CN101268194A - 使用ta-siRNA调控基因表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于遗传学特别是植物遗传学的领域，并提供了能够调控基因表达的物质。更特别地，本发明涉及用于改造ta－siRNA初级转录物从而靶向目的基因(GOI)并调控它们表达的方法。本发明还提供了用于通过所述改造的ta－siRNA来调节转基因表达的方法。

Description

使用ta-siRNA调控基因表达的方法
发明内容
技术领域
本发明属于遗传学特别是植物遗传学的领域，并提供了能够使基因特异沉默的物质。本发明特别地提供了能够产生双链RNA(dsRNA)物质的多顺反子RNA分子、利用这类分子的方法和含有这类分子的细胞和生物，特别是植物。
发明背景
许多因素影响植物和其它真核生物中的基因表达。近期，21-26核苷酸的小RNA作为真核基因表达的重要调节子出现。已知的调控小RNA分为两个基础种类。一个小RNA种类是短干扰RNA(siRNAs)。它们在RNA沉默中起关键作用，所述RNA沉默是由双链RNA(dsRNA)引起的序列特异的RNA降解过程(对植物和动物中RNA沉默的近期综述分别参阅Vance和Vaucheret(2001)Science 292：2277-2280和Zamore(2001)Nat StructBiol 8：746-750)。
近期鉴定的一个小RNA组通常已知为小型临时RNA(stRNA)，更广泛地已知为微小RNA(miRNA)。miRNA作为进化上保守的、在动物和植物中基于RNA的基因表达调节子而出现。miRNA(约21到25个nt)由带有茎环结构的较大前体产生，所述前体转录自不编码蛋白质的基因。植物和动物中的微小RNA作为转录后负调节子作用(Bartel D(2004)Cell 116，281-297；He L和Hannon GJ(2004)Nat.Rev.Genet.5，522-531)。植物miRNA靶向在发育过程中具有功能(包括发育定时、调控细胞增殖、分生组织决定(meristem identity)和模式形成(patterning))的不成比例的大量基因。miRNA生物发生或功能的整体破坏或特异miRNA-靶标相互作用的破坏通常导致发育异常(Achard P等人(2004)Development 131，3357-3365；Chen X(2004)Science 303，2022-2025；Emery JF等人(2003)Curr.Biol.13，1768-1774；Juarez MT等人(2004)Nature 428，84-88；Kidner CA和Martienssen RA(2004)Nature 428，81-84；Laufs P等人(2004)Development 131，4311-4322；Mallory AC等人(2004)Curr.Biol.14，1035-1046.；Palatnik JF等人(2003)Nature 425，257-263；Tang G等人(2003)Genes Dev.17，49-63；Vaucheret H等人(2004)Genes Dev.18，1187-1197)，这提示基于miRNA的调节对于控制生长和发育的途径是必须的。植物miRNA通常含有接近完美的与靶位点的互补性，这最经常发生于mRNA的蛋白质编码区中(Llave C等人(2002)Science 297，2053-2056；Rhoades MW等人(2002)Cell 110，513-520)。结果，大部分植物miRNA像siRNA一样作用，指导靶RNA切割(Jones-Rhoades MW和Bartel DP(2004)Mol.Cell 14，787-799；Kasschau KD等人(2003)Dev.Cell4，205-217)。相反，大部分动物miRNA和可能的一些植物miRNA起到在翻译或共翻译水平抑制表达的功能(Ambros V(2003)Cell 113，673-676；Aukerman MJ和Sakai H(2003)Plant Cell 15，2730-2741；Olsen PH和Ambros V(1999)Dev.Biol.216，671-680；Seggerson K等人(2002)Dev.Biol.243，215-225)。尽管许多动物靶标mRNA编码发育调控因子，但是没有miRNA或靶标在植物和动物之间保守(Ambros V(2003)Cell 113，673-676)。
在植物中，大部分miRNA靶基因是转录因子，它们是分生组织决定、细胞分裂、器官分离和器官极性所需要的。一些miRNA具有独特的组织特异性和/或时间表达谱。McManus等人(RNA 8：842-850(2002))也研究了miRNA模拟物，其含有19个核苷酸的连续RNA双链体、12个核苷酸长的环和一个不对称的茎-环膨胀(其由单个尿苷与两个尿苷相对组成)。合成的miRNA可以被转染进细胞，或在RNA聚合酶III启动子的调控下在细胞中表达并引起特异靶核苷酸序列的表达降低(McManus等人(2002)RNA8：842-850)。
miRNA介导的基因沉默的机制只缓慢地更加清晰：微小RNA通过遗传学确定的RNA前体的核溶解成熟而形成，所述前体采用了自身互补的折回结构(细节参阅Allen E.等人(2005)Cell，卷121，207-221及其中所引用的参考文献)。加工产生了双链中间体(miRNA/miRNA＊)，其最终为称作RISC的效应器复合物提供了miRNA链(Khvorova A等人(2003).CeH 115，209-216)。植物含有四个切酶-LIKE(DCL)蛋白质，其中之一(DCL1)对大部分或所有的miRNA前体成熟是必需的(Kurihara Y和Watanabe Y(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，12753-12758)。DCL1蛋白质含有一个RNA解旋酶和两个RNaseIII样结构域、一个中心PAZ结构域和C-端dsRNA结合基序。HEN1通过甲基化3’-端残基在miRNA生物发生或稳定性中起作用(Yu B等人(2005)Science 307，932-935)。在拟南芥属(Arabidopsis)中，HASTY(HST)提供了用于miRNA转运的相关功能(ParkMY等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，3691-3696)。植物中，含有活性miRNA的RISC复合物几乎肯定地含有一种或多种ARGONAUTE蛋白质，如AGO1(Fagard M等人(2000).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，11650-11654；Vaucheret等人(2004)Genes Dev 1187-1197)。除miRNA外，植物也产生不同种类的内源siRNA。它们与miRNA的区别在于它们来自双链的RNA，在interacsome的情况下需要RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)的活性。拟南芥属DCL2、DCL3、RDR1、RDR2和RDR6在siRNA生物发生中具有已知的作用(Dalmay T等人(2000).Cell 101，543-553；Mourrain P等人(2000).Cell 101，533-542；Peragine，A等人(2004)GenesDev.18，2368-2379；Vazquez F等人(2004b)Mol.Cell 6，69-79)。
Ta-siRNA在遗传上被定义在特异基因座上，并通过dsRNA的定相的(phased)、切酶样(切酶-LIKE)加工产生，所述dsRNA通过对RNA聚合酶II转录物的RDR6/SGS3活性形成。Ta-siRNA与靶mRNA相互作用并通过与植物miRNA相同的机制指导切割(Peragine，A等人(2004)Genes Dev.18，2368-2379；Vazquez F等人(2004b)Mol.Cell 16，69-79)。那些ta-siRNA调节靶向mRNA的累积(Vazquez等人，2004，Mol Cell 16：69-79)。ta-siRNA生物发生由拟南芥属中的某些miRNA指导(Allen E等人，Keystone symposium abstract 102，Jan 8-14，2005，Allen E等人(2005)Cell121：207-221)。简言之，例如拟南芥属miR173靶向单链的非编码RNA转录物并通过5’起始指导ta-siRNA的生物发生，即从miR173靶位点开始，通过RdR6(RNA依赖性的RNA聚合酶)沿着非编码的RNA转录物产生双链RNA，然后通过切酶以5’到3’的方向从miRNA和靶标mRNA双链体的切割位点(miR173的位置10到11之间)开始产生7到8个21-nt相的ta-siRNA。通过miR173开始的一些ta-siRNA靶向具有未知功能的mRNA。相反，拟南芥属miR390靶向单链非编码RNA转录物并通过3’起始来指导ta-siRNA的生物发生，即从miR390靶位点开始，通过RdR6沿着非编码RNA转录物产生双链RNA，然后通过切酶以3’到5’的方向从miRNA和靶标双链体的切割位点(mi390的位置10到11之间)开始产生7到8个21-nt相的ta-siRNA。非编码RNA转录物中miR390靶位点和通过miR390起始的两个21-nt相ta-siRNA(5’D7(+)和5’D8(+))在许多植物物种之间是保守的。这些ta-siRNA靶向ARF3和ARF4(生长素应答因子)。这些数据支持一种模型，其中前-ta-siRNA转录物中miRNA指导的5’或3’形成(随后是RDR6-依赖性的dsRNA形成和切酶样加工)得到定相的ta-siRNA，其负调节其它基因表达(Allen E等人(2005)Cell 121：207-221和下图)。
植物和动物使用小RNA(微小RNA[miRNAs]和siRNAs)作为转录后和外遗传调节的指导。在植物中，miRNA和反式作用(ta)siRNA通过不同的生物发生途径而形成，尽管它们均与靶转录物相互作用并指导切割。鉴定拟南芥miRNA和ta-siRNA靶标的综合方法展示了若干个新类型的小RNA调节基因，包括常规基因如Argonaute2和E2泛素缀合酶。令人惊奇的是，五个产ta-siRNA的转录物被鉴定为miR173或miR390的靶标。除了作为负调节子作用外，miR173和miR390指导的生物切割显示树立用于ta-siRNA前体加工的21-核苷酸相。这些数据支持一种模型，其中miRNA指导的前-ta-siRNA转录物中的5’或3’端形成(随后是RDR6依赖性的dsRNA形成和切酶样加工)，产生负调节其它基因的定相的ta-siRNA。
miRNA指导的切割和ta-siRNA前体的定相切酶样加工的相符记录支持下述假说：靶向初级转录物的miRNA树立用于精确ta-siRNA形成的21-核苷酸相。因此，来自三个TAS1基因座的七个siR255或相关的ta-siRNA(siR850、siR289、siR752和siR438[+])均处于和分别的miR173相关的相，即便它们来自不同的位置。
TAS3初级转录物中的MIR390基因、miR390靶位点和ta-siRNA，以及ARF3和ARF4中的TAS3ta-siRNA靶位点均在单子叶植物和双子叶植物之间保守，提示该途径至少有数亿年历史(Allen，2005)。Allen提出了以前-ta-siRNA双链体的DCL催化的加工为基础的一种模型，其开始于miRNA指导的切割所定义的末端。
ARF3和ARF4转录物由TAS3ta-siRNA靶向(Allen，2005)。因此，所有ARF基因(23个已知或预测的)中几乎三分之一被miRNA或ta-siRNA调节。ARF10、ARF16和ARF17是miR160的靶标，而ARF6和ARF8是miR167的靶标(Jones-Rhoades和Bartel(2004)Mol.Cell 14：787-799；Kasschau等人，(2003)Dev.Cell 4：205-217)。ARF蛋白质是在生长发育中转导生长素信号的转录因子(Remington等人(2004)Plant Physiol.135：1738-1752)。
许多专利申请公开了dsRNA、miRNA和siRNA的用途：
WO 99/07409描述了由特定dsRNA分子结合某些抗病毒剂组成的特异组合物。WO 99/32619和US 6,506,559描述了将某些长dsRNA分子引入细胞用于抑制线虫中基因表达的方法。WO 99/49029和WO 01/70949描述了某些载体表达的siRNA分子。WO 99/53050描述了使用某些dsRNA降低植物细胞中核酸表型表达的某些方法。WO 00/01846描述了使用特异的长dsRNA分子鉴定特异基因的某些方法，所述特异基因负责给予细胞中的特别表型。WO 00/44914和WO01/68836描述了特定长度(141bp-488bp)的酶合成或载体表达的dsRNA用于减轻某些靶基因表达的用途。WO00/63364和WO01/04313描述了使用某长度(超过250bp)的、载体表达的dsRNA抑制某些多核苷酸序列功能的某些方法和组合物。WO 01/29058描述了涉及dsRNA-介导的RNAi的特异基因的鉴定。WO 01/36646描述了使用某长度(550bp-714bp)的、酶合成的或载体表达的dsRNA分子抑制哺乳动物细胞中特定基因表达的某些方法。WO 01/38551描述了使用某些dsRNA调节植物中polycomb基因表达的某些方法。WO 01/42443描述了使用某些dsRNA修饰生物遗传特征的某些方法。WO 01/49844描述了用于在靶向的生物中促进基因沉默的特异DNA表达构建体。WO 01/53475描述了用于分离脉孢菌属(Neurospora)沉默基因的某些方法及其用途。WO01/68836描述了使用来自内源的dsRNA减弱基因表达的特异方法。WO01/70944描述了使用转基因线虫作为帕金森氏病模式使用某些dsRNA进行药物筛选的某些方法。WO 01/72774描述了可能与果蝇(Drosophila)中RNAi相关的某些来自果蝇的基因产物。WO 01/75164描述了果蝇体外RNAi体系和特异的siRNA分子用于某些功能基因组和某些治疗应用的用途。该应用显示对siRNA长度、结构、化学组成和序列的某些要求，上述这些对介导有效RNAi活性是必须的。这些研究显示21核苷酸的siRNA双链体在含有3’端二核苷酸突出端时活性最大。WO 01/92513描述了通过使用增强RNAi的因子来介导基因抑制的某些方法。WO 02/38805描述了通过RNAi鉴定的某些线虫(C.elegans)基因。WO 02/44321公开了长度为19-23nt的双链RNA(dsRNA)在果蝇体外体系中诱导序列特异转录后基因沉默。从长dsRNA或化学合成的siRNA双链体(具有突出的3’端)通过RNaseIII-样加工反应产生的的短干扰RNA(siRNA)介导溶胞产物中有效的靶RNA切割，并且切割位点接近指导siRNA所跨越的区域中心。所述PCT公开还提供了证据：dsRNA加工的方向决定了是有义的还是反义的相同靶RNA能够被所产生的siRNP复合物切割。WO 02/55692、WO02/55693和EP 1144623描述了使用dsRNA抑制基因表达的某些方法。US 2002/0086356公开了使用长度为21-23核苷酸(nt)的RNA片段在果蝇体外体系中的RNA干扰(RNAi)。所述专利申请公开文件教导了当这些21-23nt的片段被纯化并添加回果蝇提取物中时，它们在不存在长dsRNA时介导序列特异的RNAi。所述专利申请公开文件也教导了具有相同或相似特性的化学合成的寡核苷酸也能够用于靶向特异的mRNA用于哺乳动物细胞中的降解。US 2002/016216公开了通过将双链RNA(dsRNA)以足够减弱靶基因表达的量引入培养的细胞中来减弱靶基因在所述细胞中表达的方法，所述双链RNA包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在严格条件下与靶基因的核苷酸序列杂交。WO 03/006477公开了改造的RNA前体，其在细胞中表达时被细胞加工产生靶向的小干扰RNA(siRNA)，所述siRNA使用细胞自身的RNA干扰(RNAi)途径选择性地沉默靶向的基因(通过切割特异的mRNA)。通过将编码这些改造的RNA前体的核酸分子引入体内带有合适调节序列的细胞中，可以在时间和空间上(即在特定的时间和/或在特定的组织、器官或细胞中)选择性地调控改造的RNA前体的表达。WO03/064626和WO 03/064625描述了某些经化学修饰的dsRNA构建体。WO03/070918描述了适用于调节基因表达的方法和试剂。具体地，所述申请描述了下调靶基因表达的双链短干扰核酸(siRNA)分子，其中所述siRNA分子不包含核糖核苷酸，且所述双链siRNA的每条链包含约21个核苷酸。WO 04/009779公开了改造的miRNA前体，其被设计为产生靶向目的基因的新的miRNA。WO 04/66183，描述了下述发明，所述发明涉及鉴定新颖微小RNA(miRNA)分子和miRNA分子新颖靶标的计算机方法，以及通过这类方法鉴定的微小RNA分子和靶标。US 2004/0268441描述了微小RNA前体构建体，其被设计为调节任何目的核苷酸序列(内源植物基因或者可选地转基因)的表达。WO 05/019453描述了与第一和第二靶核酸序列相互作用的多功能siRNA分子、适用于调节基因表达的方法和试剂。具体地，所述发明涉及合成的经化学修饰的小核酸分子。WO 05/042705公开了鉴定、设计和合成用于靶物种的靶mRNA序列的siRNA核苷酸序列的计算机辅助方法。WO 05/042708公开了使用位置特异计分矩阵方法在转录物中鉴定siRNA靶基序的方法。所述发明还提供了用于设计具有更高沉默效力和特异性的siRNA的方法。WO 05/044981描述了适用于使用短干扰核酸(siRNA)分子调节基因表达的化合物、组合物和方法。
生物技术多个领域中主要障碍之一是难以达到平行的多个基因的平时抑制或沉默。以嵌合的反义分子为基础的方法(WO 93/23551)是低效的。以嵌合的双链RNA分子为基础的方法(WO 03/078629)代表了一种改良，但是所使用的DNA构建体仍然有些费力才能获得。因此对在植物中达到基因沉默，特别是对两个或更多靶基因的有效的方法和组合物存在未被满足的需要。该目标由本发明达成。
发明概述
本发明的第一个实施方案涉及沉默或减弱至少一个靶基因表达的方法，所述方法包括向所述植物或其部分引入或在其中表达嵌合的、包含经修饰的ta-siRNA序列的核糖核苷酸序列，其中所述序列与天然的ta-siRNA序列相比，通过至少将所述天然ta-siRNA的一个相域(phase region)替换为下述序列而被修饰，所述序列基本与所述靶基因互补并对所述天然ta-siRNA而言是异源的。
基本与所述靶基因互补的所述序列基本上与所述靶基因的未转录的和/或经转录的序列互补。所述经转录的序列包括但不限于内含子、外显子、5’UTR和3’UTR。所述靶基因的未转录序列包括但不限于启动子、增强子、抑制子、基序和用于结合调节元件的构件(module)。在序列与靶基因的未转录序列基本互补的情况下，ta-siRNA可以靶向基因的(+)或(-)链。
优选地，除了替换一个相域以外，所述天然ta-siRNA序列中的微小RNA结合位点也已被另一(异源的)序列替换，所述另一序列优选与小分子RNA序列基本互补。所述小RNA序列优选能够识别其它RNA序列并介导其切割，更优选选自微小RNA和存在于植物中的siRNA。
本领域技术人员知道可用于本发明的多种ta-siRNA。因此，作为起始材料用于构建本发明嵌合核糖核苷酸序列所使用的天然ta-siRNA序列(物质地或作为序列信息)优选由选自以下的序列描述：
a)SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所描述的序列，和
b)与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所描述的序列的序列具有至少60％同一性的序列，和
c)在一定条件下与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列或其互补序列杂交的序列，所述条件等价于当使用至少100个核苷酸长度的DNA探针时，在68℃下在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在包含1×SSC和0.1％SDS的溶液中于室温下洗涤。
除了上述修饰(替换相域和任选地替换微小RNA结合位点)之外，可以进行其它修饰(例如突变、缺失、添加等)。因此，所述经修饰的ta-siRNA可以由下述序列描述，所述序列包含选自以下的至少一个序列：
a)SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和20所述序列，和
b)由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的至少50个连续核苷酸组成的片段，
c)与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列具有至少60％同一性的序列，和
d)在一定条件下与与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列或其互补序列杂交的序列，所述条件等价于当使用至少100个核苷酸长度的DNA探针时，在68℃下在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在包含1×SSC和0.1％SDS的溶液中于室温下洗涤。
本领域技术人员知道在ta-siRNA分子中鉴定相域的方法。对本文公开的特异ta-siRNA分子而言，待替换的所述ta-siRNA的相域选自以下：
a)(对SEQ ID NO：1所述的玉米ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：1的核苷酸688到708、667到687、646到666、625到645、604到624、583到603、562到582和/或541到561所述的组的相域，和
b)(对SEQ ID NO：2所述的小麦ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：2的核苷酸585到605、564到584、543到563、522到542和/或501到521所述的组的相域，和
c)(对SEQ ID NO：3所述的稻ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：3的核苷酸525到546、504到524、483到503、462到482、441到461、420到440和/或399到419所述的组的相域，和
d)(对SEQ ID NO：4所述的棉花ta-siRNA TC31385而言)来自SEQID NO：4的核苷酸591到612、570到590、549到569、528到548、507到527、486到506、465到485和/或444到464所述的组的相域，和
e)(对SEQ ID NO：5所述的大豆ta-siRNA TC228167而言)来自SEQID NO：5的核苷酸595到616、574到594、553到573、532到552、511到531、490到510、469到489和/或448到468所述的组的相域，和
f)(对SEQ ID NO：6所述的油菜ta-siRNA 51296077而言)来自SEQ IDNO：6的核苷酸396到416、375到395、354到374、333到353、312到332、291到311、270到290和/或249到269所述的组的相域，和
g)(对SEQ ID NO：7所述的向日葵ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：7的核苷酸469到489、448到468、427到467、406到426、385到405、364到384、343到363和/或322到342所述的组的相域，和
h)(对SEQ ID NO：8所述的大麦ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：8的核苷酸482-503、461-481、440-460、419-439和/或398-418所述的组的相域，和
i)(对SEQ ID NO：9所述的番茄ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：9的核苷酸504到525、483到503、462到482、441到461、420到440、399到419、378到398和/或357到377所述的组的相域，和
j)(对SEQ ID NO：10所述的高粱ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：10的核苷酸510-531、489-509、468-488、447-467、426-446和/或405-425所述的组的相域，和
k)(对SEQ ID NO：11所述的云杉ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：11的核苷酸301到322、280到300、259到279、238到258、217到237、196到216、175到195和/或154到174所述的组的相域，和
l)(对SEQ ID NO：12所述的可可ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：12的核苷酸373到393、352到372、331到351、310到330、289到309、268到288、247到267和/或226到246所述的组的相域，和
m)(对SEQ ID NO：13所述的葡萄ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：13的核苷酸445到465、424到444、403到423、382到402、361到381、340到360、319到339和/或298到318所述的组的相域，和
n)(对SEQ ID NO：14所述的莲属(lotus)ta-siRNA而言)来自SEQ IDNO：14的核苷酸203到224、182到202、161到181、140到160、119到139、98到118、77到97和/或56到76所述的组的相域，和
o)(对SEQ ID NO：15所述的杨属(populus)ta-siRNA而言)来自SEQID NO：15的核苷酸1084到1105、1063到1083、1042到1062、1021到1041、1000到1020、9799到999、958到978和/或937到957所述的组的相域，和
p)(对SEQ ID NO：16所述的拟南芥(Arabidopsis thaliana)ta-siRNATAS1a而言)来自SEQ ID NO：16的核苷酸436到456、457到477、478到498、499到519、520到540、541到561、562到582和/或583到603所述的组的相域，和
q)(对SEQ ID NO：17所述的拟南芥ta-siRNA Arab TAS1b而言)来自SEQ ID NO：17的核苷酸592到612、613到633、634到654、655到675、676到696和/或697到717所述的组的相域，和
r)(对SEQ ID NO：18所述的拟南芥ta-siRNA Arab TAS1c而言)来自SEQ ID NO：18的核苷酸556到576、577到597、598到618、619到639、640到660和/或661到681所述的组的相域，和
s)(对SEQ ID NO：19所述的拟南芥ta-siRNA Arab TAS2而言)来自SEQ ID NO：19的核苷酸226到246、247到267、268到288、289到309、310到330和/或331到351所述的组的相域，和
t)(对SEQ ID NO：20所述的拟南芥ta-siRNA Arab TAS3而言)来自SEQ ID NO：20的核苷酸1013到1033、992到1012、971到991、950到970、929到949、908到928、887到907和/或866到886所述的组的相域。
本领域技术人员知道在ta-siRNA分子中鉴定微小RNA结合位点的方法。对于本文公开的特异ta-siRNA分子而言，待替换的微小RNA结合位点选自：
a)SEQ ID NO：1的核苷酸698到718所述的结合位点，和
b)SEQ ID NO：2的核苷酸594到615所述的结合位点，和
c)SEQ ID NO：3的核苷酸536到556所述的结合位点，和
d)SEQ ID NO：4的核苷酸601到622所述的结合位点，和
e)SEQ ID NO：5的核苷酸605到626所述的结合位点，和
f)SEQ ID NO：6的核苷酸405到426所述的结合位点，和
g)SEQ ID NO：7的核苷酸478到499所述的结合位点，和
h)SEQ ID NO：8的核苷酸492到512所述的结合位点，和
i)SEQ ID NO：9的核苷酸514到535所述的结合位点，和
j)SEQ ID NO：10的核苷酸521到541所述的结合位点，和
k)SEQ ID NO：11的核苷酸311到332所述的结合位点，和
l)SEQ ID NO：12的核苷酸382到403所述的结合位点，和
m)SEQ ID NO：13的核苷酸454到475所述的结合位点，和
n)SEQ ID NO：14的核苷酸213到234所述的结合位点，和
o)SEQ ID NO：15的核苷酸1094到1115所述的结合位点，和
p)SEQ ID NO：16的核苷酸424到445所述的结合位点，和
q)SEQ ID NO：17的核苷酸580到601所述的结合位点，和
r)SEQ ID NO：18的核苷酸544到565所述的结合位点，和
s)SEQ ID NO：19的核苷酸214到235所述的结合位点，和
t)SEQ ID NO：20的核苷酸1022到1043所述的结合位点。
可使用本发明的方法调节(例如沉默或减弱)大量靶基因，包括植物中的基因以及植物感染或吞食的病原体、动物或甚至人的基因。优选靶基因选自植物内基因、转基因或来自感染植物的病原体的基因。更优选感染植物的病原体选自病毒、真菌、细菌、昆虫和线虫。在病原体的情况下，靶基因可以是例如持家基因或其它基因，其对病原体的生存力或增殖是必须的。因此被掺入ta-siRNA分子的序列(通过替换相域)优选对应于选自以下的靶基因：植物内基因、转基因或来自感染植物的病原体的基因。在病原体的情况下，感染植物的病原体优选地选自病毒、真菌、细菌、昆虫和线虫。
通过选择指导本发明的嵌合核糖核苷酸序列表达的启动子，和通过选择用于替换天然微小RNA结合位点的对应小RNA(例如微小RNA序列)的序列，可以以例如组织特异或发育特异的方式调节沉默的模式。
优选地，用于替换天然微小RNA结合位点的序列对应于下述微小RNA，所述微小RNA优选选自内源植物微小RNA和转基因微小RNA。更优选所述微小RNA是组织特异表达的、空间受调节的、发育受调节的和/或受生物或非生物胁迫因素调节的。进一步更优选所述微小RNA由SEQ ID NO：78、79、80、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109和/或110之任一所描述，或所述微小RNA来自前体序列，特别是来自miR173和/或miR390的前体序列，例如所述微小RNA来自包含Seq ID No.210、215、216、217、218、219、220、221、222和/或223的序列。
本领域技术人员知道ta-siRNA分子中的结合位点不需要与小RNA(例如微小RNA)绝对互补。因此，与微小RNA基本互补的序列优选与微小RNA序列的互补序列相比，具有至少60％的同一性，或在其整个序列中具有不多于6个错配。更优选所述错配主要位于对应于所述微小RNA3’区的区域中。
存在将本发明的嵌合的核糖核苷酸序列引入植物中的多种方法。例如，核糖核苷酸序列可以体外合成和直接引入。然而，优选借助于表达构建体引入核糖核苷酸序列，所述核糖核苷酸序列由所述表达构建体在体内表达。因此，所述嵌合的核糖核苷酸序列的表达优选通过使用DNA表达盒来实现，所述表达盒包含在植物中有功能的启动子序列，所述启动子序列与编码所述嵌合核糖核苷酸序列的核苷酸序列有效连接。更优选所述启动子选自组成型启动子、组织特异性或组织偏好型启动子、和诱导型启动子，发育调节的启动子，和由生物或非生物胁迫因素调节的启动子。
如上所述，可以通过本发明的方法有利地沉默多种靶基因。优选沉默或减弱所述靶基因导致农学的性状。更优选所述农学性状选自疾病抗性、杀虫剂抗性、针对生物或非生物胁迫的抗性和改进的营养价值。靶基因可例如选自蛋白质、肽、脂肪酸、脂类、蜡、油、淀粉、糖、糖类、香料、调味剂(odor)、毒素、类胡萝卜素、激素、多聚体、黄酮类化合物、贮存蛋白、酚酸、生物碱、木质素、鞣质、纤维素、糖蛋白和糖脂的合成和/或降解所涉及的基因。所有这些序列是本领域技术人员所公知的并可容易地得自DNA数据库(例如GenBank)。
本文提供了新颖并同样具有创造性的嵌合核糖核苷酸序列。因此，本发明的另一实施方案涉及嵌合核糖核苷酸序列，所述嵌合核糖核苷酸序列包含经修饰的ta-siRNA序列，其中所述序列相对于天然的ta-siRNA序列而言，通过至少将所述天然ta-siRNA的一个相域替换为下述序列而被修饰，所述序列基本与靶基因互补并相对于所述天然ta-siRNA是异源的。
所述嵌合核糖核苷酸序列的特异和优选的特征如上文所述用于本发明的方法，并也用于涉及所述嵌合核糖核苷酸序列的主题的全部方面。
优选所述天然ta-siRNA序列中的微小RNA结合位点被下述序列替换，所述序列与小RNA序列基本互补，所述小RNA序列能够识别其它RNA序列并介导其切割。更优选所述小RNA选自微小RNA和存在于植物中的siRNA。用于设计替换序列的优选的微小RNA在上文描述。
嵌合核糖核苷酸序列的其它优选特征例如
a)天然ta-siRNA序列，和/或
b)经修饰的ta-siRNA序列，和/或
c)所述ta-siRNA的相域，和/或
d)待替换的微小RNA结合位点
如上文所述用于本发明的方法。
靶基因优选选自植物中的基因或感染植物的病原体的基因。
本发明的另一实施方案涉及编码本发明嵌合核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，嵌合核糖核苷酸序列从表达构建体表达。因此，本发明的另一实施方案涉及表达构建体，所述表达构建体包含在植物中有功能的启动子序列，所述启动子序列与编码上述嵌合核糖核苷酸序列的核苷酸序列功能性连接。与编码嵌合核糖核苷酸序列的序列有效连接的启动子优选选自组成型启动子、组织特异性或组织偏好型启动子，和诱导型启动子，发育调节的启动子，和由生物或非生物胁迫因素调节的启动子。
本发明的另一实施方案还涉及包含本发明表达构建体的表达载体。优选所述表达载体为真核表达载体、病毒载体、质粒载体或二元载体。
本发明的另一实施方案涉及经转化的细胞或非人生物，其包含本发明的序列(例如嵌合核糖核苷酸序列或编码所述序列的DNA序列)、表达构建体或表达载体。优选经转化的细胞或非人生物包含插入其基因组的所述表达构建体或表达载体。更优选经转化的细胞或非人生物选自哺乳动物、细菌、真菌、线虫或植物细胞和生物。最优选经转化的细胞或非人生物选自单子叶植物和双子叶植物。本发明的其它实施方案涉及本发明植物的经转化的种子和植物，和所述植物、种子和植物部分在农业和/或食品、饲料、工业产品、油、营养品和其它有价值产品生产中的用途。优选本发明的这些其它实施方案涉及
a)这类植物的经转化的种子，
b)使用所述植物培育其它植物的方法，
c)所述植物在育种或农业中的用途，
d)所述植物生产化学品、食物或饲料产品的用途。
