Az integráció véletlenszerűsége következtében a második transzformáció adott esetben a promoter nélküli A-gén olyan integrációja olyan a növényi genom pontjában valósul meg, amely képes aktívan biztosítani az A-gén transzkripcióját a fonalféreg-tápláló struktúrán belül. A parazita növényi fonalférgekkel való fertőzés utáni szűrővizsgálat olyan növényekhez vezet, amelyek elegendő mennyiségben expresszálják az A-gént a fonalféreg-tápláló struktúrákon belül, és ezzel meg lehet akadályozni ezeknek a struktúráknak a kifejlődését; ezek a növények nem képesek a teljes életciklust biztosítani a növényi parazita fonalférgek számára, miközben az A-gén egyéb, a fonalféreg-tápláló struktúrák melletti területeken való lehetséges expressziója semlegesítődik a B-gén ezzel egy időben lejátszódó expressziója révén.
Általánosabban megfogalmazva, a találmány tárgya eljárás olyan növények előállítására, amelyek a növényi parazita fonalférgekkel szemben csökkentett érzékenységgel rendelkeznek, azzal jellemezve, hogy az alábbi, az említett növény genomjába való integrációt befolyásoló lépéseket tartalmazza ;
(1) az A-gént, amely expressziója révén elősegíti egy fonalféreg-tápláló struktúra elroncsolását, egy Apromoter szabályozóhatása alá építjük be, amely legalább a fonalféreg-tápláló struktúrában expresszálódik, és (2) a B-gént, amely expressziója révén semlegesíti az A-gén roncsolóhatását, és amely B-gént egy B-promoter szabályozóhatása alá helyezünk, amely promoter lényegében az összes növényi sejtben hatékonyan biztosítja az expressziót, kivéve a fonalféreg-tápláló struktúrát, és (3) kiválasztjuk azokat a növényeket, amelyek a növényi parazita fonalférgekkel szemben csökkentett érzékenységgel rendelkeznek.
Az előnyök és a találmánnyal számos különböző módon végezhető tevékenység nyilvánvaló lesz a találmány alábbi, részletes leírásából.
A találmány szempontjából lényeges megjegyezni, hogy nincs abszolút követelmény az A-, illetve a Bpromoterekkel szemben, sem együtt, sem külön-külön, azaz a B-promotemek nem kell aktívnak lennie minden, a fonalféreg-tápláló struktúrán kívüli növényi sejtben a fejlődés minden egyes fázisában, de legalább azokban a fonalféreg-tápláló struktúrán kívüli növényi sejtekben kell aktívnak lennie, ahol az A-promoter gyenge szivárgóaktivitást mutat olyan mértékben, hogy a roncsológén expressziója csökkenti a növény életképességét a fonalféreg-tápláló struktúrán kívüli területeken. Hasonlóképpen, az A-promotemek nem kell teljesen specifikusnak lennie a fonalféreg-tápláló struktúrára, egészen addig, ameddig bármely más növényi sejtben, a növény bármely fejlődési fázisában az aktivitását a B-gén egyidejűleg megnyilvánuló aktivitása ellensúlyozza. A B-promoter mutathat még bizonyos mértékű szivárgóaktivitást is a fonalféreg-tápláló struktúrán belül, ameddig a B-gén expressziója elég alacsony ahhoz, hogy ezzel lehetővé tegye az A-géntermékek roncsolóhatásának megnyilvánulását a fonalféreg-tápláló struktúrában.
Egy alkalmas A-promotert, amely a fonalféreg-tápláló struktúrán belül aktív, de amennyire lehet más szövetekben inaktív, a jelen bejelentésben ismertetett módszerekkel lehet azonosítani. Egy ilyen A-promotemek az azonosítása és izolálása után a promotert egy roncsoló A-génnel fuzionáltathatjuk, és a II. fázisban ismertetett második transzformációs kísérletben alkalmazhatjuk. A kapott növényi vonalakat, amelyek transzgenikusak mind az A-promoter/A-gén, mind a B-promoter/B-gén struktúra szempontjából, vizsgálhatjuk, hogy csökkent aktivitással rendelkeznek-e a növényi parazita fonalférgekkel szemben, az alábbi leírás szerinti vizsgálatot alkalmazva.
Egy másik módszer szerint mind a konstitutív Bpromoter/B-gén, mind a fonalféreg-tápláló struktúra Apromoter/A-gén konstrukciókat ugyanabban a vektorban helyezhetjük el, és egyetlen transzformációs kísérletben használhatjuk. A szelekciós táptalajon felnövekvő regeneránsokat az érettségig neveljük. A növények következő generációját közvetlenül vizsgálhatjuk, hogy csökkent érzékenységgel rendelkeznek-e a növényi parazita fonalférgekkel szemben, és nem mutatnake deviáns növekedést, illetve fejlődést.
A találmány tárgya továbbá az, hogy a találmány szerinti konstitutív B-promoter fonalféreg-tápláló struktúra-specifikus repressziójának elnyomása használható arra, hogy növényeket rezisztenssé tegyünk egy herbicidre vagy antibiotikumra, és ezzel olyan növényeket állíthatunk elő, amelyek lokálisan, azaz a fonalféreg-tápláló struktúrán belül érzékenyek herbicid- vagy antibiotikumaktivitással rendelkező vegyületekre. A megfelelő herbicidrezisztencia-gének, amelyek képesek egy herbicid ha6
HU 218 897 Β tását semlegesíteni, és amelyeket egy, a találmány szerinti B-promoterhez akarunk fuzionáltatni, könnyen szelektálhatok egy, a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára; ezek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbiakban szelekciós markerként említett herbicidrezisztencia-gének. A transzformált sejtek szelektálására vagy átvizsgálására használható, szelektálható markergéneket az alábbi, nem korlátozó jellegű listáról választhatjuk: neomicin-foszfotranszferáz gének, amelyek kanamicinrezisztenciát biztosítanak (EP-B 131 623), a higromicinrezisztencia-gén (EP 186 425 A2), a patkánymájból származó glutation-S-transzferáz gén, amely a glutationból származó herbicidekkel szemben biztosít rezisztenciát (EP-A 256 223), a glutamin-szintetáz, amely túlexpressziója révén a glutamin-szintetáz inhibitorokkal, például a foszfmotricinnel szemben biztosít rezisztenciát (WO 87/05327), a Streptomyces viridochromogenes sejtekből származó acetil-transzferáz enzim, amely a foszfinotricin szelektív ágenssel szemben biztosít rezisztenciát (EP-A 275 957), az 5-enolsikimát-3-foszfát-szintetázt (EPSPS) kódoló gén, amely az N-foszfono-metil-glicinnel szemben biztosít toleranciát, a bar gén, amely a Bialaphosszal szemben biztosít rezisztenciát (például a WO 91/02071), és hasonlók. A marker megválasztása nem lényeges, ameddig működik (azaz szelektív) a választott növényi sejtekkel kombinálva.
A markergén és a számunkra lényeges gén nem szükségszerűen kapcsolódik egymáshoz, mivel a nem kapcsolt gének kotranszformációja (4,399,216 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés), szintén hatékony módszer a növények transzformációjában.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az olyan vektorok, amelyek a növények transzformálása céljából rekombináns DNS-t tartalmaznak, amelynek alkotóelemei a következők:
(a) egy szűrővizsgálat végzésére alkalmas gén a promoter aktivitásának tanulmányozására, és alkalmas egy megfelelő A-promoter és/vagy B-promoter izolálására (pMOG452), (b) a találmány szerinti megfelelő semlegesítőgének, a B-promoter szabályozóhatása alatt (pMOG583, pMOG716, pMOG719), (c) a találmány szerinti roncsológének, amelyek vagy nem rendelkeznek saját promoterrel, és egy második transzformációs kísérletben használhatók, hogy egy, a találmány szerinti, a növény genomjában található Apromoter mögé integrálódjanak, amely növény már tartalmaz egy semlegesítőgént (pMOG589), vagy (d) a találmány szerinti roncsológének, amelyek egy, a találmány szerinti izolált A-promoter szabályozása alatt állnak (pMOG699, pMOG717, pMOG711, pMOG712, pMOG713, pMOG714, pMOG715), és egy második transzformációs kísérletben vagy kotranszformációs kísérletben használhatók egy olyan vektorral, amely egy semlegesítőgént tartalmaz a találmány szerinti B-promoter szabályozóhatása alatt, (e) a találmány szerinti roncsoló- és semlegesítőgének alkalmas kombinációja, ahol is a roncsológén lehet promoter nélküli gén (pMOG718), illetve állhat egy izolált A-promoter után (pMOG718; pMOG720 és származékai), használhatók növények transzformálására egyetlen kísérletben, és amelyek közül számosnak csökkent rezisztenciája van a növényi parazita fonalférgekkel szemben.
A jelen találmány szövegösszefüggésében fonalféreg-tápláló struktúrát roncsoló anyag és a semlegesítő anyag szakkifejezés olyan kiválasztott vegyületekre vonatkozik, amelyeket olyan DNS kódol, amelynek terméke (akár fehétje, akár antiszensz RNS) károsan hat a fonalféreg-tápláló struktúra vagy az abban levő sejtszervek metabolizmusára és/vagy működésére, és/vagy életképességére, és amelyekre semlegesítőanyagok ismertek, amelyek, hogy a roncsolóanyaggal egy időben, ugyanabban a sejtben expresszálódnak, akkor elnyomják a roncsolóanyag aktivitását. A roncsoló- és semlegesítőanyagok egyik előnyös kombinációja például a barnase/barstar a Bacillus amiloliquefaciensból [Hartley, J. Mól. Bioi., 202, 913-915 (1988)], a restrikciós endonukleázok/megfelelő metilázok, például az EcoRI az Escherichia coliból [Green et al., Journal of Biological Chemistry, 256, 2143-2153 (1981)], és az EcoRI metiláz, vagy hasonló kombinációk, amelyeket a ΙΙ-es típusú restrikciós-modifikációs rendszerek összefoglaló cikkében leírtak [Wílson, Nucleic Acids Research, 19, 2539-2566 (1991)], a bakteriocinek és a megfelelő immunitásfehérjék Escherichia coliból, ilyen például a kolicin E3/Escherichia coli immunitásfehérje [Lau et al., Nucleic Acids Research, 12, 8733-8745 (1985)], illetve bármely, roncsolóanyagot kódoló gén, amelyet az antiszensz RNS egyidejű előállításával semlegesíteni lehet, egy B-promoter szabályozóhatása alatt, ilyenek lehetnek például a diftériatoxin A láncát kódoló DNS-szekvenciák [Czako & An, Plánt Physiol., 95, 687-692 (1991)], az RNázok, azaz például a TI RNáz, a fitotoxikus fehérjéket kódoló mRNS elleni ribonukleázok vagy proteázok, vagy ribozimek.
A találmány egyéb szempontjai alapján a roncsolóés semlegesítőanyagok kombinációja adott esetben olyan géneket tartalmaz, amelyek gátlólag hatnak egy olyan endogén génre, amely olyan fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely lényeges a sejt életképessége szempontjából, és semlegesítőgénként egy olyan gént tartalmaz, amely olyan fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely képes helyettesíteni az endogén fehérje vagy polipeptid funkcióját. Az ilyen roncsológének az alábbi csoportokból választhatók: (a) egy endogén RNS-transzkriptum elleni ribozimeket kódoló gének, (b) olyan gének, amelyek transzkripciójuk során olyan transzkriptumokat termelnek, amelyek komplementerek vagy legalábbis legalább részben komplementerek azokkal az endogén génekkel, amelyek lényegesek a sejt életképessége szempontjából, ami a génexpresszió antiszensz gátlása néven ismert eljárás (leírását lásd az EP-A 240 208 számú szabadalmi leírásban), vagy (c) olyan gének, amelyek transzkripciójuk során olyan RNS-transzkriptumokat termelnek, amelyek azonosak vagy legalább nagyon hasonlóak a sejt életképessége szempontjából lényeges endogén gének transzkriptu7
HU 218 897 Β maihoz, ami egy ez idáig ismeretlen módja a génexpresszió gátlásának, és amire koszuppresszió néven hivatkoznak [Napoli C. et al., The Plánt Cell, 2,279-289 (1990)].
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az antiszensz géneket használjuk a sejt életképessége szempontjából lényeges endogén gének expressziójának gátlására, amely gének a fonalféreg-tápláló struktúrában expresszálódnak egy A-promotert fuzionáltatva az említett antiszensz gének elé.
A létfontosságú endogén génekre gátlóhatással rendelkező antiszensz gének rombolóhatását semlegesíti egy semlegesítő B-gén expressziója egy, a találmány szerinti B-promoter szabályozóhatása alatt állva, és az említett B-gén, ha expresszálódik, akkor egy olyan fehéije- vagy polipeptidterméket termel, amely azonos vagy hasonló az endogén, létfontosságú gén által kódolt fehérjéhez vagy polipeptidhez, és képes helyettesíteni az endogén géntermék funkcióját a gazdanövényben. Az az előnyös, ha találmány szerinti semlegesítőgén által kódolt RNS-transzkriptum nukleotidszekvenciája eltér az endogén, létfontosságú gén RNS-transzkriptumától, hogy ezzel elkerüljük a lehetséges koszuppressziós hatást. Ennélfogva az az előnyös, ha a semlegesítőgén egy olyan fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely lényegében ugyanazokkal a funkciókkal rendelkezik, mint a létfontosságú endogén gén, de egy olyan RNS-transzkriptum közvetítőn keresztül, amely eltér; azok a semlegesítőgének, amelyek megfelelnek ennek a leírásnak, könnyen megkaphatok egy eltérő növényfajból, vagy éppen nem növényből, azaz például élesztőkből, állati eukariótákból vagy prokariótákból kapható gének adatbázisának átvizsgálásával. Előnyösen a roncsoló antiszensz transzgén és a semlegesítőtranszgén által kódolt transzkriptumok szekvenciaazonossága kisebb mint 90%, előnyösen 80%-nál kisebb, és még előnyösebb, ha az említett semlegesítőtranszgén egy olyan fehéijevagy polipeptidterméket kódol, amelynek aminosavszekvenciája nem azonos az elroncsolt géntermék szekvenciájával, és amelyben a nukleotidszekvencia kisebb mint 75%-ban azonos a semlegesítőtranszgén által kódolt transzkriptumok szekvenciájával.
Az antiszensz roncsológének által megcélzott géneket azok közül a gének közül választjuk ki, amelyek a sejt életképességének biztosításához nélkülözhetetlen enzimeket kódolnak, ezeket háztartási gének néven is említik, ha lehet, akkor a sejtmagon legyen kódolva, előnyös, ha egyetlen példányban fordul elő a genomban, jóllehet egy kisméretű géncsalád is alkalmas lehet a találmány céljaira. Továbbá az említett gének antiszensz expressziója hatásának nem szabad nullára csökkennie az ilyen enzimek által normális körülmények között szintetizált enzimtermékeknek más sejtekből vagy sejtszervekből való transzlokációja vagy diffúziója révén. Előnyösen a membrántranszlokációs enzimeket választjuk, mivel ezek részt vesznek a kémiai gradiensek kialakításában a sejtszerv membránján keresztül. Az ilyen fehérjéknek az antiszensz expresszió révén való gátlása definíció szerint nem függeszthető fel szubsztrátoknak az olyan membránon át való diffundálásával, amelyekben az említett fehérjék megtalálhatók. A transzlokálódott vegyület nem korlátozódik szerves molekulákra, hanem lehet szervetlen is, ilyen például a P, H, OH vagy az elektronok.
A membrántranszlokációs enzimek előnyösen olyan sejtszervekben fordulnak elő, amelyek száma a parazitizmus során nő, ezzel jelezve azt a lényeges szerepet, amit ezek a sejtszervek játszanak a fonalféreg-tápláló struktúrát képező sejtekben. Az ilyen sejtszervekre specifikus példa a mitokondrium, az endoplazmatikus retikulum és a plazmodezmata [Hussey et al., Protoplasma, 167, 55-65 (1992); Magnusson & Golinowski, Can. J. Botany, 69, 44-52 (1991)]. A célenzimek listáját az 1. táblázatban adjuk meg, de csak példákat említünk, a találmány oltalmi körét nem korlátozzuk az ebben a táblázatban felsorolt enzimekre. Egy sokkal részletesebb listát lehet összeállítani a Biochemistry of Plants sorozatból [Eds. Stumpf & Conn, (1988-1991), 1-16. kötet, Academic Press], vagy az Encyclopedia of Plánt Physiology alapján [New Series, Springer-Verlag, Berlin (1976)].
Jóllehet csak néhány esetben, de az ezeket az enzimeket kódoló géneket nem izolálták, és ennek következtében a gén példányszáma nem ismert, ami a jelen találmány szempontjából egy jelentős kritérium.
Példák az antiszensz expresszió által megcélzott enzimekre a fonalféreg-tápláló struktúrában, és az expresszióra a fonalféreg-tápláló struktúrán kívül.
| Enzim | Bioszintézis- üt/sejtszerv |
| ATP-szintetáz | mitokondrium |
| adenin-nukleotid-transzlokátor | mitokondrium |
| foszfáttranszlokátor | mitokondrium |
| trikarboxiláttranszlokátor | mitokondrium |
| dikarboxiláttranszlokátor | mitokondrium |
| 2-oxo-glutarát-transzlokátor | mitokondrium |
| citokróm C | mitokondrium |
| piruvát-kináz | glikolízis |
| gliceraldehid-3P-dehidrogenáz | glikolízis |
| NADPH-citokróm P450-reduktáz | lipid- metabolizmus |
| zsírsav-szintetáz komplex | lipidmetabolizmus |
| glicerin-3P-acil-transzferáz hidroxi-metil-glutaril-Coa- | lipidmetabolizmus |
| reduktáz | mevalonsavút |
| amino-acil-transzferáz | nukleinsav- metabolizmus |
| transzkripciós faktorok | nukleinsav- metabolizmus |
| elongációs faktorok | nukleinsav- metabolizmus |
Ahhoz, hogy maximalizáljuk az antiszensz hatást egy gazdanövényben, a homológ gének használata az előnyös. A homológ alatt azt értjük, hogy ugyanabból a növényfajból állítható elő, mint a gazdanövény. A heterológ szakkifejezés alatt a jelen leírás során azt értjük, hogy egy másik növényből vagy nem növényből állítjuk elő. A heterológ alatt érthetjük a gének szintetikus analógjait, amelyeket az mRNS-t kódoló nukleinsavrészükben módosítottunk, azzal a céllal, hogy leg8
HU 218 897 Β alább 5%-ban téljenek el a gazdaszervezet génjétől. Mivel a háztartási gének általában nagyon erősen konzerválódottak, más (növény-) fajokból származó heterológ próbák használhatók a megfelelő gén izolálására abból a fajból, amelyet rezisztenssé akarunk tenni. Az ilyen génizolálási módszerek a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismertek, és a jelen találmány kitanítása mellett nem igényel fölösleges kísérletezést.