在其它实施方案中，本发明涉及包含Seq ID.No.：210、215、216、217、218、219、220、221、222和/或223或其衍生物的表达构建体、Seq ID No.：210、215、216、217、218、219、220、221、222和/或223或其衍生物表达微小RNA的用途，例如Seq ID No.：210、215、216、217、218、219、220、221、222和/或223表达miR390或其衍生物的用途。
定义
缩写：BAP-6-苄氨基嘌呤；2，4-D-2，4-二氯苯氧乙酸；MS-Mura-shige和Skoog培养基；NAA-1-萘乙酸；MES，2-(N-吗啉代)-乙磺酸，IAA吲哚乙酸；Kan：硫酸卡那霉素；GA3-赤霉酸；TimentinTM：替卡西林二钠(ticarcillin disodium)/棒酸钾(clavulanate potassium)。
应当理解本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、植物种或属、构建体和试剂。还应当理解本文使用的命名法仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，所述范围仅由附带的权利要求书限制。必须注意本文和附带的权利要求书中所使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参考，除非上下文另外明确指出。因此，例如关于“载体”是指一个或多个载体，并包括本领域技术人员已知的其等价物，等等。术语“约”在本文使用表示大约、粗略地、左右、或位于范围内。当术语“约”与数字范围结合使用时，其通过将界限扩展至高于和低于所公开的数值来修饰范围。通常，在本文中使用术语“约”来修饰以20％的变化高于或低于所述值的数值，优选之上或之下(更高或更低)10％。本文使用词语“或”是指特定列表上任何一员，还包括所述列表成员的任何组合。本说明书和之后的权利要求书中使用词语“包含”、“包含着”、“包括”、“包括着”和“包括(单数)”旨在指定一种或多种所述特征、整数、成分或步骤的存在，但是它们不排除一种或多种其它特征、整数、成分、步骤或其组的存在或添加。为了清楚起见，说明书中使用的某些术语如下文定义和使用：
有农业价值的性状：术语“有农业价值的性状”是指植物生物中适用于或有利地用于食品生产或食物产品(包括植物部分和植物产品)的任何表型。非食物农业产品如纸等也包括在内。有农业价值性状的部分列表包括害虫抗性，活力，发育时间(收获时间)，提高的营养含量，新颖的生长模式、香味或色泽，盐、热、干旱和冷耐性等等。优选有农业价值的性状不包括可选择的标记基因(例如仅用于促进被转化细胞的检测或选择的、编码除草剂或抗生素抗性的基因)、导致植物激素(例如仅用于选择的生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯)生产的激素生物合成基因，或报道基因(例如萤光素酶、葡糖醛酸糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)等)。这类有农业价值的重要性状可包括害虫抗性(例如Melchers等人(2000)Curr OpinPlant Biol 3(2)：147-52)，活力，发育时间(收获时间)，提高的营养含量，新颖的生长模式、香味或色泽，盐、热、干旱和冷耐性(例如Sakamoto等人(2000)J Exp Bot 51(342)：81-8；Saijo等人(2000)Plant J 23(3)：319-327；Yeo等人(2000)Mol Cells 10(3)：263-8；Cushman等人(2000)Curr OpinPlant Biol 3(2)：117-24)等等的改良。技术人员应当明白存在大量的多核苷酸，从其中选择来给予这些和其它有农业价值的性状。
改变：“改变”或“调节”细胞(例如植物细胞)中核苷酸序列的表达是指应用本发明的方法后，细胞中所述核苷酸序列的表达水平不同于应用该方法之前其在所述细胞中的表达。在优选的实施方案中，改变表达是指应用本发明的方法后，与应用该方法之前相比，植物中核苷酸序列的表达被降低。靶基因表达的“降低”或“降低”靶基因的表达应当广义地理解，并包括细胞、生物或其部分、组织、器官、细胞或种子中靶基因或来自它的RNA、mRNA、rRNA、tRNA和/或由之编码的蛋白质产物的表达部分或几乎完全被防止或阻断，所述防止或阻断可以以不同的细胞生物学机制为基础。术语“降低的”在本文中表示更低的，优选显著更低的，更优选核苷酸序列的表达不可探测。本文使用物质(如蛋白质或mRNA)水平的“降低”是指水平相对于下述细胞或生物被降低，所述细胞或生物缺乏能够减少所述物质的本发明嵌合RNA分子。如本文所用，物质(例如由靶基因表达的RNA、mRNA、rRNA、tRNA和/或由其编码的蛋白质产物)水平的“至少部分降低”是指相对于下述细胞或生物而言，所述水平降低至少25％，优选至少50％，所述细胞或生物缺乏能够减少所述物质的本发明嵌合RNA分子。如本文所用，物质(如蛋白质或mRNA)水平的“显著降低”是指相对于下述细胞或生物(其缺乏能够减少所述物质的本发明嵌合RNA分子)而言所述水平被降低，其中所述物质的水平被降低至少75％，优选至少85％。如本文所用，物质(如蛋白质或mRNA)的“有效消除”是相对于下述细胞或生物而言，所述物质的水平降低大于95％，优选大于98％，所述细胞或生物缺乏能够减少所述物质的本发明嵌合RNA分子。可以通过技术人员熟悉的方法测定降低。因此，蛋白质量的减少可以通过例如蛋白质免疫检测来测定。另外，可以使用生物化学技术如Northern杂交、核酸酶保护分析、反转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、Western印迹、放射免疫测定(RIA)或其它免疫测定和荧光激活细胞分析(FACS)。根据减少的蛋白质产物的类型，也可以测定其活性或对生物或细胞表型的影响。用于测定蛋白质量的方法为技术人员公知。可以提到的实例为：微型Biuret方法(GoaJ(1953)Scand J Clin Lab Invest 5：218-222)、Folin-Ciocalteau方法(LowryOH等人(1951)J Biol Chem 193：265-275)或测量CBB G-250的吸收(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72：248-254)。在另一优选的实施方案中，改变表达是指应用本发明的方法之后与应用该方法之前相比，植物中核苷酸序列的表达被提高。
氨基酸序列：本文使用术语“氨基酸序列”是指一列代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或词语。本文中，氨基酸可以表示为它们通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(BiochemicalNomenclature Commission)推荐的单字母符号。类似地，核苷酸可以表示为它们通常被接受的单字母符号。
动物：术语“动物”或“动物生物”是指非人脊椎动物或无脊椎动物。优选的脊椎动物包括例如鱼类物种，非人哺乳动物如牛、马、绵羊、山羊、小鼠、大鼠或猪，和鸟如鸡或鹅。优选的动物细胞包括CHO、COS、HEK293细胞。无脊椎动物包括线虫或其它蠕虫，和昆虫。无脊椎动物包括昆虫细胞，例如果蝇S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9或Sf21细胞。另外优选能够攻击动物或人的线虫，例如钩口线虫属(Ancylostoma)、禽蛔虫属(Ascaridia)、蛔虫属(Ascaris)、仰口线虫属(Bunostomum)、新杆状线虫属(Caenorhabditis)、毛细线虫属(Capillaria)、夏柏特线虫属(Chabertia)、古柏线虫属(Cooperia)、网尾线虫属(Dictyocaulus)、血矛线虫属(Haemonchus)、异刺线虫属(Heterakis)、细颈线虫属(Nematodirus)、结节线虫属(Oesophagostomum)、奥斯脱线虫属(Ostertagia)、尖尾线虫属(Oxyuris)、副蛔虫属(Parascaris)、圆线虫属(Strongylus)、毒蛔虫属(Toxascaris)、鞭虫属(Trichuris)、毛圆线虫属(Trichostrongylus)、毛线线虫属(Tfhchonema)、弓首线虫属(Toxocara)或钩虫属(Uncinaria)的线虫。还优选能够攻击植物生物的那些，例如Bursaphalenchus、环纹线虫属(Criconemella)、Diiylenchus、茎线虫属(Ditylenchus)、球异皮线虫属(Globodera)、螺旋线虫属(Helicotylenchus)、异皮线虫属(Heterodera)、长针线虫属(Longidorus)、根结线虫属(Melodoigyne)、珍珠线虫(Nacobbus)、钱线虫(Paratylenchus)、短体线虫属(Pratylenchus)、穿孔线虫属(Radopholus)、盘旋线虫属(Rotelynchus)、垫刃线虫属(Tylenchus)或剑线虫属(Xiphinema)。优选的昆虫包括鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和同翅目(Homoptera)属的那些。
反相平行：“反相平行”在本文中是指通过互补碱基残基之间的氢键配对的两个核苷酸序列，其磷酸二酯键在一个核苷酸序列中沿5’-3’方向运行，在另一核苷酸序列中沿3’-5’方向运行。
反义：术语“反义”是指相对于其转录的正常方向而言被反转，从而表达与宿主细胞中所表达的靶基因mRNA分子互补的RNA转录物(即其能够通过Watson-Crick碱基配对与靶基因mRNA分子杂交)。反义链可以以大量不同的方法构建，只要其能够干扰靶基因的表达即可。例如，可以如下构建反义链：将靶基因的编码区(或其部分)相对于其转录的正常方向反转，以允许其互补序列的转录(例如，由反义和有义基因编码的RNA应是互补的)。另外，反义寡核苷酸链不需要具有与靶基因相同的内含子或外显子模式，在达成靶基因表达的反义抑制中靶基因的非编码区段与编码区段等效。在基因沉默的语境中，术语“反义”应理解为表示具有与靶序列互补序列的核酸，例如信使RNA(mRNA)序列，其表达的阻断被发现是由与靶序列的杂交起始的。
细胞：术语“细胞(cell)”或“植物细胞(plant cell)”在本文中使用优选表示单个细胞。术语“细胞(cells)”是指一群细胞。该群体可以是包含一种细胞类型的纯群体。类似地，该群体可包含多于一种细胞类型。在本发明中，细胞群体可包含的细胞类型的数量没有限制。细胞可以是同步的或未同步的。本发明含义中的细胞可以是被分离的(例如在悬浮培养物中)或包含在任何发育阶段的组织、器官或生物中。
编码区：本文涉及结构基因使用术语“编码区”是指编码新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列，所述新生多肽来自mRNA分子的翻译。在真核生物中，编码区的界限在5’侧通过核苷酸三联体″ATG″(其编码起始密码子甲硫氨酸)和在3’侧通过指定终止密码子(即TAA、TAG、TGA)的三个三联体之一界定。除含有内含子外，基因的基因组形式也可包括位于序列5’和3’端的序列，其存在于RNA转录物中。这些序列被称作“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物中存在的非翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区可含有调控或影响基因转录的调节序列，例如启动子和增强子。3’侧翼区可含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。
互补：“互补”或“互补性”是指两条核苷酸序列，它们包含反向平行的核苷酸序列，所述反向平行的核苷酸序列能够通过在所述反向平行核苷酸序列中互补的碱基残基之间形成氢键而配对(通过碱基配对原则)。例如，序列5′-AGT-3′与序列5′-ACT-3′互补。互补性可以是“部分”或“完全”的。“部分”互补性是指一个或多个核酸碱基根据碱基配对原则不匹配。核酸之间的“完全”或“全部”互补性是指各个和每个核酸碱基与另一碱基按照碱基配对原则匹配。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。本文使用核酸序列的“互补序列”是指其核酸与一条核酸序列的核酸显示完全互补性的核苷酸序列。
染色体DNA：术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”应当理解为不依赖于细胞周期状态的细胞核的基因组DNA。因此，染色体DNA可以被组织在染色体或染色单体中，它们可以是凝聚的或解螺旋的。可以通过本领域已知的多种方法证明和分析进入染色体DNA的插入，例如聚合酶链式反应(PCR)分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交和原位PCR。
DNA改组：DNA改组是快速、容易和有效地向DNA分子中引入(优选随机地)突变或重排，或在两个或多个DNA分子之间产生DNA序列交换(优选随机地)的方法。得自DNA改组的DNA分子是经改组的DNA分子，其为来自至少一个模板DNA分子的非天然存在的DNA分子。经改组的DNA编码了一种酶，所述酶相对于模板DNA所编码的酶而言被修饰，并优选相对于模板DNA所编码的酶而言具有改变的生物学活性。
双链RNA：“双链RNA”分子、“RNAi分子”或“dsRNA”分子包括核苷酸序列的有义RNA片段和所述核苷酸序列的反义RNA片段，二者均包含彼此互补的核苷酸序列，从而允许有义和反义RNA片段配对并形成双链RNA分子。优选该术语是指被引入细胞或生物中时，能够至少部分地降低细胞或生物的细胞中存在的mRNA种类的水平的双链RNA分子。本文使用“RNA干扰”、“RNAi”和“dsRNAi”是指由双链RNA分子的引入诱导的基因特异沉默。
内源的：“内源的”核苷酸序列是指存在于未转化细胞(例如植物或哺乳动物细胞)基因组中的核苷酸序列。
必需的：“必需的”基因是指编码生物或细胞(例如植物)生长或存活必需的蛋白质(例如生物合成酶、受体、信号转导蛋白质、结构基因产物或转运蛋白)的基因。
外显子：本文使用术语“外显子”是指该术语的正常含义，即核酸分子(通常为DNA)的片段，其编码一部分或全部被表达的蛋白质。
表达：“表达”是指基因产物的生物合成，优选细胞中核苷酸序列(例如内源基因或异源基因)的转录和/或翻译。例如在结构基因的情况下，表达包括结构基因转录为mRNA和-任选地-mRNA随后转录为一个或多个多肽。在例如反义构建体的情况下，表达可以仅指反义DNA的转录。
表达构建体(Expression construct)/表达构建体(expression construct)：本文使用表达构建体(Expression construct)/表达构建体(expressionconstruct)是同义的，是指能够指导特定核苷酸序列在适当的宿主细胞(例如植物或哺乳动物细胞)中表达的DNA序列，所述序列包含在其将被引入的所述宿主细胞中有功能的启动子，所述启动子与目的核苷酸序列有效连接，所述目的核苷酸序列任选地与终止信号有效连接。如果需要翻译，其通常还包含核苷酸序列适当翻译所需的序列。编码区可以编码目的蛋白质，也可以编码有义或反义方向的目的功能RNA，例如反义RNA、dsRNA或非翻译的RNA。包含目的核苷酸序列的表达构建体可以是嵌合的，即其至少一个部分相对于其至少一个其它部分而言是异源的。表达构建体可以是天然存在的、但是以适用于异源表达的重组形式获得的表达构建体。然而，表达构建体一般相对于宿主是异源的，即表达构建体的特定DNA序列在宿主细胞中天然不存在，并且必须通过转化事件被引入宿主细胞或宿主细胞的祖先。表达构建体中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子的调控，所述诱导型启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定的外界刺激时起始转录。在多细胞生物(例如植物)的情况下，启动子也可以对于特定组织或器官或发育阶段特异。
外源的：术语“外源的”是指通过实验操作被引入细胞基因组中的任何核酸(例如基因序列)，可包括细胞中存在的序列，只要被引入的序列相对于天然存在的序列而言含有一些修饰(例如点突变、可选择标记基因的存在等)即可。
基因：术语“基因”是指与适当的调节序列有效连接的编码区，所述调节序列能够以一些方式调节基因产物(例如多肽或功能RNA)的表达。基因包括编码区(可读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的DNA非翻译调节区(例如启动子、增强子、抑制子等)，以及适用时各编码区(即外显子)之间的间插序列(即内含子)。本文使用术语“结构基因”旨在表示被转录为mRNA的DNA序列，所述mRNA随后被翻译为以特异多肽为特征的氨基酸序列。
遗传修饰的生物：术语“遗传修饰的生物”或“GMO”是指包含异源DNA或转基因的任何生物。示范性的生物包括植物、动物和微生物。
基因组和基因组DNA：术语“基因组”或“基因组DNA”是指宿主生物的可遗传的遗传信息。所述基因组DNA包括核的DNA(也被称作染色体DNA)，也包括质体(例如叶绿体)和其它细胞器(例如线粒体)的DNA。优选术语基因组或基因组DNA是指核的染色体DNA。
发夹RNA：本文使用“发夹RNA”是指任何自身退火的双链RNA分子。以其最简单的表示，发夹RNA由通过单链RNA环连接的双链茎(其由退火RNA链构成)组成，其也被称作“锅柄RNA(pan-handle RNA)”。然而，术语“发夹RNA”也旨在包括更复杂的二级RNA结构，其包含自身退火的双链RNA序列以及内部膨胀和环。适合的特异二级结构能通过RNA分子的自由能测定，并且对于不同的情况可以使用适当的软件如FOLDRNA(Zuker和Stiegler(1981)Nucleic Acids Res 9(1)：133-48；Zuker，M.(1989)Methods Enzymol.180：262-288)来预测。
异源的：关于核酸或DNA的术语“异源的”是指与下述核酸序列连接，或被操作为与下述核酸序列连接的核苷酸序列，所述核酸序列与其天然不连接或天然在不同的位置连接。例如，包含核酸序列和与其连接的至少一个调节序列(例如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体是通过实验操作产生的构建体，其中a)所述核酸序列，或b)所述调节序列，或c)二者(即(a)和(b))不位于其天然的(本地的)遗传环境中，或已经通过实验操作被修饰，修饰的实例为一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒置或插入。天然遗传环境是指来源生物中的天然染色体基因座，或指基因组文库中的存在。在基因组文库的情况下，优选维持(至少部分维持)核酸序列的天然遗传环境。环境位于核酸序列至少一侧的侧翼，并且具有长度为至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1,000bp，非常特别优选至少5,000bp的序列。天然存在的表达构建体(例如启动子与相应基因的天然存在的组合)通过非天然的、合成的“人工”方法(例如诱变)被修饰时，成为转基因的表达构建体。这类方法已被描述(US 5,565,350；WO 00/15815)。例如，与启动子(其不是下述序列的天然启动子)有效连接的编码蛋白质的核酸序列被认为相对于该启动子是异源的。优选异源的DNA对于其被引入的细胞而言不是内源的或不是天然相关的，而是从另一细胞获得的。异源DNA还包括含有一些修饰的内源DNA序列、非天然存在的多拷贝的内源DNA序列，或与物理上与之连接的另一DNA序列并非天然相关的DNA序列。一般地(尽管并非必须地)，异源DNA编码RNA和蛋白质，所述RNA和蛋白质不由所述异源DNA在其中表达的细胞产生。
同源的DNA序列：与宿主细胞或另一DNA序列天然相关的DNA序列。
杂交：本文使用术语“杂交”包括“任何方法，通过所述方法一条核酸链与其互补链通过配对结合”。(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology，Stockton Press，New York)。杂交和杂交强度(即核酸之间的结合强度)受下述因素影响：核酸之间的互补性程度、涉及条件的严格度、所形成杂交体的Tm和核酸的G∶C比。本文使用术语“Tm”是指“解链温度”。解链温度是一群双链核酸分子有一半解离为单链的温度。计算核酸Tm的等式为本领域公知。如标准参考文献中所示，Tm值的简单估计可以通过等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算，其中核酸在1M NaCl的水溶液中(参阅例如Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization，在Nucleic AcidHybridization(1985))。其它参考文献包括更复杂的计算，所述计算将结构以及序列特征计入Tm的计算中。严格条件是本领域技术人员已知的，并可见于Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
关于核酸杂交使用的低严格条件包括与下文等价的条件：当使用长度为约100到约1,000核苷酸的DNA探针时，在68℃下，由5×SSPE(43.8g/LNaCl，6.9g/L NaH2PO4.H2O和1.85g/L EDTA，用NaOH将pH调节为7.4)、1％SDS、5×Denhardt′s试剂[每500mL含有5g Ficoll(Type 400，法玛西娅公司(Pharmacia))、5g BSA(Fraction V；西格玛公司(Sigma))的50×Denhardt′s]和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在室温下或优选37℃下在含有1×SSC(1×SSC是0.15M NaCl加上0.015M柠檬酸钠)和0.1％SDS的溶液中洗涤(优选1次15分钟，更优选两次15分钟，更优选三次15分钟)。
关于核酸杂交使用的中严格条件包括与下文等价的条件：当使用长度为约100到约1,000核苷酸的DNA探针时，在68℃下，由5×SSPE(43.8g/LNaCl，6.9g/L NaH2PO4.H2O和1.85g/L EDTA，用NaOH将pH调节为7.4)、1％SDS、5×Denhardt′s试剂[每500mL含有5g Ficoll(Type 400，法玛西娅公司)、5g BSA(Fraction V；西格玛公司)的50×Denhardt′s]和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在室温下或优选37℃下在含有0.1×SSC(1×SSC是0.15M NaCl加上0.015M柠檬酸钠)和1％SDS的溶液中洗涤(优选1次15分钟，更优选两次15分钟，更优选三次15分钟)。
关于核酸杂交使用的高严格条件包括与下文等价的条件：当使用长度为约100到约1,000核苷酸的探针时，在68℃下，由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在68℃下用含有0.1×SSC和1％SDS的溶液洗涤(优选1次15分钟，更优选两次15分钟，更优选三次15分钟)。
当涉及杂交条件时，使用术语与目的杂交条件“等价”是指所述杂交条件和所述目的杂交条件导致具有相同同源百分比(％)范围的核酸序列杂交。例如，如果目的杂交条件导致第一核酸序列与其它核酸序列杂交(所述其它核酸序列与所述第一核酸序列具有80％到90％的同源性)，则如果另一杂交条件也导致所述第一核酸序列与其它核酸序列(其与所述第一核酸序列具有80％到90％的同源性)杂交时，称所述另一杂交条件与所述目的杂交条件是等价的。当用于核酸杂交时，本领域公知可以使用大量等价的条件，包括低或高严格条件；考虑因素例如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基构成)和靶标的性质(DNA、RNA、碱基构成、存在于溶液中或被固定等)和盐与其它成分的浓度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)，并且可以改变杂交溶液来得到与上述条件不同但是等价的低或高严格杂交。本领域技术人员已知尽管可以优选更高的严格度来降低或消除非特异性结合，但是可以优选更低的严格度来检测具有不同同源性的更大量核酸序列。
“同一性”：术语“同一性”是两个或多个多肽序列之间或两个或多个核酸分子序列之间通过比较序列测定的关系。在本领域中，“同一性”也表示多肽或核酸分子序列之间通过这类序列串之间匹配测定的序列相关程度。本文使用的“同一性”可以在相同核糖核酸类型(例如DNA和DNA序列之间)或不同类型(例如RNA和DNA序列之间)的核酸序列之间测量。应当理解用RNA序列与DNA序列比较时，“同一的”RNA序列会含有核糖核苷酸，而DNA序列含有脱氧核糖核苷酸，另外，RNA序列会在DNA序列含有胸腺嘧啶的位置上含有尿嘧啶。在RNA和DNA序列之间测量同一性的情况下，RNA序列的尿嘧啶碱基被认为与DNA序列的胸腺嘧啶碱基是同一的。“同一性”可通过已知的方法容易地计算，包括但不限于Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，Oxford UniversityPress，New York(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Proj ects，Smith，D.W.，编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑，HumanaPress，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，Stockton Press，New York(1991)；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math，48：1073(1988)中所述的方法。测定同一性的方法被设计为在被检测序列之间给出最大匹配。另外，测定同一性的方法被编成公众可获得的程序。可用于测定两个序列间同一性的计算机程序包括，但不限于GCG(Devereux，J.，等人，Nucleic Acids Research12(1)：387(1984)；一套五个BLAST程序，三个被设计为用于核苷酸序列查询(BLASTN，BLASTX和TBLASTX)，两个被设计为用于蛋白质序列查询(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，Trends in Biotechnology，12：76-80(1994)；Birren等人，Genome Analysis，1：543-559(1997))。公众可从NCBI和其他来源(BLAST Manual，Altschul，S.，等人，NCBI NLM NIH，Bethesda，Md.20894；Altschul，S.，等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))获得BLASTX程序。也可使用公知的Smith Waterman算法测定同一性。多肽序列比较的参数通常包括以下：
-算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)
-比较矩阵：来自Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919(1992)的BLOSUM62
-空位罚分：12
-空位长度罚分：4
可用这些参数使用的程序为可由公众从遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，Madison，Wis.获得的“空位(gap)”程序。上述参数连同对末端缺口无罚分一起是肽比较的默认参数。用于核酸序列比较的参数包括以下：
-算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio.48：443-453(1970)
-比较矩阵：匹配-+10；错配＝0
-空位罚分：50
-空位长度罚分：3
如本文使用的，“％同一性”使用作为核酸分子序列比较的默认参数的上述参数和来自GCG，10.2版的″空位″程序测定。
感染：术语用细菌或病毒“感染”是指靶生物样品(例如细胞、组织等)与细菌或病毒在下述条件下共培养，所述条件使得细菌或病毒中含有的核酸序列被引入靶生物样品的一个或多个细胞中。
内含子：本文使用术语“内含子”是指该术语的正常含义，即核酸分子(通常为DNA)的区段，其不编码被表达蛋白质的部分或全部，且其在内源条件下被转录为RNA分子，但是在该RNA被翻译为蛋白质之前从内源RNA上被切除。剪接(即内含子去除)在cDNA和内含子序列之间确定的剪接位点上发生，例如通常为至少约4个核苷酸。例如，但不限制，形成双链RNA的本文阐述的有义和反义内含子区段不含剪接位点。
等基因的(isogenic)：遗传上等同的生物(例如植物)，除了可由于异源DNA序列的存在或不存在而不同。
经分离的：本文使用术语“经分离的”是指材料已通过人手被取出，并离开其来源的、天然的环境而存在，从而不是天然产物。经分离的材料或分子(例如DNA分子或酶)可以以纯化的形式存在，或者存在于非天然环境中，例如转基因宿主细胞中。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但是从天然体系中一部分或全部共存的材料中分离的相同多核苷酸或多肽是经分离的。这类多核苷酸可以是载体的部分，和/或这类多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，并且由于此类载体或组合物不是其来源环境的一部分而是经分离的。优选地，关于核酸使用术语“分离的”时，如在“分离的核酸序列”中是指被鉴定并从至少一种污染核酸中分离的核酸序列，所述污染核酸在所述核酸序列的天然来源中与之通常相关。分离的核酸是以与其天然被发现时不同的形式或状态存在的核酸。相反，未分离的核酸是被发现处于它们天然存在的情形中的核酸(如DNA和RNA)。例如，给定的DNA序列(例如基因)被发现在宿主细胞染色体中接近邻近的基因；RNA序列(例如编码特异蛋白质的特异mRNA序列)被发现在细胞中是作为与编码多种蛋白质的大量其它mRNA的混合物。然而，包含例如SEQ ID NO：1的分离的核酸序列包括(以举例的方式)通常含有SEQ ID NO：1的细胞中的这类核酸序列，其中所述核酸序列在与天然细胞不同的染色体或染色体外位置中，或者另外被与天然存在的不同的核酸序列侧接。经分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸序列被用于表达蛋白质时，该核酸序列应最小含有至少一部分有义链或编码链(即核酸序列可以是单链的)。或者其可既含有有义链又含有反义链(即核酸序列可以是双链的)。
哺乳动物：术语“哺乳动物”旨在包括它们的正常含义。尽管本发明最期望在人中的效力，但是其也可用于驯养的哺乳动物如犬、猫和马，以及具有特定兴趣的哺乳动物，例如动物园动物、农场牲畜(farmstock)等。
成熟蛋白质：通常靶向细胞器(如叶绿体)的蛋白质，转运肽已从其中去除。
最小启动子：启动子元件特别是TATA元件，其在不存在上游激活时是失活的或具有显著降低的启动子活性。存在合适的转录因子时，最小启动子起作用为允许转录。
非编码：术语“非编码”是指不编码被表达蛋白质部分或全部的核酸分子的序列。非编码序列包括但不限于内含子、启动子区、3’非翻译区和5’非翻译区。
核酸和核苷酸：术语“核酸”和“核苷酸”是指天然存在的或合成的或人造的核酸或核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其单链或双链、有义或反义形式的任何核苷酸类似物和多聚体或杂交体。除非另有说明，特定的核酸序列也含蓄地包括其经保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。核苷酸类似物包括在碱基、糖和/或磷酸的化学结构中具有修饰的核苷酸，所述修饰包括但不限于5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺的修饰、5-溴-尿嘧啶的取代等等；和2’-位糖修饰，包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2′-OH被选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团替换。短发夹RNA(shRNA)也可包含非天然的元件如非天然的碱基(例如ionosin和黄嘌呤)、非天然的糖(例如2′-甲氧基核糖)或非天然的磷酸二酯键(例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯和肽)。
核酸序列：短语“核酸序列”是指从5’到3’端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚体。其包括染色体DNA、自复制质粒、DNA或RNA的传染性多聚体和起最初结构作用的DNA或RNA。“核酸序列”也指连续的一列表示核苷酸的缩写、字母、字符或词语。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”，其为相对短的核酸，通常长度小于100个核苷酸。通常核酸探针的长度从约50个核苷酸到约10个核苷酸。核酸的“靶区域”是被鉴定为感兴趣的核酸部分。核酸的“编码区”是核酸的部分，该部分置于适当调节序列的调控之下时以序列特异的方式被转录和翻译，产生特定的多肽或蛋白质。编码区被称作编码这样的多肽或蛋白质。
目的核苷酸序列：术语“目的核苷酸序列”是指任何核苷酸序列，其操作可以被本领域常规技术人员认为对于任何原因(例如赋予改良的性能)是想要的。这类核苷酸序列包括，但不限于结构基因(例如报道基因、选择标记基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码序列，和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调节序列(例如启动子序列、多聚腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。目的核酸序列优选编码有农业价值的性状。
寡核苷酸：术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或多聚体，以及有类似功能的具有非天然部分的寡核苷酸。这类经修饰或取代的寡核苷酸通常因为所期望的特征而优选于天然形式，所述特征例如增强的细胞吸收、对核酸靶标提高的亲和力和存在核酸酶时提高的稳定性。寡核苷酸优选包含通过键(例如磷酸二酯)或取代键彼此共价偶联的两个或多个核单体(nucleomonomer)。
有效键合：术语“有效键合”或“有效地连接”应当理解为例如表示调节元件(例如启动子)与待表达的核酸序列和适当时其它调节元件(例如终止子)以下述方式依次排列，所述方式使得各调节元件能够履行其预期的功能，从而允许、修饰、促进或以其它方式影响所述核酸序列的表达。表达可取决于相对于有义或反义RNA核酸序列的排列而产生。为此，化学意义上的直接键合不是必需的。遗传调控序列如增强子序列也可在远离或事实上来自其它的DNA分子的位置对靶序列显示其作用。优选的排列是下述排列，其中待重组表达的核酸序列位于起启动子作用的序列之后，使得两个序列彼此共价连接。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。在优选的实施方案中，待转录的核酸序列位于启动子之后，使得转录起点与本发明嵌合RNA的预期起点一致。有效键合和表达构建体可以通过所述的常规重组和克隆技术产生(例如Maniatis T，Fritsch E和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等人(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience；Gelvin等人(编辑)(1990)Plant Molecular Biology Manual；Kluwer AcademicPublisher，Dordrecht，The Netherlands)。然而，例如作为接头(具有限制性酶特异切割位点)或信号肽作用的其它序列也可位于这两个序列之间。序列的插入也可导致融合蛋白质的表达。优选地，由启动子和待表达核酸序列键合组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在，并可通过例如转化被插入植物基因组中。
器官：关于植物使用术语“器官”(或“植物器官”)是指植物的部分，并可包括(但不限于)例如根、果实、枝条、茎、叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等等。关于动物使用术语“器官”(“动物器官”)是指动物的部分，并可包括(但不限于)例如外部器官(如臂、腿、头等)或内部器官(如心、肾、肝、胃等)。
突出端：“突出端”是双链寡核苷酸分子5’或3’羟基端相对短的单链核苷酸序列(也称作“外延”、“突出末端”或“粘性末端”)。
植物：术语“植物”或“植物生物”是指能够光合作用的任何生物，以及来自其中的细胞、组织、部分或繁殖材料(例如种子或果实)。包括在本发明范围内的是植物界高等和低等植物的所有属物种。优选一年生、多年生、单子叶和双子叶的植物和裸子植物。“植物”是指处于任何发育阶段的任何植物或植物部分。成熟的植物是指处于幼苗阶段之后任何发育阶段的植物。包括成熟的植物、种子、枝条和幼苗，和得自其中的部分、繁殖材料(例如块茎、种子或果实)和培养物(例如细胞培养物或愈伤组织培养物)。幼苗是指处于早期发育阶段的年幼的、不成熟的植物。其中还包括插条、细胞或组织培养物和种子。如与本发明一起使用的，术语“植物组织”包括但不限于整株植物、植物细胞、植物器官、植物种子、原生质体、愈伤组织、细胞培养物和形成结构和/或功能单元的任何植物细胞群体。优选本文使用术语“植物”是指大多数植物细胞，其很大程度上分化为植物发育任何阶段存在的结构。这类结构包括一个或多个植物器官，包括但不限于果实、枝条、茎、叶、花瓣等。更优选术语“植物”包括整株植物、枝条营养性器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞、藻丝等等)及其后代。本发明方法中可使用的植物纲通常与适用于转化技术的低等和高等植物纲同样宽泛，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类和多细胞藻类。其包括多种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。包括在本发明范围内的是植物界高等和低等植物的所有种属。还包括成熟的植物、种子、枝条和幼苗，和来自其中的部分、繁殖材料(例如种子和果实)和培养物(例如细胞培养物)。优选以下植物科的植物和植物材料：苋科(Amaranthaceae)、十字花科(Brassicaceae)、Carophyllaceae、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)、蝶形花亚科(Papilionoideae)、百合科(Liliaceae)、亚麻科(Linaceae)、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、番杏科(Tetragoniaceae)。一年生的、多年生的、单子叶和双子叶植物是用于产生转基因植物的优选宿主生物。重组系统或本发明方法的使用还在所有观赏植物、林木、果树或观赏树、花、切花、灌木或草中有利。所述植物可包括，但不限于苔藓类植物，如苔纲(Hepaticae)(獐耳细辛属(hepatica))和Musci(藓类)；蕨类植物如蕨类、木贼属植物和石松；裸子植物如松类、苏铁类、银杏和Gnetaeae；藻类如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophpyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、蓝藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)(硅藻类)和裸藻纲(Euglenophyceae)。用于本发明目的的植物包括以下科：蔷薇科(Rosaceae)如玫瑰，杜鹃花科(Ericaceae)如杜鹃花属(rhododendrons)和杜鹃花(azaleas)，大戟科(Euphorbiaceae)如猩猩木(poinsettia)和巴豆(croton)，石竹科(Caryophyllaceae)如石竹，茄科(Solanaceae)如碧冬茄属(petunia)，苦苣苔科(Gesneriaceae)如非洲堇(African violet)，凤仙花科(Balsaminaceae)如凤仙花(touch-me-not)，兰科(Orchidaceae)如红门兰属(orchids)，鸢尾科(Iridaceae)如唐菖蒲属(gladioli)、鸢尾属(iris)、香雪兰属(freesia)和番红花属(freesia)，菊科(Compositae)如金盏花，牻牛儿苗科(Geraniaceae)如老鹳草属(geranium)，百合科(Liliaceae)如Drachaena，桑科(Moraceae)如无花果属(Ficus)，天南星科(Araceae)如喜林芋属(philodendron)和许多其它植物。根据本发明的转基因植物还特别选自双子叶作物植物，例如选自豆科(Leguminosae)，如豌豆、苜蓿和大豆；伞形科(Umbelliferae)，特别是胡萝卜属(Daucus)(非常特别的是胡萝卜种(胡萝卜))和芹属(Apium)(非常特别的是Apium graveolens var.dulce(芹菜))和许多其它的；茄科(Solanaceae)，特别是番茄属(Lycopersicon)，非常特别的是番茄(Lycopersicon esculentum)物种(番茄)，和茄属(Solanum)，非常特别的是马铃薯(Solanum tuberosum)物种(马铃薯)和茄子(Solanum melongena)物种(茄子)、烟草和许多其它的；以及辣椒属(Capsicum)，非常特别的是辣椒(Capsicum annum)物种(胡椒)和许多其它的；豆科(Leguminosae)，特别是大豆属(Glycine)，非常特别的是大豆(Glycin max)物种(大豆)和许多其它的；十字花科(Cruciferae)，特别是芸苔属(Brassica)，非常特别的是物种欧洲油菜(Brassica napus)(欧洲油菜)、芸苔(Brassica campestris)(甜菜)、Brassica oleracea cv Tastie(卷心菜)、Brassica oleracea cv Snowball Y(花椰菜)和Brassica oleracea cv Emperor(花茎甘蓝)；和拟南芥属，非常特别的是物种拟南芥和其它；菊科，特别是莴苣属(Lactuca)，非常特别的是物种莴苣(Lactuca sativa)(莴苣)和许多其它的。本发明的转基因植物特别选自单子叶作物植物，例如谷物，如小麦、大麦、高粱和粟、黑麦、黑小麦、玉米、稻或燕麦，和甘蔗。还优选树，如苹果树、梨树、温柏树、李树、樱桃树、桃树、油桃树、杏树、番木瓜树、芒果树和其它木本物种，包括松类和落叶树，如白杨、松树、杉、雪松、橡树等。特别优选的是拟南芥、烟草(Nicotiana tabacum)、欧洲油菜、大豆、玉米(玉蜀黍)、小麦、亚麻子、马铃薯和万寿菊。
多核苷酸构建体。术语“多核苷酸构建体”是指至少部分通过重组方法产生的核酸。术语“DNA构建体”是指由脱氧核糖核苷酸组成的多核苷酸构建体。该构建体可以是单链或优选双链的。该构建体可以是环状或线性的。技术人员熟知获得一个DNA构建体的多种方法。可以借助于例如描述于Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)；Silhavy等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience；Gelvin等人(编辑)(1990)Plant Molecular BiologyManual；Kluwer Academic Pub-lisher，Dordrecht，The Netherlands中的常规重组和克隆技术制备。
多肽：术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文可交换使用，表示连续氨基酸残基的多聚体或寡聚体。
前蛋白质：通常靶向细胞器(如叶绿体)并仍然包含其转运肽的蛋白质。
启动子：术语“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”是等价物，在本文使用是指与目的核苷酸序列连接时能够调控目的核苷酸序列转录成为mRNA的DNA序列。启动子通常(尽管并非必须)位于其调控向mRNA转录的目的核苷酸序列的5’(即上游)(例如接近结构基因的转录起始位点)，并提供用于转录起始的RNA聚合酶和其它转录因子的特异结合位点。如果多核苷酸序列来自外源物种，或来自相同物种但相对于其来源形式被修饰，则该多核苷酸序列对生物或另一核苷酸序列是“异源的”。例如，与异源编码序列有效连接的启动子是指编码序列所来源的物种与启动子所来源的物种不同，或当来自相同物种时，与所述启动子不天然相关的编码序列(例如遗传改造的编码序列或来自不同生态型或变种的等位基因)。合适的启动子可来自表达应当发生的宿主细胞的基因，或来自该宿主细胞的病原体(例如植物或植物病原体如植物病毒)。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应诱导剂而提高。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调节。启动子也可以以组织特异或组织优选的方式被调节，使得其仅在特异组织类型(如叶、根或分生组织)中转录相关编码区时有活性。应用于启动子时，术语“组织特异性”是指下述启动子，其能够指导目的核苷酸序列对特异类型的组织(例如花瓣)的选择性地表达，而相同的目的核苷酸序列在不同类型的组织(例如根)中没有表达。启动子的组织特异性可以例如如下评估：将报道基因与启动子序列有效连接产生报道基因构建体，将报道基因构建体引入植物基因组中使得该报道基因构建体被整合进所产生的转基因植物的每个组织中，检测报道基因在转基因植物的不同组织中的表达(例如检测报道基因编码的mRNA、蛋白质或蛋白质的活性)。报道基因在一个或多个组织中的表达水平相对于报道基因在其它组织中的表达水平更高的检测结果显示启动子对于其中检测到更高表达水平的组织而言是特异的。用于启动子时，术语“细胞类型特异的”是指下述启动子，其能够指导目的核苷酸序列在特异类型的细胞中选择性表达，而相同的目的核苷酸序列在相同组织中不同类型细胞中没有表达。用于启动子时，术语“细胞类型特异的”也表示能够启动目的核苷酸序列在单个组织中区域中选择性表达的启动子。启动子的细胞类型特异性可以使用本领域公知的方法评价，例如GUS活性染色或免疫组织化学染色。关于启动子使用术语“组成型的”是指能够指导有效连接的核酸序列在没有刺激(例如热激、化学品、光等)时转录的启动子。通常组成型启动子能够指导转基因在几乎任何细胞和任何组织中表达。相反，“可调节的”启动子是能够在存在刺激(例如热激、化学品、光等)时指导有效连接的核酸序列一定水平转录的启动子，所述水平与不存在刺激时有效连接的核酸序列的转录水平不同。
纯化的：本文使用术语“纯化的”是指从其天然环境中取出的分子(核酸或氨基酸序列)，其为分离的或独立的。“基本纯化的”分子与其天然结合的其它成分至少60％分离，优选至少75％分离，更优选至少90％分离。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。
重组体：关于多肽或蛋白质的术语“重组体”是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质，即由用外源重组DNA构建体(其编码所预期的多肽或蛋白质)转化的细胞产生的多肽或蛋白质。重组核酸和多肽也可包括下述分子，其天然不存在，但是被人修饰、改变、突变或以其它方式处理。优选“重组多肽”是在序列中与天然存在的多肽差异至少一个氨基酸残基的非天然存在的多肽。用于生产所述重组多肽和/或核酸的优选的方法可包括定向诱变或非定向诱变、DNA改组或用于循环重组(recursive recombination)的其它方法。
有义：术语“有义”被理解为表示具有下述序列的核酸，所述序列与靶序列(例如结合蛋白质转录因子的序列和参与给定基因表达的序列)同源或同一。根据优选的实施方案，核酸包含目的基因和允许所述目的基因表达的元件。
显著的提高或降低：提高或降低(例如在酶活性或基因表达中)是指大于测量技术固有的误差界限，优选比对照酶的活性或在对照细胞中的表达提高或降低约2倍或更多，更优选提高或降低约5倍或更多，最优选提高或降低约10倍或更多。
稳定：“稳定”植物细胞中核苷酸序列的表达是指应用本发明的方法后，核苷酸序列的表达水平与下述细胞中大致相同，所述细胞来自同一世代或(当植物在相同或相当的条件下生长时)贯穿多个世代的不同植物的同一组织。
基本互补：在本文中关于核苷酸序列相对于参考或靶核苷酸序列使用时，术语“基本互补的”以其最广泛的含义表示下述核苷酸序列，其具有基本互补的核苷酸序列与所述参考或靶核苷酸序列的精确互补序列之间具有至少60％，更期望至少70％，更期望至少80％或85％，优选至少90％，更优选至少93％，仍然更优选至少95％或96％，还仍然更优选至少97％或98％，还仍然更优选至少99％或最优选100％(在该语境中，后者等价于术语“同一的”)的同一性百分比。优选沿至少19个核苷酸的长度，优选至少50个核苷酸的长度，更优选沿核酸序列的整个长度针对所述参考序列评估同一性(如果下文没有另有说明)。根据Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48：443-453；如上文所定义的)，使用University of Wisconsin GCG，GAP的SEQWEB应用，使用默认的GAP分析进行序列比较。与参考核苷酸序列“基本互补的”核苷酸序列在低严格条件下、优选在中严格条件下、最优选在高严格条件(如上文定义)下与参考核苷酸序列杂交。
基本同一：在本文中关于核苷酸序列使用术语“基本同一的”以其最广泛的含义表示对应于参考或靶核苷酸序列的核苷酸序列，其中基本同一的核苷酸序列与参考或靶核苷酸序列之间的同一性百分比期望为至少60％，更期望至少70％，更期望至少80％或85％，优选至少90％，更优选至少93％，仍然更优选至少95％或96％，还仍然更优选至少97％或98％，还仍然更优选至少99％或最优选100％(在该语境中后者等价于术语“同一的”)。优选沿至少19个核苷酸的长度，优选至少50个核苷酸的长度，更优选沿核酸序列的整个长度针对所述参考序列评估同一性(如果下文没有另有说明)。根据Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48：443-453；如上文所定义的)，用University of WisconsinGCG，GAP的SEQWEB应用，使用默认的GAP分析进行序列比较。与参考核苷酸序列“基本同一的”核苷酸序列在低严格条件下、优选在中严格条件下、最优选在高严格条件(如上文定义)下与参考核苷酸序列的精确互补序列(即其在双链分子中相应的链)杂交。特异核苷酸序列的同源物包括编码下述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列使用上文所述参数测量时与参考氨基酸序列至少24％同一，更优选至少35％同一，还更优选至少50％同一，还更优选至少65％同一，其中所述同源物编码的氨基酸序列与特异核苷酸编码的蛋白质具有相同的生物活性。关于多肽在本文中使用术语“基本同一”是指对应于参考多肽的蛋白质，其中所述多肽具有与参考蛋白质基本相同的结构和功能，例如仅发生不影响多肽功能的氨基酸序列改变。当用于多肽或氨基酸序列时，使用如上所述的默认GAP分析参数时，基本相似的多肽或氨基酸序列和参考多肽或氨基酸序列之间的同一性百分比期望为至少24％，更期望至少30％，更期望至少45％，优选至少60％，更优选至少75％，仍然更优选至少90％，还仍然更优选至少95％，还仍然更优选至少99％。同源物是使用上述参数测量时与参考多肽或氨基酸序列至少24％同一，更优选至少35％同一，还更优选至少50％同一，还更优选至少65％同一的氨基酸序列，其中由同源物编码的氨基酸序列具有与参考多肽相同的生物活性。
合成的：本文使用“合成的”是指完全通过化学手段(例如通过化学合成的互补寡核苷酸的退火)而不是通过生物学手段(例如通过扩增化学合成的模板，其中使用聚合酶链式反应(PCR)或其它酶介导的生物反应如连接或磷酸化)制备。在优选的实施方案中，使用市售寡核苷酸合成机器合成寡核苷酸，所述机器包括但不限于可得自应用生物系统有限公司(AppliedBiosystems，Inc.)的ABI 394和ABI 3900DNA/RNA合成仪或其它市售等价合成仪。
靶基因：术语“靶标”、“靶基因”和“靶核苷酸序列”等价使用。本文使用靶基因可以是存在于真核生物(如植物)中的任何目的基因。靶基因可以是内源的或被引入的。例如，靶基因是具有已知功能的基因，或是其功能未知但是其整体或部分核苷酸序列已知的基因。或者，靶基因的功能及其核苷酸序列均未知。靶基因是真核细胞的天然基因，或之前通过例如遗传转化被引入真核细胞或所述真核细胞亲本细胞中的异源基因。异源靶基因被稳定整合进真核细胞的基因组中，或作为染色体外分子(例如作为自主复制的染色体外分子)存在于真核细胞中。靶基因可包括：包含下述区域的多核苷酸，所述区域编码调节复制、转录、翻译或对靶蛋白质表达重要的其它过程的多肽或多核苷酸区域；或包含下述区域的多核苷酸，所述区域编码靶多肽和调节靶多肽表达的区域；或非编码区域，如5′或3′UTR或内含子。靶基因可以表示例如通过转录目的基因产生的mRNA分子。另外，“嵌合RNA，其包含对应于靶基因序列的序列”中的术语“对应”表示两个序列是互补的或同源的或彼此具有这类的其它生物学合理关系(例如基于核单体的序列和它们的碱基配对特性)。本发明的嵌合RNA分子所指向的“靶基因”可以与病理状态相关。例如，该基因可以是病原体相关的基因，例如病毒基因、肿瘤相关基因、可检测的基因(例如异常的引发癌症的基因)或自身免疫疾病相关的基因。靶基因也可以是在重组体细胞或遗传改变的生物中表达的异源基因。通过测定或调节(例如抑制)这类基因的功能，可以获得在医学、兽医学和生物学中有价值的信息和治疗益处。
组织：关于生物(例如植物；“植物组织”)的术语“组织”表示多个细胞的排列，包括生物已分化的和未分化的组织。组织可构成器官的部分(例如植物叶或动物皮肤的表皮)，但是也可以组成肿瘤组织(例如愈伤组织)和多种类型的培养中的细胞(例如单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、类原球茎体(protocorm-like body)等等)。组织可以是体内的(例如植物内的)、器官培养物、组织培养物或细胞培养物内的。
转化：本文使用术语“转化”是指将遗传材料(例如转基因或异源核酸分子)引入细胞、组织或生物中。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。术语“瞬时转化”或“瞬时转化的”是指一个或多个转基因引入细胞中，而不将转基因整合进宿主细胞基因组中。瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测，该方法检测一个或多个转基因编码的多肽的存在。或者可通过检测转基因(例如uid A)编码的蛋白质(例如β-葡糖醛酸糖苷酶)活性来检测瞬时转化。术语“瞬时转化体”是指被瞬时掺入进了一个或多个转基因的细胞。相反，术语“稳定转化”或“稳定转化的”是指将一个或多个转基因引入并整合进细胞的基因组中，优选导致染色体整合和通过减数分裂的稳定遗传。细胞的稳定转化可以通过用细胞的基因组DNA与能够结合一个或多个转基因的核酸序列Southern印迹杂交来检测。或者，细胞的稳定转化也可以通过扩增转基因序列的细胞基因组DNA聚合酶链式反应来检测。术语“稳定转化体”是指细胞，其将一个或多个转基因稳定地整合进基因组DNA中。因此，稳定转化体与瞬时转化体的区别在于尽管来自稳定转化体的基因组DNA含有一个或多个转基因，但是来自瞬时转化体的基因组DNA不含有转基因。转化也包括以植物病毒载体(其涉及表染色体(epichromosomal)复制和基因表达)的形式将遗传材料引入植物细胞中，这可根据减数分裂的稳定性显示可变的特性。转化的细胞、组织或植物应理解为不仅包括转化过程的终产物，也包括其转基因后代。
转基因：本文使用术语“转基因”是指任何核酸序列，其通过实验操作被引入细胞的基因组中。转基因可以是“内源DNA序列”或“异源的DNA序列”(即“外源DNA”)。术语“内源DNA序列”是指核苷酸序列，其天然存在于其被引入的细胞中，只要其相对于天然存在的序列不含有一些修饰(例如点突变、可选择标记基因的存在)。
转基因的：关于细胞、组织或生物的术语“转基因的”表示用重组DNA分子(其优选包含与目的DNA序列有效连接的合适启动子)转化的，优选稳定转化的。
未受影响的：本文使用“本质上未受影响的(essentially unaffected)”是指物质(如蛋白质或mRNA转录物)的水平没有被特定事件改变，或仅以不影响该物质生理功能的程度被改变。在优选的方面，该物质的本质上未受影响的水平为细胞或生物(其缺乏能够选择性减少另一物质的核酸分子)中发现水平的20％之内，更优选10％之内，甚至更优选5％之内。本文使用“基本未受影响”是指物质(如蛋白质或mRNA转录物)的水平，其中该物质的基本未受影响的水平为细胞或生物(其缺乏能够选择性减少另一物质的核酸分子)中发现水平的49％之内，更优选35％之内，甚至更优选24％之内。本文使用“部分未受影响”是指物质(如蛋白质或mRNA转录物)的水平，其中该物质的部分未受影响的水平为细胞或生物(其缺乏能够选择性减少另一物质的核酸分子)中发现水平的80％之内，更优选65％之内，甚至更优选50％之内。
载体：本文使用术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合的载体，或“整合载体”，其可以被整合进宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体是附加型载体(episomal vector)，即能够染色体外复制的核酸。能够指导与其有效连接的基因表达的载体在本文中称作“表达载体”。在本说明书中，除非上下文另有说明，否则“质粒”和“载体”可互换使用。本文所述体外或体内被设计为产生RNA的表达载体可以含有位于任何RNA聚合酶(包括线粒体RNA聚合酶、RNA polI、RNA pol II和RNA pol III)调控下的序列。这些载体可用于在本发明的细胞中转录所期望的RNA分子。载体可被预期地设计为利用外源线粒体RNA聚合酶(例如人线粒体RNA聚合酶，在该情况下这类载体可以利用相应的人线粒体启动子)。线粒体聚合酶可用于体内产生加帽的(通过表达加帽酶)或不加帽的信息。RNA pol I、RNA pol II和RNA polIII转录物也可以体内产生。这类RNA可以被加帽或不加帽，且如果需要可以通过多种手段来实现细胞质加帽，所述手段包括使用加帽酶，如牛痘加帽酶或甲病毒属(alphavirus)加帽酶。DNA载体被设计为含有组合中的启动子(线粒体的、RNA polI、II或polIII或病毒、细菌或噬菌体启动子，与关联聚合酶一起)之一或多个启动子。优选地，当启动子为RNA pol II时，编码该RNA分子的序列具有大于约300nt的可读框以避免在核中降解。这类质粒或载体可包括来自细菌、病毒或噬菌体的质粒序列。这类载体包括染色体、附加体和来自病毒的载体，例如来自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件和病毒的载体，来自其组合的载体如来自质粒和噬菌体遗传元件、粘粒和噬菌粒的载体。因此，一个示范性的载体是单链或双链的噬菌体载体。另一示范性的载体是单链或双链的RNA或DNA病毒载体。可以通过将DNA和RNA引入细胞的已知技术将这类载体作为多核苷酸(优选DNA)引入细胞。在噬菌体和病毒载体情况下，也可以(并优选)通过用于感染和转导的公知技术将载体作为包装的(packaged)或包壳的(encapsidated)病毒引入细胞。病毒载体可以是可复制型或复制缺陷型。在后一情况下，通常仅在互补宿主细胞(complementing host cell)中发生病毒繁殖。
野生型：术语“野生型”、“天然的”或“天然来源的”关于生物、多肽或核酸序列是指所述生物是天然存在的，或可得自至少一种天然存在的生物，其未被人改变、突变或以其它方式操作。
发明详述
本发明的第一个实施方案涉及沉默或减弱至少一个靶基因表达的方法，所述方法包括向所述植物或其部分引入或在其中表达嵌合的、包含经修饰的ta-siRNA序列的核糖核苷酸序列，其中所述序列与天然的ta-siRNA序列相比，通过至少将所述天然ta-siRNA的一个相域替换为下述序列而被修饰，所述序列基本与所述靶基因互补并对于所述天然ta-siRNA是异源的。
本文公开的本发明的关键性、发明性特征在于使用ta-siRNA的天然基因沉默能力来实际上沉默或减弱植物中的任何目的基因，但是将所述ta-siRNA的一个天然相替换为对应于目的靶基因的序列。
特别令人感兴趣和发明有优势的是实质上所有的ta-siRNA都具有多于一个相。这允许通过用对应于所述不同目的靶基因的序列替换天然相来同时沉默多于一个(例如2、3、4、5、6、7、8个)不同的靶基因。从而可以达成多重基因的协同沉默，这迄今为止是一个非常复杂的工作，并且是生物技术学领域未满足的需要。该目的可以通过本发明所涉及的方法和主题来容易地达成。
不受任何特异功能性作用机制的限制，内源miRNA被认为与嵌合RNA序列中的miRNA标签相互作用，从而诱导其降解(或基因沉默)。令人惊奇地发现该沉默被限制于组织、时间和/或环境条件下，其中内源miRNA天然表达并被发现未扩散至整个生物。
1.嵌合ta-siRNA
术语“嵌合RNA”或“嵌合RNA分子”或“嵌合核糖核苷酸序列”在本文中可互换使用，并旨在表示至少一部分由核糖核苷酸组成的多核苷酸分子，其包含与另一序列共价连接的至少一部分天然ta-siRNA分子，所述另一序列对所述ta-siRNA序列是异源的(即在天然形式中不与之连接)。
本发明嵌合RNA序列是“至少部分由核糖核苷酸组成”的事实表示例如嵌合RNA序列可包含除核糖核苷酸之外的碱基。如下文所述，本发明的嵌合RNA分子也可通过化学合成获得。通过该方法，可合并除天然存在的核糖核苷酸残基之外的残基(例如修饰的残基)。
特异地，术语“嵌合核糖核苷酸序列”表示包含修饰的ta-siRNA序列的多核苷酸分子，其至少部分(优选完全)由核糖核苷酸组成，其中所述序列相对于天然的ta-siRNA序列而言被修饰，所述修饰为至少将所述天然ta-siRNA的一个相域替换为下述序列，所述序列与所述靶基因基本互补并相对于所述天然ta-siRNA异源。修饰表示天然ta-siRNA分子的部分也可能足够达成本发明的结果。优选嵌合核糖核苷酸分子包含天然ta-siRNA分子序列信息的至少50％，优选至少60％或70％，更优选至少80％或90％，最优选至少95％。
1.1鉴定和分离待改造的天然ta-siRNA
本领域技术人员明白可用于本发明的多种ta-siRNA。本文使用术语“Ta-siRNA”或“反式作用siRNA”是指具有转录(transcating)沉默特性的核糖核苷酸序列。Ta-siRNA是siRNA(小干扰RNA)种类的一个亚类，所述siRNA种类至少包括所述内源反式作用siRNA(ta-siRNA)、重复相关的siRNA(rasiRNA)和小扫描RNA(scnRNA)。Ta-siRNA是内源的反式作用siRNA，其反式指导内源关联mRNA的切割(靶基因与产生siRNA的基因不同)。Ta-siRNA可得自非编码基因的内含子(例如Arabidopsis Vazquez等人，2004b中)。这些RNA的生物发生似乎取决于属于两个不同途径的基因：AGO1、DCL1、HEN1、HYL1(miRNA途径所需)和RDR6与SGS3(病毒诱导的顺式作用siRNA途径所需)。天然ta-siRNA的靶基因可以根据它们的广阔互补性来预测。迄今为止，仅在具有RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的植物和线虫蠕虫中发现ta-siRNA。Ta-siRNA可以限制在具有RdRP依赖性dsRNA生产体系的生物中，而不存在于缺乏该体系的生物如哺乳动物中(细节参阅Kim VN(2005)Mol.Cells 19(1)：1-15)。Ta-siRNA指导下述基因的杂沉默(hetero-silencing)，抑制其表达，所述基因与它们所来自的基因几乎没有相似之处。在该含义中，已被表征的其它内源siRNA是顺式作用、进行自沉默的，以抑制下述基因的表达，所述基因与其来源的基因座相同或非常相似(Vazquez等人，(2004)Mol Cell 69-79)。反式作用siRNA(ta-siRNA)的生物发生需要DCL1和RDR6(Peragine A.等人(2004)Genes Dev.18：2368-237；Vazquez F等人(2004)Mol.Cell 16：69-79)。与miRNA基因相反，ta-siRNA前体转录物不形成折叠结构，但是有义和反义小RNA均从完全互补的RNA双链体加工而来。
因此，作为起始材料用于构建本发明嵌合核糖核苷酸序列所使用的天然ta-siRNA序列(作为材料或作为序列信息使用)优选由选自以下的序列描述：
a)SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列，和
b)与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列具有至少60％(优选至少70％或80％，更优选至少85％或90％，更优选至少95％或98％，最优选99％)同一性的序列，和
c)在一定条件下与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列或其(完全)互补序列杂交的序列，所述条件等价于当使用至少100个核苷酸(优选100个到约1,000个核苷酸；更优选至少200个核苷酸，甚至更优选至少500个核苷酸)长度的DNA探针时，在68℃下在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在包含1×SSC和0.1％SDS的溶液中于室温下洗涤。
更优选的c)的序列是在与下文等价的条件下杂交的序列：当使用长度至少100个核苷酸(优选100到约1,000个核苷酸；更优选至少200个核苷酸，甚至更优选至少500个核苷酸)的DNA探针时，在68℃下，由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在室温下用含有0.1×SSC和1％SDS的溶液洗涤。更优选的这些条件在上文定义章节给出。甚至更优选的c)的序列是在与下文等价的条件下杂交的序列：当使用长度至少100个核苷酸(优选100到约1,000个核苷酸；更优选至少200个核苷酸，甚至更优选至少500个核苷酸)的探针时，在68℃下，由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在68℃下用含有0.1×SSC和1％SDS的溶液洗涤。更优选的这些条件在上文定义章节给出。
通常，可通过以计分标准为基础的计算机算法来鉴定ta-siRNA。优选所述计分标准可包括使用的以下八条标准：
1.30％-52％GC含量-因为满足该标准加1分。
2.位置15-19(有义)上三个或更多的A/U-对每个A/U加1分，最多
总计加5分。在最终的输出中，至少3分需要被记为正(″+″)。
3.由Tm＜20℃测量的内部重复或发夹的缺失-因为满足此标准加1分。
4.位置19(有义)上为A-因为满足该标准加1分。
5.位置3(有义)上为A-因为满足该标准加1分。
6.位置10(有义)上为U-因为满足该标准加1分。
7.位置19(有义)上非G/C-因为不满足该标准减1分。
8.位置13(有义)上非G-因为不满足该标准减1分。
用于鉴定ta-siRNA的更精致的方案描述于下文实施例1中。然而本领域已知的其它方法可用于鉴定额外的ta-siRNA。例如，直系同源的ta-siRNA(例如对应于本文具体公开的ta-siRNA但来自于不同植物物种的ta-siRNA)也可以通过筛选(电子或材料)文库获得。这可以通过杂交筛选或通过计算机算法(例如blastn)筛选完成。因此，可以使用与本文具体公开的ta-siRNA在序列碱基上具有显著同一性和/或与之杂交的ta-siRNA。
除了上述修饰(替换一个相域和任选地替换微小RNA结合位点)之外，可以进行其它修饰(例如突变、缺失、添加等)。因此，所述修饰的ta-siRNA由下述序列描述，所述序列包含至少一个选自以下的序列：
a)SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列，和
b)由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的至少50个连续核苷酸组成的片段
c)与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和20所述序列的序列具有至少60％(优选至少70％或80％，更优选至少85％或90％，更优选至少95％或98％，最优选99％)同一性的序列，和
d)在一定条件下与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列或其互补序列杂交的序列，所述条件等价于当使用至少100个核苷酸(优选100个到约1,000个核苷酸；更优选至少200个核苷酸，甚至更优选至少500个核苷酸)长度的DNA探针时，在68℃下在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在包含1×SSC和0.1％SDS的溶液中于室温下洗涤。
更优选的c)的序列是在与下文等价的条件下杂交的序列：当使用长度至少100个核苷酸(优选100到约1,000个核苷酸；更优选至少200个核苷酸，甚至更优选至少500个核苷酸)的DNA探针时，在68℃下，由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在室温下用含有0.1×SSC和1％SDS的溶液洗涤。更优选的这些条件在上文定义章节给出。甚至更优选的c)的序列是在与下文等价的条件下杂交的序列：当使用长度至少100个核苷酸(优选100到约1,000个核苷酸；更优选至少200个核苷酸，甚至更优选至少500个核苷酸)的探针时，在68℃下，由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在68℃下用含有0.1×SSC和1％SDS的溶液洗涤。更优选的这些条件在上文定义章节给出。