Hogy megkülönböztessük a lehetséges célgéneket és kiválasszuk az előnyös jelölteket a fonalféreg-rezisztencia kialakításához, a következő eljárás alkalmazható a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakemberek számára: a számunkra érdekes génen keresztül promoterszekvenciák izolálhatok a genomiális DNSből, és ezt használhatjuk klónozáshoz egy markergén, például a GUS előtt [Jefferson et al., EMBO J., 6, 3901-3907 (1987)]. Ezt az expressziós konstrukciót azután egy növény transzformálására alkalmas bináris vektorba, bejuttatjuk Agrobacteriumba, és átvisszük a növény genomjába. A regenerált növényeket azután PN-nel fertőzzük, és a teljes növény hisztokémiai elemzésére használjuk, főleg a fonalféreg-tápláló struktúrák elemzésére. Abban az esetben, amikor a használt promoterszekvencia eredetileg egy olyan gént szabályozott, amely lényeges a fonalférgek fejlődéséhez, a génnek nem szabad a növény nagy részében aktívnak lennie (mivel egy háztartási gént szabályoz), hanem sokkal aktívabbnak kell lennie a fonalféreg-tápláló struktúrán belül, mint a környező szövetekben. Egy ilyen példát ír le Cramer [Proc. 31st Ann. Meeting Amer. Soc. Nematologists, Vancouver Canada (1992)], a hidroximetil-glutaril-CoA-reduktáz (HMGR) promoterrel. Ez a promoter sokkal aktívabbá válik a fertőzött gyökérszövetben, főleg azokban a sejtekben, amelyek a fonalférgek táplálásában vesznek részt. A HMGR egy kulcs(sebességmeghatározó) enzim nagyszámú vegyület, például a terpének és a szterolok esetében. Mivel a növényi parazita fonalférgek nem képesek a saját szteroljaikat megszintetizálni [Chitwood & Lusby, Lipids, 26, 619-627 (1991)], ezért teljesen a növényre kell hagyatkozniuk ezzel a vegyülettel, tehát a magas HMGRszint előnyös a növényi parazita fonalférgek számára. Ezzel szemben ennek az enzimnek a leszabályozása a táplálósejtekben antiszensz expresszióval, amint azt a jelen találmányban ismertetjük, súlyos hatással van a fonalférgek fejlődésére.
Egy másik módszer szerint az előnyös jelöltek kiválasztásához az egysejtű eukariótáknál, azaz például az élesztőnél vagy a Chlamydomonasnál hozzáférhető mutánsok használhatók indikációként. Ha egy adott enzimre nagyszámú mutánst lehet izolálni, akkor nagyon valószínű, hogy ez az enzim redundáns, több példányszámban előforduló géncsaládban van jelen, vagy alternatív bioszintézisutak léteznek, amelyekkel meg lehet kerülni a mutált enzimet [Strathem, Jones & Broach (Eds.), The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1981)]. Az ilyen gének kevésbé alkalmasak a találmányban ismertetett eljárásokban való alkalmazásra. Ezzel szemben az olyan enzimekben való mutáció, amely általában letális a befogadósejt számára, és ennélfogva nagyon ritkán hozzáférhető, azt mutatja, hogy az ilyen génnek egy antiszensz deregulációja gátolja a sejt megfelelő fejlődését, és használható arra a célra, hogy a növényi parazita fonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkező növényeket állítsunk elő, a találmány szerinti leírás alapján. Génroncsoló módszerek léteznek, amelyekkel meg lehet vizsgálni, hogy egy gén lényeges-e a sejt életképessége szempontjából, amely esetben a roncsolás letális lesz [Rothstein, Methods in Enzymology, 101, 202-211 (1983)]. A homológ gén azután izolálható a megcélzott növényből, az élesztőgént használva próbaként.
Ennek a találmánynak az alkalmazása nem korlátozódik azokra a növényfajokra, amelyeken a találmányt demonstráljuk. A növényfaj megválasztását elsődlegesen az határozza meg, hogy növényi parazita fonalférgekkel való fertőzés által okozott kárt mekkorára becsülik a mezőgazdaságban, és a növény mennyire alkalmas a transzformálásra. Azokat a növényeket, amelyek a mezőgazdasági gyakorlatban károsodnak a növényi parazita fonalférgek miatt, és amelyek jelentősen érzéketlenebbekké tehetők a növényi parazita fonalférgekkel szemben a jelen találmány szerinti módszerek alkalmazásával, a 2. táblázatban soroljuk fel, anélkül azonban, hogy az említett nemekre korlátoznánk magunkat.
A jelen találmány szerinti szövegösszefüggésben meghatározott fonalféregfaj a Heteroderoidea szupercsaládba tartozik, és megoszlik a Heteroderidea család, valamint a Meloidogynidae család között, és idetartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a 2. táblázatban említett fajok.
Egy megfelelő A-promotert úgy definiálunk, mint egy olyan promotert, amely a fonalféreg-tápláló struktúrán belül egy utánaépített gén expresszióját vezérli, olyan szinten, amely elegendő ahhoz, hogy káros hatással legyen a fonalféreg-tápláló struktúra metabolizmusára és/vagy működésére, és/vagy életképességére, miközben ennek a promotemek előnyösen, de nem szükségszerűen inaktívnak kell lennie a fonalféreg-tápláló struktúrán kívül; legalábbis soha nem szabad annyira aktívnak lennie a fonalféreg-tápláló struktúrán kívül, hogy a roncsolóanyag, amelyet az A-gén kódol, aktivitása ne legyen elegendő mértékben semlegesíthető a Bgén termékével.
Egy megfelelő A-promotert növények átvizsgálásával azonosíthatunk, oly módon, hogy a B-gént a megfelelő B-promoter szabályozása alatt expresszáljuk, és az említett növényt regeneráljuk egy második transzformáció után, amelyet egy promoter nélküli A-gén-konstrukciót és előnyösen egy második szelekciós markert (amely eltér attól, amelyet a B-promoter/B-gén konstrukcióban használtunk) hordozó DNS-konstrukcióval végzünk, és elemezzük az említett növényeket, hogy a növényi parazita fonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkeznek-e. A promoter nélküli A-génkonstrukció random integrációja a promoteraktivitással rendelkező régiókban lehetővé teszi, hogy a transzformáit, regenerált növények növényi parazita fonalférgek9
HU 218 897 Β kel való fertőzése után kiválasszuk azokat a növényeket, amelyek megfelelő szintű A-gén-expresszióval rendelkeznek a fonalféreg-tápláló struktúrában, miközben megmarad a normális fenotípusuk az összes többi növényi részben, a fonalféreg-tápláló struktúrán kívüli szövetekben működő B-gén semlegesítőhatása következtében. Amint azt a kísérleteink mutatják, nincs szükség egy, a jelen találmányban ismertetett tulajdonságokkal rendelkező A-promoter izolálására, mert az integrációs folyamat viszonylag magas frekvenciával működik.
Ez a módszer, amint azt Kertbundit és munkatársai más környezetben igazolták [Kertbundit et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 5212-5216 (1991)], különösen alkalmas az Arabidopsis növényeknél való alkalmazás céljára, mivel a kis genom viszonylag magas gyakorisággal eredményezi azt, hogy az integráció a genom transzkripciósán aktív régióiban játszódjon le.
Egy másik módszer szerint egy megfelelő A-promotert olyan génekből izolálhatunk, amelyek a fonalféreg-fertőzés során magasabb szinten expresszálódnak a fonalféreg-tápláló struktúrákban. Az ilyen géneket a fertőzött és egészséges gyökerekből extrahált mRNS-ből készített cDNS-klónok differenciális szűrővizsgálatával izolálhatjuk, amit a burgonya esetében igazoltak [Gurr S. J. et al., Molecular and General Genetics, 226, 361-366 (1991)]. Jóllehet az ilyen promotereket sohasem írták le részletesen, ezek jól ismert módon kiválaszthatók és izolálhatok egy növényből, az alábbiak szerint:
1. Egy olyan mRNS-t keresünk, amely főleg (habár nem szükségszerűen kizárólag) a fertőzött gyökérszövetben található,
2. izoláljuk ezt az mRNS-t,
3. cDNS-t készítünk ebből az mRNS-ből,
4. ezt a cDNS-t próbaként használjuk ahhoz, hogy azonosítsuk azokat a régiókat ebben a növényi genomban, amely ezt a specifikus mRNS-t kódoló DNS-t tartalmaz,
5. azonosítjuk és izoláljuk a DNS-en az ezt a specifikus mRNS-t kódoló részekből az 5’-szekvenciákat, amelyek a promoterrégiót tartalmazzák.
Előnyösen az mRNS izolálására használt fertőzött gyökerekben dúsítani kell a fonalféreg-tápláló struktúrákat, például szinkrón fertőzéssel [Hammond-Kosack et al., Physiol. Mól. Plánt. Pathol., 35, 495-506 (1989)], illetve a fonalféreg-tápláló struktúrák közvetlen izolálásával azokból a növényekből, amelyekben a fonalféreg-tápláló struktúrák kis nagyítással közvetlenül megfigyelhetők. Például az Arabidopsis gyökerekben fejlődő fonalféreg-tápláló struktúrák kis nagyítás mellett láthatók és könnyen izolálhatok, minimális egyéb sejtszennyezéssel [Sijmons et al., Plánt J., 1, 245-254 (1991)]. Ez lehetővé teszi azoknak a géneknek az izolálását, különösen molekuláris dúsítási módszerek alkalmazásával [Dickinson et al., Adv. Mól. Gén. PlantMicrobe Internet., 1, 276-279 (1991)], amelyek megfelelnek ezeknek a mRNS-eknek, majd ezt követően a promoterelemek is izolálhatok. Ha egyszer egyet azonosítottunk, akkor hasonló gének izolálhatok más növényfajokból, ha az azonosított gént használjuk próbaként, mint a 4. lépésben. Fajspecifikus 5’-szekvenciák izolálhatok azután ezekből a növényfajokból, hogy egy, a jelen találmányban ismertetetthez hasonló stratégiában alkalmazzuk. Az azonosított genomiális kiónok 5'-szekvenciáit fuzionál tathatjuk egy A-génhez, hogy azután egy megfelelő expressziós vektorba építsük be egy növény transzformálása céljából. Ilyen vektor például a pMOG22 vagy a pMOG23.
Egy másik módszer szerint az A-gén expresszálására alkalmas promotereket interpozonjelöléssel izolálhatunk [Topping et al., Developm., 112, 1009-1019 (1991)]. Ebben a megközelítésben számos különböző transzgenikus növényt regeneráltak, Agrobacteriumból származó T-DNS-sel végzett transzformáció után, amely konstrukció a Topping és munkatársai által ismertetett promoter nélküli GUS-konstrukciót tartalmazza [Topping et al., Developm., 112, 1009-1019 (1991)], vagy pMOG452-vel végzett transzformációval, amint azt a példákban ismertetjük. Egy gyökércsomó vagy cisztafonalféreggel végzett fertőzés és a fonalféreg-tápláló struktúra kifejlődésére hagyott idő után a gyökereket megfesthetjük a GUS-aktivitás vizsgálata céljából. A T-DNS véletlenszerű integrációja lehetővé teszi olyan promoterszekvenciák azonosítását, amelyek főleg a fonalféreg-tápláló struktúrákban aktívak, vagy például gyökérspecifikusak, de a fonalféregtápláló struktúrán belül maradnak aktívak. A promoterszekvenciáknak az ilyen típusú interpozonjelölése különösen jól bevált az Arabidopsis fajnál [Kertbundit et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 5212-5216 (1991)] és a dohánynál [Topping et al., Developm., 112, 1009-1019 (1991)]. A GUS-expresszióért felelős 5’- szekvenciák fordított polimeráz-láncreakcióval (fordított PCR) izolálhatok [Does et al., Plánt Mól. Bioi., 17, 151-153 (1991)]. Ha egyszer a megfelelő szabályozószekvenciákat vagy a fonalféreg-tápláló struktúrában átíródó géneket azonosítottuk, akkor ezek próbaként használhatók más növényekből homológ szekvenciák izolálására. Emellett ezeket a más fajokból származó szekvenciákat fuzionáltathatjuk egy A-génhez, hogy azután egy növényi transzformációhoz alkalmas vektorba építsük be. Egy másik módszer szerint egy alkalmas A-promotert a rolC promoter csonkított verziójából készítünk, amely az Agrobacterium rhizogenes pRiA4 plazmid 11-es és 12-es nyitott leolvasási kerete közötti 11 286-12 132-es nukleotidszekvenciából származik [Slightom et al., Journal of Biological Chemistry, 261,108-121 (1986)]. Hasonlóképpen azokat a promotereket, mint az előzőkben ismertetett interpozonjelölési technikával azonosított promotereket, amelyek a gyökér vaszkuláris szövetére specifikusak, de a fonalféreg-tápláló struktúra fejlődése során szuppresszálva vannak, érzéketlenné tehetők a fonalféreg-tápláló struktúra szuppressziós hatására, ha eltávolítjuk a promotemek azon részeit, amelyek a leszabályozásért felelősek, amint az a rolC promoter csonkított verziójánál lehet látni. Az ilyen mutált promoterszekvenciák azután A-promoterként alkalmazhatók.
HU 218 897 Β
Egy másik módszer szerint az alábbi promoterszekvencia használható A-promoterként; egy dohánygyökér specifikus promoter A-0,3TobRB7 [Yamamoto et al., Plánt Cell, 3, 371-382 (1991)]. A TobRB7 promoter teljes hosszúságú szekvenciája nagyon aktív a fonalféreg-tápláló struktúrában, és ez az aktivitás sokkal specifikusabb lesz a fonalféreg-tápláló struktúrára, ha a promoter csonkított Δ-0.3 verzióját használjuk [Taylor et al., Proc. 3 lst Ann. Meeting Amer. Soc. Nematologists, Vancouver, Canada (1992)].
Egy másik módszer szerint azok a promoterek is használhatók A-promoterként, amelyek aktívak a gyökér vaszkuláris szövetében vagy egyéb növényi részekben, és főleg a fonalféreg-tápláló struktúrában lesznek aktívak [például a hidroxi-metil-glutaril-CoA-reduktáz promoter; Cramer, Proc. 3 lst Ann. Meeting Amer. Soc. Nematologists, Vancouver Canada (1992)], ameddig a fonalféreg-tápláló struktúrán kívüli aktivitása soha nem magasabb, mint a B-promoter aktivitása.
Egy alkalmas B-promotert olyan promoterként határozunk meg, amely lényegében minden olyan sejtben vezérli az expressziót, amelyben az A-gén expresszálódik, azzal a feltétellel, hogy nem vezérli az expresszió a fonalféreg-tápláló struktúrában, illetve nem hatékonyan vezérli. (A „lényegében minden sejt” szakkifejezés alatt legalább azokat a sejteket értjük, amelyeknek életképeseknek kell lenniük ahhoz, hogy normális növényi növekedést kapjunk, illetve az ilyen növények kereskedelmi hasznosításához fejlődést. Illusztrációként azokra a növényekre, amelyekben a roncsolóhatás nem semlegesítődik precízen a gazdanövény összes sejtjében, de ennek ellenére életképes és alkalmas a kereskedelmi forgalomba hozatalra, azokat a növényeket említjük, amelyek a találmány szerinti roncsológént a porzószál sejtjeiben expresszálják; ez hímsteril növényeket eredményezhet, amelyeket néhány tennék esetében kereskedelmi érték szempontjából vonzó tulajdonságnak lehet tekinteni.) A promoterszekvenciák szabályozószekvenciák, amelyek a transzkripció növényekben való vezérlésében aktívak, kinyerhetők növényekből vagy növényi vírusokból, illetve kémiai úton szintetizálhatok. A szabályozószekvenciák tartalmazhatnak fokozószekvenciákat is, amilyenek például a CaMV 35S promoterében találhatók [Kay et al., Science, 236, 1299-1302 (1987)], valamint mRNS-stabilizáló szekvenciákat is, amilyen például az alfalfa-mozaikvírus RNA4 leaderszekvencia [Brederode et al., Nucleic Acids Research, 8, 2213-2223 (1980)], illetve bármely egyéb olyan szekvencia, amely hasonlóképpen működik.
Egy másik módszer szerint ahhoz, hogy az összes vagy lényegében az összes növényi szövetben expressziót kapjunk, egy B-promoter/B-gén konstrukciót komplemetálhatunk egy második, B’-promoter/B-gén konstrukcióval, amelynek az expressziós mintázata kiegészíti a B-promoter/B-gén mintázatát, azzal a feltétellel, hogy sem a B-promoter, sem a B’-promoter nem működik a fonalféreg-tápláló struktúrában. Emellett a hibrid promoterek, amelyek a különböző promotereket (illetve azok részeit) tartalmazzák kombinálva, hogy az előzőkben meghatározott expressziós mintázatot kapjuk, szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.
A B-promoter előnyösen a karfiol-mozaikvírus 35S promotere, illetve annak származéka, amit általában egy erős konstitutív promotemek tekintenek a növényi szövetekben [Odell et al., Natúré, 313, 810-812 (1985)]. A B-promoterre egy másik előnyös példa a rolD jelű erős gyökérpromoter [Leach & Aoyagi, Plánt Sci., 79, 69-76 (1991)], amely az Agrobacterium rhizogenes pRi4 plazmidjából származik; az ORF15 5’ határolórégiója [Slightom et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 108-121 (1986)]. Egyéb konstitutív promoterek, úgymint a nopalin-szintetáz promoter [Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8721 (1984)] vagy a görvélyfíímozaikvírus-promoter (EP-A 426 641) alkalmassága B-promoterként való felhasználásra vizsgálható markergénekhez, például GUS-hoz [Jefferson, Plánt Mól. Bioi. Reporter, 5, 387-405 (1987)] való fúzióval, ezeknek a konstrukcióknak növényekbe való transzferével, majd az ilyen transzgenikus növények növényi parazita fonalférgekkel való fertőzése után a növény hisztokémiai elemzésével.
Más szabályozószekvencia lehet bármely más szekvencia, amely önmagában működik a növényekben, és amelyeknek a megválasztása a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára egyszerű feladat. Egy ilyen szekvencia lehet például az Agrobacterium tumefaciens nopalin-szintetáz (nos) génjének 3’ határolórégiója [Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8721 (1984)].
A találmány tárgya továbbá eljárás a növényi parazita fonalférgek által a terményekben okozott károk csökkentésére, ami abban áll, hogy egy B-promoter szabályozóhatása alá helyezett herbicidrezisztenciagént, amely legalább a növény gyökereiben expresszálódik, de nem expresszálódik hatékonyan a fonalféreg-tápláló struktúrákban, hordozó növényeket felnevelünk, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk :
1) felneveljük az említett növényeket,
2) az említett növények gyökereit érintkezésbe hozzuk egy herbiciddel.