1.2替换ta-siRNA的相域
本领域技术人员知道在ta-siRNA分子中鉴定相域的方法。术语“相域”表示约21个核苷酸的区域，其由切酶从ta-siRNA初级转录物加工而来，其优选具有对至少一个植物内源基因的基本互补性。这些相可通常如下鉴定(以miR173ta-siRNA为例)：对5’起始的ta-siRNA形成(如miR173指导的ta-siRNA)而言，miR173与初级转录物上其互补位点结合，并介导从miR173的5’端起位置10和11之间的转录物切割。从该切割位点，沿5’到3’方向产生一组约21nt的ta-siRNA相，这涉及一组关键酶(如RDR6、SGS3和切酶)。对3’起始的ta-siRNA形成(如miR390指导的ta-siRNA)而言，应用相似的方法，除了ta-siRNA的形成是从miR390切割位点开始沿3’到5’方向的。
如何鉴定这些相的更详细流程描述于下文实施例2和实施例3中。对本文具体公开的ta-siRNA序列而言，所述相注释在序列表中。
对本文公开的特异ta-siRNA分子而言，待替换的所述ta-siRNA的相域选自以下：
a)(对SEQ ID NO：1所述的玉米ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：1的核苷酸688到708、667到687、646到666、625到645、604到624、583到603、562到582和/或541到561所述的组的相域，和
b)(对SEQ ID NO：2所述的小麦ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：2的核苷酸585到605、564到584、543到563、522到542和/或501到521所述的组的相域，和
c)(对SEQ ID NO：3所述的稻ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：3的核苷酸525到546、504到524、483到503、462到482、441到461、420到440和/或399到419所述的组的相域，和
d)(对SEQ ID NO：4所述的棉花ta-siRNA TC31385而言)来自SEQID NO：4的核苷酸591到612、570到590、549到569、528到548、507到527、486到506、465到485和/或444到464所述的组的相域，和
e)(对SEQ ID NO：5所述的大豆ta-siRNA TC228167而言)来自SEQID NO：5的核苷酸595到616、574到594、553到573、532到552、511到531、490到510、469到489和/或448到468所述的组的相域，和
f)(对SEQ ID NO：6所述的油菜ta-siRNA 51296077而言)来自SEQ IDNO：6的核苷酸396到416、375到395、354到374、333到353、312到332、291到311、270到290和/或249到269所述的组的相域，和
g)(对SEQ ID NO：7所述的向日葵ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：7的核苷酸469到489、448到468、427到467、406到426、385到405、364到384、343到363和/或322到342所述的组的相域，和
h)(对SEQ ID NO：8所述的大麦ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：8的核苷酸482-503、461-481、440-460、419-439和/或398-418所述的组的相域，和
i)(对SEQ ID NO：9所述的番茄ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：9的核苷酸504到525、483到503、462到482、441到461、420到440、399到419、378到398和/或357到377所述的组的相域，和
j)(对SEQ ID NO：10所述的高粱ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：10的核苷酸510-531、489-509、468-488、447-467、426-446和/或405-425所述的组的相域，和
k)(对SEQ ID NO：11所述的云杉ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：11的核苷酸301到322、280到300、259到279、238到258、217到237、196到216、175到195和/或154到174所述的组的相域，和
l)(对SEQ ID NO：12所述的可可ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：12的核苷酸373到393、352到372、331到351、310到330、289到309、268到288、247到267和/或226到246所述的组的相域，和
m)(对SEQ ID NO：13所述的葡萄ta-siRNA而言)来自SEQ ID NO：13的核苷酸445到465、424到444、403到423、382到402、361到381、340到360、319到339和/或298到318所述的组的相域，和
n)(对SEQ ID NO：14所述的莲属(lotus)ta-siRNA而言)来自SEQ IDNO：14的核苷酸203到224、182到202、161到181、140到160、119到139、98到118、77到97和/或56到76所述的组的相域，和
o)(对SEQ ID NO：15所述的杨属(populus)ta-siRNA而言)来自SEQID NO：15的核苷酸1084到1105、1063到1083、1042到1062、1021到1041、1000到1020、9799到999、958到978和/或937到957所述的组的相域，和
p)(对SEQ ID NO：16所述的拟南芥ta-siRNA TAS1a而言)来自SEQID NO：16的核苷酸436到456、457到477、478到498、499到519、520到540、541到561、562到582和/或583到603所述的组的相域，和
q)(对SEQ ID NO：17所述的拟南芥ta-siRNA Arab TAS1b而言)来自SEQ ID NO：17的核苷酸592到612、613到633、634到654、655到675、676到696和/或697到717所述的组的相域，和
r)(对SEQ ID NO：18所述的拟南芥ta-siRNA Arab TAS1c而言)来自SEQ ID NO：18的核苷酸556到576、577到597、598到618、619到639、640到660和/或661到681所述的组的相域，和
s)(对SEQ ID NO：19所述的拟南芥ta-siRNA Arab TAS2而言)来自SEQ ID NO：19的核苷酸226到246、247到267、268到288、289到309、310到330和/或331到351所述的组的相域，和
t)(对SEQ ID NO：20所述的拟南芥ta-siRNA Arab TAS3而言)来自SEQ ID NO：20的核苷酸1013到1033、992到1012、971到991、950到
970、929到949、908到928、887到907和/或866到886所述的组的相域。
至少上述相之一被一序列取代，所述序列与目的靶基因基本互补并且对于所述天然ta-siRNA是异源的(即与其替换的序列不同)。优选所述序列与其替换的相域长度相同(通常相域具有21个核苷酸的长度，但是也可具有20到23个核苷酸的长度；例如20、21、22或23个核苷酸。然而，可以发现长度上的较小变化可以忍耐。因此，替换相域的序列可以比所述相域短或长例如一个、两个或三个核苷酸。
替换可以通过本领域技术人员已知的多种克隆技术完成，例如描述于Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)；Silhavy等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience；Gelvin等人(Eds)(1990)Plant Molecular BiologyManual；Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，The Netherlands中的技术。优选所述替换通过PCR介导的突变方法完成。
替换天然相域的序列应当与目的靶基因基本互补。已发现与靶基因的绝对互补性对于达成有效的基因沉默或减弱而言并非绝对必需的。另外，在一些情况下部分沉默是有利的，并可通过不使用完全互补性来更好地用量。因此，优选替换相域的序列与靶基因序列至少60％(优选至少70％或80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选95％)互补。换言之，优选在其长度(例如20到24个核苷酸)上，替换相域的所述序列与和相应靶基因绝对互补相比，具有不多于10个，优选不多于5或8个，更优选不多于3或4个，甚至更优选不多于2个，最优选不多于1个错配。替换天然相的序列与之互补的靶基因片段根据下述原则选择，所述原则与确定用于反义或dsRNAi途径的靶区域的原则相同。例如，如果需要高特异性，则如下选择区域：与其它无关基因序列没有或有很少同源性。如果需要沉默基因家族则如下选择区域：其代表了该家族的保守区域。
特别令人感兴趣的和本发明的优势是实质上所有的ta-siRNA都具有多于一个相。这允许通过用对应于所述不同目的靶基因的序列替换多于一个(例如至少2、3、4、5、6、7、8个)的天然相来同时沉默多于一个(例如至少2、3、4、5、6、7、8个)不同的靶基因。从而可以达成多重基因的协同沉默。当应当调节整个代谢途径或应当获得针对多于一种病原体的抗性时，这特别令人感兴趣。需要调节多个基因时存在多种其它的有前景的途径。
可使用本发明的方法调节(例如沉默或减弱)大量靶基因，包括植物中的基因以及植物感染或吞食的病原体、动物或甚至人的基因。优选靶基因选自植物内基因、转基因或来自感染植物的病原体的基因。更优选感染植物的病原体选自病毒、真菌、细菌、昆虫和线虫。在病原体的情况下，靶基因可以是例如持家基因或其它基因，其对病原体的生存力或增殖是必须的。因此被掺入ta-siRNA分子的序列(通过替换相域)优选对应于选自以下的靶基因：植物内基因、转基因或来自感染植物的病原体的基因。在病原体的情况下，感染植物的病原体优选地选自病毒、真菌、细菌、昆虫和线虫。
1.3替换ta-siRNA的微小RNA结合区
优选地，除了替换一个相域以外，所述天然ta-siRNA序列中的微小RNA结合位点也已被另一(异源的)序列替换，所述另一序列优选与小RNA序列基本互补。
本领域技术人员知道在ta-siRNA分子中鉴定微小RNA结合位点的方法。术语“微小RNA结合位点”是指ta-siRNA初级转录物中与miRNA基本互补的短区域(优选约21到23个核苷酸)。微小RNA结合位点相可以通过计算机分析鉴定和5’RACE确定(参阅‘Prediction of miRNA targets’inSupplemental data，Allen等人，2005，Cell 207-221)。
小RNA例如描述于Gustafson AM，等人(2005)Nucleic Acids Res 33，D637-40。微小RNA描述于(Lau NC等人(2001)Science 294(5543)：858-62；注释在：Science.2001Oct 26；294(5543)：797-9中)。用于系统鉴定或预测miRNA的相当的基因组方法和计算机方法描述于(例如程序MiRscan；Jones-Rhoades MW，Bartel DP(2004)Mol Cell 14(6)：787-99，Lim等人(2003)Genes Dev.7(8)：991-1008；Ohler U等人(2004)RNA 10(9)：1309-22；Robins H等人(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102(11)：4006-9.Epub 2005Feb 28；Rhoades MW等人(2002)Ceu 110(4)：513-20；Sunkar R等人(2005)Plant Cell 17(5)：1397-411.Epub 2005年4月1日；Wang XJ等人(2004)Genome Biol.5(9)：R65.Epub 20048月31日)中。这类预测也可以通过EST分析进行。(Smalheiser NR(2003)Genome Biol.4(7)：403.Epub 2003Jun18)。所有这些参考文献引入本文作为参考。
如何鉴定微小RNA结合位点的更详细流程描述于下文实施例2和3中。对本文具体公开的ta-siRNA序列而言，所述微小RNA结合位点在序列表中注释。对于本文公开的具体ta-siRNA分子而言，待替换的微小RNA结合位点选自：
a)SEQ ID NO：1的核苷酸698到718所述的结合位点，和
b)SEQ ID NO：2的核苷酸594到615所述的结合位点，和
c)SEQ ID NO：3的核苷酸536到556所述的结合位点，和
d)SEQ ID NO：4的核苷酸601到622所述的结合位点，和
e)SEQ ID NO：5的核苷酸605到626所述的结合位点，和
f)SEQ ID NO：6的核苷酸405到426所述的结合位点，和
g)SEQ ID NO：7的核苷酸478到499所述的结合位点，和
h)SEQ ID NO：8的核苷酸492到512所述的结合位点，和
i)SEQ ID NO：9的核苷酸514到535所述的结合位点，和
j)SEQ ID NO：10的核苷酸521到541所述的结合位点，和
k)SEQ ID NO：11的核苷酸311到332所述的结合位点，和
l)SEQ ID NO：12的核苷酸382到403所述的结合位点，和
m)SEQ ID NO：13的核苷酸454到475所述的结合位点，和
n)SEQ ID NO：14的核苷酸213到234所述的结合位点，和
o)SEQ ID NO：15的核苷酸1094到1115所述的结合位点，和
p)SEQ ID NO：16的核苷酸424到445所述的结合位点，和
q)SEQ ID NO：17的核苷酸580到601所述的结合位点，和
r)SEQ ID NO：18的核苷酸544到565所述的结合位点，和
s)SEQ ID NO：19的核苷酸214到235所述的结合位点，和
t)SEQ ID NO：20的核苷酸1022到1043所述的结合位点。
上述微小RNA结合位点被下述序列替换，所述序列与小RNA序列基本互补。所述小RNA序列优选能够识别其它RNA序列并介导其切割，更优选其选自微小RNA和存在于植物中的siRNA。
术语小RNA表示短RNA，其为约19-24个核苷酸长。
术语微小RNA(或miRNA)表示约19到24个核苷酸的非编码小RNA。其从内源miRNA基因转录而来，转录物形成茎-环的二级结构。这类转录物(前miRNA)通过一组酶(包括切酶)被加工为成熟和有功能的形式，即miRNA。植物miRNA含有对通常位于mRNA蛋白质编码区的靶位点具有接近完美的互补性。植物miRNA被装配进RISC复合物后，通过靶向并降解mRNA或抑制翻译来负调节基因表达。
术语siRNA表示约19-24个核苷酸的小干扰RNA。其来自dsRNA转基因、转座子、病毒等并由切酶从长双分子RNA双链体或展开的发夹加工而来。SiRNA被装配进RISC复合物来靶向和降解mRNA。siRNA和miRNA之间的差异在本领域和下文表1中更详细地描述。
表1：siRNA和miRNA之间的区别
  miRNA  siRNA
  来自基因组基因座(即内源基因)  衍生的dsRNA转基因、转座子、病毒
  从来自局部RNA发夹前体的转录物加工而来  从长的双分子RNA双链体或展开的发夹加工而来
  单个miRNA分子从每个miRNA发夹前体分子的一个臂聚集而来  许多不同的siRNA从siRNA前体的两条链聚集而来
  miRNA序列在相关生物中是保守的  siRNA序列不保守
  反式沉默  自沉默
  空间表达或时间表达  dsRNA转基因表达
  转录后基因沉默或翻译抑制  转录或转录后的基因沉默
可以通过本领域技术人员已知的多种克隆技术完成替换，所述技术例如描述于Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)；Silhavy等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience；Gelvin等人(编辑)(1990)Plant Molecular BiologyManual；Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，The Netherlands。优选通过PCR介导的突变途径进行所述替换。
替换天然微小RNA结合位点(下文也称作“RNA标签”)的序列应当与小RNA序列基本互补。已发现靶基因对小RNA序列(例如内源微小RNA)的绝对互补性对于达成与靶小RNA的有效结合而言并非绝对必需的。因此，优选替换微小RNA结合位点的序列与小RNA分子序列至少60％(优选至少70％或80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选95％)互补。换言之，优选在其长度(例如20到24个核苷酸)上，替换微小RNA结合位点的所述序列与和小RNA序列(例如微小RNA)绝对互补相比，具有不多于10个，优选不多于5或8个，更优选不多于3或4个，甚至更优选不多于2个，最优选不多于1个错配。更优选与小RNA(例如微小RNA)基本互补的序列优选在其整个序列上与小RNA(例如微小RNA)序列的互补序列具有至少60％的同一性或不大于6个错配。更优选所述错配主要在对应于所述小RNA(例如微小RNA)的3’区的区域中。尽管错配的核苷酸可以贯穿miRNA序列(即在任何位置)发生，但是优选它们位于接近内源miRNA 3’区或在其中的区域。内源miRNA的3’区与miRNA标签的5’区互补。因此，优选所述错配在miRNA标签的5’区。已经证明例如可在miRNA的3’区改造3个错配加上G::U摇摆而不影响其功能(Mallory等人，EMBO Journal，23：3356-3364，(2004))。因此，在最优选的实施方案中，术语基本互补是指miRNA标签和内源miRNA之间可以发生3.5个错配(即3个真错配加上一个计为0.5的G:U摇摆)。以该种方式可以将miRNA序列设计为调节任何靶序列的表达。
尽管本发明不依赖于特定尺寸的RNA-标签，但是RNA-标签应具有与天然微小RNA结合位点长度相似的长度，其在本领域已知为一般包含约15个和30个之间的核苷酸(约20到约28个核苷酸，更特别地约21-24个核苷酸)。因此优选所述序列具有与被替换的微小RNA结合位点相同的长度(通常，相域具有21个核苷酸的长度，但是也具有20到23个核苷酸的长度；例如20、21、22或23个核苷酸)。然而，替换微小RNA结合位点的序列可以比微小RNA结合位点更长或更短(例如更长或更短一个、两个或三个核苷酸)。
在一个优选的实施方案中，小RNA为天然微小RNA，其更优选选自内源植物微小RNA和转基因微小RNA。
本发明一个有利的特征是通过选择微小RNA，可以使靶基因的沉默成为组织或发育特异性的。因此优选微小RNA是组织特异表达的、空间调节的、发育调节的和/或由生物或非生物胁迫因素调节的。
本领域技术人员知道大量微小RNA和鉴定它们的方法(见上文)。示范性的miRNA由例如SEQ ID NO：78、79、80、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109和/或110之任一描述，或微小RNA来自前体序列，特别是miR173和/或miR390的前体序列，例如微小RNA来自包含Seq ID No.210、215、216、217、218、219、220、221、222和/或223的序列。额外的miRNA及其表达谱(可用于达成组织或发育特异沉默)描述于表20、21A、21B和22中。
通过选择指导本发明嵌合核糖核苷酸序列表达的启动子(细节见下文)，但是也通过选择对应于用于替换天然微小RNA结合位点的小RNA(例如微小RNA序列)的序列，可以以例如组织特异或发育特异的方式调节沉默谱。为了允许组织或发育特异的基因沉默或减弱，优选微小RNA(待表达的核苷酸序列中包含的序列与之基本互补)不是组成型表达的，但是在选自以下的至少一个参数中表达有变化：组织、空间、时间、发育、环境或其它外源因素。优选微小RNA是组织特异性或偏好性表达的、空间调节的、发育调节的和/或受其它因素(如生物或非生物胁迫因素)调节的。
组织-组织特异性或偏好性表达的miRNA在本文中应理解为：在给定的特异时间(这类表达谱可随时间(例如在发育或老化期间)改变或不改变)或在其它条件(外源因素如胁迫)下，在生物所有组织中不以相同程度表达的miRNA。优选miRNA仅在一个或少许组织中表达，而在其它组织中不表达为显著量(例如容易通过标准RNA检测方法如Northern印迹来检测的量)。
受其它因素调节的miRNA可包括在生物与因素相互作用时被上调或下调(在一个、多个或所有组织中)的miRNA，所述因素优选外源因素，更优选胁迫刺激。这类胁迫刺激可包括非生物胁迫和生物胁迫因素。根据玉米miR160(细节见实施例)是胁迫诱导的微小RNA的事实，非常可能一些其它的miRNA被一系列环境刺激(例如生物胁迫和化学品)诱导。使用上述类似的策略，可以调控转基因响应环境刺激在某些组织中的表达。
存在鉴定和分离多种生物和组织中的miRNA的若干方法。例如，从生物或特异组织或细胞类型中分离总RNA后，将RNA在变性的15％聚丙烯酰胺凝胶中分离(resolve)。将代表15到26个核苷酸尺寸范围的凝胶片段切下，洗脱小RNA并回收。随后，将小RNA与5’和3’RNA/DNA嵌合寡核苷酸接合体连接。使用RT引物进行反转录反应，然后用适当的引物进行PCR。然后将PCR产物克隆进载体中用于测序(Sunkar R和ZhuJK.(2004)The Plant Cell 16：2001：2019)。已将若干其它技术和方法应用于检测生物或组织中的miRNA，例如Northern印迹分析、基于核糖核酸酶保护的PAGE、基于微阵列的miRNA作图和qRT-PCR Tagman分析。
1.4生产和/或表达本发明的嵌合RNA
本文提供了新颖并同样具有发明性的嵌合核糖核苷酸序列。因此，本发明的另一实施方案涉及嵌合核糖核苷酸序列，所述嵌合核糖核苷酸序列包含经修饰的ta-siRNA序列，其中所述序列相对于天然的ta-siRNA序列而言，通过至少将所述天然ta-siRNA的一个相域替换为下述序列而被修饰，所述序列基本与靶基因互补并相对于所述天然ta-siRNA是异源的。
所述嵌合核糖核苷酸序列的特异和优选的特征如上文所述，并也用于涉及所述嵌合核糖核苷酸序列的主题的全部方面。优选所述天然ta-siRNA序列中的微小RNA结合位点被下述序列取代，所述序列与小RNA序列基本互补，所述小RNA序列能够识别其它RNA序列并介导其切割。更优选所述小RNA选自微小RNA和存在于植物中的siRNA。用于设计替换序列的优选的微小RNA在上文描述。嵌合核糖核苷酸序列的其它优选特征例如：
a)天然ta-siRNA序列，和/或
b)经修饰的ta-siRNA序列，和/或
c)所述ta-siRNA的相域，和/或
d)待替换的微小RNA结合位点
如上文所述用于本发明的方法。
嵌合RNA分子可以通过本领域技术人员熟悉的多种手段被生产并用于宿主细胞或生物。本发明的嵌合RNA分子可以通过本领域已知的任何方法生产或合成，例如使用重组表达、酶合成或化学合成。RNA分子可体外(例如使用酶合成和化学合成)或体内(使用本领域公知的重组DNA技术)合成。
例如嵌合RNA可以在真核靶细胞之外产生，或可在靶细胞内(通过表达构建体)重组产生。在一个实施方案中，本发明的嵌合RNA分子可以通过酶合成方法或化学合成方法体外产生。在另一实施方案中，嵌合RNA分子可以在重组培养物(例如细菌细胞)中产生，从其中分离，并用于下文讨论的方法中。在另一实施方案中，另一物质(例如表达构建体或载体)在被递送给靶细胞或生物后体内产生嵌合RNA分子。靶细胞或生物优选哺乳动物、植物细胞或动物(如线虫)细胞或生物。例如，嵌合RNA分子可以是
a)从靶细胞或生物中的表达构建体或表达载体表达而来，或
b)从体内或体外转录体系的表达构建体表达而来，其中嵌合RNA分子纯化自所述转录体系，并被引入宿主细胞或生物(例如通过加料或注射)，或
c)(例如通过加料或注射)引入宿主细胞或生物中的嵌合RNA分子的化学合成。
1.4.1通过重组表达来表达嵌合RNA
在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合RNA分子可以通过重组表达产生。因此，在本发明的一个实施方案中，嵌合RNA通过表达构建体或表达载体在细胞中产生。
在本发明一个优选的实施方案中，嵌合核糖核苷酸序列表达自表达构建体。为此目的，核糖核苷酸序列可以由相应的DNA序列编码和转录。因此，本发明的另一实施方案涉及编码本发明嵌合核糖核苷酸序列的脱氧核糖核苷酸序列。
因此，本发明的另一实施方案涉及包含启动子序列和与之功能性连接的核苷酸序列(其编码上述嵌合核糖核苷酸序列)的表达构建体。
优选嵌合核糖核苷酸序列在植物中直接表达。因此，优选启动子是在植物中有功能的启动子。与编码嵌合核糖核苷酸序列的序列有效连接的启动子优选选自组成型启动子、组织特异或组织偏好型启动子和诱导型启动子、发育调节启动子，和由生物或非生物胁迫因素调节的启动子。
嵌合RNA分子可以在植物细胞或生物中直接制造(例如表达)，在植物细胞或生物中能够直接实现其功能而不需要其它引入。或者，嵌合RNA分子可以在另一细胞中表达，任选地纯化，随后递送进靶细胞或生物中。因此，本发明的RNA分子可以在重组微生物(例如细菌和酵母)或重组宿主细胞或生物(例如植物或哺乳动物细胞)中产生，并任选地通过常规技术从其培养物中分离。参阅例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING，ALABORATORY MANUAL，第二版；Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989(其为详述这些技术的示范性实验室手册)中描述的技术和US 5,824,538；5,877,159和65,643,771中描述的技术，所述参考文献引入本文作为参考。
本发明的RNA分子体内形成时，它们优选使用表达构建体或表达载体产生。更优选表达构建体或载体包含编码至少一个上述本发明嵌合RNA分子的核酸序列，优选双链DNA分子，其与转录调节序列(启动子)有效连接，所述转录调节序列能够实现所述核酸序列在选定的宿主或靶细胞中转录产生本发明的嵌合RNA。如所讨论的，大量启动子可用于本发明的实践中。启动子可以根据所预期的结果来选择。因此，用于表达嵌合RNA的核苷酸序列可以与组成型、组织优选的、诱导型、发育型或其它启动子组合，用于根据预期的结果在植物中表达。特异的启动子在下文描述。表达构建体及其元件优选如上文所定义用于本发明的方法。
表达构建体的用途和产生为本领域已知(还参阅WO 97/32016；U.S.Pat.Nos.5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693；及其中所述参考文献)。
表达构建体可以是部分的或更大的载体构建体。因此，本发明的另一实施方案涉及包含本发明表达构建体的表达载体。优选该表达载体为真核表达载体。更优选该真核表达载体为病毒载体、质粒载体或二元载体。表达构建体可以通过合适的限制性切割位点被插入载体(优选质粒载体)中。得到的载体首先被引入大肠杆菌中。选择正确转化的大肠杆菌，培养，并通过本领域技术人员熟悉的方法获得重组载体。可使用限制性分析和测序来验证克隆步骤。优选的载体为可能将表达构建体稳定整合进宿主基因组中的载体。合适的启动子和载体构建体描述于美国专利申请No.20040220130中。可商业获得大量试剂盒用于从细菌中纯化载体(例如质粒)。为了它们的适当用途，依照制造商的说明书(参阅例如均来自法玛西娅生物技术公司(Pharmacia Biotech)的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；来自斯莱特因(Stratagene)的StrataCleanTM和来自强基因公司(Qiagen)的QIAprepTM)。然后可将分离和纯化的载体进一步操作以产生其它质粒，用于转染细胞或掺入其它载体体系(例如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens))中来感染和转化靶细胞或生物(优选植物)。
用于表达本发明嵌合核糖核苷酸序列的表达构建体或载体可以是DNA、RNA，并可以是单链或双链的。优选表达构建体或载体为DNA，更优选双链DNA。更优选表达载体为双链的、环状的质粒DNA载体。载体的实例(细节参阅上文定义章节)可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒或农杆菌。优选载体为真核表达载体。更优选真核表达载体为病毒载体或质粒载体。
在某些实施方案中，表达构建体或载体为例如附加型，且转染是瞬时的。在其它实施方案中，表达构建体或载体(或其部分，如二元载体的T-DNA区)被染色体整合，例如以产生稳定转染的细胞系。用于形成这类稳定细胞系的优选载体描述于US 6,025,192和WO/9812339，其引入本文作为参考。用于在大肠杆菌中表达的载体优选为pQE70、pQE60和pQE-9(强基因有限公司(QIAGEN，Inc.))；pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(斯莱特因克隆系统有限公司(Stratagene Cloning Systems，Inc.))；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(法玛西娅生物技术有限公司(Pharmacia Biotech，Inc.))。
如上文所述(对特异的生物和细胞而言下文更详细)，表达构建体和载体可以被引入生物或细胞中。本发明的另一实施方案涉及经转化的细胞或非人生物，其包含本发明的序列(例如嵌合核糖核苷酸序列或编码所述序列的DNA序列)、表达构建体或表达载体。优选经转化的细胞或非人生物包含插入其基因组(优选染色体或质体DNA)的所述表达构建体或表达载体。更优选经转化的细胞或非人生物选自哺乳动物、细菌(原核的)、真菌、线虫或植物细胞和生物。
优选的原核生物主要是细菌，如埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、丙酸杆菌属(Proionibacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、真杆菌属(Eubacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、欧文氏菌属(Erwinia)、农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、Phaeodactylum、豆形虫属(Colpidium)、被孢霉属(Mortierella)、虫霉属(Entomophthora)、毛霉属(Mucor)、隐甲藻属(Crypthecodinium)或蓝细菌属(Cyanobacteria)的细菌，例如集胞藻属(Synechocystis)。优选的微生物主要是能够感染植物从而转移本发明构建体的那些。优选的微生物是农杆菌属的微生物，特别是根癌农杆菌和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)物种。
植物可以是单子叶、双子叶植物或裸子植物；动物可以是脊椎动物或无脊椎动物。优选的动物和植物生物在上文定义章节给出。优选的真菌为曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、阿舒囊霉属(Ashbya)、脉孢菌属(Neurospora)、镰孢属(Fusarium)、白僵菌属(Beauveria)或IndianChem Engr.Section B.卷37，No 1，2(1995)，15页，表6中描述的其它真菌。特别优选的是丝状半子囊菌纲(Hemiascomycete)棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)。优选的酵母是假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)，特别优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(ATCC登录号No.201178)。特别优选的动物生物是线虫。
优选的生物是植物生物。优选的植物特别选自作物植物。最优选的为：
a)适合产油的植物，例如欧洲油菜、向日葵、芝麻、红花(Carthamustinctorius)、橄榄树、大豆、玉米、花生、蓖麻植物、油棕、小麦、可可树，或多种坚果物种，例如胡桃、椰子或杏树。其中特别优选的依次是双子叶植物，特别是欧洲油菜、大豆和向日葵。
b)用于生产淀粉的植物，例如玉米、小麦或马铃薯。
c)用作粮食材料和/或饲料材料和/或有用植物的植物，其中对病原体的抗性将是有利的，例如大麦、黑麦、稻、马铃薯、棉花、亚麻或亚麻籽。
d)可用于生产精细化学品(例如维生素和/或类胡萝卜素)的植物，例如欧洲油菜。
植物变种可以被排除在外，特别是根据植物培育者权利法(PlantBreeders Rights)可以注册的植物变种。注意到植物不需要被考虑为“植物变种”，只简单地因为其基因组中稳定地含有转基因，所述转基因被引入植物或其祖先的细胞中。除植物外，本发明提供这类植物的任何克隆、种子、自交或杂交后代和后裔，和这些中任意的任何部分或繁殖体(例如插条和种子)，其可用于有性或无性地再生或繁殖。本发明还包括植物，其为这类植物有性或无性繁殖的幼苗、克隆或后代，或所述植物、子代、克隆或后代的任何部分或繁殖体。本发明的遗传修饰的植物(其可被人或动物消耗)也可以用作食物或饲料，例如直接使用或在本领域已知的加工后使用。本发明还提供生物(特别是植物)的部分，特别是繁殖部分或储存部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠、花粉、根、块茎、茎、叶、柄、果实、浆果、坚果、树皮、荚果、种子和花。在本发明特别优选的实施方案中，植物部分为种子。
1.4.2将嵌合RNA引入细胞和生物
本发明的嵌合RNA或其递送或生产物质(例如表达构建体或载体)(下文一起称作“RNA物质”)可以以本领域技术人员熟悉的多种方式引入生物或细胞(例如植物)中。“引入”就本发明的目的而言，应广义理解为并且包括下述方法，所有所述方法适用于将本发明的RNA物质直接或间接地引入生物或生物的细胞、区室、组织、器官或种子中，或在其中产生本发明的RNA物质。引入可以导致RNA物质的瞬时存在或稳定存在。所述RNA物质在上文详细描述。
通常，RNA物质以允许每个细胞至少递送一个拷贝的量被引入或施用。如果合适，更高的用量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1,000个拷贝)能够造成更有效的表型(例如靶基因的更高表达或更高抑制)。施用给细胞、组织或生物的RNA物质的用量取决于细胞、组织或生物的性质，靶基因的性质和RNA物质的性质，并且所述用量可容易地被优化以获得所期望的表达或抑制水平。
优选至少约100个分子，优选至少约1,000个、更优选至少约10,000的RNA物质，最优选至少约100,000的RNA物质被引入。在将RNA物质通过除注射外的方法(例如通过浸泡、电穿孔或脂质介导的转染)施用给细胞培养物或组织中的细胞的情况下，细胞优选暴露于培养基中相似水平的RNA物质中。
例如，RNA物质可以通过转化、转染、注射、发射、接合、胞吞作用和吞噬作用被引入细胞中。用于引入的优选方法包括但不限于：
a)将本发明的嵌合RNA分子直接或物理引入靶细胞或生物中的方法，和
b)将本发明的嵌合RNA分子间接引入靶细胞或生物中的方法(例如通过先将表达构建体引入，然后细胞内表达)。
1.4.2.1将RNA直接和物理地引入靶细胞或生物
在本发明的嵌合RNA(或RNA物质)在靶细胞或生物外产生的情况下，其可以与靶生物(优选人、病原体或植物细胞或生物)的一个或多个细胞接触(即使其接触，本文也表示被施用或递送至)并被其吸收。接触可以是体外的，例如在试管或培养皿中(并可以被引入或不引入受试者中)；或体内的，例如在受试者(例如哺乳动物、病原体或植物受试者)中。病原体优选线虫。
本发明的嵌合RNA(或RNA物质)可以被直接引入细胞(即细胞内地)；或细胞外引入腔、胞间隙、生物的循环中，经口引入，或可以通过将生物浸在含有本发明嵌合RNA(或RNA物质)的溶液中引入。用于经口引入的方法包括将RNA与生物的食物直接混合，以及经改造的方法，该方法中用作食物的物种被改造为表达本发明的嵌合RNA(或RNA物质)，然后被喂给待被影响的生物。
引入核酸的物理方法包括将本发明嵌合RNA(或RNA物质)的溶液直接注射进细胞中或细胞外注射进生物中。例如，在胚胎或细胞的情况下，本发明的嵌合RNA(或RNA物质)通过显微注射被便利地施用；将核酸引入细胞中的其它方法包括通过被本发明嵌合RNA(或RNA物质)覆盖的粒子轰击、将细胞或生物浸泡在本发明嵌合RNA(或RNA物质)的溶液中、在存在本发明嵌合RNA(或RNA物质)时电穿孔细胞膜、脂质体介导本发明嵌合RNA(或RNA物质)的递送和通过化学品如磷酸钙介导的转染。
本发明的嵌合RNA(或RNA物质)物质可以与增强细胞RNA吸收的成分一起被引入，或以其它方式提高其功能。进入细胞的递送可以通过合适的本领域已知方法(包括磷酸钙、DMSO、甘油或葡聚糖、电穿孔)增强，或使用本领域已知方法通过转染(使用例如阳离子、阴离子或中性脂类组合物或脂质体)来增强(参阅例如WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；US 4,897,355；Bergan等人1993.Nucleic Acids Research.21：3567)。使用下述化合物的多胺或聚阳离子缀合物也可被使用，所述化合物为例如聚赖氨酸、鱼精蛋白或N1，N12-二(乙基)精胺(参阅例如Bartzatt，R.等人1989.Biotechnol.Appl.Biochem.11：133；Wagner E.等人1992.Proc.Natl.Acad.Sci.88：4255)。在细胞培养物或组织外植体的情况下，细胞在含有本发明嵌合RNA(或RNA物质)的溶液中便利地孵育或由脂质介导转化；在整个动物或植物的情况下，本发明的嵌合RNA(或RNA物质)通过注射或灌注进生物的腔或胞间隙，或通过经口全身的、局部的、肠胃外的(包括皮下的、肌内的和静脉施用)、阴道的、直肠的、鼻内的、眼的或腹膜内施用被便利地引入。
另外，本发明的嵌合RNA(或RNA物质)可以通过可植入的延长释放设备来施用。用于经口引入的方法包括将RNA与生物的食品直接混合，以及改造的方法，所述改造的方法中用作食物的物种被改造为表达RNA，然后被喂给待受影响的生物。本发明的嵌合RNA(或RNA物质)可以被喷雾在植物上，或植物可被遗传改造为以下述量表达所述RNA，所述量足够杀死一些或全部已知感染该植物的病原体。
1.4.2.2间接引入RNA
或者，可通过引入(例如通过转化或转染)一个或多个表达构建体或表达载体(其编码本发明的嵌合RNA分子)向细胞提供RNA物质。本发明嵌合RNA的表达可以是瞬时的或(例如，在例如使用选择标记整合进生物基因组后)是稳定的。对于药物应用而言优选RNA物质被瞬时引入而不稳定整合进基因组中。对于植物中应用而言，优选嵌合RNA表达体系被稳定整合进细胞的基因组中，例如染色体DNA或细胞器(例如质体(例如叶绿体)、线粒体等等)DNA中。优选整合进染色体DNA中。
表达构建体和载体通常在上文描述(参阅定义章节和1.3.1章节)。优选的表达构建体在下文针对本发明组合物和方法的具体应用更加详细地描述。通过引入表达构建体或载体(RNA可从其中转录而来)给细胞提供RNA的方法公开于WO 99/32619。原则上，上文所述将RNA分子直接引入细胞中的所有方法可以用于引入类似表达构建体或载体的核酸分子。
1.5植物转化&表达技术
可以使用常规的重组DNA技术在植物细胞中表达本发明的嵌合RNA。通常，这涉及使用本领域已知的标准克隆方法将编码本发明嵌合RNA的核苷酸序列插入表达构建体或表达载体中。
1.5.1.构建植物表达构建体的要求
表达构建体或本发明的表达构建体包含与编码本发明嵌合RNA的核酸序列有效连接的一个或多个遗传调控序列(或调节序列)。这些遗传调控序列调节宿主细胞中嵌合RNA的表达。遗传调控序列描述于例如“Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)”或“Gruber和Crosby，在：Methodsin Plant Molecular Biology and Biotechnolgy，CRC Press中，Boca Raton，Florida，编辑：Glick和Thompson，第7章，89-108”及其中所引用的参考文献中。期望用于在植物中表达的序列首先与在植物中有功能的合适启动子有效连接。这类表达构建体任选地包含转基因表达所需要或所选择的其它序列。这类序列包括，但不限于转录终止子、增强表达的外来序列。这些表达构建体被容易地转移至下文所述的植物转化载体中。
1.5.1.1.启动子
赋予本发明嵌合RNA表达的核酸序列优选包含植物特异启动子或与之有效连接。术语“植物特异启动子”原则上表示能够在植物或植物部分、植物细胞、植物组织、植物培养物中控制基因(特别是外源核酸序列或基因)表达的任何启动子。在该语境中，所述植物特异启动子的表达特异性可以是例如组成型的、组织特异的、诱导型的或发育特异的。优选以下的：
1.5.1.1.1组成型启动子
当期望在转基因植物或其它生物的所有组织中表达基因时，可以使用“组成型”启动子，其通常在大部分环境条件和发育阶段或细胞分化阶段中是活性的。适用于植物的启动子也包括得自Ti或Ri质粒的、得自植物细胞、植物病毒或其它生物(其启动子被发现在植物中有功能)的启动子。在植物中有功能，从而适用于在本发明方法中的细菌启动子包括章鱼碱合成酶启动子、胭脂氨酸合成酶启动子和甘露碱合成酶启动子。调控本发明嵌合RNA(和/或选择标记)表达的启动子可以是组成型的。用于植物中的合适的组成型启动子包括例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区(Franck等人(1980)Cell 21：285-294；Odell等人(1985)Nature 313：810-812；Shewmaker等人(1985)Virology 140：281-288；Gardner等人(1986)PlantMol Biol 6：221-228)、19S转录起始区(US 5,352,605和WO 84/02913)和VI启动子区，来自根癌农杆菌T-DNA的1′-或2′-启动子，和本领域技术人员已知的在植物细胞中有活性的其它启动子。其它合适的启动子包括来自玄参(Figwort)花叶病毒的全长转录启动子，肌动蛋白启动子(例如稻肌动蛋白启动子；McElroy等人(1990)Plant Cell 2：163-171)，组蛋白启动子，微管蛋白启动子或甘露碱合成酶启动子(MAS)。其它组成型植物启动子包括多种泛素或聚泛素启动子(Sun和Callis(1997)Plant J 11(5)：1017-1027，Cristensen等人(1992)Plant Mol Biol 18：675-689；Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632；Bruce等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA86：9692-9696；Holtorf等人(1995)Plant Mol Biol 29：637-649)，mas、Mac或DoubleMac启动子(US 5,106,739；Comai等人(1990)Plant Mol Biol15：373-381)，泛素启动子(Holtorf等人(1995)Plant Mol Biol 29：637-649)、Rubisco小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)，豆球蛋白B启动子(GenBank登录号No.X03677)，来自农杆菌的胭脂氨酸合成酶(NOS)启动子，TR二元启动子，来自农杆菌的章鱼碱合酶(OCS)启动子，Smas启动子，肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)，液泡ATP酶亚基启动子，pEMU启动子(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81，581-588)；MAS启动子(Velten等人(1984)EMBO J.3(12)：2723-2730)，玉米H3组蛋白质启动子(Lepetit等人(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-285；Atanassova等人(1992)Plant J 2(3)：291-300)，α-伴大豆球蛋白启动子，菜豆蛋白启动子，ADH启动子和热休克启动子，来自拟南芥的腈水解酶启动子(WO 03/008596；GenBank登录号No.：U38846，核苷酸3,862到5,325或者5342)，来自小麦的富含脯氨酸蛋白质启动子(WO 91/13991)，豌豆(Pisum sativum)ptxA基因的启动子，和来自本领域技术人员已知的多种植物基因的其它转录起始区。
然而应当注意，因为本发明嵌合RNA的高效力，本发明的方法不依赖于驱动嵌合RNA转录产生的强启动子区的存在。换言之，启动子(特别是可在植物中表达的启动子)的全部范围可以用来指导转录。
1.5.1.1.2组织特异性启动子
可以使用优选的启动子，其仅在一个或一些组织或器官中调节表达，所述组织或器官如叶、根、果实、种子、花药、胚珠、花粉、分生组织、茎或花，或其部分。例如，来自番茄的组织特异性ES启动子特别适用于指导基因的表达，使得预期的基因产物位于果实中(参阅例如Lincoln等人(1988)Proc Natl Acad Sci USA 84：2793-2797；Deikman等人(1988)EMBOJ 7：3315-3320；Deikman等人(1992)Plant Physiol 100：2013-2017)。合适的种子特异启动子包括来自以下基因的启动子：来自玉米的MAC1(Sheridan等人(1996)Genetics 142：1009-1020)、来自玉米的Cat3(GenBank No.L05934)、来自玉米的编码油质蛋白18kD的基因(GenBank No.J05212)、来自拟南芥的胎萌-1(viviparous-1)(Genbank登录号No.U93215)、编码拟南芥油质蛋白的基因(Genbank登录号No.Z17657)、来自拟南芥的Atmycl(Urao等人(1996)Plant Mol Biol 32：571-576)、来自拟南芥的2S种子储存蛋白质基因家族(Conceicao等人(1994)Plant 5：493-505)、编码欧洲油菜(Brassica napus)的油质蛋白20kD的基因(GenBank No.M63985)、来自欧洲油菜的油菜籽蛋白(GenBank No.J02798，Joseffson等人(1987)JBiol Chem 262：12196-12201)、油菜籽蛋白基因家族(例如来自欧洲油菜；Sjodahl等人(1995)Planta 197：264-271，US 5,608,152；Stalberg等人(1996)Planta 199：515-519)、编码欧洲油菜的2S贮存蛋白的基因(Dasgupta等人(1993)Gene 133：301-302)、编码大豆油质蛋白A(Genbank登录号No.U09118)和油质蛋白B(Genbank No.U09119)的基因、编码大豆低分子量富含硫的蛋白质的基因(Choi等人(1995)Mol Gen Genet 246：266-268)、菜豆蛋白基因(US 5,504,200，Bustos等人(1989)Plant Cell 1(9)：839-53；Murai等人(1983)Science 23：476-482；Sengupta-Gopalan等人(1985)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 82：3320-3324(1985))、2S清蛋白基因、豆球蛋白基因(Shirsat等人(1989)Mol Gen Genet 215(2)：326-331)、USP(未知种子蛋白质)基因、蔗糖结合蛋白质基因(WO 00/26388)、豆球蛋白B4基因(LeB4；Fiedler等人(1995)Biotechnology(NY)13(10)：1090-1093，
Figure A20068003461900751
等人(1992)Plant J 2(2)：233-239；
Figure A20068003461900752
等人(1991a)Mol Gen Genet225(3)：459-467；
Figure A20068003461900753
等人(1991b)Mol Gen Genet 225：121-128)、拟南芥油质蛋白基因(WO 98/45461)、芸苔属(Brassica)Bce4基因(WO91/13980)，编码“高分子量麦谷蛋白”(HMWG)、麦醇溶蛋白、分支酶、ADP-葡萄糖焦磷酸酶(AGP酶)或淀粉合酶的基因。此外优选的启动子为能够在单子叶植物(例如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等等)中种子特异表达的启动子。可有利地使用的启动子是lpt2或lpt1基因(WO 95/15389，WO95/23230)的启动子，或WO 99/16890中所述的启动子(大麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、谷醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、kasirin基因或裸麦醇溶蛋白基因)。更优选的是叶特异性和光诱导型的启动子，如来自cab或Rubisco的启动子(Timko等人(1985)Nature 318：579-582；Simpson等人(1985)EMBO J 4：2723-2729)；花药特异性启动子如来自LAT52的启动子(Twell等人(1989)Mol Gen Genet217：240-245)；花粉特异性启动子如来自Zml3的启动子(Guerrero等人(1993)Mol Gen Genet 224：161-168)；和小孢子优选的启动子，如来自apg的启动子(Twell等人(1983)Sex.Plant Reprod.6：217-224)。更合适的启动子为例如对块茎、贮藏根或根特异的启动子，例如I类patatin启动子(B33)、马铃薯组织蛋白酶D抑制剂启动子、淀粉合酶(GBSS1)启动子或sporamin启动子，和果实特异的启动子如番茄果实特异启动子(EP-A 409625)。更加合适的启动子为确保叶特异性表达的启动子。可以提到的启动子为马铃薯胞质FBP酶(FBPase)启动子(WO 98/18940)、Rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸盐羧化酶)SSU(小亚基)启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等人(1989)EMBO J 8(9)：2445-2451)。其它优选的启动子为在种子和植物胚中支配表达的启动子。更合适的启动子为例如果实成熟特异的启动子例如番茄果实成熟特异性启动子(WO 94/21794)，花特异性启动子例如八氢番茄红素合酶启动子(WO 92/16635)或P1-rr基因的启动子(WO 98/22593)，或如EP-A249676中所述的另一结节特异性启动子可有利地被使用。启动子也可以是髓特异性启动子，例如从植物TrpA基因中分离的启动子，如WO 93/07278中所述。
其它优选的启动子描述于下表中。
表1b：驱动ta-siRNA表达的可能的启动子候选者
  启动子   5’-UTR   IME＊-内含子   终止子   组织特异性   参考文献
  稻(Oryzasativa)咖啡酰-CoA-O-甲基转移酶   自身的(own)   玉米(Zeamays)泛素   自身的   所有(组成型的)   WO2006/084868
  稻咖啡酰-CoA-O-甲基转移酶   自身的   玉米泛素   NOS   根(种仁(kernel)、花粉)   WO2006/084868
  稻咖啡酰-CoA-O-甲基转移酶   自身的   稻BPSI.1   NOS   胚   PCT/EP2006/060513
  稻C-8，7-甾醇-异构酶   自身的   玉米泛素   NOS   根、种仁   WO2006/084868
  稻C-8，7-甾醇-异构酶   自身的   稻BPSI.1   NOS   根、种仁   PCT/EP2006/060513
  玉米富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP)   自身的   玉米泛素   自身的   根、穗丝(种仁：胚)   WO2006/084868
  玉米富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP)   自身的   稻BPSI.1   自身的   根、穗丝、糊粉层   PCT/EP2006/060513
  玉米乳酸脱氢酶   自身的   玉米泛素   NOS或自身的   根、种仁   WO2006/084868
  玉米乳酸脱氢酶   自身的   稻BPSI.1   NOS   胚外层   PCT/EP2006/060513
  玉米乳酸脱氢酶   自身的   稻BPSI.5   NOS   胚乳和糊粉层，主要位于种仁的上侧   PCT/EP2006/060513
  叶绿体蛋白质   自身的   玉米泛   NOS   叶、胚乳   WO2006/084868
 12样蛋白质   素
 叶绿体蛋白质12样蛋白质   自身的   稻BPSI.1   NOS   叶   PCT/EP2006/060513
 玉米球蛋白1   自身的   N/A   NOS   胚(主要在盾片中)、糊粉层   Genetics，150：863-872(1998)
 玉米球蛋白1   自身的   稻BPSI.1   NOS   胚、糊粉层   PCT/EP2006/060513
 稻V-ATP酶   自身的   稻BPSI.1   NOS   根优选的   PCT/EP2006/060513
 玉米泛素   自身的   玉米泛素   NOS   遍在的，组成型的   Plant Physiology100：1503-1507(1992)
 稻肌动蛋白1   自身的   稻肌动蛋白1   NOS   遍在的，组成型的   The Plant Cell，2：163-171
 稻LEA   自身的   稻BPSI.1   NOS   胚   PCT/EP2006/060513
 根癌农杆菌Super   自身的   N/A   NOS   发芽时的胚   PF56540
 欧芹(Petroselinumcrispum)泛素   自身的   N/A   NOS   遍在的，组成型的   WO03/102198
 UK398   自身的   N/A   NOS   叶肉或表皮优选的   EP01666599，US20060156429；
＊IME代表内含子介导的增强作用
对单子叶植物中表达的优选模式和水平而言，启动子构建体优选与5’UTR中赋予内含子介导的增强(IME)的内含子功能性连接，和/或与合适的3’UTR功能性连接，优选如上表所指出的。
1.5.1.1.3化学诱导型启动子
表达构建体也可含有化学诱导型启动子(综述文章：Gatz等人(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48：89-108)，借助于该种启动子，编码本发明嵌合RNA的核酸序列在植物中的表达能够被调控在特定的时间点。也可类似地使用这类启动子，例如水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 0388186)、四环素诱导型启动子(Gatz等人(1991)Mol Gen Genetics 227：229-237)、脱落酸诱导型启动子(EP 0335528)或乙醇-环己酮诱导型启动子(WO 93/21334)。谷胱甘肽-S转移酶同种型II基因(GST-II-27)的启动子也是合适的，其能够通过外源应用的安全剂(例如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺(W093/01294))被活化，且其在单子叶植物和双子叶植物的大量组织中可操作。可用于本发明的其它示范性诱导型启动子包括来自ACE1体系的启动子，其应答铜(Mett等人PNAS 90：4567-4571(1993))；或来自玉米的In2启动子，其应答苯磺酰胺除草剂安全剂(Hershey等人(1991)Mol Gen Genetics 227：229-237；Gatz等人(1994)Mol GenGenetics 243：32-38)。可以使用对植物通常不应答的诱导剂做出应答的启动子。示范性的诱导型启动子为来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性被糖皮质类固醇激素诱导(Schena等人(1991)Proc Nat′l Acad SciUSA 88：10421)。其它优选的启动子为生物或非生物胁迫诱导的启动子，例如PRP1基因的病原体诱导型启动子(Ward等人(1993)Plant Mol Biol22：361-366)，番茄热诱导hsp80启动子(US 5,187,267)，马铃薯寒冷诱导型α淀粉酶启动子(WO 96/12814)或伤诱导的pinII启动子(EP-A10375091)。
1.5.1.1.4胁迫或病原体诱导型启动子
可以使用指导表达的环境调控的启动子。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括生物或非生物胁迫因素或其它环境条件，例如病原体攻击、缺氧条件、乙烯或光的存在。
可由生物或非生物胁迫诱导的启动子包括，但不限于PRP1基因的病原体诱导型启动子(Ward等人(1993)Plant Mol Biol 22：361-366)、来自番茄的热诱导型hsp70或hsp80启动子(US 5,187,267)、来自马铃薯的寒冷诱导型α淀粉酶启动子(WO 96/12814)、光诱导型PPDK启动子或伤诱导型pinII启动子(EP375091)。病原体诱导型启动子包括下述基因的启动子，所述基因作为病原体攻击的结果被诱导，例如PR蛋白质、SAR蛋白质、b-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等等的基因(例如Redolfi等人(1983)Neth J PlantPathol 89：245-254；Uknes，等人(1992)The Plant Cell 4：645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral 4：111-116；Marineau等人(1987)Plant Mol Biol9：335-342；Matton等人(1987)Molecular Plant-Microbe Interactions2：325-342；Somssich等人(1986)Proc Natl Acad Sci USA 83：2427-2430；Somssich等人(1988)Mol Gen Genetics 2：93-98；Chen等人(1996)Plant J10：955-966；Zhang和Sing(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91：2507-2511；Warner，等人(1993)Plant J 3：191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell1：961-968(1989))。还包括在内的是伤诱导型启动子，例如pinII基因(Ryan(1990)Ann Rev Phytopath 28：425-449；Duan等人(1996)Nat Biotech14：494-498)、wun1和wun2基因(US 5,428,148)、win1和win2基因(Stanford等人(1989)Mol Gen Genet 215：200-208)、系统素(McGurl等人(1992)Science 225：1570-1573)、WIP1基因(Rohmeier等人(1993)Plant Mol Biol22：783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Letters 323：73-76)、MPI基因(Corderok等人(1994)The Plant J 6(2)：141-150)等等的启动子。
1.5.1.1.5发育依赖型启动子
其它优选的启动子为例如果实成熟特异性启动子，例如来自番茄的果实成熟特异性启动子(WO 94/21794，EP 409625)。发育依赖型启动子部分地包括上述组织特异性启动子，因为个体组织天然地由于发育的作用而形成。发育调节的启动子特别描述于(Baerson和Lamppa(1993)Plant MolBiol 22(2)：255-67)。
1.5.1.1.6其它合适的启动子和启动子元件
启动子也可包括其它启动子、启动子元件或能够修饰表达-支配特征的最小启动子。因此例如，组织特异性启动子可除某些胁迫因素的作用外发生，由于遗传调控序列。这类元件例如为针对水胁迫、脱落酸(Lam和Chua(1991)J Biol Chem 266(26)：17131-17135)和热胁迫(Schoffl等人(1989)Molecular&General Genetics 217(2-3)：246-53)所描述的。
1.5.1.2其它遗传调控元件
遗传调控序列还被理解为允许从基因组中去除插入序列的那些。基于cre/lox(Dale和Ow(1991)Proc Nat′l Acad Sci USA 88：10558-10562；Sauer(1998)Methods 14(4)：381-92；Odell等人(1990)Mol Gen Genet223：369-378)、FLP/FRT(Lysnik等人(1993)NAR 21：969-975)或Ac/Ds体系(Lawson等人(1994)Mol Gen Genet 245：608-615；；Wader等人(1987)在TOMATO TECHNOLOGY 189-198(Alan R.Liss，Inc.)中；US 5,225,341；Baker等人(1987)EMBO J 6：1547-1554)的方法允许从宿主生物的基因组中(适当时为组织特异性和/或诱导型地)去除特异的DNA序列。调控序列在该语境中可表示特异的侧翼序列(例如lox序列)，其随后允许(借助于cre重组酶)去除。
1.5.1.2.1转录终止子
可获得大量转录终止子用于表达构建体中。它们负责转基因的转录终止及其正确多聚腺苷酸化。适当的转录终止子为已知在植物中作用的那些，并包括CaMV 35S终止子、tml终止子、OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂氨酸合成酶)终止子和豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶植物或双子叶植物二者中。
1.5.1.2.2增强或调节表达的序列
遗传调控序列还包括基因的5’非翻译区、内含子或非编码3’区，例如肌动蛋白质-1内含子或Adh1-S内含子1、2和6(一般参考：The MaizeHandbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，New York(1994))。已经证明，它们可在基因表达的调节中发挥重要作用，并已显示其增强表达，特别是单子叶植物细胞中的表达。因此，已经证明，5’非翻译序列可增强异源基因的瞬时表达。这样的翻译增强子中可提及的实例为烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie等(1987)Nucl Acids Res 15：8693-8711)等。它们还能启动组织特异性(Rouster J等(1998)Plant J 15：435-440)。
1.5.2.构建植物转化载体
用于表达本发明嵌合RNA分子的表达构建体优选包含在表达载体中。多种用于植物转化的转化载体是植物转化领域技术人员所公知的。载体的选择将取决于优选的转化技术和转化的靶物种。
1.5.2.1载体元件
表达构建体和由其得来的载体还可包含功能元件。术语功能元件应以其广义理解，指对本发明的表达构建体、载体或转基因生物的产生、增殖或功能有影响的所有元件。例如(但非限制)，可能提到以下元件：
1.5.2.1.1.可选择标记基因
可选择标记基因可用于选择和分离成功转化的细胞。优选地，在本发明的方法中，可以使用一种标记选择原核宿主，而使用另一种标记选择真核宿主，特别是植物物种宿主。标记可赋予针对杀生物剂(例如抗生素、毒素、重金属等)的抗性，或者通过互补发挥功能，将原养型传递至营养缺陷型宿主。用于植物的优选可选择标记可包括但不仅限于以下标记：
1.5.2.1.1.1.阴性选择标记
阴性选择性标记赋予对杀生物化合物的抗性，所述杀生物化合物如代谢抑制物(例如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐，WO 98/45456)、抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如膦丝菌素或草甘膦)。特别优选的阴性选择标记是赋予除草剂抗性的那些。除它们作为标记物的功能外，这些标记可用于对产生的植物赋予除草剂抗性性状。可以提到的实例为：
-膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT；也称作Bialophos抗性；bar；de Block等人(1987)EMBO J 6：2513-2518；EP 0333033；US 4,975,374)
-5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(EPSPS；US 5,633,435)或草甘膦氧化还原酶基因(US 5,463,175)，其赋予对
Figure A20068003461900821
(N-磷酰甲基甘氨酸)的抗性(Shah等(1986)Science 233：478)
-草甘膦降解酶(草甘膦氧化还原酶；gox)，
-茅草枯(Dalapon)失活脱卤素酶(deh)
-磺酰脲和咪唑啉酮失活乙酰乳酸合酶(例如具有例如S4和/或Hra突变的被突变的ALS变体
-溴苯腈(Bromoxynil)降解腈水解酶(bxn)
-卡那霉素或G418抗性基因(NPTII；NPTI)，其编码例如新霉素磷酸转移酶(Fraley等(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：4803)，其表达赋予抗生素卡那霉素及相关抗生素新霉素、巴龙霉素、艮他霉素和G418抗性的酶，
-2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐磷酸酶(DOGR1-基因产物；WO 98/45456；EP 0807836)，其赋予针对2-脱氧葡萄糖的抗性(Randez-Gil等(1995)Yeast 11：1233-1240)。
-潮霉素磷酸转移酶(HPT)，其介导对潮霉素的抗性(Vanden Elzen等(1985)Plant Mol Biol.5：299)。
-二氢叶酸还原酶(Eichholtz等人(1987)Somatic Cell and MolecularGenetics 13，67-76)。
赋予抗生素抗性的细菌起源的其它阴性可选择标记基因包括赋予抗生素壮观霉素抗性的aadA基因，艮他霉素乙酰基转移酶，链霉素磷酸转移酶(SPT)，氨基糖苷-3-腺嘌呤基转移酶和博来霉素抗性决定簇(Svab等(1990)Plant Mol.Biol.14：197；Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.210：86；Hille等(1986)Plant Mol.Biol.7：171(1986)；Hayford等(1988)PlantPhysiol.86：1216)。
特别优选的是赋予针对毒效应抗性的阴性选择标记，所述毒效应由D-氨基酸如D-丙氨酸和D-丝氨酸引起(WO 03/060133；Erikson等人(2004)Nat Biotechnol.22(4)：455-8)。在该竞争中特别优选作为阴性选择标记的是来自酵母瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)(红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides))的daol基因(EC：1.4.3.3：GenBank登录号No.：U60066)和大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC：4.3.1.18；GenBank登录号No.：J01603])。根据所使用的D-氨基酸，D-氨基酸氧化酶标记可以用作提供阴性选择(例如与例如D-丙氨酸或D-丝氨酸组合时)或反选择(例如与D-亮氨酸或D-异亮氨酸组合时)的二元功能标记物。
1.5.2.1.1.2.阳性选择标记
阳性选择标记赋予转化植物与未转化植物相比的生长优势。基因例如来自根癌农杆菌(菌株PO22；Genbank登录号No.：AB025109)的异戊烯基转移酶可以——作为细胞分裂素生物发生的关键酶——促进转化植物的再生(例如在无细胞分裂素的培养基上进行选择)。相应的选择方法已有描述(Ebinuma等人(2000a)Proc Natl Acad Sci USA 94：2117-2121；Ebinuma等人(2000b)Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes(ipt，rol A，B，C)of Agrobacterium as selectable markers，MolecularBiology of Woody Plants.Kluwer Academic Publishers)。赋予转化植物与未转化植物相比的生长优势的其他阴性选择标记描述于例如EP-A 0601092。生长刺激选择标记可包括(但不仅限于)β-葡糖醛酸糖苷酶(与例如细胞分裂素葡糖苷酸组合)、甘露糖-6-磷酸异构酶(与甘露糖组合)、UDP-半乳糖-4-差向异构酶(与例如半乳糖组合)，其中特别优选甘露糖-6-磷酸异构酶与甘露糖的组合。