A találmány ezen megvalósítási módja szerint a Bgén expressziójával szemben támasztott követelmények sokkal szigorúbbak, azaz az összes olyan sejtben expresszálódnia kell, amely érintkezésbe lép a herbiciddel, a fonalféreg-tápláló struktúra kivételével. Ebből a célból a B-promotert egy második konstitutív B’-promoterrel komplementálhatjuk (amely ugyanannak a Bgénnek egy másik példányához kapcsolódik), azzal a feltétellel, hogy a B’-promoter sem okoz expresszi ót a fonalféreg-tápláló struktúrában. A találmány ezen megvalósítási módjára jellemző példák közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a herbicidek, például a szulfonil-karbamid-osztályba tartozó vegyületek [Mazur & Falco, Ann. Rév. Plánt Physiok, 40, 441-470 (1989)]. Az ebben a szabadalomban alkalmazott példa (higromicinrezisztencia-gén a 35S promoter szabályozása alá helyezve, majd növesztés és fertőzés higromicint tartalmazó közegben) csupán de11
HU 218 897 Β monstrálja a megközelítés alkalmazhatóságát. A mezőgazdasági célra használt herbicid megválasztását elsődlegesen a herbicidrezisztencia-gén hozzáférhetősége, a herbicid ára és környezeti hatásai, formulázásra való alkalmassága (akár talajinjekció akár permetezés formájában), a talajban való mobilitása, valamint az a képessége határozza meg, hogy a fonalféreg-tápláló struktúrát alkotó sejteket eléri-e és hatással van-e rájuk, mennyire mobil a növényi szövetben, és képes-e elérni a fonalféreg-tápláló struktúra sejtjeit, ha a talaj fölé permetezik.
Mivel számos fonalféreg széles gazdaspecifitást mutat, és nagyszámú különböző növényfajon képes élősködni, és azért is, mert a különböző növények fonalféreg-tápláló struktúrái nagyfokú hasonlóságot mutatnak, az várható, hogy a promoterek, azaz például a CaMV 35S vagy egyéb, a jelen találmány szerinti leírásnak megfelelő konstitutív promoterek leszabályozása (azaz az aktivitás hiánya) nagyszámú növényfajban előfordul a jelen találmány szerinti példák mellett. A találmány érvényességi köre nem korlátozódik azokra a fajokra, amelyeket példaként bemutatunk. A növényfaj megválasztását elsődlegesen meghatározza az a becsült kár, amelyet a növényiparazitafonalféreg-fertőzések okoznak a mezőgazdaságban, valamint az, hogy a növényfaj mennyire transzformálható. Azokat a növénynemzetségeket, amelyek a mezőgazdasági gyakorlatban a növényi parazita fonalférgek által okozott fertőzés miatt károsodnak, és amelyek sokkal kevésbé érzékennyé tehetők a növényi parazita fonalférgekkel szemben a jelen találmány szerinti módszer alkalmazásával, a 2. táblázatban soroljuk fel.
A fonalféregfajok közé, amint azt a jelen találmány szövegében definiáljuk, az összes olyan növényi parazita fonalféreg beletartozik, amely a gazdasejteket speciálisan adaptálódott táplálóstruktúrákká módosítja, a vándorló ektoparazitáktól (azaz például a Xiphinema spp.) a sokkal fejlettebb, egy helyben maradó endoparazitákig (például Heteroderidae, Meloidogynae vagy Rotylenchulinaé). Az élősködő paraziták listáját a 2. táblázatban adjuk meg, de a találmány érvényességi köre nem korlátozódik az ebben a táblázatban említett fajokra. Egy sokkal részletesebb listát közölnek Zuckerman és munkatársai [eds., in: Plánt Parasitic Nematodes, Vol I, New York, 139-162 (1971)].
A találmány szerinti módszerek, amelyekkel a fonalféreg-fertőzésnek a terményekben okozott károkozó hatásaival szemben harcolunk, hasonlóképpen alkalmazhatók a nem fonalféreg kártevőkkel és patogénekkel szemben, abban az esetben, amikor az említett patogén vagy kártevő helyileg leszabályozza a növényi promotereket a behatolás helyén (ilyen például a gombák által indukált szürcsölőfonal vagy a tetvek által indukált horzsolódás). Az az elv, hogy befolyásoljuk egy semlegesítőanyag termelődését az összes vagy a legtöbb nem fertőzött növényi sejtben, hogy ezzel semlegesítsük egy sejtet károsító anyag termelődését legalább a fertőzés helyén, független a patogén vagy a kártevő fajától.
2. táblázat
Példák a növényi parazita fonalférgekre, valamint fő gazdanövényeikre
| Fonalféregfaj Meloidogyne | Fő növényfaj |
| M. hapla | széles gazdaspecifitás |
| M. incognita | széles gazdaspecifitás |
| M. exigua | kávé, tea, Capsicum, Citrullus |
| M. indica | Citrus |
| M. javanica | széles gazdaspecifitás |
| M. africana | kávé |
| M. graminis | gabonafélék, füvek |
| M. graminicola M. arenaria Heterodera | rizs |
| & Globodera | széles gazdaspecifitás |
| H. mexicana | Lycopersicum esculentum, Solanum spp. |
| H. punctata | gabonafélék, füvek |
| G. rostochiensis | Solanum tuberosum, solanum spp. Lycopersicon esculentum |
| G. pallida | Solanum tuberosum |
| G. tabacum | Nicotiana tabacum, Nicotiana spp. |
| H. cajani | Cajanus cajan, Vigna sinensis |
| H. glycines | Glycine max, Glycine spp. |
| H. oryzae | Oryza sativa |
| H. schachtii | Béta spp., Brassica spp. |
| H. trifolii | Trifolium spp. |
| H.avenae | gabonafélék, füvek |
| H. carotae | Daucus carota |
| H. cruciferae | Cruciferae |
| H. goettingiana | Pisum sativum, Vicia spp. |
A jelen találmány szövegösszefüggésében akkor mondunk egy növényt a növényi parazita fonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkezőnek, ha az érett nőivarúak számában a növényi gyökerek felszínén statisztikailag jelentős csökkenés figyelhető meg a kontrollnövényekhez viszonyítva. Az érzékeny/rezisztens osztályozás az érett nőivarúak száma alapján általános gyakorlat mind a ciszta-, mint a gyökércsomó-fonalférgek esetében [például La Mondia, Plánt Disease, 75, 453-454 (1991); Omwega et al., Phytopathol., 80, 745-748 (1990)].
A növényeknek a találmány szerint a növényi parazita fonalférgekkel szembeni érzékenysége csökkentésének alapelve a fonalféreg-tápláló struktúra manipulálása. A fonalféreg-tápláló struktúra manipulálása a találmány szerinti leírásnak megfelelően egyrészt a fonalféreg-tápláló struktúra kialakulásának megakadályozását vagy késleltetését jelenti, illetve roncsolását, ha a fonalféreg-tápláló struktúra már kifejlett állapotban van.
Az az előnyös, ha a fonalféreg-tápláló struktúra kialakulásának megelőzését vagy késleltetését a fonalféreg-fertőzés első lépéseiben végezzük; ebből a célból a fonalféreg-tápláló struktúrát roncsoló A-gén egy A-pro12
HU 218 897 Β moter szabályozóhatása alatt kell hogy álljon, amely az expressziót a fonalféreg-tápláló struktúra képződésének beindulásakor vezérli.
Elvileg azonban az is elfogadható, ha egy roncsoló A-gén egy A-promoter szabályozóhatása alatt áll, amely a roncsolóhatású A-gén expresszióját a fonalféreg-tápláló struktúra képződésének egy sokkal előrehaladottabb állapotában indítja be, és ezzel a fonalféregtápláló struktúra pusztulását okozza. Ennek a két szélsőséges esetnek bármelyike a fertőzött növény csökkent érzékenységét okozza a behatoló fonalférgekkel szemben. A találmány szempontjából a „fonalféreg-tápláló struktúra roncsolása” szakkifejezés magában foglalja a fonalféreg-tápláló struktúra kialakulásának késleltetését, ha már egyszer kialakult, vagy éppen kialakulóban van, akkor a fonalféreg-tápláló struktúra visszafejlődését, valamint a kialakult fonalféreg-tápláló struktúra teljes összeomlását.
Egy növényi parazita fonalféreggel szembeni csökkent érzékenység lehet annak a következménye, hogy a fonalféreg-tápláló struktúrák száma csökken a fertőzött növényi gyökérben, a fonalféreg-tápláló struktúra képződésének előrehaladása csökken, illetve a két hatás kombinációja.
Egy, a jelen találmány szerinti fonalféreg-tápláló struktúra tartalmaz egy kiinduló táplálósejtet, ami azt a sejtet vagy nagyon korlátozott számú sejtet jelenti, amelyből a fonalféreg-tápláló struktúra kialakul, a behatoló fonalférgek indukálóhatása következtében.
A találmány szerinti fonalféreg-tápláló struktúrát roncsoló hatás nem korlátozódik csak a fonalféreg-tápláló struktúrával szembeni káros hatásokra olyan káros hatásokat is értünk alatta, amelyek emellett közvetlen kölcsönhatás révén a fonalférgek fejlődésére is káros hatással vannak.
Számos technika ismert a jelen találmány szerinti DNS-szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS bejuttatására a gazdanövényekbe. Az ilyen technikák közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a protoplasztok transzformációja a kalcium/polietilénglikol módszerrel, az elektroporáció és a mikroinjektálás, vagy a (bevont) részecskékkel való bombázás [Potrykus, Bio/Technol., 8, 535-542 (1990)].
Ezek mellett az úgynevezett közvetlen DNS-transzformációs módszerek mellett a transzformációs rendszerek tartalmaznak olyan vektorokat is, amelyek széles körben hozzáférhetők, ilyenek például a virális vektorok [például a karfiol-mozaikvírus (CaMV) és bakteriális vektorok (például az Agrobacterium nemzetségből), Potrykus, Bio/Technol., 8, 535-542 (1990)]. A szelekció és/vagy a szűrővizsgálat után a protoplasztokat, sejteket vagy növényi részeket, amelyeket transzformáltunk, teljes növényekké regenerálhatjuk, a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával [Horsch et al., Science, 225, 1229-1231 (1985)]. A transzformációs és/vagy regenerációs technikák megválasztása nem kritikus a jelen találmány szempontjából.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az úgynevezett bináris vektorokat használjuk fel (leírásuk megtalálható az EP-A 120 516 számú szabadalmi leírásban), amelyekben Agrobacterium törzseket használunk, amelyek egy, a virulenciagéneket hordozó segítőplazmidot tartalmaznak, valamint egy kompatibilis plazmidot, a bináris vektort, amely az átviendő génkonstrukciót tartalmazza. Ez a vektor képes mind Escherichia coliban, mind Agrobacteriumb&n szaporodni; a jelen találmányban használt a Binl9 bináris vektorból származik [Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8721 (1984)]. Az ebben a példában használt bináris vektorok a T-DNS bal és jobb oldali karjai között egy kanamicinrezisztenciát kódoló azonos NPTIII gént tartalmaznak [Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8721 (1984)], valamint egy többszörös klónozóhelyet, hogy a számunkra lényeges génkonstrukciót ideklónozzuk.
Az egyszikű növények transzformálása és regenerálása nem egy általános eljárás. A legfrissebb tudományos eredmények azonban azt mutatják, hogy elvileg az egyszikű növények transzformálhatok, és termékeny transzgénikus növények regenerálhatok a transzformált sejtekből. A reprodukálható szövettenyésztő rendszerek kifejlesztése ezeknél a terményeknél, a genetikai anyagnak a növényi sejtekbe való juttatására használt hatékony módszerekkel együtt, megkönnyítik a transzformációt. Jelenleg az egyszikű növények transzformálásának előnyös módszere a növényi részek vagy szuszpenziós sejtek mikrorészecskebombázása és a közvetlen DNS-bejuttatás vagy elektroporáció [Shimamoto et al., Natúré, 338, 274-276 (1989)]. A transzgénikus kukoricanövényeket úgy állították elő, hogy a Streptomyces hygroscopicus bar gént, amely a foszfínotricinacetil-transzferázt kódolja (ez egy olyan enzim, amely a foszfínotricin nevű herbicidet inaktiválja), egy kukoricaszuszpenziós tenyészet embrionális sejtjeibe juttatták be mikrorészecskebombázással [Gordon Kamin, Plánt Cell, 2, 603-618 (1990)]. A genetikai anyag bejuttatását az aleuronprotoplasztokba vagy egyéb egyszikű terményekbe, azaz például árpába és rozsba már közölték [Lee, Plánt Mól. Bioi., 13,21-30 (1989)]. Az árpanövényeket embriogén szuszpenziós tenyészetekből regenerálták, csak a koros kompakt és csomós embriogén kalluszszövetek szelektálásával az embriogén szuszpenziós tenyészet létrehozása céljából [Vasil, Bio/Technol., 8, 429-434 (1990)]. A transzformációs rendszerekkel való kombináció ezeknél a terményeknél lehetővé teszi azt, hogy a jelen találmányt egyszikű növényekre alkalmazzuk. Ezek a módszerek használhatók még kétszikű növények transzformálására és regenerálására is.
Az alábbi példákat csak a találmány illusztrálása céljából adjuk meg, célunk ezekkel nem az, hogy korlátozzuk a találmány oltalmi körét. Hacsak külön nem említjük, akkor a példákban a Sambrook és munkatársai által leírt standard módszereket használjuk [Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1990)].
1. példa
Intermedier vektorok készítése
a) A pMOG18 készítése
HU 218 897 Β
A pMOG készítésének részletes leírását Pen és munkatársai közlik [Pen et al., Eur. Pat. Appl. 0 449 375 A2 (1991)]. Ez a konstrukció tartalmazza a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét, egy dupla fokozószekvenciával, az alfalfa-mozaikvírus (A1MV) RN4A leaderszekvenciából származó kettős fokozószekvenciát, a β-glükuronidázt kódoló gént [a pRAJ275 plazmidból származik; Jefferson, Plánt Mól. Bioi. Reporter, 5, 387-405 (1987)], amit a nopalin-szintetáz (nos) transzkripciós terminátor követ. A teljes expressziós konstrukció egy EcoRI/HindlII fragment formájában van jelen a pMOG18 plazmidon.
b) A pMOG180 plazmid készítése
A pMOG180 expressziós vektor a pMOG plazmid egy származéka, amelyből a GUS-t kódoló gént eltávolítottuk; más gének építhetők be az A1MV RNA4 leader és a 3’ nos terminátor közé egy BamHI fragment formájában.
Ebből a célból a pMOGl8-ból származó EcoRI/NcoI fragmentet, amely a 35S promotert és az A1MV RNA4 leaderszekvenciákat tartalmazza, PCR-amplifikálással szintetizáljuk, indítómolekulaként az
5’ GTTTCTACAGGACGGAGGATCCTGGAAGTATTTGAAAGA 3’ szekvenciát (SEQ ID NO: 1) és az
5’ CAGCTATGACCATGATTACG 3’ szekvenciát (SEQ ID NO: 2) használva, ezáltal az Ncol hasítási helyet BamHI hasítási helyre mutáltatva. A pMOG 18 vektort azután EcoRI és BamHI restrikciós enzimmel hasítjuk, majd az újonnan szintetizált EcoRI/BamHI fragmentet Egáljuk a két restrikciós hasítási hely közé. Ahhoz, hogy elkerüljük a PCR okozta véletlenszerű mutációkat a promoterszekvenciákban, a PCR-rel szintetizált EcoRI/BamHI fragmentben levő EcoRI/EcoRV fragmentet a pMOG 18-ból származó vadszekvenciákkal helyettesítjük. A rövid EcoRV/BamHI fragmentet szekvenálással megvizsgáljuk, hogy vannak-e benne mutációk. A kapott expressziós vektor a pMOGl80 plazmid.
c) A pMOG707 plazmid készítése
A pMOG707 klónozóvektor egy jobb oldali T-DNS-szekvenciát, egy többszörös klónozóhelyet és egy terminátort tartalmaz, azért, hogy alkalmas fragmenten levő különböző promoter/gén kombinációkat tudjunk klónozni. Ezt a vektort a következőképpen állítjuk elő: a pMTL klónozóvektorból [Chambers et al., Gene, 68, 139-149 (1988)] az Xhol hasítási helyet Xhol emésztéssel eltávolítjuk, Klenow-fragmenttel tompavégűvé tesszük, majd összeligáljuk, így kapjuk a pMTL26/2 plazmidot. Ezt a módosított pMTL vektort használjuk a pMOG23 vektorból származó EcoRI/BglII fragment klónozására, amely a többszörös klónozóhelyet és a jobb határolószekvenciákat tartalmazza, így kapjuk a pMOG584bis szekvenciát. A polilinkerszekvenciát meghosszabbítjuk oly módon, hogy egy szintetikus linkerszekvenciát viszünk be a BamHI és Xhol hasítási helyek közé, ezáltal további Ncol, Xhol és Xbal hasítási helyeket hozunk létre. Ezt követően a nopalinszintetáz transzkripciós terminátort egy BamHI/HindlII fragment formájában izoláljuk a ROK.1 plazmidból [Baulcombe et al., Natúré, 321,446 (1986)], egy szintetikus adapterhez Egáljuk, oly módon, hogy a HindlII hasítási helyet ne javítsuk ki, majd egy EcoRI hasítási helyet viszünk be, és a konstrukciót egy BamHI/EcoRI fragment formájában a meghosszabbított pMOG584 plazmidba, így kapjuk a pMOG707 plazmidot (2. ábra).
2. példa
A MOG101 Agrobacterium törzs készítése
Egy binárisvektor-rendszert használunk a génkonstrukciók Arabidopsis növényekbe való átvitelére. Az Agrobacterium tumefaciens virulenciafunkciókat tartalmazó segítőplazmid a pTiB6 oktopin Ti-plazmidból származik. A MOG101 egy Agrobacterium tumefaciens törzs, amely egy nem onkogén Ti-plazmidot hordoz, amelyből a teljes T-régiót kivágták, és egy, a Tnl831 transzpozonról származó bakteriális spektinomicinrezisztencia-markerrel helyettesítettek [Hooykaas et al., Plasmid, 4, 64-75 (1980)].
A pTiB6 Ti-plazmid két szomszédos T-régiót tartalmaz, a TL- (bal oldali T) és a TR- (jobb oldali T) régiókat. Ahhoz, hogy egy olyan származékot kapjunk, amelyből a TL- és TR-régiók hiányoznak, először előállítottuk a pMOG579 intermedier vektort. A pMOG579 egy pBR322-származék, amely a 2, a T-régiókon kívül jobbra és balra található Ti-plazmid-fragmentet tartalmazza (3. ábra). A 2 fragmentet (sötéttel jelezve) a pMOG579-ben (4. ábra) egy 2,5 kb méretű, a Tnl831 transzpozonról származó BamHI-HindlII fragment választja el [Hooykaas et al., Plasmid, 4, 64-75 (1980)], amely a spektinomicinrezisztencia-markert hordozza (4. ábra). A plazmidot bejuttatjuk az Agrobacterium tumefaciens LBA101 törzsbe {C58-C9 (pTiB6)=egy kúrált C58 törzs, amelybe háromszülős keresztezéssel bejuttattuk az Escherichia co/iból származó pTiB6 plazmidot [Koekman et al., Plasmid, 7, 119-132 (1982)]}, segítőként pRK2013 plazmidot tartalmazó HBlOl-et használva. A transzkonjugánsokat a rifampicin- (20 mg/l) és a spektinomicin- (250 mg/l) rezisztencia alapján szelektáljuk. A pMOG579 és a pTiB6 plazmidok közötti kettős rekombináció a karbenicillinrezisztencia (a pBR322 marker) elvesztését és a teljes T-régió delécióját eredményezi. 5000, 100 mg/l karbenicillint tartalmazó lemezre replikázott spektinomicinrezisztens transzkonjugáns közül kettőt találtunk érzékenynek. A Southem-elemzés azt mutatja, hogy egy kettős rekombinációs esemény kivágta a teljes T-régiót (nem mutatjuk). A kapott törzs jele MOG101. Ez a törzs és készítése analóg a GV2260 törzsével [Deblaere et al., Nucleic Acids Research, 13, 4777-4788 (1985)].
3. példa
A bináris vektorok készítése
a) A pMOG23 készítése
Ebben a példában a pMOG23 bináris vektor készítését írjuk le {Escherichia coli K-12 DH5-alfa törzsben letétbe helyezve a Centraal Bureau voor Schimmelculturesnél, 1990. január 29-én, CBS 102.90 letéti szám alatt).
HU 218 897 Β
A pMOG23 bináris vektor a Binl9 vektor származéka [Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8721 (1984)]. A pMOG23 vektor előállításához a Binl9 vektort a jelen találmány szempontjából lényegtelen módon változtatjuk meg, a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismerős technikák alkalmazásával.
Először is a bal oldali határolószakaszt (LB) és a jobb oldali határolószakasz pozícióját (RB) felcseréljük a neomicin-foszfotranszferáz II (NPTII) génnel. Másodszor az NPTII gén orientációját megváltoztatjuk, ezáltal a transzkripció az LB irányába játszódik le. Végezetül a Binl9 polilinkert egy olyan polilinkerrel helyettesítjük, amely az alábbi restrikciósenzim-felismerési helyeket tartalmazza: EcoRI, Smal, BamHI, Xbal, Sacl, Xhol, HindllI (5. ábra).
b) A pMOG22 készítése
A pMOG22 bináris vektor a pMOG23 vektor származéka, amelyben az NPTII gént egy higromicinrezisztencia-génnel helyettesítettük {HPT, higromicinfoszfotranszferáz, a pLG90 plazmidból [Van dér Elzen et al., Plánt Mól. Bioi., 5,299-302 (1985)]}, a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismerős technikák alkalmazásával. A pMOG22 készítését Comelissen és munkatársai írják le részletesen [Eur. Pat. Appl. 0 440 304 Al (1991)], és az Escherichia coli K12 DH5 alfa törzsben van letétbe helyezve a Centraal Bureau voor Schimmel-culturesnél, 1990. január 29-én, CBS 101.90 letéti szám alatt (6. ábra).
c) A pMOG25 és a pMOG28 vektorok készítése; bináris vektorok, amelyek a 35S promotert és a GUSgént tartalmazzák
A pMOG 18-ból származó EcoRI/HindlII fragmentet a pMOG22 és pMOG23 polilinkerébe klónozzuk, így kapjuk a pMOG25 (7. ábra) és a pMOG28 bináris plazmidokat.
d) A pMOG452 készítése: egy bináris vektor, amely egy promoter nélküli GUS-gént tartalmaz
A GUS-gént, amelyet egy 3’ nos terminátorhoz fuzionáltattunk, de nem tartalmaz 5’ szabályozószekvenciát, egy EcoRI-BamHI fragment formájában klónozunk a pBHOl plazmidból [Jefferson, Plánt Mól. Bioi. Reporter, 5, 387-405 (1987)] a pMOG23 bináris vektor többszörös klónozóhelyére, így kapjuk a pMOG452 bináris plazmidot (8. ábra).
e) A pMOG630 plazmid készítése: egy bináris vektor, amely a rolD promotert és a GUS-gént tartalmazza
A pRiA4 plazmid rolD génje 373 bp méretű 5’ határolórégióját [Leach & Aoyagi, Plánt Sci., 79, 69-76 (1991)] a pMOG452 plazmidban levő GUS-gén elé klónozzuk, standard klónozási technikák alkalmazásával, így kapjuk a pMOG630 bináris plazmidot (8. ábra). A rolD promoter aktivitásának elemzéséhez nagyon hasonló konstrukciókat írnak le.
f) A pMOG679 készítése; egy bináris vektor, amely egy csonkított rolC promotert és a GUS-gént tartalmazza
A rolC promoter egy csonkított verzióját, amely az Agrobacterium rhizogenes pRiA4 plazmid TL-DNS-e 11-es és 12-es nyitott leolvasási kerete közötti
286-12 132-es nukleotidszekvenciából származik [Slightom et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 108-121 (1986)] izoláljuk a pRiA4 plazmidból, standard PCR-technika alkalmazásával, oly módon, hogy a csonkított rolC promoterszekvenciát a mindkét végre bejuttatott BamHI hasítási hellyel amplifikáljuk. Ezt az amplifikált fragmentet azután a pMOG452 plazmid GUS-génjéhez fuzionáltathatjuk, így kapjuk a pMOG679 bináris plazmidot (8. ábra). A csonkított rolC promotemek a GUS-génhez viszonyított orientációját restrikciós elemzéssel ellenőrizzük.
g) A pMOG583 készítése; egy bináris vektor, amely a 355 promotert és egy barstar gént tartalmaz
A Bacillus amyloliqufaciensbcA származó barstar gént a pMT316 plazmidból izoláljuk [Hartley, Journal of Molecular Biology, 202, 913-915 (1988)]. A pMT316 plazmidot HindllI restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd egy szintetikus adapter jelenlétében Egáljuk, ezáltal a HindllI restrikciós hasítási helyet egy BamHI restrikciós hasítási hellyel helyettesítjük. A barstar gént azután egy BamHI fragment formájában izoláljuk, majd a pMOG180 BamHI restrikciós hasítási helyére klónozzuk. A teljes expressziós konstrukciót azután egy EcoRI/HindlII fragment formájában a pMOG22 bináris vektor többszörös klónozóhelyére klónozzuk, így kapjuk a pMOG583 plazmidot (9. ábra).
h) A pMOG716 plazmid készítése; egy bináris vektor, amely rolD promotert és egy barstar gént tartalmaz
A Bacillus amyloliquefaciensbcA származó barstar gént a pMT316 plazmidból izoláljuk [Hartley, Journal of Molecular Biology, 202, 913-915 (1988)]. A pMT316 plazmidot HindllI restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd egy szintetikus adapter jelenlétében Egáljuk, ezáltal a HindllI restrikciós hasítási helyet egy BamHI restrikciós hasítási hellyel helyettesítjük. A barstar gént azután egy BamHI fragment formájában izoláljuk, majd a pMOG707 plazmid BamHI hasítási helyére klónozzuk, a nopalin-szintetáz terminátor elé. A pRiA4 plazmid rolD génje 373 bp méretű 5’ határolórégióját [ORF15, Slightom et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 108-121 (1986)] azután a barstar gén elé klónozzuk, és azután a teljes kazettát átvisszük a pMOG22 plazmidba, így kapjuk a pMOG716 bináris vektort (10. ábra).
i) A pMOG718 plazmid készítése; egy bináris vektor, amely két barstar gént tartalmaz, amelyeket a 35S és a rolD promoter szabályoz
A 35S-barstar és ro/D-barstar fragmenteket, amint azt a 3. g) és 3. h) pontokban ismertettük, szintén használhatjuk két barstar gént tartalmazó bináris vektor előállítására, mindegyiket egy másik B típusú promoter vezérel, és mindegyik egy növényi sejtekben működő terminátorhoz van fuzionáltatva. Erre a célra a promoterbarstar-terminátor fragmentek használhatók bárki, a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára, a pMOG23 plazmidban való tandem klónozás céljára, így állítható elő a pMOG718 bináris vektor (11. ábra).
HU 218 897 Β
j) A pMOG589 plazmid készítése; egy bináris vektor, amely egy promoter nélküli bamase gént tartalmaz
A pMOG23 plazmidból izoláljuk az EcoRI—BglII fragmentet, amely tartalmaz egy többszörös klónozó helyet és a jobb oldali határolószekvenciákat, majd a pMTL26/2 plazmidba (1. c) példa) klónozzuk, így kapjuk a pMOG584 plazmidot. Ezt követően a nos terminátort egy BamHI-HindlII fragment formájában izoláljuk a pM0G18 plazmidból, majd egy szintetikus adapterhez ligáljuk oly módon, hogy a HindlII hasítási helyet nem állítjuk helyre, és egy EcoRI hasítási helyet juttatunk be, majd ezt követően egy BamHI-EcoRI fragment formájában klónozzuk a pMOG584 plazmidba, így kapjuk a pMOG585 plazmidot.
Abból a célból, hogy elnyomjuk a bamase gén szivárgóaktivitását baktériumokban, egy bakteriális promoter szabályozása alatt álló barstart kódoló gént klónozunk a vektorokba, a T-DNS-en kívül, a bináris vektorok esetében. Ebből a célból a pMT316 plazmidot [Hartley, Journal of Molecular Biology, 202, 913-915 (1988)] EcoRI restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd egy szintetikus adaptert Egálunk hozzá oly módon, hogy az EcoRI hasítási helyet nem állítjuk helyre, viszont egy HindlII hasítási helyet beviszünk. Ezt a módosított fragmentet azután egy HindlII fragment formájában klónozzuk a pMTL24 vektorba [Chambers et al., Gene, 68, 139-149 (1988)], így hozzuk létre a pMOG586 vektort. A tac promoter régióban levő Xhol és BamHI hasítási helyeket eltávolítjuk oly módon, hogy Klenow-polimerázzal tompa végeket alakítunk ki. A Zac/barstar szekvenciát egy Sphl fragment formájában izoláljuk, majd a pMOG585 plazmid Sphl hasítási helyére építjük be, a jobb oldali kar és a BglII hasítási hely közé, így állítjuk elő a pMOG587 plazmidot (12. ábra).
A Bacillus amyloliquefaciensbői származó bamase gén a pMT416 plazmidban található [Hartley, Journal of Molecular Biology, 202, 913-915 (1988)]. Az érett bamase-t kódoló gént PCR-technikával amplifikáljuk, olyan indítómolekulák alkalmazásával, amelyek egy ATG kodont és egy Xhol hasítási helyet visznek be a bamase 5’-végére, valamint egy BamHI hasítási helyet a 3’-végére. Ennek a fragmentnek meghatározzuk a szekvenciáját, hogy ellenőrizzük, helyes-e a bamase kódolószekvenciája, majd a pMOG587 plazmidba ligáljuk, amelyet BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel linearizáltunk, így kapjuk a pMOG588 plazmidot. Mind a pMOG23, mind a pMOG588 plazmidot EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kapott fragmenteket ligáljuk, és ismét linearizáljuk BglII restrikciós enzimmel. A megfelelő méretű fragmenteket BglII restrikciós enzimmel emésztett pMOG23 plazmidba ligáljuk, így hozzuk létre a pMOG589 bináris vektort (13. ábra).
Egy másik módszer szerint, azzal a céllal, hogy leküzdjük a bamase gén potenciális szivárgóaktivitását baktériumokban, egy intront lehet bejuttatni a bamase gén kódolószekvenciájába, az alábbiak szerint: a barnásé gént a pMT416 plazmidból izoláljuk PCR-rel, az alábbi indítómolekula-kombináció alkalmazásával:
5’ indítómolekula:
5’ CTGCTCGAGCCTAGGCACAGGTTATCAACACGTTTG 3’ (SEQ ID NO: 3);
3’ indítómolekula:
5’ CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG 3’ (SEQ
IDNO: 4), ezáltal egy Xhol és egy AvrII hasítási helyet juttatunk be a gén 5’-végére, és egy BamHI hasítási helyet a 3’-végére. Ezt a fragmentet egy XhoI/BamHI fragment formájában szubklónozzuk a pMOG707 plazmidba. A Solanum tuberosumbói származó ST-LS1 jelű második intront PCR-rel izoláljuk a p35S GUS INT plazmidba [Vancanneyt et al., Molecular and General Genetics, 220, 245-250 (1990)], ezáltal AvrII hasítási helyeket juttatunk be az intron mindkét oldalára. Ezt az intront AvrII fragment formájában juttatjuk be a bamase génbe. Az intront tartalmazó bamase gént újra izoláljuk ebből a plazmidból, PCR-módszert, valamint az alábbi indítómolekulákat alkalmazva:
5’ indítómolekula:
5’ CTTACTCGAGCCATGGTAAGTTTCTGC 3’ (SEQ IDNO: 5)
3’ indítómolekula:
5’ CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG 3’ (SEQ
IDNO: 6), ezáltal egy startkodont juttatunk be az ST-LS1 intron szekvencia elé. Ezt a fragmentet azután egy XhoI/BamHI fragment formájában szubklónozzuk a pMOG707 plazmidba, amelyet előzetesen BamHI restrikciós enzimmel linearizáltunk, majd részlegesen emésztettünk Xhol restrikciós enzimmel (ezáltal az Xbal hasítási hely megmarad a polilinkerszekvenciában), így kapjuk a pMOG588i plazmidot (13. ábra). Mind a pMOG23, mind a pMOG588i plazmidot EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kapott fragmenteket ligáljuk és ismét linearizáljuk BglII restrikciós enzimmel. A megfelelő méretű fragmenteket BglII restrikciós enzimmel emésztett pMOG23 plazmidba ligáljuk, így kapjuk a pMOG589i bináris vektor (13. ábra). A „pMOG—i” jelölést a szabadalmi leírásban annak jelzésére használjuk, hogy egy intron jelenlétét jelezzük a bamase génben.
A jelen találmány szempontjából mindegy, hogy egy intront tartalmazó bamase gént, vagy egy, a T-DNS-határain kívüli barstar gént használunk a jelen példa bináris vektorainak előállítására.
k) A pMOG591i plazmid készítése; egy bináris vektor, amely egy többszörös klónozóhelyet tartalmaz egy promoter nélküli bamase gén előtt
Ezt a konstrukciót arra használjuk, hogy számos különböző, a 12. példában definiált szabályozószekvenciát építsünk be. Ebből a célból a pMOG588i szintetikus többszörös klónozóhelyét az 5’ bamase szekvencia és a T-DNS jobb karja között meghosszabbítjuk. A kapott pMOG590i plazmidot használjuk a pMOG591i bináris vektor készítésére (13. ábra). Ezt a vektort azután arra használjuk, hogy A-promoter-szabályozó szekvenciákat juttassunk be transzkripciós fúzió formájában a bamase-t kódoló génnel együtt.
HU 218 897 Β
l) A pMOG717i plazmid készítése; egy bináris vektor, amely egy csonkított rolC promotert és egy bamase gént tartalmaz
A csonkított rolC promoterszekvenciát, amelyet a
3. f) példában ismertetünk, a pRiA4 plazmidból lehet izolálni [Slightom et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 108-121 (1986)], majd amplifikáljuk, oly módon, hogy az 5’-végen egy Xbal hasítási helyet hozunk létre, a 3’-végen pedig egy Ncol hasítási helyet hozunk létre. Ezt a fragmentet pMOG588i plazmidba lehet klónozni, így létre lehet hozni transzkripciós íűziót a csonkított rolC promoter és a bamase gén között. Ezt a plazmidot használjuk a pMOG717i bináris vektor készítéséhez (13. ábra).
m) A pMOG699 plazmid készítése; egy bináris vektor, amely egy csonkított promotert (A-0,3TobRB7-5A) és egy bamase gént tartalmaz
A Á-0,3TobRB7-5A promoterszekvenciát [Yamamoto et al., Plánt Cell, 3,371-382 (1991)] a dohányból izolált genomiális DNS kétlépéses PCR-reakciójával izoláljuk. Az első PCR-reakcióban a TobRB7-5A gén egy részét izoláljuk, az alábbi indítómolekulák alkalmazásával :
5’ indítómolekula:
5’ CTCCAAATACTAGCTCAAAACC 3’ (SEQ
IDNO: 7)
3’ indítómolekula:
5’ CCTCACCATGGTTAGTTCTC 3’ (SEQ ID
NO: 8).
A kapott PCR-terméket használjuk a A-0,3TobRB-75A fragment izolálására, az alábbi indítómolekulák alkalmazásával:
5’ indítómolekula:
5’ CTTGAATTCTAGATAAGCTTATCTAAC 3’ (SEQIDNO: 9)
3’ indítómolekula:
5’ CCTCACCATGGTTAGTTCTC 3’ (SEQ ID
NO: 10).
A kapott PCR-terméket gélen tisztítjuk, tompavégűvé alakítjuk, majd pUC9-be szubklónozzuk [Vieira & Messing, Gene, 19, 259-268 (1982)], amelyet azután Smal restrikciós enzimmel linearizálunk. A kapott plazmidot Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, majd részlegesen emésztjük Ncol restrikciós enzimmel, így kapjuk a helyes A-0,3TobRB7-5A fragmentet, amelyet azután a pMOG588i plazmidba szubklónozunk. Ezt a plazmidot használjuk a pMOG699i bináris vektor készítéséhez (13. ábra)
n) A pMOG711 plazmid készítése: egy bináris vektor, amely egy csonkított promotert tartalmaz (A-0,3TobRB7-5A), valamint egy antiszensz NADPH-CytP450-reduktáz ATR1 gént
A NADPH-citokróm P450-reduktáz ATR1 kiónt (EMBL letéti szám X66016) Arabidopsis thaliana var. Landsberg erectából izoláltuk, ebből a fajból készített mRNS-ből készült cDNS-t használva PCR-eljárásban. Az alábbi indítómolekulákat használjuk a számukra lényeges szekvencia amplifikálására:
5’ GGCGGATCGGAGCGGGGAGCTGAAG 3’ (SEQ IDNO: 11), illetve
5’ GATACCATGGATCACCAGACATCTCTG 3’ (SEQ ID NO: 12).