1.5.2.1.1.3.反选择标记
反选择标记特别适于选择包含所述标记的具有确定缺失序列的生物(Koprek等(1999)Plant J 19(6)：719-726)。反选择标记的实例包括胸苷激酶(TK)、胞嘧啶脱氨酶(Gleave等(1999)Plant Mol Biol.40(2)：223-35；Perera等(1993)Plant Mol.Biol 23(4)：793-799；Stougaard(1993)Plant J3：755-761)、细胞色素P450蛋白质(Koprek等(1999)Plant J 19(6)：719-726)、卤代烷(haloalkan)脱卤素酶(Naested(1999)Plant J 18：571-576)、iaaH基因产物(Sundaresan等(1995)Gene Develop 9：1797-1810)、胞嘧啶脱氨酶codA(Schlaman和Hooykaas(1997)Plant J 11：1377-1385)或tms2基因产物(Fedoroff和Smith(1993)Plant J 3：273-289)。
1.5.2.1.2.报道基因
报道基因编码易于定量的蛋白质，并通过其颜色或酶活性使得有可能评估转化效率、表达位点或表达时间。在本文中特别优选在植物组织中编码以下报道蛋白质的基因(Schenborn和Groskreutz(1999)Mol Biotechnol13(1)：29-44)：例如绿色荧光蛋白(GFP)(Haseloff等(1997)Proc Natl AcadSci USA 94(6)：2122-2127；Sheen等(1995)Plant J 8(5)：777-784；Reichel等(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(12)：5888-5893；Chui等(1996)Curr Biol 6：325-330；Leffel等(1997)Biotechniques.23(5)：912-8；Tian等(1997)Plant Cell Rep 16：267-271；WO 97/41228)、氯霉素转移酶、萤光素酶(Millar等(1992)Plant Mol Biol Rep 10：324-414；Ow等(1986)Science234：856-859)、水母发光蛋白(Prasher等(1985)Biochem Biophys ResCommun 126(3)：1259-1268)、β-半乳糖苷酶、R基因座基因(编码在植物组织中调节花色素苷色素(红色)产生的蛋白质，这因此使得有可能直接分析启动子活性而无需加入其他辅助物质或显色底物(Dellaporta等(1988)在：Chromosome Structure and Function：Impact of New Concepts，第18Stadler Genetics Symposium，11：263-282；Ludwig等(1990)Science247：449)，其中特别优选β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson(1987b)PlantMol.Bio.Rep.，5：387-405；Jefferson等(1987)EMBO J 6：3901-3907)。β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)表达通过组织与5-溴-氯-吲哚-β-D-葡糖醛酸孵育后的蓝色来检测；细菌萤光素酶(LUX)表达通过光发射来检测；萤火虫萤光素酶(LUC)表达通过与萤光素孵育后的光发射来检测；半乳糖苷酶表达通过组织用5-溴-氯-吲哚-β-D-吡喃型半乳糖苷染色后的亮蓝色来检测。报道基因还可以代替抗生素抗性标记作为评分标记。这些标记用于检测所转移基因的表达水平的存在，或对其进行测量。仅当细胞修饰的效率很高时，在植物中使用评分标记鉴定或标记经遗传修饰的细胞才能工作良好。
1.5.2.1.3.复制起点
复制起点确保本发明的表达构建体或载体扩增(例如在大肠杆菌中扩增)。可能提及的实例为ORI(DNA复制起点)、pBR322ori或P15Aori(Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY))。在大肠杆菌中发挥功能的复制系统的其他实例为ColE1、pSC101、pACYC184等。作为大肠杆菌复制系统的补充或替代，可以使用广泛宿主范围的复制系统，例如P-1不相容性质粒如pRK290的复制系统。这些质粒特别有效地与有甲或卸甲Ti质粒一起用于将T-DNA转移至植物宿主。
1.5.2.1.4.农杆菌介导的转化所必需的元件，例如T-DNA的右和/或(任选的)左边界或vir区。
1.5.2.1.5.多克隆位点(MCS)，其允许并有利于插入一个或多个核酸序列。
1.5.2.2用于植物转化的载体
1.5.2.2.1适用于农杆菌转化的载体
如果使用农杆菌，则将表达构建体整合进特定的质粒载体中，可整合进穿梭载体、中间载体中或二元载体中。如果将Ti或Ri质粒用于转化，则待引入植物基因组的表达构建体区域的侧翼为至少右边界，但在多数情况下为右边界和左边界。农杆菌转化优选使用二元载体。二元载体在大肠杆菌和农杆菌中均能够复制。它们优选包含选择标记基因和接头或多聚接头，其侧翼为右(和任选的左)T-DNA边界序列。它们可直接转化进农杆菌中(Holsters等(1978)Mol Gen Genet 163：181-187)。载体中可包括允许选择转化农杆菌的选择标记基因(如nptIII基因)。在这种情况下作为宿主生物的农杆菌应该已经包含了带有vir区的卸甲(即非致癌性)质粒。该区域是将T-DNA转移进植物细胞所必需的。T-DNA用于转化植物细胞的用途已经得到广泛的研究和描述(EP 120516；Hoekema，在：The Binary PlantVector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，第五章；An等(1985)EMBO J 4：277-287)。多种二元载体是已知的，并可用于使用农杆菌的转化，例如pBI101.2或pBIN19(克隆技术实验有限公司(ClontechLaboratories，Inc.)USA；Bevan等(1984)Nucl Acids Res 12：8711)、pBinAR、pPZP200或pPTV。
1.5.2.2.2适用于非农杆菌转化的载体
不使用根癌农杆菌进行的转化防止了对所选转化载体中T-DNA的需要，从而除了如上述含有T-DNA序列的载体以外，还可以使用缺乏这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄入(如PEG和电穿孔)和显微注射进行的转化。载体的选择主要取决于被转化物种的优选选择。适用于非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35。(参阅如US 5,639,949)。
1.5.3.转化技术
1.5.3.1一般技术
一旦建立了本发明的表达构建体或表达载体，就可以将其转化进植物细胞中。将核酸序列(如载体)引入植物基因组以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法是已知的(Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，71-119页(1993)；White FF(1993)Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和Wu R编辑，Academic Press，15-38；Jenes B等(1993)Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编辑，Academic Press，128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol42：205-225；Halford NG，Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1)：62-73)。
转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接转化法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、使用基因枪的生物射弹法(“particle bombardment”；Fromm ME等(1990)Bio/Technology.8(9)：833-9；Gordon-Kamm等(1990)Plant Cell 2：603)、电穿孔、在包含DNA的溶液中孵育干胚以及显微注射。在这些直接转化法的情况下，所使用的质粒不需要满足任何特定要求。可以使用简单质粒，如pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等。如果需要从转化细胞再生完整植物，优选在质粒上存在额外的选择标记基因。直接转化技术对双子叶植物和单子叶植物同样适合。
转化也可以通过农杆菌进行的细菌感染(例如EP 0116718)、通过病毒载体进行的病毒感染(EP 0067553；US 4,407,956；WO 95/34668；WO93/03161)或通过花粉(EP 0270356；WO 85/01856；US 4,684,611)来进行。基于农杆菌的转化技术(特别是对于双子叶植物)为本领域所公知。农杆菌菌株(如根癌农杆菌或发根农杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，其在农杆菌转化之后转移至植物中。T-DNA(转移DNA)整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可以位于Ri或Ti质粒上，或者可以分别包含在所谓的二元载体中。用于农杆菌介导的转化的方法描述于例如Horsch RB等(1985)Science 225：1229f。农杆菌介导的转化最适用于双子叶植物，但也可适用于单子叶植物。通过农杆菌进行的植物转化已有所描述(White FF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；in Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，15-38页；Jenes B等(1993)Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev PlantPhysiol Plant Molec Biol 42：205-225)。
转化可引起瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可插入落入这些广泛类别(如上文定义章节中所述)的任何植物和植物细胞，但其在作物植物细胞中特别有用。
多种组织均适于作为用于农杆菌所介导转化方法的起始材料(外植体)，包括但不仅限于愈伤组织(US 5,591,616；EP-A1604662)、不成熟胚(EP-A1672752)、花粉(US 54,929,300)、苗端(US 5,164,310)或者植物中(inplanta)转化(US 5,994,624)。本文所述的方法和材料可与本领域已知的基本所有农杆菌介导的转化法组合。优选的组合包括(但不仅限于)以下的起始材料和方法
表2：植物转化方法
  品种   材料/引文
  单子叶植物：   不成熟胚(EP-A1672752)愈伤组织(EP-A1604662)胚胎发生愈伤组织(US 6,074,877)花序(US 6,037,522)花(在植物内(in planta))(WO 01/12828)
  香蕉   US 5,792,935；EP-A1731632；US 6,133,035
  大麦   WO 99/04618
  品种   材料/引文
  玉米   US 5,177,010；US 5,987,840
  菠萝   US 5,952,543；WO 01/33943
  稻   EP-A1897013；US 6,215,051；WO 01/12828
  小麦   AU-B 738153；EP-A1856060
  豆类   US 5,169,770；EP-A1397687
  芸苔属(Brassica)   US 5,188,958；EP-A1270615；EP-A11,009,845
  可可   US 6,150,587
  柑橘属(Citrus)   US 6,103,955
  咖啡   AU 729635
  棉花   US 5,004,863；EP-A1270355；US 5,846,797；EP-A11,183,377；EP-A11,050,334；EP-A11,197,579；EP-A11,159,436花粉转化(US 5,929,300)植物内转化(US 5,994,624)
  豌豆   US 5,286,635
  胡椒   US 5,262,316
  白杨   US 4,795,855
  大豆   萌发的大豆幼苗苗端的子叶节(US 5,164,310)萌发约7天的大豆幼苗的初级或更高的叶节的叶腋分生组织器官发生的愈伤组织培养物脱水的胚轴US 5,376,543；EP-A1397687；US 5,416,011；US 5,968,830；US 5,563,055；US 5,959,179；EP-A1652965；EP-A11,141,346
  甜菜   EP-A1517833；WO 01/42480
  番茄   US 5,565,347
1.5.3.2.质体转化
在另一优选实施方案，将本发明的核苷酸序列(优选本发明嵌合RNA分子的表达载体)直接转化进质体基因组。在质体表达中基因通过同源重组插入每个植物细胞中数千拷贝的环状质体基因组中，其优点为超越核表达基因的巨大的拷贝数允许实现高表达水平。在优选的实施方案中，该核苷酸序列插入质体靶向载体中，并转化进期望的植物宿主的质体基因组中。获得对于含有该核苷酸序列的质体基因组为同质的植物，其优选能够高表达该核苷酸序列。
质体转化技术广泛描述于例如U.S.专利No.5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,877,462，PCT申请No.WO 95/16783和WO 97/32977以及McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305，其均通过全文引用作为参考。用于质体转化的基本技术包括将克隆质体DNA区域(其侧翼为选择标记)与该核苷酸序列一起引入适当的靶组织，例如使用生物射弹或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)。1至1.5kb的侧翼区被称为靶向序列，其促进与质体基因组发生同源重组，从而允许替换或修饰原质体系中的特定区域。最初，使用赋予对壮观霉素和/或链霉素的抗性的叶绿体16S rRNA和rps12基因的点突变作为转化的可选择标记(Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8526-8530；Staub等(1992)PlantCell 4，39-45)。这些标记之间克隆位点的存在允许产生用于引入外源基因的质体靶向载体(Staub等(1993)EMBO J.12，601-606)。通过用编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺嘌呤基转移酶的细菌aadA基因这一显性选择标记替换隐性rRNA或r-蛋白质抗生素抗性基因可显著提高转化率(Svab等(1993)Proc.Natl.Acad.Sc.USA 90，913-917)。用于质体转化的其他可选择标记为本领域所公知，并包括在本发明的范围内。
为了使用本发明的方法，技术人员拥有可用的已知工具(如带有适于植物的启动子的表达载体)和转化及再生植物的方法。
1.5.4.选择和再生技术
为了选择已经成功进行转化的细胞，优选引入可选择标记，其赋予成功进行转化的细胞以对杀生物剂(如除草剂)、代谢抑制物如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(WO 98/45456)或者抗生素的抗性。该选择标记允许将转化细胞从未转化细胞中选择出来(McCormick等(1986)Plant Cell Reports5：81-84)。合适的选择标记描述于上文。
可以以已知的方式由转化细胞再生转基因植物。得到的小植株可以以惯常的方式种植和培养。优选地，应该培养两代或更多代，以确保基因组整合是稳定和可遗传的。合适的方法已有描述(Fennell等(1992)Plant CellRep.11：567-570；Stoeger等(1995)Plant Cell Rep.14：273-278；Jahne等(1994)Theor Appl Genet 89：525-533)。
本发明的其他实施方案涉及本发明植物的转化种子和植株，以及所述植物、种子和植物部分在农业和/或生产食品、饲料、工业产品、油、营养品和其他有价值产品中的用途。优选地，本发明的这些其他实施方案涉及
a)这类植物的经转化的种子，
b)使用所述植物培育其它植物的方法，
c)所述植物在育种或农业中的用途，
d)所述植物生产化学品、食物或饲料产品的用途。
2.本发明嵌合RNA的应用
本发明具有广泛的可能应用，优选在植物领域中。获得多基因沉默(任选地以组织特异性或发育调节方式)是特别有用的。
本发明的嵌合RNA分子、用于其表达的表达构建体和表达载体以及包含所述分子的转基因生物可用于基因沉默(即在靶细胞或生物中弱化、降低或抑制靶基因表达)
任何在细胞(优选植物细胞)中表达的基因均可被靶向。在细胞中表达的基因是被转录以获得RNA(如mRNA)并任选地获得蛋白质的基因。靶基因可以是内源性基因或外源性或外源基因(即转基因或病原体基因)。例如，由于病毒递送构建体的基因组整合而存在于细胞基因组中的转基因可以使用本发明的嵌合RNA进行调节。所述外源基因可被整合到宿主基因组(优选染色体DNA)中，或者可以存在于染色体外遗传构建体如质粒或粘粒中。例如，靶基因可以存在于引入了嵌合RNA的细胞基因组中，或者在能感染这些生物或细胞的病原体的基因组中，例如病毒、细菌、真菌或原生动物。
优选地，靶基因为真核基因，更优选为哺乳动物、线虫、真菌或植物基因。优选地，靶基因为细胞的内源基因或相对于细胞基因组为异源基因，如病原体基因。优选地，病原体的基因来自能感染真核生物的病原体。最优选地，所述病原体选自病毒、细菌、真菌和线虫。通过在植物中表达本发明的嵌合RNA，不仅植物基因可以发挥基因沉默靶基因的功能，而且感染植物或食用(作为食物或饲料)植物的生物的基因也可以。因此，靶基因也可以是动物或植物病原体的基因。靶基因优选选自植物或感染植物病原体基因。
优选地，靶基因的表达(通过表达的RNA或蛋白质来衡量)被降低、抑制或弱化至少10％、优选至少30％或40％、优选至少50％或60％、更优选至少80％、最优选至少90％或95％。靶产物(如转录物或蛋白质)的水平可以在整个生物(如植物或哺乳动物)中降低，或者这种靶产物的降低可以局限于该生物的一种或多种特定器官或组织。例如，产物的水平可以在一种或多种植物组织或器官中降低，包括但不仅限于根、块茎、茎、叶、柄、果实、浆果、坚果、树皮、荚果、种子和花。优选的器官为植物种子。
2.1在植物生物技术中的应用
本发明组合物和方法的后续应用可以以举例而非限制性的方式提及。
本发明的方法优选用于生成具有有利特性的植物的植物生物技术目的。这样，可以改良植物或其种子作为食品或饲料的适用性，例如通过改变代谢物特别是蛋白质、油、维生素和/或淀粉的组成和/或含量。还可以提高生长速率、产量或对生物或非生物胁迫因素的抗性。在植物生物技术领域的后续应用是特别有利的。
本发明的另一方面涉及包含本发明嵌合RNA的转基因植物或植物细胞或者用于表达所述嵌合RNA的表达构建体或表达载体。另一实施方案涉及本发明转基因生物(如转基因植物)和来自它们的细胞、细胞培养物、部分(例如在转基因植物的情况下为根、叶等)以及转基因繁殖材料如种子或果实用于生产食品或饲料、药物或精细化学品的用途，例如酶、维生素、氨基酸、糖、脂肪酸、天然或合成调味料、香料和着色剂。特别优选生产三酰甘油、脂类、油类、脂肪酸、淀粉、生育酚和生育三烯酚(tocotrienol)和类胡萝卜素。可被人和动物消费的本发明经遗传修饰的植物也可用作食物或饲料，例如直接使用或在进行已知的加工之后使用。
可以使用本发明的方法调节多种靶基因，包括植物中的基因，还包括感染或食用植物的病原体、动物或甚至人的基因。优选地，靶基因选自植物内基因、转基因或来自感染植物的病原体的基因。更优选地，感染植物的病原体选自病毒、真菌、细菌、昆虫和线虫。在病原体的情况下，靶基因可以是例如持家基因或其他基因，其对病原体的生存力或增殖是必需的。靶基因的弱化或沉默可具有多种效果(还取决于靶基因的性质)。优选地，沉默或弱化所述靶基因导致农学性状。所述农学性状可优选地选自疾病抗性、除草剂抗性、针对生物或非生物胁迫的抗性以及改善的营养价值。在该语境中，靶基因可优选选自如以下物质的合成和/或降解中涉及的基因：蛋白质、肽、脂肪酸、脂类、蜡、油、淀粉、糖、糖类、香料、调味剂、毒素、类胡萝卜素、激素、多聚体、黄酮类化合物、贮存蛋白、酚酸、生物碱、木质素、鞣质、纤维素、糖蛋白和糖脂。所有这些序列都是本领域技术人员所熟知的，并可从DNA数据库(如GenBank)容易地获得。
3.1.2具有增强的特异性的、用于基因沉默的植物靶基因
DNA可以出于表达RNA转录物的目的被引入植物，所述转录物作用为影响植物的表型，但是却不翻译成蛋白质。两个实例为反义RNA和具有核酶活性的RNA。它们均可在降低或消除天然或所引入植物基因的表达中发挥可能的功能。
可以构建或分离基因，其在转录时产生与靶向的信使RNA的全部或部分互补的反义RNA或双链RNA。反义RNA降低该信使RNA的多肽产物的产生。该多肽产物可以是植物基因组编码的任何蛋白质。上述基因将称为反义基因。因此，反义基因可以通过转化方法被引入植物中，以产生所选择目的基因的表达降低的新转基因植物。例如，该蛋白质可以是催化植物中反应的酶。该酶活性的降低可降低或消除该反应的产物，其包括植物中任何酶促合成的化合物，如脂肪酸、氨基酸、糖类、核酸等。或者，该蛋白质可以是贮存蛋白例如玉米醇溶蛋白，或者结构蛋白质，其表达的降低分别可引起种子中氨基酸组成的变化或植物形态的变化。上述可能性仅用于举例，而不代表本申请的完整范围。
通过本发明的表达盒之一的反义RNA或双链RNA表达是特别优选的。有义RNA的表达也可用于基因沉默(共抑制)。此RNA优选为非翻译RNA。通过双链RNA的基因调节(“双链RNA干扰”；dsRNAi)为本领域所熟知，并已描述用于多种生物，包括植物(如Matzke 2000；Fire A等1998；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)。
可以构建或分离在转录时产生RNA酶或核酶的基因，所RNA酶或核酶可发挥核糖核酸酶内切酶的作用，催化具有选定序列的RNA分子的切割。所选定信使RNA的切割可导致其编码的多肽产物的产生降低。这些基因可用于制备具有它们的新转基因植物。该转基因植物可具有降低的多肽水平，包括但不仅限于上述可通过反义RNA影响的多肽。
还可以将基因引入，以产生通过共抑制机制降低天然基因产物表达的新转基因植物。已经证实，在烟草、番茄和矮牵牛(Goring 1991；Smith1990；Napoli 1990；van derkrol 1990)中，天然基因有义转录物的表达会以与反义基因所观察到的情况相似的方式降低或消除天然基因的表达。引入的基因可编码全部或部分的所靶向的天然蛋白质，但其翻译并不是降低天然蛋白质水平所必需的。
所提及的可能的靶基因应理解为举例，而非限制：
3.1.2.1针对非生物胁迫因子(热、冷、干旱、湿度提高、环境毒素、UV照射)的改良的保护。
优选降低胁迫反应中所涉及的基因的表达。
对于本应用，优选使用允许特异性沉默敏感组织(幼苗、胚)的miRNA标签或者被胁迫因素内源性抑制的miRNA的所对应的miRNA标签来设计miRNA标签。
3.1.2.2修饰脂肪酸、脂质或油的组成和/或含量
可以实现对脂肪酸含量或脂肪酸组成的修饰(优选在油料作物如欧洲油菜或向日葵中)，例如通过降低脂肪酸生物合成基因的基因表达，优选选自编码以下的基因的那些：乙酰转移酶、酰基转运蛋白(“酰基载体蛋白”)、去饱和酶如硬脂酰去饱和酶或微粒体D12-去饱和酶特别是Fad2-1基因、丙二酰转酰基酶、β-酮脂酰-ACP合成酶、3-酮-ACP还原酶、烯酰基-ACP水化酶、硫酯酶如酰基-ACP硫酯酶、烯酰基-ACP还原酶。修饰脂类组成的其他多种有利方法已有描述(Shure M等(1983)Cell 35：225-233；Preiss等(1987)Tailoring Genes for Crop Improvement(Bruening等编辑)，Plenum Press，S.133-152；Gupta等(1988)Plant Mol Biol.10：215-224；Olive等(1989)Plant Mol Biol 12：525-538；Bhattacharyya等(1990)Cell60：155-122；Dunwell JM(2000)J Exp Botany 51Spec No：487-96；Brar DS等(1996)Biotech Genet Eng Rev 13：167-79；Kishore GM和SomervilleCR(1993)Curr Opin Biotech 4(2)：152-8))。优选特别为Fad2基因(例如Genbank登录号AF124360(阿比西尼亚油菜(Brassica carinata))，AF042841(芜青(Brassica rapa))，L26296(拟南芥)，A65102(欧洲榛(Corylus avellana))所述)。修饰脂类含量的其他有利基因和方法描述于例如US 5,530,192和WO 94/18337。还可以通过降低淀粉含量来提高脂类含量，例如由于降低糖类代谢的酶(如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶)的表达来实现。
对于本应用，优选使用允许在种子中进行特异性沉默的miRNA标签来设计miRNA标签。例如，玉米miR167主要在种子中表达，在ta-siRNA初级转录物中使用miR167结合位点(与miR167互补)可增强种子特异性沉默。
3.1.2.3修饰糖类组成
对糖类组成的修饰可以通过如降低糖类代谢基因或糖类生物合成基因(如直链淀粉、果胶、纤维素或细胞壁糖类的生物合成的基因)的基因表达来实现。因此可以以有利方式影响多种细胞过程(成熟、可储存性、淀粉组成或淀粉含量等)。可以提到的靶基因为例如但不仅限于磷酸化酶、淀粉合成酶、Q酶、蔗糖-6-磷酸合成酶、蔗糖-6-磷酸磷酸酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、分支酶、脱支酶和多种淀粉酶。相应的基因已有描述(Dunwell JM(2000)J Exp Botany 51Spec No：487-96；Brar DS等(1996)Biotech GenetEng Rev 13：167-79；Kishore GM和Somerville CR(1993)Curr OpinBiotech 4(2)：152-8)。影响糖类代谢(特别是淀粉生物合成)的有利基因描述于WO 92/11375、WO 92/11376、US 5,365,016和WO 95/07355。
对于本应用，优选使用允许在种子中增强特异性表达的miRNA标签来设计miRNA标签。例如，玉米miR167主要在种子中表达，在ta-siRNA初级转录物中使用miR167结合位点(与miR167互补)可增强种子特异性沉默。
3.1.2.4修饰颜色或色素形成
对颜色或色素(优选对观赏植物的)的修饰可通过如降低黄酮类化合物生物合成基因的基因表达来实现，所述基因例如以下的基因：查耳酮合酶、查耳酮异构酶、苯丙氨酸脱氨酶、脱氢山奈黄素(黄酮)羟化酶如双氢黄酮3-羟化酶或双氢黄酮2-羟化酶、二氢黄烷醇还原酶、二氢黄烷醇2-羟化酶、类黄酮3’-羟化酶、类黄酮5’-羟化酶、类黄酮糖基转移酶(例如葡糖基转移酶如UDPG：类黄酮3-O-葡糖基转移酶、UDPG：黄烷醇7-O-葡萄糖基转移酶或鼠李糖基转移酶)、类黄酮甲基转移酶(如SAM：花色素-3-(对香豆酰基)芸香苷-5-葡糖苷-3’，5’-O-甲基转移酶)和类黄酮酰基转移酶(Hahlbrock(1981)Biochemistry of Plants，7卷，Conn(编辑)；Weiring和de Vlaming(1984)“Petunia”，KC Sink(编辑)，Springer-Verlag，New York)。特别适合的是EP-A1522880中所述序列。
对于本应用，优选使用允许在花及其部分中增强特异性表达的miRNA标签来设计miRNA标签。例如，拟南芥At miR319b主要在花中表达，在ta-siRNA初级转录物中使用miR319b结合位点(与At miR319b互补)可在花中增强目的基因的特异性表达。
3.1.2.5.降低贮存蛋白含量
降低编码贮存蛋白(下文称为SP)的基因的基因表达具有多种优势，例如降低变应原潜能或修饰其他代谢物的组成或量。贮存蛋白描述于EP-A 0591530、WO 87/47731、WO 98/26064、EP-A 0620281；Kohno-Murase J等(1994)Plant Mol Biol 26(4)：1115-1124等。SP用于储藏种子或花粉的萌发中迅速异养生长所需的碳、氮和硫。在多数情况下，它们没有酶活性。SP仅在种子发育中在胚中合成，并在该过程中首先在胚或胚乳中差异分化细胞的蛋白质储藏囊泡(PSV)中累积。贮存蛋白可以按照其他特征性特性的函数分为亚类，例如其在不同溶液(水、盐水、醇)中的沉降系数或溶解度。沉降系数可通过超速离心以技术人员熟悉的方式进行测定(例如Correia JJ(2000)Methods in Enzymology 321：81-100中所述)。总体而言，根据其序列，贮存蛋白可以分为四个大基因家族：2S清蛋白(油菜籽蛋白样)、7S球蛋白(菜豆蛋白样)、11S/12S球蛋白(豆球蛋白/cruciferin样)和玉米醇溶蛋白。
2S清蛋白可广泛见于双子叶植物种子，包括重要的经济作物科，如豆科(Fabaceae)(如大豆)、十字花科(Brassicaceae)(如油菜)、大戟科(如蓖麻植物)或菊科(Asteraceae)(如向日葵)。2S清蛋白是含有保守性半胱氨酸残基的致密球状蛋白质，经常形成异二聚体。7S球蛋白以三聚体形式存在，不包含半胱氨酸残基。在合成之后，它们被切割为较小的片段并糖基化，与2S清蛋白的情况一样。尽管多肽的大小不同，但不同的7S球蛋白是高度保守的，并且很可能追溯到共同的前体蛋白质，与2S清蛋白的情况一样。仅少量的7S球蛋白可见于单子叶植物。在双子叶植物中，它们的量经常低于11S/12S球蛋白。除了2S清蛋白以外，11S/12S球蛋白在双子叶植物中构成贮存蛋白的大部分。来自不同植物属的不同11S球蛋白质的高度相似性继而使得可以得出其在进化过程中共享前体蛋白质的结论。所述贮存蛋白优选选自2S清蛋白(油菜籽蛋白样)、7S球蛋白(菜豆蛋白样)、11S/12S球蛋白(豆球蛋白/cruciferin样)或玉米醇溶蛋白类别。特别优选的11S/12S球蛋白优选包括来自以下的11S球蛋白：欧洲油菜、大豆和拟南芥属、向日葵、亚麻籽、芝麻、红花、橄榄树、大豆或多种坚果物种。特别优选的玉米醇溶蛋白谷醇溶蛋白优选包括来自单子叶植物特别是玉米、稻、燕麦、大麦或小麦的蛋白质。
对于本应用，优选使用允许在种子中增强特异性沉默的miRNA标签来设计miRNA标签。例如，玉米miR167主要在种子中表达，在ta-siRNA初级转录物中使用miR167结合位点(与miR167互补)可增强种子特异性沉默。
3.1.2.6.获得针对植物病原体的抗性
本发明的方法和手段将特别适用于在真核细胞或生物特别是植物细胞和植物中获得病原体(如病毒或线虫)抗性。预计在宿主生物(如植物)中转录产生的嵌合RNA分子(或由其产生的dsRNA分子)能传播到该生物的全身。因此有可能在嫁接到包含本发明嵌合基因的转基因茎干上的植物非转基因接穗的细胞中降低核酸的表型表达(反之亦然)，该方法在园艺学、栽培或果实生产中非常重要。
可以通过降低某种病原体的生长、存活、某发育阶段(如蛹化)或增殖所必需基因的基因表达来获得对植物病原体的抗性，所述病原体为例如蜘蛛类、真菌、昆虫、线虫、原生动物、病毒、细菌和疾病。合适的降低可以引起上述步骤的完全抑制，但也可以是推迟一个或多个步骤。这可以是例如允许病原体进入的植物基因，但也可以是病原体同源基因。优选地，嵌合RNA(或由其产生的dsRNA)针对病原体基因。例如，可以用上述物质的适当制剂处理植物，例如喷雾或扬洒，然而植物本身也可以转基因生物的形式包含所述物质并将它们传递至病原体，例如以胃毒剂的形式。多种病原体的多种必需基因为技术人员所公知(例如对于线虫抗性：WO93/10251，WO 94/17194)。
因此，本发明的一个方面提供这样的方法，其中抑制的靶基因编码植物病原体(如昆虫或线虫)中的蛋白质。在一个方面中，方法包括将包含DNA的核酸构建体引入病原体被靶向的植物的基因组，所述DNA转录成嵌合RNA，所述嵌合RNA形成至少一个dsRNA分子，其在病原体(如昆虫或线虫)摄入或感染所述植物的细胞时有效降低病原体中靶基因的表达。在优选的实施方案中，所述基因抑制对该病原体为致死性。
最优选的病原体为真菌病原体，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、小麦白粉病菌(Blumeria graminis)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotium)、颖枯壳针孢(Septoria nodorum)、小麦壳针孢(Septoria tritici)、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)、黑胫茎点霉(Phomalingam)；细菌病原体如坏腐棒杆菌(Corynebacterium sepedonicum)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv.tabaci)、丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola)、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)、野油菜黄单胞菌锦葵致病变种(Xanthomonas campestris pv.malvacearum)和野油菜黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas campestris pv.oryzae)以及线虫如马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)、马铃薯白线虫(G.pallida)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、燕麦胞囊线虫(Heterodera avenae)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、小麦粒线虫(Anguina tritici)和北方根结线虫(Meloidogyne hapla)。