Ez egy Ncol hasítási helyet visz be a PCR-ffagment N-terminálisára Ezt követően a PCR-fragmentet BamHI-NcoI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd antiszensz irányban a pMOG707 plazmidba klónozzuk a nopalin-szintetáz terminátor elé. A csonkított A-0,3TobRB7-5A promoterszekvenciát [Yamamoto et al., Plánt Cell, 3, 371-382 (1991)], izolálását a 3. m) pontban ismertettük, egy Xbal-Ncol fragment formájában lehet beépíteni. A teljes szekvenciát ezután a pMOG23 bináris vektorba klónozzuk egy EcoRI restrikciós enzimmel, valamint a megmaradt egyedi restrikciós enzimek egyikével végzett emésztés után, így kapjuk a pMOG711 bináris vektort (14. ábra).
o) A pMOG712 plazmid készítése; egy bináris vektor, amely egy csonkított promotert (A-0,3TobRB7-5A) és egy antiszensz NADPH-CytP450-reduktáz ATR2 gént tartalmaz
A NADPH-citokróm P450-reduktáz ATR2 kiónt (EMBL letéti szám X66017) Arabidopsis thaliana var. Landsberg erectából izoláltuk, ebből a fajból készített mRNS-ből készült cDNS-t használva PCR-eljárásban. Az alábbi indítómolekulákat használjuk a számukra lényeges szekvencia amplifikálására:
5’ GGTTCTGGGGATCCAAAACGTGTCGAG 3’ (SEQ IDNO: 13) és
5’ GGCTTCCATGGTTTCGTTACCATACATC 3’ (SEQ IDNO: 14).
Ily módon egy-egy, a PCR-fragmentet határoló BamHI és Ncol restrikciósenzim-felismerési helyet viszünk be. Ezt követően a PCR-fragmentet BamHI és Ncol restrikciós enzimekkel emésztjük, majd antiszensz irányban klónozzuk a pMOG707 plazmidba a nopalin szintetáz terminátor elé. A A-0,3TobRB7-5A csonkított promoterszekvenciát [Yamamoto et al., Plánt Cell, 3, 371-382 (1991)], izolálását a 3. m) pontban ismertettük, egy Xbal-Ncol fragment formájában lehet beépíteni. A teljes szekvenciát ezután a pMOG23 bináris vektorba klónozzuk egy Xhol enzimmel végzett teljes és az EcoRI enzimmel végzett részleges emésztés, illetve Xbal restrikciós enzimmel végzett teljes és EcoRI restrikciós enzimmel végzett részleges emésztés után, így kapjuk a pMOG712 bináris vektort (14. ábra).
p) A pMOG713 plazmid készítése; egy bináris vektor, amely egy csonkított promotert tartalmaz (A-0,3TobRB7-5A), valamint egy antiszensz glicerin3-foszfát-acetil-transzferáz gént
A glicerin-3-foszfát-acil-transzferáz ATS1 kiónját (EMBL letéti szám D00673) Arabidopsis thalianából izoláltuk, ebből a fajból készített mRNS-ből készült cDNS-t használva PCR-eljárásban. Az alábbi indítómolekulákat használtuk az amplifikálásban:
5’ GCCCGGGATCCGGTTTATCCACTCG 3’ (SEQ IDNO: 15) és
5’ GAGTATTTTCCATGGATTGTGTTTGTG 3’ (SEQ IDNO: 16).
Ez mind Smal, mind BamHI, illetve Ncol hasítási helyet hoz létre, amelyek az ATS1 kiónt határolják. Ezt követően a PCR-fragmentet Smal és Ncol restrikciós
HU 218 897 Β enzimekkel emésztjük, majd így szubklónozzuk pMOG445 plazmidba. (A pMOG445 egy pUC18-származék, amely egy oligonukleotidadaptemek a többszörös klónozóhelybe való beillesztésével Clal, Ncol és BglII restrikciós hasítási helyeket tartalmaz az EcoRI és SstI hasítási helyek között). Ezt követően az ATS1 kiónt Ncol és részleges BamHI emésztés után izoláljuk, majd antiszensz módon klónozzuk pMOG707 plazmidba, a nopalin-szintetáz terminátor elé. A A-0,3TobRB7-5A csonkított promoterszekvenciát [Yamamoto et al., Plánt Cell, 3, 371-382 (1991)], izolálását a 3. m) pontban ismertettük, egy Xbal-Ncol fragment formájában lehet beépíteni. A teljes szekvenciát ezután a pMOG23 bináris vektorba klónozzuk EcoRI restrikciós enzimmel, és a többi megmaradt egyedi restrikciós enzim közül eggyel végzett emésztés után, így kapjuk a pMOG713 bináris vektort (14. ábra).
q) A pMOG714 plazmid készítése; egy bináris vektor, amely egy csonkított promotert (A-0,3TobRB7-5A) és egy antiszensz adenin-nukleotid-transzlokátor gént tartalmaz.
A mitokondriális adenin-nukleotid-transzlokátor kiónt [PANT1, EMBL letéti száma X57557; Winning et al., Plánt J., 2, 763-773 (1992)] Solanum tuberosuwból izoláljuk, ebből a fajból készített mRNS-ből készült cDNS-t használva PCR-eljárásban. Az alábbi indítómolekulákat használtuk az amplifikálásban:
5’ GCTAGCCGGATCCATCTGAGCTCCAG 3’ (SEQIDNO: 17) és
5’ GACGTCCATGGCTGAATTAGCCACCACG 3’ (SEQ ID NO: 18).
Ezt követően a PCR-fragmentet BamHI és Ncol restrikciós enzimekkel emésztjük, majd antiszensz irányban klónozzuk a pMOG707 plazmidba a nopalin-szintetáz terminátor elé. A A-0,3TobRB7-5A csonkított promoterszekvenciát [Yamamoto et al., Plánt Cell, 3, 371-382 (1991)], izolálását a 3. m) példában ismertettük, egy Xbal-Ncol fragment formájában lehet beépíteni. A teljes szekvenciát ezután a pMOG23 bináris vektorba klónozzuk, EcoRI restrikciós enzimmel, és a többi megmaradt egyedi restrikciós enzim közül eggyel végzett emésztés után, így kapjuk a pMOG714 bináris vektort (14. ábra).
r) A pMOG715 plazmid készítése; egy bináris vektor, amely egy csonkított promotert A-0,3TobRB7-5A) és egy antiszensz ATP-szintetáz gént tartalmaz.
Az ATP-szintetáz béta-alegységének kiónját [Boutry and Chua, EMBO J., 4,2159-2165 (1985)] dohányból izoláljuk (Nicotiana plumbaginifolia), ebből a fajból készített mRNS-ből készült cDNS-t használva PCR-eljárásban. Az alábbi indítómolekulákat használtuk az amplifikálásban:
5’ CCCTCCAGGATCCCTTCTCGGAGGCTTC 3’ (SEQIDNO: 19) és
5’ GAAAAGAAAGCCATGGAACTTTATAATC 3’ (SEQ IDNO: 20).
Ezzel mind BamHI, mind Ncol hasítási helyet lehet bejuttatni az ATP-szintetáz határolószekvenciáiként. Ezt követően a PCR-fragmentet BamHI és Ncol restrikciós enzimekkel emésztjük, majd antiszensz irányban klónozzuk a pMOG707 plazmidba a nopalin szintetáz terminátor elé. A A-0,3TobRB7-5A csonkított promoterszekvenciát [Yamamoto et al., Plánt Cell, 3, 371-382 (1991)], izolálását a 3. m) példában ismertettük, egy Xbal-Ncol fragment formájában lehet beépíteni. A teljes szekvenciát ezután a pMOG23 bináris vektorba klónozzuk, EcoRI restrikciós enzimmel és a többi megmaradt egyedi restrikciós enzim közül eggyel végzett emésztés után, így kapjuk a pMOG715 bináris vektort (14. ábra).
s) A pMOG719, egy bináris plazmid leírása, amely egy B típusú promotert, és egy értelmes heterológ, az életképesség szempontjából lényeges gént tartalmaz.
Ezt a leírást az általános ismertetés céljával adjuk meg; a PMOG719 egy pMOG22-származék, és egy első növényi transzformációban használjuk, ezt követi azután egy transzformáció egy bináris vektorral, a 3. n)-r) példákban leírtak alapján. A pMOG719 konstrukció egy B-promotert tartalmaz, egy értelmes génhez fuzionáltatva, amely olyan fehérjét vagy polipeptidet, amely funkcionálisan hasonlít a 3. n)-r) példákban említett antiszensz génhez, de nukleotidszekvenciája heterológ (15. ábra). Az antiszensz transzgén és az értelmes transzgén által kódolt transzkriptumok nukleotidszekvencia-azonossága 90%-nál kisebb, előnyösen 80%-nál kisebb, de sokkal előnyösebb, ha 75%-nál kisebb. Az értelmes transzgént a célfajtól eltérő fajból lehet izolálni. Az ilyen heterológ génekre példaként az alábbi konstrukciókat adjuk meg:
- a pMOG180 expressziós kazettát (1. példa, 35S promoter/nos terminátor) a pMOG22 plazmidba egy EcoRI-HindlII fragment formájában visszük át, így kapjuk a pMOG22bis plazmidot;
- a pMOG719-l plazmid: a glicerin-3P-aciltranszferázt kódoló gént [Ishizaki et al., FEBS Lett., 238, 424-430 (1980); EMBL letéti száma Y00771] tök-cDNS-ből izoláljuk PCR-amplifikálással, az alábbi indítómolekulák felhasználásával:
5’ GCTTCCAGATCTATGGCGGAG 3’ (SEQ ID NO: 21) és
5’ GATTACCAAAAGATCTGATGTTG 3’ (SEQ IDNO: 22).
Az amplifikált fragmentet BglII restrikciós enzimmel emésztjük, majd a pMOG22bis bináris vektorba klónozzuk, amelyet előzőleg BamHI enzimmel linearizáltunk, így kapjuk a pMOG719-l bináris vektort. Ezt a vektort restrikciós emésztéssel leellenőrizzük, hogy a G3PT inszertet a helyes, értelmes orientációban tartalmazza-e;
- a pMOG719-2 plazmid: az adenin-nukleotidtranszlokátort kódoló gént [Baker and Leaver, Nucleic Acids Research, 13, 5857-5867 (1985); EMBL letéti száma X02842] kukorica-cDNS-ből izoláljuk PCR-amplifikálással, az alábbi indítómolekulák alkalmazásával:
5’ GAATTCGGATCCTGATGCCAGACCCCGCTCTGTG 3’ (SEQ ID NO: 23) és
5’ GGACCGGGATCCCACACTGCTCTTG 3’ (SEQ IDNO: 24).
Az amplifikált fragmentet BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a pMOG22bis bináris vektorba
HU 218 897 Β klónozzuk, amelyet előzőleg BamHI restrikciós enzimmel linearizáltunk, így kapjuk a pMOG719-2 bináris vektort. Ezt a vektort restrikciós elemzéssel leellenőrizzük, hogy az ANT-inszert a helyes, értelmes orientációban található-e;
- a pMOG719-3 plazmid: az ATP-szintetáz bétaalegységét kódoló gént [Winning et al., Nucleic Acids Research, 18, 5885 (1990); EMBL letéti száma X54233] kukorica-cDNS-ből izoláljuk, az alábbi indítómolekulák alkalmazásával:
5’ CCCTGGATCCGGACCGGCCATGGC 3’ (SEQ IDNO: 25) és
5’ CAAGCAAGGATCCTCCTTATGAAGC 3’ (SEQ IDNO: 26).
Az amplifikált fragmentet tompavégűvé tesszük, majd pUC9 plazmidba szubklónozzuk [Vieira & Messing, Gene, 19, 259-268 (1982)], amelyet Smal és HincII restrikciós enzimmel linearizálunk. A kapott vektort BamHI restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük, majd részlegesen emésztjük Ncol restrikciós enzimmel, és a pMOG22bis plazmidba klónozunk, így kapjuk a pMOG719-3 bináris vektort. Ezt a vektort restrikciós elemzéssel ellenőrizzük, hogy az ATP-szintetáz inszertet a helyes, értelmes orientációban tartalmazza-e.
4. példa
A bináris vektorok mobilizációja Agrobacteriumha
A 3. példában ismertetett bináris vektorokat háromszülős keresztezéssel mobilizáljuk, Escherichia coli K-12 HB-101 törzset alkalmazva (amely az RK2013 plazmidot tartalmazza) [Ditta et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 7247-7351 (1980)], Agrobacterium tumefaciens MOG101 vagy LBA4404 törzsbe (II. példa) [Hoekema et al., Natúré, 303, 179-180 (1983)], amely a T-DNS növényekbe való transzferéhez szükséges virulenciagéneket tartalmazza.
5. példa
Növények transzformálása
a) Arabidopsis thaliana transzformálása
Az Arabidopsis thaliancd. úgy transzformáljuk, hogy a növényi szövetet együtt tenyésztjük Agrobacterium tumefaciens MOG101 törzzsel, amely a 3. példában ismertetett bináris vektorok közül egyet hordoz. A transzformációt úgy hajtjuk végre, hogy az Arabidopsis thaliana (C24-es ekotípus) gyökérszegmentjeit Valvekens és munkatársai leírása szerint [Valvekens et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 5536-5540 (1988)] együtt tenyésztjük. A transzgenikus növényeket a szelekciós táptalajon növekedő hajtásokból regeneráljuk (vagy kanamicinen, vagy higromicinen való növekedés, attól függően, hogy milyen bináris plazmidot használtunk, a pMOG23-at vagy a pMOG22-t), meggyökereztetjük, majd sarjaztató táptalajra vagy talajra visszük. A fiatal növényeket érettségig neveljük, majd hagyjuk, hogy beporozzák saját magukat és magot hozzanak.
b) Burgonya (Solanum tuberosum sp.) transzformálása
A burgonyát úgy transzformáljuk, hogy a növényi szövetet együtt tenyésztjük Agrobacterium tumefaciens LBA4404 baktériummal, amely a 3. példában ismertetett bináris vektorokat tartalmazza. A transzformálást úgy végezzük, hogy a burgonya (Solanum tuberosum var. Desiree) gumókorongjait együtt tenyésztjük, Hoekema és munkatársai leírása szerint [Hoekema et al., Bio/Techn., 7, 273-278 (1989)]. A transzgenikus növényeket olyan hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon növekszenek (a táptalaj vagy kanamicint, vagy higromicint tartalmaz, attól függően, hogy a pMOG22 vagy a pMOG23 bináris plazmidot használtuk), meggyökereztetjük, steril parazitamentes módon sokszorozzuk merisztémahasításokkal és talajra visszük. A növényeket érettségig neveljük, majd hagyjuk, hogy gumókat hozzanak.
c) Dohány (Nicotiana tabacum SRI) transzformálása
A dohányt úgy transzformáljuk, hogy a növényi szövetet együtt növesztjük Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzzsel [Hoekema et al., Natúré, 303, 179-180 (1983)], amely a 3. példában ismertetett bináris vektorok közül egyet tartalmaz. A transzformálást úgy végezzük, hogy dohánylevélkorongokat (Nicotiana tabacum SRI) tenyésztünk együtt Horsch és munkatársai leírása szerint [Horsch et al., Science, 227, 1229-1231 (1985)]. A transzgenikus növényeket olyan hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon növekszenek (a táptalaj vagy kanamicint, vagy higromicint tartalmaz, attól függően, hogy a pMOG22 vagy a pMOG23 bináris plazmidot használtuk), meggyökereztetjük, és talajra visszük. A növényeket érettségig neveljük, majd hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák és magokat hozzanak.
6. példa
A transzgenikus Arabidopsis növények növényi parazita fonalférgekkel szembeni érzékenységének vizsgálata
A transzgenikus Arabidopsis növényeknek mind in vitro körülmények között, mind talajban vizsgáljuk az M. incognita vagy a H. schachtii cisztafonalférgekkel szembeni rezisztenciáját. Az in vitro elemzéshez a magokat a felszínükön sterilezzük, a növényeket felneveljük, majd Sijmons és munkatársai leírása szerint beoltjuk [Sijmons et al., Plánt J., 1, 245-254 (1991)]. Két héttel a fertőzés után a gyökérrendszereket vizuálisan megvizsgáljuk, hogy hány fertőzés található rajtuk, és az eredményt vad típusú Arabidopsis növényekkel kapott eredményekkel hasonlítjuk össze. Azokat a növényvonalakat tekintjük rezisztenseknek, amelyek jelentősen kisebb érzékenységet mutatnak a növényi parazita fonalférgekkel szemben (azaz a kontrollgyökereken talált nőivarú egyedekhez viszonyítva jelentős csökkenést tapasztalunk). A talajban növesztett növények esetében a hajtásokat szelektív táptalajon saijaztatjuk (10 mg/l higromicin vagy 50 mg/l kanamicin). A rezisztens hajtásokat talaj/homok keverékre (1:3 térfogat/térfogat) visszük át, 1x1x6 cm-es átlátszó műanyag csövekben. Amikor a rozetták jól kifejlődtek (körülbelül 14 nap elteltével), a tartóedényeket egyenként körül19
HU 218 897 Β belül 300 sávozott H. schachtii J2-vel oltjuk be. A H. schachtii sávozódását úgy serkentjük, hogy a cisztákat néhány napra 3 mmol/1 ZnCl2-oldatba merítjük, körülbelül 20 °C-on. 18 nappal a beoltás után a gyökereket óvatosan eltávolítjuk a talaj/homok keverékből, és savas fúkszinnal festjük [Dropkin, in: Introduction to plánt nematology, 2nd edition, Wiley & Sons, New York (1989)]. Ebben a vizsgálatban az érzékeny növények gyökérrendszerén átlagosan 17 ciszta található (4-40 ciszta/gyökérrendszer a megfigyelt tartomány). Egy genotípust akkor tartunk rezisztensnek, ha a ciszták átlagos száma gyökérrendszerenként kettőre csökken. Hasonlóképpen, a növényeket sávozott M. incognita J2-vel lehet beoltani, illetve tojásanyaggal, amit a talaj/homok keverékbe keverünk. A növényeket azután megvizsgáljuk, hogy van-e horzsolódás rajtuk, ami világosan látható azután, hogy a talaj/homok keveréket eltávolítottuk a gyökerekről.
7. példa
A transzgenikus dohánynövények növényi parazita fonalférgekkel szemben mutatott érzékenységének vizsgálata
A fonalféreg-rezisztencia elemzéséhez a talajt előre fertőzzük M. incognita tojásokkal. Ezt az oltóanyagot úgy állíthatjuk elő, hogy a M. incogni tóból törzstenyészetet tartunk fenn talajon növesztett zellemövényekben (Apium graveolens), standard üvegházi körülmények között, 25 °C alatt. Az érett zeller gyökérrendszerét, amely nagyszámú gyökércsomót, valamint érett M. incognita hímivarú egyedet tartalmaz, óvatosan lerázzuk a talaj eltávolítása céljából, majd röviden homogenizáljuk egy Waring blendorban (2 másodperc), majd 60 grammos részekre mérjük szét. Ezeket a gyökérmintákat 1 kg homok/talaj (1:1) keverékkel keveqük össze, majd transzgenikus dohánynövények növesztésére használjuk, legalább hat hétig. Minden egyes genotípusnál legalább 100 növényt használunk az egyes vizsgálatokban. A talaj/homok keveréket óvatosan kimossuk, és a gyökérrendszerenkénti horzsolásokat egy nagyítóval megszámláljuk. Ebben a vizsgálatban a kontrollnövények átlagosan 25±15 horzsolást tartalmaznak. Egy genotípust akkor tekintünk rezisztensnek, ha a horzsolások száma gyökérrendszerenként kettőre csökken.