对病毒的抗性可以通过如降低病毒外壳蛋白、病毒复制酶、病毒蛋白酶等的表达来获得。大量植物病毒以及适当的靶基因为技术人员所公知。本发明的方法和组合物在获得线虫抗性植物中尤其有用(靶基因参阅如WO 92/21757，WO 93/10251，WO 94/17194)。
本发明提供获得病原体抗性生物特别是植物的方法，包括为该生物的细胞提供本发明的嵌合RNA分子的步骤，所述嵌合RNA分子能在真核细胞中提供至少部分双链的RNA分子，所述嵌合RNA分子包含
a)至少一种第一核糖核苷酸序列，其与至少一个病原体基因的至少一部分靶核苷酸序列基本相同，和
b)至少一种第二核糖核苷酸序列，其与所述第一核苷酸序列基本互补，并能够与所述第一核苷酸序列杂交形成双链RNA结构，和
c)至少一种第三核糖核苷酸序列，其位于所述第一和所述第二核苷酸序列之间，包含至少一个可移除RNA元件，该元件可通过真核细胞的RNA加工机制移除，而不将得到的分别包含所述第一和所述第二核糖核苷酸序列的序列共价连接。
优选地，所述第一核糖核苷酸序列与病原体基因组的至少部分核苷酸序列具有65％至100％的序列同一性，优选75％至100％，更优选85％至100％，最优选95％至100％。更优选地，所述病原体选自病毒、细菌、真菌和线虫。
3.1.2.7.预防茎折断
可以通过如降低糖类代谢基因(见上文)的基因表达来获得对茎折断易感性的降低。有利的基因已有描述(WO 97/13865等)，包括组织特异性的多聚半乳糖醛酸酶或纤维素酶。
对于本应用，优选使用允许在茎中增强特异性表达的miRNA标签来设计miRNA标签。例如，玉米miR159主要在茎中表达，在ta-siRNA初级转录物中使用miR159结合位点(与Zm miR159互补)可增强目的基因在茎中的特异性表达。
3.1.2.8.延迟果实成熟
可以通过如降低选自以下基因的基因表达来实现果实成熟的延迟：多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、β-(1-4)葡聚糖酶(纤维素酶)、β-半乳聚糖酶(β-半乳糖苷酶)或乙烯生物合成的基因如1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶、类胡萝卜素生物合成的基因如前八氢番茄红素(prephytoene)或八氢番茄红素生物合成的基因，例如八氢番茄红素去饱和酶。其他有利的基因为例如WO91/16440，WO 91/05865，WO 91/16426，WO 92/17596，WO 93/07275或WO 92/04456，US 5,545,366。
对于本应用，优选使用允许在果实中增强特异性表达的miRNA标签来设计miRNA标签。
3.1.2.9实现雄性不育。合适的靶基因描述于WO 94/29465、WO89/10396、WO 92/18625等。已描述在植物细胞中降低转基因表型表达等的一个具体应用是恢复雄性能育，后者通过引入包含雄性不育DNA的转基因来获得(WO 94/09143、WO 91/02069)。目的核酸具体地为该雄性不育DNA。
对于本应用，优选使用允许在花粉中增强特异性表达的miRNA标签来设计miRNA标签。
3.1.2.10.降低不想要的或有毒植物组分，如芥子油苷。适当的靶基因已有描述(WO 97/16559等)。对于本应用，优选使用允许在种子中增强特异性表达的miRNA标签来设计miRNA标签。例如，玉米miR167主要在种子中表达，在ta-siRNA初级转录物中使用miR167结合位点(与ZmmiR167互补)可增强种子特异性沉默。
3.1.2.11.延迟衰老症状。合适的靶基因为肉桂酰辅酶A：NADPH还原酶或肉桂酰醇脱氢酶等。其他靶基因已有描述(WO 95/07993等)。
3.1.2.12.修饰木质化和/或木质素含量，这主要是在树木物种中。合适的靶基因描述于WO 93/05159、WO 93/05160等。
3.1.2.13.通过降低咖啡酸O-甲基转移酶或肉桂酰醇脱氢酶的表达来在食品(优选种子)中修饰纤维含量。
3.1.2.14.修饰棉花的纤维品质。合适的靶基因描述于US 5,597,718等。
3.1.2.15.通过降低如多酚氧化酶(WO 94/03607)等来降低如马铃薯对碰伤的敏感性。
3.1.2.16.通过如降低来自尿黑酸盐分解代谢途径的基因的表达来增强维生素E生物合成，所述基因为例如尿黑酸1，2-双加氧酶(HGD；ECNo.：1.13.11.5)、顺丁烯二酸单酰-乙酰乙酸异构酶(MAAI；EC No.：5.2.1.2)或延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAAH；EC No.：3.7.1.2)。
3.1.2.17.通过降低如N-甲基-腐胺氧化酶和腐胺N-甲基转移酶的表达来降低如烟草中的尼古丁含量。
3.1.2.18.通过降低咖啡因生物合成的基因如7-甲基黄嘌呤3-甲基转移酶的基因表达来降低咖啡豆(如咖啡(Coffea arabica))的咖啡因含量。
3.1.2.19.通过降低茶碱生物合成基因如1-甲基黄嘌呤3-甲基转移酶的基因表达来降低茶(茶(Camellia sinensis))中的茶碱含量。
3.1.2.20.通过如降低苏氨酸生物合成(如通过降低苏氨酸合酶的表达)来增加甲硫氨酸含量(Zeh M等(2001)Plant Physiol 127(3)：792-802)。
此外，本发明的方法和化合物可用于获得落叶抗性(WO 97/13865)、获得修饰的花颜色谱(EP 522880，US 5,231,020)、降低生物中不想要(次要)代谢物的存在，如植物中的芥子油苷(WO97/16559)或叶绿素含量(EP 779364)、通过代谢改造(如降低糖类代谢(WO 92/11375，WO 92/11376，US5,365,016，WO 95/07355)或脂类生物合成(WO 94/18337，US 5,530,192)等所涉及的特定基因的表达)来修饰真核细胞或生物中合成的代谢物谱等。有利基因的其他实例描述于例如Dunwell JM，Transgenic approaches to cropimprovement，J Exp Bot.2000；51Spec No；第487-96页。
每项提到的应用可以单独使用。当然，也有可能同时使用一种以上的上述方法。在该语境中，如果使用所有方法，则降低上文定义的至少两种不同靶基因的表达。在该语境中，这些靶基因可来源于单组基因(优选的用于使用)，或者属于不同的用途组。
3.实施例
本领域技术人员将会理解或能够确定本文所述本发明具体实施方案的许多等价方案而无需超出常规实验。这些等价方案旨在包括在下列权利要求中。本文引用的所有专利、公开专利申请和其他参考文献的完整内容明确地通过参考整体引入本文。
现将参考以下实施例更易于理解地对本发明进行一般描述，所述实施例仅用于说明本发明某些方面和实施方案的目的，而并非旨在限制本发明。
序列
1.SEQ ID NO 1：编码玉米ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
2.SEQ ID NO 2：编码小麦ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
3.SEQ ID NO 3：编码稻ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
4.SEQ ID NO 4：编码棉花ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
5.SEQ ID NO 5：编码大豆ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
6.SEQ ID NO 6：编码油菜ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
7.SEQ ID NO 7：编码向日葵ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
8.SEQ ID NO 8：编码大麦ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
9.SEQ ID NO 9：编码番茄ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
10.SEQ ID NO 10：编码高粱ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
11.SEQ ID NO 11：编码云杉ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
12.SEQ ID NO 12：编码可可ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
13.SEQ ID NO 13：编码葡萄ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
14.SEQ ID NO 14：编码莲属(lotus)ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
15.SEQ ID NO 4：编码白杨(poplar)ta-siRNA初级转录物的核糖核苷酸序列
16.SEQ ID NO 16：编码拟南芥属TAS1a的核糖核苷酸序列
17.SEQ ID NO 17：编码拟南芥属TAS1b的核糖核苷酸序列
18.SEQ ID NO 18：编码拟南芥属TAS1c的核糖核苷酸序列
19.SEQ ID NO 19：编码拟南芥属TAS2的核糖核苷酸序列
20.SEQ ID NO 20：编码拟南芥属TAS3的核糖核苷酸序列
21.SEQ ID NO 21：MW-P1F，寡核苷酸引物5’-aggtcaaataaggaaaacga-3’
22.SEQ ID NO 22：MW-P2R，寡核苷酸引物5’-gccttgcaaaataagaatac ca-3’
23.SEQ ID NO 23：pRMW1，含有ta-siRNA At2g27400初级转录物的Gateway进入载体
24.SEQ ID NO 24：pRMW5，含有改造的ta-siRNA(其靶向GUS基因)的Gateway进入载体
25.SEQ ID NO 25：pRMW6，含有改造的ta-siRNA(其靶向GUS报道基因)的Gateway进入载体
26.SEQ ID NO 26：pRMW7，含有改造的ta-siRNA(靶向GUS报道基因)的Gateway进入载体
27.SEQ ID NO 27：pRMW8，含有改造的ta-siRNA(靶向非特异性核苷酸作为对照)的Gateway进入载体
28.SEQ ID NO 28：MW-P17F，寡核苷酸引物5’-agcttgactagagaattcga atcc-3’
29.SEQ ID NO 29：MW-P18R，寡核苷酸引物5’-gatccgggctgcacatacat aac-3’
30.SEQ ID NO 30：pRMW9，含有PcUbi4-2启动子的Gateway进入载体
31.SEQ ID NO 31：pRMW13，用于表达改造的ta-siRNA基因(其靶向GUS报道基因)的二元载体。
32.SEQ ID NO 32：pRMW14，用于表达改造的ta-siRNA基因(其靶向GUS报道基因)的二元载体。
33.SEQ ID NO 33：pRMW15，用于表达改造的ta-siRNA基因(其靶向GUS报道基因)的二元载体。
34.SEQ ID NO 34：pRMW16，用于表达改造的ta-siRNA基因(其靶向非特异性的核苷酸作为对照)的二元载体。
35.SEQ ID NO 35：pRLM293，含有NOS终止子的Gateway进入载体
36.SEQ ID NO 36：pRLM251，Gateway目的载体
37.SEQ ID NO 37：MW-P11F，寡核苷酸引物5’-ccatatcgcaacgatgacgt-3’
38.SEQ ID NO 38：MW-P12R，寡核苷酸引物5’-gccagtccccttgatagcga-3’
39.SEQ ID NO 39：pRMW2，含有拟南芥属ta-siRNA At3g17185初级转录物的Gateway进入载体。
40.SEQ ID NO 40：pRMW23，含有改造的ta-siRNA(其靶向拟南芥属八氢番茄红素去饱和酶基因)的Gateway进入载体。
41.SEQ ID NO 41：pRMW24，含有改造的ta-siRNA(其靶向拟南芥属八氢番茄红素去饱和酶基因)的Gateway进入载体。
42.SEQ ID NO 42：pRMW25(＝pRSM5)，含有改造的ta-siRNA(其靶向拟南芥属八氢番茄红素去饱和酶基因)的Gateway进入载体。
43.SEQ ID NO 43：pRMW26(＝pRSM6)，含有改造的ta-siRNA(其靶向拟南芥属八氢番茄红素去饱和酶基因)的Gateway进入载体。
44.SEQ ID NO 44：pRPR57，含有玉米ta-siRNA初级转录物的Gateway进入载体
45.SEQ ID NO 45：编码DsRed 2-2靶区域互补序列的核酸序列
46.SEQ ID NO 46：pRPR58，含有改造的ta-siRNA(其靶向DsRed2)的Gateway进入载体。除5′D7(+)和5′D8(+)相被替换外，pRPR58与pRPR57相同。
47.SEQ ID NO 47：编码DsRed 2-1靶区域互补序列的核酸序列
48.SEQ ID NO 48：pRPR59，含有改造的ta-siRNA(其靶向DsRed2)的Gateway进入载体。除5′D7(+)和5′D8(+)相被替换外，pRPR59与pRPR57相同。
49.SEQ ID NO 49：pRLM283，含有甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子的Gateway进入载体
50.SEQ ID NO 50：pRLM336，含有玉米Glb1启动子的Gateway进入载体
51.SEQ ID NO 51：pRPR56，含有水稻叶绿体蛋白质12-样(Os.CP12)启动子和来自金属硫蛋白基因的第一个内含子的Gateway进入载体。
52.SEQ ID NO 52：pRLM217，含有下述成分并且侧翼为重组位点attL4和attR1的Gateway目的载体。玉米泛素和内含子启动子、作为选择标记的大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]和章鱼碱合酶3终止子。
53.SEQ ID NO 53：pRLM373，通过多位点Gateway克隆使用以下构型构建的二元载体：T-DNA左边界、Ubi启动子、Ocs终止子、attB4位点、ScBV启动子、attB1位点、玉米ta-siRNA前体、attB2位点、NOS终止子、T-DNA右边界
54.SEQ ID NO 54：pRLM376，除了5′D7(+)和5′D8(+)相被靶向DsRed 2基因的DNA片段替换外，与pRLM373相同的二元载体
55.SEQ ID NO 55：pRLM379，除了5′D7(+)和5′D8(+)相被靶向DsRed 2基因的DNA片段替换外，与pRLM373相同的二元载体
56.SEQ ID NO 56：pRLM374，除了球蛋白1启动子被用于替换ScBV启动子外，与pRLM373相同的二元载体
57.SEQ ID NO 57：pRLM377，除了5′D7(+)和5′D8(+)相被靶向DsRed 2基因的DNA片段替换外，与pRLM374相同的二元载体
58.SEQ ID NO 58：pRLM380，除了5′D7(+)和5′D8(+)相被靶向DsRed 2基因的DNA片段替换外，与pRLM377相同的二元载体
59.SEQ ID NO 59：pRLM375，一种二元载体，且前-ta-siRNA的表达位于Os.CP12启动子和水稻金属硫蛋白(Os.MET)内含子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向编码ARF4的内源基因。
60.SEQ ID NO 60：pRLM378，一种二元载体，且前-ta-siRNA的表达位于Os.CP12启动子和NOS终止子的调控下。改造的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向叶中的DsRed2报道基因(位置341-362bp)。
61.SEQ ID NO 61：pRLM381，一种二元载体，且前-ta-siRNA的表达位于Os.CP12启动子和NOS终止子的调控下。改造的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向叶中的DsRed2报道基因(分别为位置26-44bp和341-362bp)。
62.SEQ ID NO 62：pRPR29，含有改造的5’D7和D8相(其靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因)的核酸序列
63.SEQ ID NO 63：编码改造的5′D8(+)相(其靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因)的核酸序列。
64.SEQ ID NO 64：编码改造的5′D7(+)相(其靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因)的核酸序列。
65.SEQ ID NO 65：pRPR22，含有改造的ta-siRNA(其靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因)的Gateway进入载体。
66.SEQ ID NO 66：pRPR31(＝pRLM424)，除了5′D7(+)和5′D8(+)相被靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因的DNA片段替换外，与pRLM373相同的二元载体
67.SEQ ID NO 67：pRPR32(pRLM428)，除了5′D7(+)和5′D8(+)相被靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因的DNA片段替换外，与pRLM375相同的二元载体
68.SEQ ID NO 68：pRPR35，含有改造的5′D7(+)和5′D8(+)相和改造的miR166结合位点的核酸序列。
69.SEQ ID NO 69：编码miR166结合位点的核酸序列
70.SEQ ID NO 70：编码Zm miR166的核糖核酸序列
71.SEQ ID NO 71：pRPR36，除了miR390结合位点被miR166结合位点替换外，与pRP58相同的Gateway进入载体。
72.SEQ ID NO 72：pRPR37，含有改造的5′D7(+)和5′D8(+)相和改造的miR166结合位点的核苷酸序列。
73.SEQ ID NO 73：编码miR167结合位点的核酸序列
74.SEQ ID NO 74：编码Zm miR167的核糖核酸序列
75.SEQ ID NO 75：pRPR38，除了miR166结合位点被niR167结合位点替换外，与pRPR36相同的Gateway进入载体。
76.SEQ ID NO 76：pRPR39，除了miR390结合位点被miR166结合位点替换外，与pRLM376相同的二元载体。
77.SEQ ID NO 77：pRPR40(pRPR47)，除了miR390结合位点被miR167结合位点替换外，与pRLM376相同的二元载体。
78.SEQ ID NO 78：编码拟南芥属小RNA18的核糖核酸序列
79.SEQ ID NO 79：编码拟南芥属小RNA19的核糖核酸序列
80.SEQ ID NO 80：编码拟南芥属小RNA14的核糖核酸序列
81.SEQ ID NO 81：编码拟南芥属小RNA18结合位点的核酸序列
82.SEQ ID NO 82：编码拟南芥属小RNA19结合位点的核酸序列
83.SEQ ID NO 83：编码拟南芥属小RNA14结合位点的核酸序列
84.SEQ ID NO 84：编码拟南芥属miRNA(at-miR160b)的核糖核酸序列
85.SEQ ID NO 85：编码拟南芥属miRNA(at-miR163)的核糖核酸序列
86.SEQ ID NO 86：编码拟南芥属miRNA(at-miR167a)的核糖核酸序列
87.SEQ ID NO 87：编码拟南芥属miRNA(at-miR172b)的核糖核酸序列
88.SEQ ID NO 88：编码拟南芥属miRNA(at-miR319b)的核糖核酸序列
89.SEQ ID NO 89：编码稻miRNA(os-miR156a)的核糖核酸序列
90.SEQ ID NO 90：编码稻miRNA(os-miR156I)的核糖核酸序列
91.SEQ ID NO 91：编码稻miRNA(os-miR159b)的核糖核酸序列
92.SEQ ID NO 92：编码稻miRNA(os-miR160f)的核糖核酸序列
93.SEQ ID NO 93：编码稻miRNA(os-miR162a)的核糖核酸序列
94.SEQ ID NO 94：编码稻miRNA(os-miR164a)的核糖核酸序列
95.SEQ ID NO 95：编码稻miRNA(os-miR164d)的核糖核酸序列
96.SEQ ID NO 96：编码稻miRNA(os-miR166a)的核糖核酸序列
97.SEQ ID NO 97：编码稻miRNA(os-miR167g)的核糖核酸序列
98.SEQ ID NO 98：编码稻miRNA(os-miR168a)的核糖核酸序列
99.SEQ ID NO 99：编码稻miRNA(os-miR169g)的核糖核酸序列
100.SEQ ID NO 100：编码稻miRNA(os-miR169i)的核糖核酸序列
101.SEQ ID NO 101：编码稻miRNA(os-miR171b)的核糖核酸序列
102.SEQ ID NO 102：编码稻miRNA(os-miR397b)的核糖核酸序列
103.SEQ ID NO 103：编码稻miRNA(os-miR398a)的核糖核酸序列
104.SEQ ID NO 104：编码稻miRNA(os-miR399k)的核糖核酸序列
105.SEQ ID NO 105：编码玉米miRNA(zm-miR156)的核糖核酸序列
106.SEQ ID NO 106：编码玉米miRNA(zm-miR159)的核糖核酸序列
107.SEQ ID NO 107：编码玉米miRNA(zm-miR160b)的核糖核酸序列
108.SEQ ID NO 108：编码玉米miRNA(zm-miR166)的核糖核酸序列
109.SEQ ID NO 109：编码玉米miRNA(zm-miR167)的核糖核酸序列
110.SEQ ID NO 110：编码玉米miRNA(zm-miR171)的核糖核酸序列
其它序列列于本申请附上的序列表中。
实施例
一般方法：
除非另有说明，否则所有的化学品均得自弗拉克(Fluka)(Buchs)、默克(Merck)(Darmstadt)、罗斯(Roth)(Karlsruhe)、塞瓦(Serva)(Heidelberg)和西格玛(Sigma)(Deisenhofen)。限制性酶、DNA修饰酶和分子生物学试剂盒来自安发玛西亚(Amersham-Pharmacia)(Freiburg)、百欧美特(Biometra)罗切(Roche)(Mannheim)、新英格兰生物实验室(New England Biolabs)(Schwalbach)、诺华因(Novagen)(Madison，Wisconsin，USA)、柏克林艾尔莫(Perkin-Elmer)(Weiterstadt)、强基因公司(Qiagen)(Hilden)、斯莱特因(Stratagen)(Amsterdam，Netherlands)、英俊公司(Invitrogen)(Karlsruhe)和安宾(Ambion)(Cambridgeshire，大不列颠联合王国(United Kingdom))。所使用的试剂根据制造商的说明使用。
除非另有说明，否则本发明的实践使用属于本领域技术的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这类技术在文献中被详细解释。参阅例如Molecular Cloning A LaboratorvManual，第二版，Sambrook，J.等人编辑(Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))；Short Protocols in Molecular Biology，第三版，Ausubel，F.等人编辑(Wiley，N.Y.(1995))；DNA Cloning，I和II卷(D.N.Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑(1984))；Mullis等人U.S.专利No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984))；论文，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker，编辑，Academic Press，London(1987))；Handbook OfExperimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑(1986))；和Miller，J.Experiments in Molecular Genetics(Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1972))。
寡核苷酸的化学合成可以使用phosphoamidite方法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，第896-897页)以已知的方式进行。就本发明的目的进行的克隆步骤(例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、核酸转移至硝酸纤维素膜和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、细菌培养、噬菌体繁殖和重组DNA的序列分析)如Sambrook等人(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press；ISBN 0-87969-309-6中所述进行。使用ABI激光荧光DNA测序仪通过Sanger(Sanger等人(1977)ProcNatl Acad Sci USA 74：5463-5467)的方法测序重组的DNA分子。
实施例1：双子叶植物和单子叶植物中农杆菌介导的转化
1.1转基因拟南芥(Columbia)植物的转化和再生
为了产生转基因拟南芥属植物，用多种构建体转化根癌农杆菌(菌株C58C1pGV2260)。随后使用农杆菌菌株产生转基因植物。为此，将单个经转化的农杆菌菌落在4ml培养物(培养基：含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的YEB培养基)中于28℃下孵育过夜。然后使用培养物接种相同培养基中的400ml培养物，将其过夜孵育(28℃，220rpm)并离心(GSA离心机，8,000rpm，20分钟)。沉淀物重悬于浸润培养基(1/2MS培养基；0.5g/L MES，pH 5.8；50g/L蔗糖)中。将悬浮液引入植物箱(杜澈发(Duchefa))中，将100μL的SILWET L-77(用聚烯烃氧化物修饰的七甲基三硅氧烷；奥斯特种有机硅有限公司Osi Specialties Inc.，货号P030196)添加至0.02％的终浓度。在干燥器中，将载有8到12棵植物的植物箱在真空中暴露10到15分钟，然后自发充气。重复两次或3次。于是所有的植物被植入含有潮湿土壤的花盆中，并在长日条件(白天温度22到24℃，夜晚温度19℃；相对大气湿度65％)下生长。6周后收获种子。
或者，可以通过根转化获得转基因拟南芥属植物。使用最大8周龄的植物白色根枝条。为此使用保持在无菌条件下1MS培养基(1％蔗糖；100mg/L肌醇；1.0mg/L硫胺素；0.5mg/L吡哆醇；0.5mg/L烟酸；0.5gMES，pH 5.7；0.8％琼脂)中的植物。根在愈伤组织诱导培养基(1×Gamborg’s B5培养基；2％葡萄糖；0.5g/L巯基乙醇；0.8％琼脂；0.5mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；0.05mg/L细胞分裂素)上生长3天。将长度为0.5cm的根切片转移至10到20ml的液体愈伤组织诱导培养基(组成如上所述，但是不添加琼脂)中，用1mL上述过夜的农杆菌培养物(于28℃，200rpm在LB中培养)接种并摇动2分钟。允许过量的培养基被抽出后，将根外植体转移至含有琼脂的愈伤组织诱导培养基上，然后转移至不含琼脂的愈伤组织诱导液体培养基(含500mg/L羧噻吩青霉素钠/克拉维酸(betabactyl)，史克必成药物有限公司(SmithKline Beecham PharmaGmbH)，Munich)上，摇动孵育，最终转移至枝条诱导培养基(5mg/L 2-异戊烯基腺嘌呤磷酸盐；0.15mg/L吲哚-3-乙酸；50mg/L卡那霉素；500mg/L羧噻吩青霉素钠/克拉维酸)上。5周后和1或2次培养基更换后，将小绿色枝条转移至萌发培养基(1MS培养基；1％蔗糖；100mg/L肌醇；1.0mg/L硫胺素；0.5mg/L吡哆醇；0.5mg/L烟酸；0.5g MES，pH 5.7；0.8％琼脂)上并再生为植物。
1.2作物植物的转化和再生
使用标准转化和再生技术的农杆菌介导的植物转化也可以为转化作物植物的目的而进行(Gelvin&Schilperoort(1995)Plant Molecular BiologyManual，第二版，Dordrecht：Kluwer，Academic Publ.ISBN0-7923-2731-4；Glick&Thompson(1993)Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，Boca Raton：CRC Press，ISBN 0-8493-5164-2)
例如，能够通过子叶或下胚轴转化来转化欧洲油菜(Moloney等人(1989)Plant Cell Reports 8：238-242，de Block等人(1989)Plant Physiol.91：694-701)。用于选择农杆菌和植物的抗生素的使用取决于用于转化的二元载体和农杆菌菌株。欧洲油菜的选择通常使用卡那霉素作为植物标记来进行。亚麻籽(亚麻(Linum usitatissimum))中农杆菌介导的基因转移可以使用例如Mlynarova等人((1994)Plant Cell Report 13：282-285)描述的技术进行。大豆转化可以使用例如EP-A10424047或EP-A10397687、US5,376,543、US 5,169,770中描述的技术进行。玉米或其它单子叶植物的转化可以使用例如US 5,591,616中描述的技术进行。
使用粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或通过硅碳酸盐纤维技术的植物转化由例如Freeling&Walbot(1993)”The maize handbook”ISBN3-540-97826-7，Springer Verlag New York)描述。
实施例2：通过数据采掘鉴定植物ta-siRNA初级转录物
Allen等人，(2005)描述了五个拟南芥ta-siRNA初级转录物，其中四个由miR173起始，第五个由miR390起始。编码miR173-指导的ta-siRNA的基因座是三个旁系同源基因座TAS1a(At2g27400)、TAS1b(At1g50055)和TAS1c(At2g39675)，加上与At2g39680注释序列反义的TAS2。编码miR390-指导的ta-siRNA的基因座为At3g17185。作者还描述了来自若干植物物种的5’D7(+)和5’D8(+)相序列，以及miR390结合位点(Ceu121：207-221，2005)。根据这些短的保守序列，可以使用公共数据库(例如http://tigrblast.tigr.org/tgi/)和内部数据库进行blastn搜索来鉴定来自许多双子叶植物和单子叶植物物种的初级转录物。例如，在使用保守的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA的BLAST搜索中，在玉米数据库(www.maizegdb.org)中鉴定了一系列重叠的EST(AY109233、BE519095、BM268436、BM349498、BM351282、BZ323111、CF012706和CG201712)。比对分析这些EST和基因组序列后，鉴定了玉米ta-siRNA初级转录物。
ta-siRNA的相形成由miRNA起始。在miRNA173指导的ta-siRNA的情况下，miR173与初级转录物中其互补位点结合，随后从miR173的5’端切割了位置10和11之间的转录物。从该切割位点通过5’到3’方向(涉及一组关键酶如RDR6、SGS3和切酶)产生了一系列约21nt相的ta-siRNA。使用相似的过程产生miR390指导的ta-siRNA，除了ta-siRNA的形成是从miR390切割位点开始沿3’到5’的方向。
由miR173或由miR390起始的所有ta-siRNA初级转录物可用于改造，使得至少一个21-nt相ta-siRNA靶向目的基因并下调其表达。基于一个物种(例如玉米)的被改造ta-siRNA初级转录物可以在另一物种(例如大豆)中有功能，只要转录物由适当的miRNA(例如存在于玉米和大豆中的miR390)起始即可。下文是通过数据挖掘鉴定的ta-siRNA初级转录物列表：玉米(SEQ ID NO：1)、小麦(SEQ ID NO：2)、稻(SEQ ID NO：3)、棉花(SEQ IDNO：4)、大豆(SEQ ID NO：5)、油菜(SEQ ID NO：6)、向日葵(SEQ ID NO：7)、大麦(SEQ ID NO：8)、番茄(SEQ ID NO：9)、高粱(SEQ ID NO：10)、云杉(SEQ ID NO：11)、可可(SEQ ID NO：12)、葡萄(SEQ ID NO：13)、莲属(SEQ ID NO：14)和杨属(SEQ ID NO：15)、拟南芥属TAS1a(SEQ IDNO：16)、拟南芥属TAS1b(SEQ ID NO：17)、拟南芥属TAS1c(SEQ ID NO：18)、拟南芥属TAS2(SEQ ID NO：19)和拟南芥属TAS3(SEQ ID NO：20)。
尽管ta-siRNA首先通过与遗传分析结合的小RNA克隆方法被发现(Vazq uez等人，(2004)Molecular Cell 16：69-79；Allen等人，(2005)Cell121：207-221)，但是最近成功地开发了发掘拟南芥属未注释的、非编码EST数据库以鉴定ta-siRNA初级转录物的方案。这类方案主要基于某些ta-siRNA及其靶标在不同植物物种之间的保守性(Williams等人，(2005)，PNAS，9703-9708)。
实施例3：改造拟南芥属miR173调节的ta-siRNA At2g27400(TAS1a)，用于下调转基因拟南芥植物中GUS基因的表达
拟南芥属GUS转基因植物含有来自欧芹(欧芹(Petroselinum crispum)Pc.泛素；996bp)的泛素启动子、全长的β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS报道基因；2,001bp)和来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacenes)的胭脂氨酸合成酶(NOS)终止子(253bp)。在转基因拟南芥中，由于泛素启动子的活性，GUS基因表达被检测为在整个植物中是组成型和遍在的。
使用引物MW-P1F(AGGTCAAATAAGGAAAACGA)(SEQ ID NO：21)和MW-P2R(GCCTTGCAAAATAAGAATACCA)(SEQ ID NO：22)从拟南芥属基因组DNA中PCR扩增At2g27400基因，并将其TA克隆进GateWay进入载体PCR8/GW/TOPO(英俊(Invitrogen)#K2500-20)中。该构建体称作pRMW1(SEQ ID NO：23)。在pRMW1中，799bp At2g27400基因含有180bp的ta-siRNA区、423bp的ta-siRNA上游区(可能的启动子区)和196bp下游区(可能的终止子区)。在从miR173的第11位开始的八个21-nt ta-siRNA相中，3’D2(+)、3’D4(+)和3’D6(+)相用三个21-nt GUS序列替换。胸腺嘧啶被用作三个GUS-ta-siRNA序列的起始。与GUS序列位置在18和21的错配被引入，以模拟天然ta-siRNA与其在拟南芥植物中的靶基因之间的碱基配对错配(表3)。
表3.用于改造的ta-siRNA(其靶向GUS基因)的Gateway进入载体(Gateway entry vector)。
  构建体名称   改造的3’D2(+)序列 改造的3’D4(+)序列   改造的3’D6(+)序列
  PRMW5(SEQIDNO：24)   taatcgcctgtaagtgcactc(靶向GUS M1346) taatcgcctgtaagtgcactc(靶向GUS M1346)   taatcgcctgtaagtgcactc(靶向GUS M1346)
  pRMW6(SEQID NO：25)   ttaccatccgtaataacagtc(靶向GUS C1585) ttaccatccgtaataacagtc(靶向GUS C1585)   ttaccatccgtaataacagtc(靶向GUS C1585)
  pRMW7(SEQID NO：26)   Tacctttcggtataaagcctc(靶向GUS N215) Taatcgcctgtaagtgcactc(靶向GUSM1346)   ttaccatccgtaataacagtc(靶向GUS C1585)
  pRMW8(SEQIDNO：27)   ctcacgtgaatgtccgctaat(从靶向GUS M1346的TA-siRN序列拼凑得来的随机序列) Ctcacgtgaatgtccgctaat(从靶向GUS M1346的TA-siRN序列拼凑得来的随机序列)   ctcacgtgaatgtccgctaat(靶向从GUS M1346的TA-siRN序列拼凑得来的随机序列)
  PRMW1(SEQIDNo：23)   tcctaagtccaacatagcgtt(野生型TAS1a 3’D2(+)相序列)  ttttaagtctaacatagcgtt(野生型TAS1a 3’D4(+)相序列)  ttctaagtccaacatagcgta(野生型TAS1a 3’D6(+)相序列)
注意：GUS M1346表示GUS中部的位置1346。
GUS C1585表示GUS C端的位置1586。
GUS N1585表示GUS N端的位置215。
含有GUS-ta-siRNA的这四个构建体在产生用于植物转化的二元载体时被用作Gateway进入载体的目的基因。
为了在拟南芥中表达PDS-ta-siRNA，选择三个启动子：欧芹泛素启动子(Pc.ubi)、拟南芥属叶优选的启动子(UK398、EP 01666599和US20060156429)和蚕豆(faba bean)未知种子蛋白质(USP)启动子用于组成型、叶优选的和种子特异的表达。Pc.Ubi和UK398启动子被PCR扩增并TA克隆进Gateway 5’进入载体pENTR 5’-TOPO(英俊(Invitrogen)#K591-20)中，分别产生pRMW9(SEQ ID NO：30)和pRMW 31(SEQ ID NO：152)。使用引物MW-P17F(AGCTTGACTAGAGAATTCGAATCC)(SEQ IDNO：28)和MW-P18R(GATCCGGGCTGCACATACATAAC)(SEQ IDNO：29)扩增Pc.Ubi启动子。使用引物MW-P35F(GATCCAATCTCATCCACTGA)(SEQ ID NO：195)和MW-P36R(CCATGGTTAATTAACCACCA)(SEQ ID NO：196)扩增pUK398启动子。pRLM257(SEQ ID NO：153)为含有USP启动子的Gateway进入载体。使用pRMW9、pRMW31和pRLM257，从而产生用于植物转化的二元载体。
通过将三个含有启动子、目的基因、终止子和一个目的载体的进入载体在LR反应(英俊(Invitrogen)#K591-10)中组合，经由多位点Gateway克隆构建了十五个二元表达载体(表4)。通过限制性酶消化、PCR和测序确认最终的二元载体。
表4.用于在拟南芥中表达GUS-ta-siRNA的二元载体
二元载体   5’进入载体(启动子) 目的基因载体   3’进入载体(终止子) 目的载体
  pRMW13(SEQ ID NO：31)   pRMW9(SEQIDNO：30)(欧芹pUbi4-2)   pRMW5(GUS-Mta-siRNA)(SEQID NO：242) pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
pRMW14(SEQID NO：32) pRMW9(欧芹pUbi4-2)(SEQID NO：30)   pRMW6(GUS-Cta-siRNA)(SEQID NO：25) pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
  pRMW15(SEQID NO：33)   pRMW9(SEQIDNO：30)(欧芹pUbi4-2)   pRMW7(SEQIDNO：26)(GUSNMCta-siRNA pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
  pRMW16(SEQID NO：34)   pRMW9(SEQIDNO：30)(欧芹pUbi4-2)   pRMW8(SEQIDNO：27)(模拟品) pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
pRMW17(SEQ ID NO：161)   pRMW9(SEQIDNO：30)(欧芹pUbi4-2) PRMW1(SEQID  NO：23)(ta-siRNAAt2g27400) pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
pRMW18(SEQ ID NO：154) pRLM257(SEQ ID NO：153)   pRMW5(GUS-Mta-siRNA)(SEQID NO：242) pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
pRMW19(SEQ ID NO：155) pRLM257(SEQ ID NO：153) pRMW6(GUS-Cta-siRNA)(SEQID NO：25) pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
pRMW20(SEQ ID NO：156) pRLM257(SEQ ID NO：153)   pRMW7(SEQIDNO：26)(GUSNMCta-siRNA pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
  pRMW21(SEQ ID NO：157)   pRLM257(SEQ ID NO：153)   pRMW8(SEQIDNO：27)(模拟)   pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM251(SEQID NO：36)
  pRMW22(SEQ ID NO：158)   pRLM257(SEQ ID NO：153)   PRMW1(SEQID NO：23)(ta-siRNA   pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM251(SEQID NO：36)
  At2g27400)
pRMW40(SEQ ID NO：159) pRMW31(SEQ ID NO：152)   pRMW5(GUS-Mta-siRNA)(SEQID NO：242) pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
pRMW41(SEQ ID NO：160) pRMW31(SEQ ID NO：152)   pRMW6(GUS-Cta-siRNA)(SEQID NO：25) pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
pRMW42(SEQID NO：162) pRMW31(SEQ ID NO：152)   pRMW7(SEQIDNO：26)(GUSNMCta-siRNA pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35) pRLM251(SEQID NO：36)
  pRMW43(SEQID NO：163)   pRMW31(SEQ ID NO：152)   pRMW8(SEQIDNO：27)(模拟)   pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM251(SEQID NO：36)
  pRMW44(SEQID NO：164)   pRMW31(SEQ ID NO：152)   PRMW1(SEQID  NO：23)(ta-siRNAAt2g27400)   pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM251(SEQID NO：36)
注意：GUS-M ta-siRNA表示靶向GUS基因5’区的ta-siRNA。
GUS-C ta-siRNA表示靶向GUS基因3’区的ta-siRNA。
GUS-NMC ta-siRNA表示靶向GUS基因中三个不同区域的前-ta-siRNA。
欧芹泛素启动子(Pc.ubi)在该表中指示欧芹pUbi4-2。
使用花浸染(floral dip)法(Weigel和Glazebrook，Arabidopsis.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)将含有GUS-ta-siRNA的15个二元载体再-转化进GUS转基因拟南芥植物中。收获所有的T1种子，表面灭菌并置于萌发培养基A-MS-005(补充有100nMPursuit、10μg/mL膦丝菌素、500μg/mL cefotaximine和2μg/mL苯菌灵的1/2MS培养基)上。在萌发培养基上于4℃冷处理48小时后，将种子在Percival培养箱中于22℃下12小时光/12小时暗培养。收获植物组织(包括叶、茎、花和长角果)并在GUS染色溶液(Jerfferson等人，1987EMBO J.6：3901-3907)中于37℃下染色过夜。所有的植物组织由于GUS活性而被染成蓝色。ta-siRNA/GUS转基因植物和用于转化的亲本GUS系之间没有观察到可见的色差。由于亲本系中强GUS表达和GUS蛋白质的稳定性，可能ta-siRNA/GUS以相对低的效力引起GUS mRNA减少。设计更好的21-ntta-siRNA/GUS和/或选择GUS mRNA不同的待靶向区域可能促进沉默的效力。
将GUS-ta-siRNA转基因系与拟南芥突变系(其中ta-siRNA生物发生途径中的一个关键成分(SGS3或RDR6)受损)杂交。GUS表达水平恢复至与EW115A转基因植物相似的水平，因为GUS-ta-siRNA的生产被破坏。
与上文相似，组织特异性启动子(例如根特异性启动子)也被用于在拟南芥属GUS转基因植物中表达GUS-ta-siRNA。作为在特异组织中表达GUS-ta-siRNA的结果，GUS信号以组织特异的方式被特异地下调。
实施例4：改造拟南芥属miR390调节的ta-siRNA At3g17185(TAS3)， 用于下调转基因拟南芥植物中GUS基因的表达
使用引物MW-P11F(CCATATCGCAACGATGACGT)(SEQ ID NO：37)和MW-P12R(GCCAGTCCCCTTGATAGCGA)(SEQ ID NO：38)从拟南芥基因组DNA中PCR扩增拟南芥属ta-siRNA基因At3g17185，然后将其TA克隆进PCR8/GW/TOPO载体(英俊(Invitrogen)#K2500-20)。该构建体称作pRMW2。在pRMW2(SEQ ID NO：39)中，1200bp的At3g17185基因含有178bp ta-siRNA区、865bp ta-siRNA上游区(可能的启动子区)和156bp ta-siRNA下游区(可能的终止子区)。在从miR390的位置11开始的八个21-nt ta-siRNA相中，两个非常相似的相5’D7(+)和5’D8(+)被来自实施例3中所述GUS序列的相同的两个2Int片段替换。这些改造的ta-siRNA/GUS前体被用作进入载体(表5)以产生二元表达载体(表6)。
表5.用于改造靶向GUS的TAS3ta-siRNA的Gateway进入载体。
  构建体名称  改造的5’D7(+)序列   改造的5’D8(+)序列
  pRMW53(SEQ ID NO：166)  taatcgcctgtaagtgcactc(靶向GUS M1346)   taatcgcctgtaagtgcactc(靶向GUS M1346)
  pRMW54(SEQ ID NO：167)  ttaccatccgtaataacagtc(靶向GUS C1585)   ttaccatccgtaataacagtc(靶向GUS C1585)
  PRMW38(SEQ ID NO：165)  tcttgaccttgtaagacccca(野生型TAS35’D7序列)   tcttgaccttgtaaggccttt(野生型TAS35’D8序列)
注意：GUS M1346是指GUS中部位置1346。
GUS C1585是指GUS C-端位置1586。
两个启动子(实施例3中描述的Pc.ubi和UK398)被用于表达在拟南芥中靶向GUS的TAS3ta-siRNA。通过多位点Gateway克隆构建了六个二元载体(表6)。通过限制性酶分析和测序来确证最终的二元载体。
表6.用于表达靶向GUS的TAS3ta-siRNA的二元载体
  二元载体   5’进入载体(启动子)   目的基因载体   3’进入载体(终止子)   目的载体
  pRMW74(SEQ ID NO：169)   pRMW9(SEQIDNO：30)(欧芹pUbi4-2)   pRMW53(GUS-Mta-siRNA)(SEQ ID NO：166)   pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  pRMW75(SEQID NO：170)   pRMW9(SEQIDNO：30)(欧芹pUbi4-2)   pRMW54(GUS-Cta-siRNA)(SEQ ID NO：167)   pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM402(SEQ IDNO：174)
  pRMW76(SEQ ID NO：168)   pRMW9(SEQIDNO：30)(欧芹pUbi4-2)   PRMW38(ta-siRNATAS3)(SEQ IDNO：165)   pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  pRMW77(SEQID NO：172)  pRMW31(SEQ ID NO：152)(拟南芥属pUK398启动子)   pRMW53(GUS-Mta-siRNA)(SEQ ID NO：166)  pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  pRMW78(SEQ ID NO：173)  pRMW31(SEQ ID NO：152)(拟南芥属pUK398启动子)   pRMW54(GUS-Cta-siRNA)(SEQ ID NO：167)  pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  pRMW79(SEQ ID NO：171)  pRMW31(SEQ ID NO：152)(拟南芥属pUK398启动子)   PRMW38(ta-siRNATAS3)(SEQ IDNO：165)  pRLM293(Nos终止子)(SEQID NO：35)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
注意：在该表中，欧芹泛素启动子(Pc.ubi)是指欧芹pUbi4-2。
使用花浸染法(Weigel和Glazebrook，Arabidopsis.A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)将这六个二元载体转化进由Pc.ubi启动子驱动的转基因GUS拟南芥植物中。作为ta-siRNA/GUS表达的结果，GUS的表达水平被降低。如实施例3中所述，将ta-siRNA转基因植物与拟南芥突变体sgs3或rdr6杂交，GUS基因的表达水平被恢复为与亲本GUS转基因植物相似的水平。
实施例5：改造拟南芥属miR173调节的ta-siRNA At2g27400(TAS1a)，用于下调拟南芥植物中八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因的表达
与实施例3中所述相同的ta-siRNA At2g27400基因被改造为靶向拟南芥属内源PDS基因(登录号#AF360196)。相同的21-nt ta-siRNA相3’D2(+)、3’D4(+)和3’D6(+)被来自拟南芥属PDS基因的21-nt序列替换(表7)。这四个构建体被用作目的基因Gateway进入载体，从而产生用于植物转化的二元载体。PDS1、PDS2、PDS3和PDS4是指要改造的ta-siRNA靶向的PDS mRNA的不同区域。
表7.用于改造的ta-siRNA(其靶向PDS基因)的Gateway进入载体。
  构建体  改造的3’D2(+)   改造的3’D4(+)   改造的3’D6(+)
  名称  序列   序列   序列
  pRMW27(SEQ IDNO：43)  ttcttgtcttaagcgcttgag(PDS1)(靶向PDS247-267)   ttcttgtcttaagcgcttgag(PDS1)(靶向PDS247-267)   ttcttgtcttaagcgcttgag(PDS1)(靶向PDS247-267)
  pRMW23(SEQ IDNO：40)  ttcctgaagaaaccggttcaa(PDS2)(靶向PDS987-1007)   ttcctgaagaaaccggttcaa(PDS2)(靶向PDS987-1007)   ttcctgaagaaaccggttcaa(PDS2)(靶向PDS987-1007)
  PRMW39(SEQ IDNO：176)  tcatatgtgttcttcagtttt(PDS3)(靶向PDS1331-1351)   tcatatgtgttcttcagtttt(PDS3)(靶向PDS1331-1351)   tcatatgtgttcttcagtttt(PDS3)(靶向PDS1331-1351)
  PRMW24(SEQ IDNO：41)  ttacaagttaaggacatgtcg(PDS4)(靶向PDS1394-1414)   ttacaagttaaggacatgtcg(PDS4)(靶向PDS1394-1414)   ttacaagttaaggacatgtcg(PDS4)(靶向PDS1394-1414)
为了在拟南芥属中表达PDS-ta-siRNA，选择三个启动子：欧芹泛素启动子(Pc.ubi)、拟南芥属叶优选的启动子(UK398、EP 01666599和US20060156429)和蚕豆(faba bean)未知种子蛋白质(USP)启动子用于组成型、叶优选的和种子特异的表达。Pc.Ubi和UK398启动子被PCR扩增并TA克隆进Gateway 5’进入载体pENTR 5’-TOPO(英俊(Invitrogen)#K591-20)中，分别产生pRMW9(SEQ ID NO：30)和pRMW 31(SEQ ID NO：152)。使用引物MW-P17F(AGCTTGACTAGAGAATTCGAATCC)(SEQ IDNO：28)和MW-P18R(GATCCGGGCTGCACATACATAAC)(SEQ IDNO：29)扩增Pc.Ubi启动子。使用引物MW-P35F(GATCCAATCTCATCCACTGA)(SEQ ID NO：195)和MW-P36R(CCATGGTTAATTAACCACCA)(SEQ ID NO：196)扩增UK398启动子。pRLM257(SEQ ID NO：153)为USP启动子的Gateway进入载体。使用pRMW9、pRMW31和pRLM257产生用于植物转化的二元载体。通过将三个含有启动子、目的基因、终止子和一个目的载体的进入载体在LR反应(英俊(Invitrogen)#K591-10)中组合，经由多位点Gateway克隆构建了九个二元表达载体(表8)。通过限制性酶消化和测序确认最终的二元载体。
表8.用于在拟南芥中表达ta-siRNA/PDS的二元载体
  二元载体   5’进入载体(启动子)   目的基因载体   3’进入载体(终止子)   最终载体
  pRSM1(SEQID NO：177)   pRMW31(SEQ ID NO：152)(拟南芥属pUK398启动子)   pRMW23(SEQ ID NO：40)(TAS1/PDS2)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ IDNO：174)
  pRSM2(SEQID NO：178)   pRMW31(SEQ ID NO：152)(拟南芥属pUK398启动子)   pRMW24(SEQ ID NO：41)(TAS1/PDS4)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ IDNO：174)
  pRSM3(SEQID NO：179)   pRMW31(SEQ ID NO：152)(拟南芥属pUK398启动子)   pRMW27(SEQ ID NO：43)(TAS1/PDS1)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  pRSM4(SEQID NO：180)   pRMW31(SEQ ID NO：152)(拟南芥属pUK398启动子)   PRMW39(SEQ ID NO：176)(TAS1/PDS3)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  pRSM5(SEQID NO：181)   pRMW9(SEQID NO：30)(欧芹pUbi4-2启动子)   pRMW23(SEQ ID NO：40)(TAS1/PDS2)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  PRSM6(SEQID NO：182)   pRMW9(SEQID NO：30)(欧芹pUbi4-2启动子)   pRMW24(SEQ ID NO：41)(TAS1/PDS4)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  PRSM7(SEQID NO：183)   pRMW9(SEQID NO：30)(欧芹pUbi4-2启动子)   pRMW27(SEQ ID NO：43)(TAS1/PDS1)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  PRSM8(SEQID NO：184)   pRMW9(SEQID NO：30)(欧芹pUbi4-2启动子)   PRMW39(SEQ ID NO：176)(TAS1/PDS3)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  PRMW111(SEQ ID NO：185)   pRLM257(SEQ ID NO：153)(pUSP启动子)   PRMW39(SEQ ID NO：176)(TAS1/PDS3)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
注意：在该表中，欧芹泛素启动子(Pc.ubi)是指欧芹pUbi4-2。
这些二元载体被转化进野生型拟南芥Columbia-0和拟南芥突变体sgs3-12或rdr6-14中(使用花浸染法(Weigel和Glazebrook，Arabidopsis.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002))。收获除pMW111转基因系外的所有T1种子，表面灭菌并置于萌发培养基A-MS-007(补充有10μg/mL膦丝菌素、500μg/mL cefotaximine和2μg/mL苯菌灵的1/2MS培养基、3％蔗糖、0.5g/L MES)上。在萌发培养基上于4℃冷处理48小时后，将种子在Percival培养箱中于22℃下12小时光/12小时暗培养。在Percival培养箱中选择培养基上生长7天后，观察到具有不同程度光漂白表型(其为在植物中敲除或下调PDS基因的典型表型)的幼苗。这些表型持续发展，直到植物成熟。光漂白表型被分为4类：白色(W)、淡绿(PG)、主要为绿色(MG)和绿色(G)。表9概括了3周龄转基因植物中的表型。具有非常严重的光漂白表型的一些幼苗在发芽后7天停止生长，它们在下表中包括在白色表型中。
表9.显示光漂白表型的TAS1/PDS转基因植物的百分比
Figure A20068003461901231
注意：对各数据点而言，分析了13-68株植物。
来自表9的数据指出，靶向PDS mRNA不同区域的所有四个改造的ta-siRNA/PDS构建体均能够引起光漂白表型。当植物PDS基因高度保守的编码区被改造的ta-siRNA(即ta-siRNA/PDS2和ta-siRNA/PDS3)靶向时，表达这类ta-siRNA的大部分转基因植物显示最严重的表型(即白色)。可能靶向保守区的改造的ta-siRNA与靶向目的基因其它区域相比，对基因沉默具有更强的作用。
已经显示RDR6和SGS3基因是ta-siRNA生物发生所需的。当ta-siRNA/PDS构建体被转化进rdr6-14或sgs3-12突变体植物中时，没有转基因植物显示光漂白表型。该结果指出在野生型背景下，光漂白表型事实上是由靶向PDS的改造的ta-siRNA引起的。
还进行了Q-RT-PCR分析来检测转基因植物中的PDS mRNA水平，并使用拟南芥属GAPDH(AY039539)和肌动蛋白2(NM112764)基因表达作为数据分析的内源对照。
使用的引物和探针为：
PDS正向引物MW-P83F(TTGGAGAACTTGGGATCAATG)(SEQID NO：211)、PDS 反向引物MW-P84R(GGCATAGCAAAAATCATGGAG)(SEQ ID NO：212)、PDS Taqman探针#86(GCAGTGGA)(SEQ ID NO：214)，来自罗切应用科学(RocheApplied Science)Q-RT-PCR通用探针文库(货号04689119001)；
GAPDH正向引物MW-P71F(TCGAGGGAACAGGAGTGTTT)(SEQ ID NO：197)、GAPDH反向引物MW-P72R(CTCCGGCTTGGATATGCTT)(SEQ ID NO：198)、GAPDH taqman探针#68(AGGAGCAG)(SEQ ID NO：207)，来自罗切应用科学(RocheApplied Science)Q-RT-PCR通用探针文库(货号04688678001)；
肌动蛋白2正向引物MW-P67F(TCCTTGTACGCCAGTGGTC)(SEQ ID NO：199)、肌动蛋白2反向引物MW-P68R(CACGTCCAGCAAGGTCAAG)(SQE ID NO：200)、肌动蛋白2Taqman探针#88(CATCCTCC)(SQE ID NO：208)，来自罗切应用科学(RocheApplied Science)Q-RT-PCR通用探针文库(货号04689135001)
使用Trizol试剂(英俊(Invitrogen)，#15596-026)从植物中纯化总RNA。使用15ng总RNA用于反转录反应(15μL)，该反应使用反向引物和根据制造商方案使用MultiScripe反转录酶(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)，#4139983)。反转录反应的条件为：16℃30分钟、42℃30分钟和85℃5分钟。使用ABI 7900和2×Universal Taqman Master混合物(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，#4324018)进行实时PCR。作为模板，在20μL PCR反应中使用15μL RT反应中的1.33μL。PCR反应的条件为：95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃60秒进行40个循环。表10和11显示在带有ta-siRNA/PDS构建体的转基因植物中，对内源PDS基因表达水平的Q-RT-PCR分析的结果。
表10.来自5周龄转基因植物(其带有改造的ta-siRNA/PDS)的PDSmRNA的Q-RT-PCR分析
注意：针对拟南芥属GAPDH表达将PDS表达标准化。
如表10中所示，表达改造的ta-siRNA(TAS1a/PDS1)的转基因植物与野生型Col-0植物和表达野生型ta-siRNA(TAS1a)的转基因植物相比，具有显著降低的PDS mRNA水平。另外，转基因植物中ta-siRNA/PDS对PDS表达的降低与光漂白表型的严重度相关，即最低的PDS水平在白色植物(约12％的Col-0PDS水平和5％的野生型TAS1转基因)中检测到，最高的PDS水平在绿色植物(63％的Col-0植物和25％的野生型TAS1转基因植物)中检测到。
表11.带有改造的ta-siRNA/PDS的7周龄转基因植物的PDSQ-RT-PCR分析
Figure A20068003461901261
注意：针对拟南芥属GAPDH表达将PDS表达标准化
如表11中所示，在Col-0遗传背景下，在带有TAS1a/PDS2的转基因植物中，PDS mRNA水平也被显著降低，其中最低的PDS mRNA水平在白色植物(0.23％的Col-0)中，最高的水平在绿色植物中(57％的Col-0)。然而，带有相同转基因但是处于rdr6-14背景下的转基因植物中，PDS mRNA水平未被降低。与表10一起，这些结果指示在带有靶向PDS mRNA不同区域(即PDS1或PDS2)的改造的ta-siRNA的转基因植物中，PDS mRNA水平被显著降低。另外，这类降低依赖于功能性的RDR6，这与RDR6在ta-siRNA生产中的作用一致。
为了确认PDS ta-siRNA在TAS1a/PDS1植物中被生产，进行实时PCR方法，其为miRNA检测方案(Shi和Chiang，2005Biotechniques 39：519-25)的修饰。来自表10中12种植物每一株的4μg总RNA在H2O中被稀释到45μL。用DNase(无DNA试剂盒，安宾(Ambion)，货号(cat#)1906)根据制造商方案处理所述RNA。经Dnase处理的RNA的最终回收体积为每个45μL。用大肠杆菌聚(A)聚合酶I(E-PAP)使用安宾(Ambion)的聚(A)加尾试剂盒(货号1350)向经Dnase处理的RNA添加聚(A)尾。对每份45μL经DNase处理的RNA，添加11μL H2O、20μL的5×E-PAP缓冲液、10μL的25mM MnCl2、10μL的10mM ATP，和4μL的E-PAP酶，并将反应在37℃孵育1小时。使用来自安宾(Ambion)的Megascript RNAi试剂盒(货号1626)的试剂对聚(A)加尾的RNA反应进行柱纯化。对每100μL的聚(A)尾反应，加入50μL的10×结合缓冲液、100μL的H2O和250μL的100％ETOH，并将该混合物转移至置于收集管中的柱体中。在10,000×g将柱体离心2分钟，然后用500μL的2×洗涤缓冲液洗涤两次。用100μL的预热到95℃的H2O回收RNA。通过反转录使用英俊(Invitrogen)的ReverseTranscriptase III试剂盒(货号18080-051)向聚(A)加尾的RNA添加3’衔接序列。向8μL的每聚(A)加尾的RNA中加入1μL JD-dT 77引物：((5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTCCACCACCATAGGTTTTTTTTTTTTVN-3’，，V＝A、C或G，N＝A、C、G或T)(SEQ ID NO：205)和1μL 10mM dNTP。将这些混合物在65℃孵育5分钟，然后置于冰上。向每份混合物添加2μL10×RT缓冲液、4μL 25mM MgCl2、2μL 0.1M DTT、1μL RNaseOUT和1μL Superscript III RT。反应在42℃孵育1小时，通过在85℃孵育5分钟终止反应，然后将反应置于冰上。然后每份反应中加入60μLH2O。
检测PDS ta-siRNA的实时PCR在96孔PCR平板中如下进行。每个反应含有1μL反转录的RNA、6.6μL H2O、10μL Taqman PCR Master混合物(ABI货号4324-018)、1μL与3’衔接序列的一部分互补的反向引物JD-Rev#77(5’GCGAGCACAGAATTAATAC 3’)(SEQ ID NO：209)、0.4-ABI Taqman探针Human#77(5’-GGTGGTGG-3’，锁定的核酸)(SEQ  ID  NO：206)和1μL  正向寡聚物MW-P92(5’-ATTCATTCTTGTCTTAAGCGC-3’)(SEQ ID NO：201)或MW-P99(5’-GAAAGTGACTACATCGGGGAA-3’)(SEQ ID NO：202)。MW-P92最3’端的16个核苷酸与PDS121ntta-siRNA的碱基1-16相同，MW-P99与拟南芥属miR166相同并用作实验的阳性对照。用ABI 7000使用参数5分钟95℃，(15秒95℃、1分钟60℃)40个循环进行实时PCR。使用Ct值计算，将每株植物的PDS ta-siRNA的相对量针对miR166标准化。
表12.转基因植物中ta-siRNA/PDS的相对量。
Figure A20068003461901281
表12显示仅从带有改造的ta-siRNA/PDS的转基因植物中检测到PDS ta-siRNA，在带有对照载体(即没有改造的ta-siRNA的野生型TAS1基因)的转基因植物和Col-0野生型拟南芥中未检测到。另外，PDSta-siRNA的数量与表型的程度和PDS基因的减少直接相关，即