8. példa
Transzgenikus dohánynövények növényi parazita fonalférgekkel szembeni érzékenységének elemzése
A transzgenikus burgonyanövények M. incognitával szemben mutatott rezisztenciáját úgy vizsgáljuk, hogy a burgonyanövényeket olyan talajban növesztjük 6 hétig, amelyet előre befertőztünk M. incognita tojásokkal, majd homokkal összekevertük (1:3 térfogat/térfogat), majd a talaj eltávolítása után megszámláljuk a gyökérrendszeren kifejlődött horzsolások számát. Egy másik módszer szerint a dobodéra ssp. elleni rezisztencia vizsgálatára egy zárt tartóedényt használunk. Ebben a vizsgálatban három párhuzamos 2-4 cm-es gumót viszünk át talajra, amelyet előre beoltottunk G. rostochiensis vagy G. pallida cisztáival, átlátszó tartóedényeket használunk. A perifériális gyökérrendszereket vizuálisan vizsgáljuk 7-8 héttel a csírázás után, a ciszták megjelenését vizsgálva. Egy genotípust akkor tekintünk rezisztensnek, ha a három párhuzamos közül az egyikben sincs ciszta, illetve akkor tekintjük érzékenynek, ha a három párhuzamos közül már az egyikben ciszta van.
9. példa
A GUS-aktivitás vizsgálata olyan növények táplálóstruktúráiban, amelyek transzgenikusak a kiméra 35S/GUS konstrukcióra
A pMOG25 vagy pMOG28 (35S/GUS) konstrukciók T DNS-ére transzgenikus növényi vonalakat használunk ciszta- és gyökércsomó-fonalférgekkel való fertőzéshez, majd ezt követően a GUS-aktivitás vizsgálatára [Jefferson, Plánt Mól. Bioi. Reporter, 5, 387-405 (1987)] a táplálóstruktúra belsejében. Az Arabidopsis különösen alkalmas erre a célra, mivel ezek a növények könnyen használhatók egy fertőző mikroorganizmust tartalmazó tenyészetekben, mind a Heterodera schachtii, mind a Meloidogyne incognita szervezetekkel [Sijmons et al., Plánt J., 1, 245-254 (1991)]. A táplálóstruktúra fejlődése kivételesen jól látható ezen a növényfajon, ha agarlemezen növesztjük. A fertőzött gyökérrészeket tartalmazó agardarabokat közvetlenül kivágjuk a Petri-csészékből, anélkül hogy bármi módon megzavarnánk a fonalféreg-növény kölcsönhatást, és közvetlenül arra használjuk, hogy hisztokémiai GUS-festést végezzünk 37 °C-on az 5-bróm-4-klór-3-indolil-glükuroniddal (Χ-Glu), az alábbi összetételű pufferben: 100 mmol/1 NaPi, pH=7,0, 10 mmol/1 Na2EDTA, 0,1% Triton X100, 2,1 pg/ml ferricianid, 1,6 pg/ml ferrocianid. Ezzel a növényimodell-rendszerrel a 35S promoter aktivitásának leszabályozását világosan igazoljuk celluláris szinten. Nincs kimutatható GUS-aktivitás (mivel nincs 35S promoter-aktivitás) egyik olyan sejtben sem, amely a táplálóstruktúra része, még akkor sem, ha ismételten festjük X-Glu-val. Ezzel szemben a fertőzetlen gyökerek minden részében található GUS-aktivitás, és különösen magas a fiatal gyökérszövetekben és a vaszkuláris cilinderekben. Az Arabidopsis M. incognitával való fertőzésének későbbi állapotában a 35S promoter leszabályozása a táplálóstruktúrán kívül is megfigyelhető.
A transzgenikus dohánynövényeket talajban oltjuk be dobodéra tabacummal vagy M. incognitával, és a táplálóstruktúrák megfelelő kifejlődése után elemezzük. Ebből a célból a gyökereket óvatosan mossuk a talaj eltávolítása céljából, Χ-Glu vizsgálópufferben inkubáljuk, majd duplán festjük a fonalférgek kimutatása céljából savas fúkszinnal [Dropkin, in: Introduction to plánt nematology, 2nd edition, Wiley & Sons, New York (1989)].
Hasonló kísérleteket végzünk transzgenikus burgonyával, dobodéra rostochiensisszel, G. pallidával vagy M. incognitával való talajban való beoltás után. A GUS-aktivitás egyik esetben sem mutatható ki a táplálóstruktúrákban, míg a fertőzetlen gyökérrészekben a 35 S promotertől várt expressziét figyelhettük meg. így
HU 218 897 Β a CaMV35S promoter megfelel azoknak a követelményeknek, amiket ebben az alkalmazásban a B típusú promotertől elvárunk.
10. példa
A GUS-aktivitás elemzése a kiméra ro/D/GUS konstrukcióra transzgenikus növények táplálóstruktúráiban
A pMOG630 (ro/D/GUS) konstrukció T-DNS-ére transzgenikus növényi vonalakat használunk cisztavagy gyökércsomó-fonalférgekkel való fertőzéshez, majd a GUS-aktivitás ezt követő elemzésére, amint azt az előző példában ismertettük. Itt ismét világosan igazolni lehet a ro/D promoter aktivitásának leszabályozását celluláris szinten. Nincs kimutatható GUS-aktivitás (mivel nincs ro/D promoter-aktivitás) a táplálóstruktúrák részét képező sejtekben, még X-Glu-val történő ismételt festés után sem. Ezzel szemben a fertőzetlen gyökerekben a GUS-aktivitás minden gyökérrészben megfigyelhető, és különösen magas a fiatal gyökérszövetben, beleértve a vaszkuláris cilindert, az epidermiszt és a gyökérszőröket. így az Agrobacterium rhizogenes rolD promotere megfelel az ebben az alkalmazásban a B típusú promoterekkel szemben támasztott feltételeknek.
11. példa
A GUS-aktivitás elemzése olyan növények táplálóstruktúrájában, amelyek a kiméra csonkított ro/C/GUS konstrukcióra transzgenikusak
A pMOG679 (csonkított ro/C/GUS) konstrukció T-DNS-ére transzgenikus növényi vonalakat használjuk ciszta- vagy gyökércsomó-fonalférgekkel való fertőzéshez, majd a GUS-aktivitás elemzéséhez, a 6. példában leírtak alapján. A 35S vagy ro/D promoterrel ellentétben, ugyanakkor számos más promoterrel is ellentétben, amelyeket hasonló körülmények között vizsgáltunk, egy 5’ csonkított ro/C promoter/GUS fúzió kék csapadékot eredményez a táplálóstruktúrán belül, ha a megfelelő szubsztrátot adjuk a sejtekhez. Tehát az Agrobacterium rhizogenes 5’ csonkított promotere megfelel azoknak a követelményeknek, amelyeket ebben az alkalmazásban az A típusú promoterrel szemben állítottunk.
12. példa
Az A-promoter típusú szabályozószekvenciák azonosítása transzgenikus növények fonalféreg-tápláló struktúráiban
a) Az Arabidopsis transzformálása pMOG452-vel
Az Arabidopsist Agrobacterium MOG101 törzzsel transzformáljuk, amely a pMOG452 bináris vektort (promoter nélküli GUS, a T-DNS jobb karjához fúzionáltatva) tartalmazza, az 5. példában ismertetett eljárást alkalmazva.
b) A GUS-aktivitás elemzése a promoter nélküli GUS-konstrukcióra transzgenikus növények tápláló struktúráiban
Transzgenikus növényi vonalakat (pMOG452, T2 vagy későbbi generációk) használunk növényi parazita fonalférgekkel való fertőzéshez, majd az ezt követő GUS-elemzéshez, a 9. példában leírtak alapján. Egy ilyen, H. schacstiival végzett szűrővizsgálati kísérletből kapott eredmények meglepően nagy számban eredményeztek a szcincíciumban GUS-aktivitással rendelkező növényeket, miközben az egyéb növényi részekben nem volt kimutatható, vagy nagyon alacsony volt a GUS-aktivitás, ezzel jelezve, hogy a szabályozószekvenciák, amelyek a gének aktivitását vezérlik a fonalféreg-tápláló struktúrákban, a GUS-génhez kapcsolódtak, és így alkalmasak arra, hogy az ilyen szabályozószekvenciákat gyorsan izolálni lehessen. A 13 független transzgenikus növényvonal közül egy vonal mutatott kapcsolt promotert, amely csak a gyökerekben volt aktív, és a fonalféreg-tápláló struktúrán belül maradtak aktívak. Ezt meg lehet erősíteni egy promoter nélküli GUS-konstrukcióra transzgenikus Arabidopsis növényekkel, amint azt Topping és munkatársai [Topping et al., Developm., 112, 1009-1019 (1991)]. A 25 transzgenikus növényi vonal közül kettő GUS-aktivitást mutatott a fonalféreg-tápláló struktúrát tartalmazó sejtekben. Ez a magas gyakoriság azt mutatja, hogy a jelzés megfelelő, és ezért alkalmas olyan szabályozószekvenciák izolálására, amelyek kielégítik az A típusú promoterrel szemben támasztott követelményeket. A fordított helyzet (GUS-aktivitás az egészséges vaszkuláris cilinderekben, de leszabályozott aktivitás a fejlődő táplálóstruktúrákban) még nagyobb gyakorisággal figyelhető meg, és ennélfogva a módszer elvileg alkalmas olyan szabályozószekvenciák azonosítására is, amelyek kielégítik a B típusú promoterrel szemben támasztott követelményeket.
c) A-promoter típusú szabályozószekvenciák izolálása a fonalféreg-tápláló struktúrákban GUS-t expresszáló transzgenikus növényekből
Azokat a növényi vonalakat izoláljuk, amelyek GUS-aktivitást expresszálnak a fonalféreg-tápláló struktúrákon belül, és előnyösen nincs vagy nagyon alacsony az aktivitásuk más szövetekben, és ezeket használjuk genomiális DNS izolálására. Az integrálódott GUS-gén előtti (5’) szabályozószekvenciákat az alábbi lépésekben izoláljuk, fordított PCR alkalmazásával [Does et al., Plánt Mól. Bioi., 17, 151-153 (1991)], az alábbi indítómolekulákat használva:
5’ CCAGACTGAATGCCCACAGGC 3’ (SEQ ID NO: 27) és
5’ GGTGACGCATGTCGCGCAAG 3’ (SEQ ID NO: 28).
Az amplifikált fragmentet használjuk egy Arabidopsis genomiális könyvtár átvizsgálására, olyan genomiális kiónok izolálása céljából, amelyek olyan szabályozószekvenciákat tartalmaznak, amelyek megfelelnek az A típusú promoterekkel szemben támasztott követelményeknek. Egy másik módszer szerint a GUS-gén első 200 bázispárját használhatjuk próbaként egy, a kiválasztott növényekből készített genomiális könyvtár átvizsgálásához.
13. példa
Barstar szintézise transzgenikus növényekben, B típusú promoterek által szabályozva
HU 218 897 Β
A barstar gént expresszáló növények Westem-blot elemzéséhez egy barstar elleni antiszérumot használunk, amelyet az alábbiak szerint állítunk elő:
a barstar fehérjének leginkább antigéntulajdonságú determinánsait három különböző predikciós módszerrel határozzuk meg, amelyek a hidrofilitáson, flexibilitáson és a béta-kanyarokon alapulnak. Ennek az elemzésnek az alapján három pepiidet szintetizálunk automatizált peptidszintetizátorral, amelyeknek a szekvenciája az alábbi:
a) Ala-Glu-Ser-Val-Leu-Gln-Val-Phe-Arg-GluAla-Lys-Ala-Glu-Gly (SEQ ID NO: 29)
b) Arg-Gln-Phe-Glu-Gln-Ser-Lys-Gln-Leu-ThrGlu-Asn-Gly-Ala-Glu (SEQ ID NO: 30)
c) Leu-Lys-Lys-Glu-Leu-Ala-Leu-Pro-Glu-Tyr-TyrGly-Asn-Leu-Asp (SEQ ID NO: 31)
Ezeket a peptideket megtisztítjuk, majd mindegyikből 1,5-1,5 mg-ot kapcsolunk 7,5 mg szarvasmarha-szérumalbuminhoz (BSA), glutáraldehid felhasználásával. A keletkező konjugátumokat elemeztük, és meghatároztuk, hogy az (a) peptidből 7,5 mól jutott egy mól BSAra, a (b) peptidből 10,0 mól jutott egy mól BSA-ra, és a (c) peptidből 6,7 mól jutott egy mól BSA-ra. A konjugátumokat 50 mmol/1 HEPES, 100 mmol/1 NaCl összetételű oldatban oldjuk, 1 mg/ml végkoncentrációban, és összekeveijük. Nyulakat injekciózunk 0,15 ml kevert konjugátummal Freund-féle komplett adjuvánsban, majd háromszor megismételjük, erósítőinjekciókat adva 0,15 ml kevert konjugátumból, inkomplett Freund-féle adjuvánsban. A keletkező szérumot részlegesen tisztítjuk, és az antitestfrakciót -80 °C-on tároljuk. Ezt a szérumot használjuk 5000-10 000-szeres hígításban, 0,5% zsírmentesített száraz tejet tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldat, 1% Tween 20, 0,5% Triton X-100 összetételű oldatban. A Westem-elemzéshez nyers növényi kivonatokat választunk el 10-27% gradiens SDS-PAGE-n, majd nitro-cellulózra elektroblottoljuk. A barstar antitesteket kecske-anti-nyúl-peroxidáz konjugátumokkal mutatjuk ki, majd Amersham (UK) ECL-módszerrel detektáljuk.
Az Arabidopsis, dohány és burgonya választása a barstar és a bamase expressziós konstrukciók bejuttatására az Arabidopsisnák azon a kiváló tulajdonságán alapul, hogy a növény-fonalféreg kölcsönhatásokat jól lehet elemezni rajta [Sijmons et al., Plánt J., 7, 245-254 (1991)], valamint a dohány és a burgonya transzformálására rendelkezésre álló kiváló transzformációs kísérleti leírásokon, és semmi esetre sem célunk, hogy a találmány oltalmi körét azokra a növényfajokra korlátozzuk, amelyeket a találmány megvalósítása során alkalmazunk.
Az Arabidopsist olyan Agrobacterium MOG101 törzzsel transzformáljuk, amely a pMOG583 vagy a pMOG716, vagy a pMOG718 bináris vektort tartalmazza, mindegyiket a 3. példában ismertettük, az 5. példa
a) pontjában ismertetett eljárások alapján. A transzformánsokat szelektív táptalajon regeneráljuk, amely 10 mg/1 higromicint tartalmaz. Hagyjuk, hogy mindegyik higromicinrezisztens növény beporozza önmagát, majd a kapott magokat higromicintartalmú közegben csíráztatjuk, és Westem-blottal vizsgáljuk a barstar gén expresszióját, BSA-barstar konjugátumok elleni antitestek felhasználásával. A magas, közepes és alacsony expressziót mutató növények egy-egy képviselőjét használjuk a második transzformálási kísérletben.
A dohányt és a burgonyát olyan Agrobacterium LBA4404 törzzsel transzformáljuk, amely a pMOG583 vagy a pMOG716, vagy a pMOG718 bináris vektort tartalmazza. Ezeket a vektorokat a 3. példában ismertettük, az 5. b) és 5. c) példákban ismertetett eljárásokat alkalmazva a transzformálásra. A transzformánsokat szelektív táptalajon regeneráljuk, majd hagyjuk, hogy a rezisztens növények önmagukat beporozzák, vagy klónozással szaporítjuk őket. A dohány esetében a kapott magvakat szelektív táptalajon csíráztatjuk, majd vizsgáljuk a barstar gén expresszióját Westem-blottal vizsgáljuk, barstar elleni antitestek felhasználásával. A klónozással szaporított burgonyaklónoknak is vizsgáljuk a barstar expresszióját, miután a növényeket talajra vittük át. A magas, közepes és alacsony expressziót mutató növények egy-egy képviselőjét használjuk a második transzformálási kísérletben.
14. példa
A 13. példából származó, promoter nélküli bamase DNS-szekvenciák bejuttatása barstart expresszáló növényekbe, és a növényi parazita fonalférgekkel szemben mutatott csökkent érzékenység vizsgálata
a) Az Arabidopsis transzformálása pMOG589i plazmiddal
A 13. példából kiválasztott Arabidopsis növényvonalakat, amelyek a barstar gént expresszálják a pMOG589i bináris vektort (3. példa) tartalmazó Agrobacterium MOG101 bináris vektorral transzformáljuk, a 6. példában ismertetett eljárás alkalmazásával. A transzformánsok regenerálását 50 mg/ml kanamicint tartalmazó közegben végezzük. Mindegyik kanamicinrezisztens regeneránst érettségig neveljük, hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák, és vizsgáljuk, hogy van-e közöttük deviáns fenotípusú. Az összes, normál fenotípusú növényből származó magvat kanamicinen csíráztatjuk, majd felneveljük, hogy megtermelje a magvak következő generációját. A kanamicint tartalmazó közegen végzett következő csíráztatási lépés lehetővé teszi azoknak a növényeknek az azonosítását, amelyek az NPTII génre homozigóták.
b) A transzgenikus Arabidopsis növényi parazita fonalférgekkel szemben tanúsított érzékenységének elemzése.
A 14. példa a) pontja szerint előállított növényeket használjuk annak megállapítására, hogy mennyire érzékenyek a növényi parazita fonalférgekre, a 6. példában leírtak alapján. Ezekből az elemzésekből számos olyan növényi vonalat sikerült azonosítanunk, amelyek csökkent érzékenységet mutatnak a növényi parazita fonalférgekkel szemben (azaz például a ciszták száma csökken, átlagos értéke 10 cisztánál kevesebb gyökérrendszerenként), főleg azok között a vonalak között, amelyeket a 13. példában a magas barstar expresszió alapján választottunk ki. Emellett számos aberráns fenotípust (azaz például csökkent életképesség, steril, nem virágzó, kis gyökérrendszer) figyeltünk meg, valószínűleg a
HU 218 897 Β bamase gén helyi expressziója következtében. Az integrálódott bamase gén előtti (5’) szabályozószekvenciákat fordított PCR segítségével izoláljuk [Does et al., Plánt Mól. Bioi., 17, 151-153 (1991)]. Az amplifikált fragmentet használjuk az Arabidopsis genomiális könyvtár átvizsgálására, olyan genomiális kiónok izolálása céljából, amelyek az A típusú promoterrel szemben támasztott körülményeknek megfelelnek. Egy másik módszer szerint a bamase gént használjuk próbaként a kiválasztott növényekből készített genomiális könyvtár átvizsgálására.
c) A dohány és a burgonya transzformálása pMOG591bis plazmiddal.
Azokat a szabályozószekvenciákat, amelyeket az ebben a példában ismertetett eljárásokkal azonosítottunk, használhatjuk arra, hogy a pMOG591i (3. példa) többszörös klónozóhelyére illesszük be, így hozva létre a pMOG591bis bináris vektort. Ezt a vektort azután egy második növényi transzformációban használjuk, például olyan dohány- vagy burgonyanövények transzformációjában, amelyeket a 13. példában a magas barstar expresszió alapján kiválasztottunk. A kapott dupla transzformánsoknak vizsgálhatjuk a növényi parazita fonalférgekkel szembeni csökkent érzékenységét, a 7. és 8. példában leírtak alapján.
75. példa
Csonkított rolC promoter/bamase DNS-szekvenciák bejuttatása barstart expresszáló növényekbe
A 13. példában kiválasztott növényi vonalakat használjuk a pMOG717i (csonkított ro/C/bamase; 3. példa) bináris vektort tartalmazó Agrobacterium MOG101 vagy LBA4404 törzzsel való transzformációhoz, a 6. példában ismertetett eljárásokat alkalmazva. A transzformánsok regenerálását kanamicint tartalmazó közegen végezzük. Mindegyik kanamicinrezisztens regeneránst érettségig neveljük, hagyjuk, hogy beporozzák önmagukat vagy gumókat hozzanak létre (fajtól függően), és vizsgáljuk a deviáns fenotípusokat. Az önbeporzó fajok esetében mindegyik, normál fenotípusú növényt kanamicinen regeneráljuk, majd felneveljük, hogy megtermeljék a magvak következő generációját. A kanamicint tartalmazó közegen végzett következő regenerálással az NPTII génre homozigóta növényi vonalakat lehet azonosítani. A burgonya esetében a transzgenikus növényeket klónozással szaporítjuk.
b) A kettős transzformáns növényi vonalak elemzése a növényi parazita fonalférgekkel szemben tanúsított érzékenységük alapján
Azokat a növényeket, amelyek már transzgenikusak a barstar génre (akár a pMOG583, akár a pMOG716, akár a pMOG718 miatt) és a bamase génre (pMOG717i) vizsgáljuk, hogy mennyire érzékenyek a növényi parazita fonalférgekre, a 6-8. példákban leírtak alapján. Ezeknek az elemzéseknek az alapján olyan növényi vonalakat lehet azonosítani, amelyek a növényi parazita fonalférgekkel szemben jelentősen csökkent érzékenységet mutatnak (azaz a kontrollgyökerekkel összehasonlítva a ciszták és horzsolódások száma jelentősen csökkent), különösen azoknál a vonalaknál, amelyeket a 13. példában a barstar magas szintű expressziója alapján választottunk ki.
16. példa
A A-0,3TobRB7-5A promoter/bamase DNS-szekvenciák bejuttatása barstart expresszáló növényekbe
A 13. példában kiválasztott növényi vonalakat használjuk a pMOG699i bináris vektort (3. példa) tartalmazó Agrobacterium MOG101 vagy LBA4404 mikroorganizmussal való transzformációban, az 5. példában ismertetett eljárásokat alkalmazva. A transzformánsok regenerálását kanamicint tartalmazó táptalajon végezzük. Mindegyik kanamicinrezisztens regeneránst érettségig neveljük, hagyjuk, hogy beporozza önmagát vagy gumót képezzen (a fajtól függően), és vizsgáljuk a deviáns fenotípusokat. Az önbeporzó fajoknál mindegyik normális fenotípusú növényt kanamicinen csíráztatjuk, majd felneveljük, hogy megtermelje a magvak következő generációját. A következő csíráztatás kanamicint tartalmazó táptalajon lehetővé teszi, hogy azonosítsuk azokat a növényi vonalakat, amelyek homozigóták az NPTII génre. A burgonya esetében a transzgenikus növényi vonalakat klónozással szaporítjuk.
b) A duplán transzgenikus növények növényi parazita fonalférgekkel szemben tanúsított érzékenységének elemzése
Azokat a növényeket, amelyek már mind a barstarra (vagy a pMOG583, vagy a pMOG716, vagy a pMOG718 következtében), mind a bamase konstrukcióra (pMOG699i) transzgenikusak, a 6-8. példákban leírtak alapján vizsgálhatjuk a növényi parazita fonalférgekkel szemben tanúsított érzékenységük alapján. Ezekből az elemzésekből olyan növényi vonalakat lehet azonosítani, amelyek jelentősen csökkent érzékenységet mutatnak a M. incognitávai szemben (azaz a kontroligyökerekkel összehasonlítva jelentősen csökken a horzsolások száma), különösen azok közül a vonalak közül, amelyeket a 13. példában a barstar magas expressziója alapján kiválasztottunk.
7. példa
Növényi parazita fonalférgekkel szembeni csökkent érzékenység kialakítása egyetlen transzformációs lépésben
Egy másik módszer szerint olyan bináris vektorokat készítünk, amelyek mind a barstar, mind a bamase szabályozott expressziójához szükséges expressziós kazettákat tartalmazzák a 3. példa g)-m) pontjaiban ismertetett DNS-fragmentekből oly módon, hogy az megfelel a jelen találmány általános leírásában ismertetetteknek, az 1. ábrán látható módon. Az ilyen bináris vektorokat azután arra lehet használni, hogy olyan növényeket állítsunk elő, amelyek a növényi parazita fonalférgekkel szemben csökkent érzékenységgel rendelkeznek, egyetlen transzformációs lépésben, és a kapott növényi vonalakat a 6-8. példákban leírtak alapján elemezzük.
18. példa
Növényi parazita fonalférgekkel szembeni csökkent érzékenység kialakítása A-promoter/antiszensz homo23
HU 218 897 Β lóg, az életképesség szempontjából lényeges gén és Bpromoter/értelmes, heterológ, az életképesség szempontjából lényeges gén bináris konstrukció alkalmazásával
Ezek a példák a kétkomponensű rendszereknek ugyanazon a koncepcióján alapulnak, amit az 1. ábrán mutatunk be. Ez magában foglalja egy homológ génnek a helyi (táplálóstruktúra) antiszensz expresszióját (amely gént előnyösen a célfajból izolálunk), és amely gén a sejt metabolizmusa szempontjából létfontosságú, valamint egy második transzgén expresszióját, amelyet ha expresszálunk, akkor képes teljesen vagy részlegesen semlegesíteni az első transzgén által keltett hatásokat, és amely valójában egy heterológ génnek egy értelmes konstrukciója, valamint a táplálóstruktúrán kívüli sejtekben expresszálódik.
a) A A-0,3TobRB7 promoter és az antiszensz NADPH-citokróm P450-ATR1 gén kiméra DNSszekvenciák bejuttatása a fonalférgek által okozott táplálóstruktúrák specifikus represszálása érdekében ArabidopsisVma
A B típusú promoterből és egy, a NADPH-CytP450-ATRl-reduktáz heterológ génből álló konstrukcióra transzgenikus Arabidopsis növényeket használunk egy második transzformációs lépésben, oly módon, hogy a növényi szövetet együtt tenyésztjük Agrobacterium tumefaciens MOG101 törzzsel, amely a pM0G711 bináris vektort tartalmazza, az 5. példában leírtak alapján. A transzgenikus növényeket olyan hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon növekednek, meggyökereztetjük őket, és a csíráztatáshoz táptalajra vagy talajba tesszük őket. A fiatal növényeket érettségig növesztjük, majd hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák és magot hozzanak. A mind az antiszensz, mind az értelmes konstrukcióra transzgenikus növényeket a leírtak szerint megvizsgáljuk, hogy csökkent-e az érzékenységük a növényi parazita fonalférgekkel szemben.
b) A A-0,3TobRB7 promoter és az antiszensz NADPH-citokróm P450, ATR2 gén kiméra DNSszekvenciák bejuttatása a fonalférgek által okozott táplálóstruktúrák specifikus represszálása érdekében Arabidopsisbm
A B típusú promoterből és egy, a NADPH-CytP450-ATR2-reduktáz heterológ génből álló konstrukcióra transzgenikus Arabidopsis növényeket használunk egy második transzformációs lépésben, oly módon, hogy a növényi szövetet együtt tenyésztjük Agrobacterium tumefaciens MOG101 törzzsel, amely a pMOG712 bináris vektort tartalmazza, az 5. példában leírtak alapján. A transzgenikus növényeket olyan hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon növekednek, meggyökereztetjük őket, és a csíráztatáshoz táptalajra vagy talajba tesszük őket. A fiatal növényeket érettségig növesztjük, majd hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák és magot hozzanak. A mind az antiszensz, mind az értelmes konstrukcióra transzgenikus növényeket a leírtak szerint megvizsgáljuk, hogy csökkent-e az érzékenységük a növényi parazita fonalférgekkel szemben.
c) A 35S promoter és a tök-glicerin-3-foszfátacil-transzferázt kódoló kiméra DNS-szekvenciák bevitele
Az Arabidopsis növényeket pMOG719-l vektorral transzformáljuk oly módon, hogy a növényi szövetet együtt tenyésztjük Agrobacterium tumefaciens MOG101 törzzsel, amely a bináris vektort tartalmazza, az 5. példában leírtak alapján. A transzgenikus növényeket olyan hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon növekednek, meggyökereztetjük őket, és a csíráztatáshoz táptalajra vagy talajba tesszük őket. A fiatal növényeket érettségig növesztjük, majd hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák és magot hozzanak. A homozigótavonalakat az utódok elemzése útján választjuk ki, szelektív táptalajon való csíráztatással. A heterológ gén expressziós szintjét Northem-blottal elemezzük.
d) A A-0,3TobRB7 promoter és az antiszensz glicerin-3-foszfát-acil-transzferáz gén kiméra DNS-szekvenciájának bejuttatása, azzal a céllal, hogy Arabidop.v/.s'ban specifikusan elnyomjuk a fonalférgek által indukált táplálóstruktúrákat
A pMOG719-l konstrukció T-DNS-ére transzgenikus Arabidopsis növényeket használjuk egy második transzformációs kísérletben, oly módon, hogy a növényi szövetet együtt tenyésztjük Agrobacterium tumefaciens MOG101 törzzsel, amely a pMOG713 bináris vektort tartalmazza, az 5. példában leírtak alapján. A transzgenikus növényeket olyan hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon növekednek, meggyökereztetjük őket, és a csíráztatáshoz táptalajra vagy talajba tesszük őket. A fiatal növényeket érettségig növesztjük, majd hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák és magot hozzanak. A mind az antiszensz, mind az értelmes konstrukcióra transzgenikus növényeket a leírtak szerint megvizsgáljuk, hogy csökkent-e az érzékenységük a növényi parazita fonalférgekkel szemben.
e) A 35S promoter és a kukorica-adenin-nukleotid-transzlokátor kiméra DNS-szekvenciák bejuttatása
A dohánynövényeket pMOG719-2 vektorral transzformáljuk oly módon, hogy a növényi szövetet együtt tenyésztjük Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzzsel, amely a bináris vektort tartalmazza, az 5. példában leírtak alapján. A transzgenikus növényeket olyan hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon növekednek, meggyökereztetjük őket, és a csíráztatáshoz táptalajra vagy talajba tesszük őket. A fiatal növényeket érettségig növesztjük, majd hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák és magot hozzanak. A homozigótavonalakat az utódok elemzése útján választjuk ki, szelektív táptalajon való csíráztatással. A heterológ gén expressziós szintjét Northem-blottal elemezzük.
f) A A-0,3TobRB7 promoter és az antiszensz adenin-nukleotid-transzlokátor génből álló kiméra DNSszekvenciák bejuttatása, azzal a céllal, hogy specifikusan elnyomjuk a fonalférgek által indukált tápláló struktúrákat burgonyában
A pMOG719-2 konstrukció T-DNS-ére transzgenikus burgonyanövényeket használjuk egy második transzformációs kísérletben, oly módon, hogy a növé24
HU 218 897 Β nyi szövetet együtt tenyésztjük Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzzsel, amely a pMOG714 bináris vektort tartalmazza, az 5. példában leírtak alapján. A transzgenikus növényeket olyan hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon növekednek, meggyökereztetjük ókét, majd klónozással szaporítjuk. A mind az antiszensz, mind az értelmes konstrukcióra transzgenikus növényeket a leírtak szerint megvizsgáljuk, hogy csökkent-e az érzékenységük a növényi parazita fonalférgekkel szemben.
g) A 35S promoter és a kukorica-ATP-szintetáz béta-alegységét kódoló gén kiméra DNS-szekvenciák bejuttatása
Burgonyanövényeket transzformálunk pMOG719-3 plazmiddal oly módon, hogy együtt tenyésztjük az Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzzsel, amely a bináris vektort tartalmazza, az 5. példában leírtak alapján. A transzgenikus növényeket regeneráljuk a hajtásokból, majd talajra visszük, és klónozással in vitro szaporítjuk. A heterológ gén expresszióját Northem-blottal elemezzük.
h) A A-0,3TobRB7 promoter és az antiszensz ATP szintetáz gén kiméra DNS-szekvenciák bejuttatása a fonalférgek által indukált táplálóstruktúrák specifikus represszálására dohányban
A pMOG719-3 konstrukció T-DNS-ére transzgenikus dohánynövényeket használjuk egy második transzformációs kísérletben, oly módon, hogy a növényi szövetet együtt tenyésztjük Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzzsel, amely a pMOG715 bináris vektort tartalmazza, az 5. példában leírtak alapján. A transzgenikus növényeket olyan hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon növekednek, meggyökereztetjük őket, majd csíráztató táptalajra vagy talajra visszük. A fiatal növényeket érettségig neveljük, majd hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák és magot hozzanak. A mind az antiszensz, mind az értelmes konstrukcióra transzgenikus növényeket a leírtak szerint megvizsgáljuk, hogy csökkent-e az érzékenységük a növényi parazita fonalférgekkel szemben.
19. példa
Egy toxinra rezisztens transzgenikus Arabidopsis növények vizsgálata növényi parazita fonalférgekkel szembeni érzékenység szempontjából, toxikus vegyület jelenlétében
All. példából származó kiválasztott növényi vonalakat, amelyek a pMOG25 konstrukcióra transzgenikusak, és a GUS, valamint a HPT-géneket hordozzák, miközben mindegyik a CaMV 35 S promoter szabályozása alatt áll, fonalféreg-agar táptalajon csíráztatjuk [Sijmons et al., Plánt J., 1, 245-254 (1991)], amelyet 10-20 pg/ml higromicinnel egészítettünk ki (1 pg/mles lépésekben emelkedő koncentrációban), hogy meghatározzuk a szubletális higromicinkoncentráció maximumát az egyes növényekre, mivel a T-DNS-integrációs pozíciója befolyásolja a HPT-gén expresszióját, és ennek következtében a higromicinrezisztencia szintjét is. A kiválasztott vonalakból származó új magvakat friss Petri-csészéken csíráztatjuk, fonalféreg-agar táptalajon, amely a szubletális higromicinkoncentráció maximumát tartalmazza, majd beoltjuk növényi parazita fonalféreggel [Sijmons et al., Plánt J., 1, 245-254 (1991)]. A fonalférgek viselkedését naponta vizsgáljuk fordított mikroszkóppal és normális penetrációval, majd a viselkedésüket vizsgáljuk a gyökerekben a korai fertőzési stádiumban, higromicin jelenlétében. A fertőzés későbbi fázisában jelentősen csökkent számú hímivarú egyed fejlődik ki a gyökereken, ha higromicinen növesztjük. A fonalféreg-tápláló struktúrák fejlődését gátolja a helyi higromicinérzékenység, a 35S promoter leszabályozása következtében. Az alábbiakban megadjuk a találmány leírásában szereplő szekvenciák listáját.
1. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 39 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GTTTCTACAGGACGGAGGATCCTGGAAGTATTTGAAAG
2. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 20 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CAGCTATGACCATGATTACG
3. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 36 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CTGCTCGAGCCTAGGCACAGGTTATCAACACGTTTG
4. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 22 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG
5. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 27 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CTTACTCGAGCCATGGTAAGTTTCTGC
6. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 22 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG
HU 218 897 Β
7. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 22 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CTCCAAATACTAGCTCAAAACC
8. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 20 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CCTCACCATGGTTAGTTCTC
9. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 28 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CTTGAATTCTAGATAAGCTTATCTAAC
10. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 20 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CCTCACCATGGTTAGTTCTC
11. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 25 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GGCGGATCGGAGCGGGGAGCTGAAG
12. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 27 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GATACCATGGATCACCAGACATCTCTG
13. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 27 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GGTTCTGGGGATCCAAAACGTGTCGAG
14. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 28 bázisú
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GGCTTCCATGGTTTCGTTA CCATACATC
15. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza : 25 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GCCCGGGATCCGGTTTA TCCACTCG
16. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 27 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GAGTATTTTCCATGGATT GTGTTTGTG
17. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa : nukleinsav A szekvencia hossza: 27 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GCTAGCCGGATCCATCTGA GCTCCAG
18. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 29 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GACGTCCATGGCTGAATTA GCCACCACG
19. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 28 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CCCTCCAGGATCCCTTCT CGGAGGCTTC
20. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa : nukleinsav A szekvencia hossza: 28 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GAAAAGAAAGCCATGGA ACTTTATAATC
21. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 21 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GCTTCCAGATCTATGG CGGAG
22. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav
HU 218 897 Β
A szekvencia hossza: 23 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GATTACCAAAAGATCTGATGTTG
23. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 34 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GAATTCGGATCCTGATGCCAGACCCCGCTCTGTG
24. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 25 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GGACCGGGATCCCACACTGCTCTTG
25. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 24 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CCCTGGATCCGGACCGGCCATGGC
Ala-Glu-Ser-Val-Leu-Gln-Val1 5
30. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: aminosav
A szekvencia hossza: 15 aminosavmaradék A szekvencia száltípusa: egyszálas
Arg-Gln-Phe-Glu-Gln-Ser-Lys1 5
31. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: aminosav
A szekvencia hossza: 15 aminosavmaradék A szekvencia száltípusa: egyszálas
Leu-Lys-Lys-Glu-Leu-Ala-Leu1 5
26. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 25 bázis A szekvencia száltípusa: egyszálas Topológia: lineáris A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: CAAGCAAGGATCCTCCTTATGAAGC
27. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 21 bázis A szekvencia száltípusa: egyszálas Topológia: lineáris A molekula típusa: cDNS A szekvencia leírása: CCAGACTGAATGCCCACAGGC
28. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 20 bázis
A szekvencia száltípusa: egyszálas
Topológia: lineáris
A molekula típusa: cDNS
A szekvencia leírása: GGTGACGCATGTCGCG CAAG
29. számú szekvenciavázlat A szekvencia típusa: aminosav
A szekvencia hossza: 15 aminosavmaradék A szekvencia száltípusa: egyszálas Topológia: lineáris
A molekula típusa: peptid
A szekvencia leírása:
-Arg-Glu-Ala-Lys-Ala-Glu-Gly 10 15
Topológia: lineáris
A molekula típusa: peptid
A szekvencia leírása:
-Leu-Thr-Glu-Asn-Gly-Ala-Glu 10 15
Topológia: lineáris A molekula típusa: peptid A szekvencia leírása:
-Glu-Tyr-Tyr-Gly-Asn-Leu-As p
Claims (3)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy egy növényben expresszálódó gént tartalmaz, amely az alábbi sorrendben tartalmaz- egy A-promotert, amely egy utána álló gén expresszióját vezérli egy fonalférget tápláló struktúrában,- egy A-gént, amely a fonalférget tápláló struktúrában expresszálódva annak elroncsolódását okozza, és adott esetben- egy transzkripciós terminátort és egy poliadenilezési szignálszekvenciát az A-gén expresszióját a fonalférget tápláló struktúrában biztosító módon összekapcsolva.HU 218 897 Β2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy A-0,3TobRB7-5A vagy csonkított ro/C promoterből előállított promotert tartalmaz.3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy bamase génből nyert Agént tartalmaz.4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy egy gazdanövényből nyert A-gént tartalmaz a promoterhez a gazdanövényben előforduló természetes orientációval ellentétes orientációban íuzionáltatva, ahol az A-gén az alábbiak egyike: ATP-szintetáz, adenin-nukleotid-transzlokátor, trikarboxiláttranszlokátor, dikarboxiláttranszlokátor, 2-oxo-glutarát-transzlokátor, citokróm C, piruvát-kináz, gliceraldehid-3P-dehidrogenáz, NADPH-citokróm p450-reduktáz, zsírsav-szintetáz komplex, glicerin-3P-acil-transzferáz, transzkripciós iniciációs faktor és transzkripciós elongációs faktor.5. Növényi transzformációs vektor, azzal jellemezve, hogy egy, az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-t tartalmaz.6. Egy Agrobacterium törzs, azzal jellemezve, hogy egy 5. igénypont szerinti növényi transzformációs vektort tartalmaz.7. Növény, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti rekombináns DNS-t tartalmaz, melynek expressziója következtében a transzformált növény csökkent érzékenységet mutat növényi parazita fonalférgekkel szemben a nem transzformált növényhez képest.8. A 7. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS expressziója egy fonalférget tápláló struktúra elroncsolódását okozza a növényben.9. A 7. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS expressziója egy fonalférget tápláló struktúra kialakulását késlelteti a növényben.10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS tartalmaz- egy A-gént, amely expressziója révén egy fonalférget tápláló struktúra elroncsolódását okozza, behelyezve egy A-promoter szabályozása alá, mely az A-gén expresszióját legalább a fonalférget tápláló struktúrában vezérli, és- egy B-gént, amely expressziója révén semlegesíti az A-gén roncsolóhatását, behelyezve egy B-promoter kontrollja alá, amely az expressziót lényegében az összes olyan növényi sejtben szabályozza, ahol az Agén expresszálódik, azzal a feltétellel, hogy a B-promoter nem vezérli hatékonyan a B-gén expresszióját a fonalférget tápláló struktúrában.11. A 10. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy az A-gén bamase-t kódol, a B-gén barstart kódol, az A-promoter egy, a növényben is megtalálható promoter és a B-promoter a CaMV 35S vagy a ro/D promoterből nyert promoter.12. A 11. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy az A-promoter egy növényből izolált promoter vagy ennek egy származéka.13. A 8. vagy 9. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS egy olyan A-gént tartalmaz, amely egy fonalférget tápláló struktúra kialakulásához vagy fenntartásához nélkülözhetetlen fehérjét vagy polipeptidet kódoló endogén gént gátol.14. A 10. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy az A-gén egy DNS-transzkriptumot termel, amely egy fonalférget tápláló struktúra kialakulásához vagy fenntartásához nélkülözhetetlen fehérjét vagy polipeptidet kódoló endogéngén-transzkriptummal komplementer, és a B-gén egy, az endogén gén által kódolt fehérje vagy polipeptid funkcióját helyettesítő fehérjét vagy polipeptidet kódol.15. A 14. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a B-gén egy, a gazdanövénytől eltérő növényfajból származik.16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a B-gén egy alábbi fehérjét vagy polipeptidet kódol: ATP-szintetáz, adenin-nukleotid-transzlokátor, trikarboxiláttranszlokátor, dikarboxiláttranszlokátor, 2-oxo-glutarát-transzlokátor, citokróm C, piruvát-kináz, gliceraldehid-3P-dehídrogenáz, NADPH-citokróm p450-reduktáz, zsírsav-szintetáz komplex, glicerin-3P-acil-transzferáz, transzkripciós iniciációs faktor és transzkripciós elongációs faktor.17. A 10-16. igénypontok bármelyike szerinti növény, azzal jellemezve, hogy az A-promoter a A-0,3TobRB7-5A promoterből származik.18. A 7-17. igénypontok bármelyike szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a Solanaceae családba tartozik.19. A 18. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy Solanum tuberosum.20. A 19. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy burgonya-cisztafonalféreggel szemben csökkent érzékenységgel rendelkezik.21. Egy növényi anyag, azaz virág, gyümölcs, levél, virágpor, mag vagy gumó, azzal jellemezve, hogy a 7-20. igénypontok bármelyike szerinti növényből származik, és az említett növény rekombináns DNS-ét tartalmazza.22. Eljárás egy növényi parazita fonalféreggel szemben csökkent érzékenységgel rendelkező növény előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket hajtjuk végre:1) egy befogadó növényi sejtet rekombináns DNSsel transzformálunk, amely tartalmaz (a) egy A-gént, amelyet közvetlenül a T-DNS jobb karja mellé, attól elfelé mutató hányba klónoztunk, mely amikor expresszálódik egy fonalférget tápláló struktúrában, annak roncsolódását okozza, és (b) egy növényi szelekciós markert;
- 2) a transzformált sejtből szelekciós nyomás alatt egy teljes növényt hozunk létre; és
- 3) azonosítunk egy transzformált, az említett növényi parazita fonalféreggel szemben csökkent érzékenységgel rendelkező növényt.23. Eljárás egy növényi parazita fonalféreggel szemben csökkent érzékenységgel rendelkező növény előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket hajtjuk végre:1) egy befogadó növényi sejtet rekombináns DNSsel transzformálunk, amely tartalmaz (a) egy A-gént,HU 218 897 Β amely expressziója révén egy fonalférget tápláló struktúra elroncsolódását okozza, behelyezve egy A-promoter szabályozása alá, mely az A-gén expresszióját legalább a fonalférget tápláló struktúrában biztosítja, és (b) egy B-gént, amely expressziója révén semlegesíti az A-gén roncsolóhatását, behelyezve egy B-promoter kontrollja alá, amely az expressziót lényegében az összes olyan növényi sejtben biztosítja, ahol az A-gén expresszálódik, azzal a feltétellel, hogy a B-promoter nem biztosítja a B-gén hatékony expresszióját a fonalférget tápláló struktúrában, és (c) egy növényi szelekciós markergént;2) a transzformált sejtből szelekciós nyomás alatt egy teljes növényt hozunk létre; és3) azonosítunk egy transzformált növényt, amely az említett parazita fonalféreggel szemben csökkent érzékenységgel rendelkezik.24. Eljárás növényi parazita fonalféreggel szemben csökkent érzékenységgel rendelkező növény előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket hajtjuk végre:1) egy befogadó növényi sejtet rekombináns DNSsel transzformálunk, amely tartalmaz (a) egy B-gént, amely expressziója révén semlegesíti a 3) lépésben bejuttatott A-gén roncsolóhatását, behelyezve egy B-promoter kontrollja alá, amely a B-gén expresszióját az összes olyan növényi sejtben biztosítja, ahol az A-gén expresszálódik, azzal a feltétellel, hogy a B-promoter nem biztosítja a B-gén hatékony expresszióját a fonalférget tápláló struktúrában, és (b) egy növényi szelekciós markergént;2) a transzformált sejtből szelekciós nyomás alatt egy teljes növényt hozunk létre; és3) a 2) lépésben kapott növényből vagy annak utódából származó befogadósejtet, amely legalább a B-gént tartalmazza, egy rekombináns DNS-sel transzformáljuk, amely tartalmaz (c) egy A-gént, amely expressziója révén roncsolóhatással van egy fonalférget tápláló struktúrára, behelyezve egy A-promoter kontrollja alá, amely az A-gén expresszióját legalább egy fertőzött növényigyökér-fonalférget tápláló struktúrájában biztosítja.25. A 22-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befogadó növényi sejt transzformációs lépését úgy hajtjuk végre, hogy a növényi sejtet egy, a rekombináns DNS-t tartalmazó Agrobacterium törzzsel együtt inkubáljuk.26. Eljárás növényekben növényi parazita fonalférgek által okozott károk csökkentésére, azzal jellemezve, hogy a 7-21. igénypontok bármelyike szerinti növényt növesztjük.27. Eljárás növényekben növényi parazita fonalférgek által okozott károk csökkentésére, azzal jellemezve, hogy herbicidrezisztencia-gént tartalmazó növényeket növesztünk, melyekben a herbicidrezisztencia-gént egy B-promoter szabályozás alá helyeztük, melynek következtében a gén legalább a növények gyökereiben expresszálódik, de nem expresszálódik a fonalférget tápláló struktúrákban, a következő lépések alkalmazásával :1) növesztjük az említett növényeket, és2) a növények gyökereit egy herbiciddel hozzuk érintkezésbe.28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, a B-promotert a karfiol-mozaikvírus 35S promoterből nyerjük.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91203041 | 1991-11-20 | ||
| EP92200046 | 1992-01-10 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9401451D0 HU9401451D0 (en) | 1994-08-29 |
| HUT70264A HUT70264A (en) | 1995-09-28 |
| HU218897B true HU218897B (hu) | 2000-12-28 |
Family
ID=26129483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9401451A HU218897B (hu) | 1991-11-20 | 1992-11-02 | Növényi parazita nematódokra csökkentett fogékonyságú növények és eljárás az előállításukra |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5866777A (hu) |
| EP (1) | EP0668921A1 (hu) |
| JP (1) | JPH07500970A (hu) |
| AU (1) | AU2928492A (hu) |
| CA (1) | CA2121578A1 (hu) |
| HU (1) | HU218897B (hu) |
| RU (1) | RU2143000C1 (hu) |
| WO (1) | WO1993010251A1 (hu) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4420782C1 (de) * | 1994-06-15 | 1995-08-17 | Fluegge Ulf Ingo Prof Dr | DNA-Sequenz, kodierend einen 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter |
| PT100930B (pt) * | 1991-10-04 | 2004-02-27 | Univ North Carolina State | Plantas transgenicas resistentes aos agentes patogenicos e metodo para a sua producao |
| GB9205474D0 (en) * | 1992-03-13 | 1992-04-29 | Cambridge Advanced Tech | Root knot nematode resistance |
| CA2146113A1 (en) * | 1992-10-15 | 1994-10-15 | Adrianus Johannes Van Tunen | Genetic moderation of restoration or plant phenotypes |
| US6008436A (en) * | 1993-01-21 | 1999-12-28 | North Carolina State University | Nematode-resistant transgenic plants |
| ZA939767B (en) * | 1993-01-21 | 1994-09-14 | Univ North Carolina State | Nematode-resistant transgenic plants |
| US5612471A (en) * | 1994-05-25 | 1997-03-18 | The Regents Of The University Of California | Nematode-induced genes in tomato |
| EP0811070B1 (en) * | 1995-02-21 | 2005-09-14 | Bayer BioScience N.V. | Method to obtain male-sterile plants |
| US6262344B1 (en) | 1995-06-13 | 2001-07-17 | Syngenta Mogen B.V. | Nematode-inducible plant gene promoter |
| HUP9903512A3 (en) * | 1996-06-04 | 2000-04-28 | Syngenta Mogen Bv | Nematode-inducible plant gene promoter |
| ZA9710270B (en) * | 1996-11-18 | 1998-06-10 | Mogen Internat Nv | Nematode-inducible regulatory DNA sequences. |
| WO1998031822A1 (en) * | 1997-01-20 | 1998-07-23 | Plant Genetic Systems, N.V. | Pathogen-induced plant promoters |
| US6392119B1 (en) | 1997-01-24 | 2002-05-21 | Dna Plant Technology Corporation | Two component plant cell lethality methods and compositions |
| GB9706381D0 (en) * | 1997-03-27 | 1997-05-14 | Cambridge Advanced Tech | Improvements relating to the specificity of gene expression |
| WO1999028483A2 (en) * | 1997-11-27 | 1999-06-10 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. | Isolation and characterization of plant regulatory sequences |
| US6448471B1 (en) * | 1998-01-22 | 2002-09-10 | Piotr S. Puzio | Nematode-feeding structure specific gene and its application to produce nematode resistant plants |
| AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
| NZ547283A (en) | 1998-03-20 | 2008-06-30 | Commw Scient Ind Res Org | Control of gene expression |
| WO1999053050A1 (en) | 1998-04-08 | 1999-10-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
| US8598332B1 (en) | 1998-04-08 | 2013-12-03 | Bayer Cropscience N.V. | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
| US20040214330A1 (en) | 1999-04-07 | 2004-10-28 | Waterhouse Peter Michael | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
| US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
| EP1092778A1 (en) * | 1999-10-13 | 2001-04-18 | Ses Europe N.V./S.A. | Agrobacterium-based transformation method for Beta vulgaris |
| AU2001275474A1 (en) * | 2000-06-12 | 2001-12-24 | Akkadix Corporation | Materials and methods for the control of nematodes |
| AU2002334894A1 (en) | 2001-10-16 | 2003-04-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for promoting nematode resistance in plants |
| DE10212892A1 (de) | 2002-03-20 | 2003-10-09 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression |
| US7453025B2 (en) | 2004-09-22 | 2008-11-18 | Arborgen, Llc | Reproductive ablation constructs |
| GB0421598D0 (en) | 2004-09-29 | 2004-10-27 | Cambridge Advanced Tech | Modification of plant development and morphology |
| CN101268194A (zh) | 2005-09-20 | 2008-09-17 | 巴斯福植物科学有限公司 | 使用ta-siRNA调控基因表达的方法 |
| US8053630B2 (en) * | 2006-02-23 | 2011-11-08 | Basf Plant Science Gmbh | Nematode inducible plant metabolite exporter gene promoters |
| EP2044204B1 (en) | 2006-06-07 | 2014-04-30 | Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. | Plant expression constructs and methods of utilizing same |
| US20110258736A1 (en) * | 2007-08-31 | 2011-10-20 | Basf Plant Science Gmbh | Pathogen Control Genes and Methods of Use in Plants |
| WO2009027539A2 (en) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Basf Plant Science Gmbh | Method for producing a transgenic plant cell, a plant or a part thereof with increased resistance to plant disease |
| AR075466A1 (es) | 2008-10-22 | 2011-04-06 | Basf Se | Uso de herbicidas tipo auxina en plantas cultivadas |
| AR075465A1 (es) | 2008-10-22 | 2011-04-06 | Basf Se | Uso de herbicidas de sulfonilurea en plantas cultivadas |
| WO2013184768A1 (en) | 2012-06-05 | 2013-12-12 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods of gene silencing in plants |
| US20150250174A1 (en) | 2012-10-01 | 2015-09-10 | Basf Se | Use of n-thio-anthranilamide compounds on cultivated plants |
| WO2016091674A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Basf Se | Use of cyclaniliprole on cultivated plants |
| CA2980505A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Basf Agrochemical Products B.V. | Use of an insecticidal carboxamide compound against pests on cultivated plants |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4940840A (en) * | 1984-03-26 | 1990-07-10 | Dna Plant Technology Corporation | Novel chitinase-producing bacteria and plants |
| US5236843A (en) * | 1987-08-12 | 1993-08-17 | Mycogen Corporation | Gene encoding a nematode-active toxin cloned from a Bacillus thuringiensis isolate |
| US4948734A (en) * | 1987-08-12 | 1990-08-14 | Mycogen Corporation | Novel isolates of bacillus thuringiensis having activity against nematodes |
| US4970168A (en) * | 1989-01-27 | 1990-11-13 | Monsanto Company | Virus-resistant plants |
| ATE203276T1 (de) * | 1989-08-10 | 2001-08-15 | Aventis Cropscience Nv | Pflanzen mit modifizierten blüten |
| RU2129373C1 (ru) * | 1990-09-10 | 1999-04-27 | Эдвенст Текнолоджиз (Кембридж) Лимитед | Способ борьбы с нематодами |
| CA2110169A1 (en) * | 1991-05-30 | 1992-12-10 | Walter Van Der Eycken | Nematode-responsive plant promoters |
-
1992
- 1992-11-02 RU RU94033345/13A patent/RU2143000C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1992-11-02 WO PCT/EP1992/002559 patent/WO1993010251A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-11-02 US US08/244,122 patent/US5866777A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-11-02 JP JP5508939A patent/JPH07500970A/ja active Pending
- 1992-11-02 CA CA002121578A patent/CA2121578A1/en not_active Abandoned
- 1992-11-02 AU AU29284/92A patent/AU2928492A/en not_active Abandoned
- 1992-11-02 HU HU9401451A patent/HU218897B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-11-02 EP EP92923499A patent/EP0668921A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07500970A (ja) | 1995-02-02 |
| EP0668921A1 (en) | 1995-08-30 |
| HU9401451D0 (en) | 1994-08-29 |
| WO1993010251A1 (en) | 1993-05-27 |
| RU94033345A (ru) | 1996-05-10 |
| CA2121578A1 (en) | 1993-05-27 |
| RU2143000C1 (ru) | 1999-12-20 |
| US5866777A (en) | 1999-02-02 |
| AU2928492A (en) | 1993-06-15 |
| HUT70264A (en) | 1995-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU218897B (hu) | Növényi parazita nematódokra csökkentett fogékonyságú növények és eljárás az előállításukra | |
| EP0589841B1 (en) | Methods for the production of hybrid seed | |
| US5530187A (en) | Transgenic plants containing multiple disease resistance genes | |
| EP0427529A1 (en) | Larvicidal lectins and plant insect resistance based thereon | |
| JPH09503652A (ja) | Ｈｍｇ２プロモーター発現系ならびに植物および植物細胞培養物における遺伝子産物の収穫後生産 | |
| CZ20013859A3 (cs) | Herbicidně rezistentní rostliny | |
| Zhang et al. | Expression of human lactoferrin cDNA confers resistance to Ralstonia solanacearum in transgenic tobacco plants | |
| AU5420594A (en) | Plants with reduced susceptibility to plant-parasitic nematodes | |
| AU2010267655B2 (en) | Expression of transcription regulators that provide heat tolerance | |
| US6395963B1 (en) | Nematode-inducible regulatory DNA sequences | |
| AU5379699A (en) | Gene switch | |
| AU707563B2 (en) | Nematode-inducible plant gene promoter | |
| US6262344B1 (en) | Nematode-inducible plant gene promoter | |
| US7094952B1 (en) | Method for obtaining transgenic plants expressing a protein with activity producing hydrogen peroxide by transformation by agrobacterium rhizogenes | |
| US6448471B1 (en) | Nematode-feeding structure specific gene and its application to produce nematode resistant plants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SYNGENTA MOGEN B. V., NL |
|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |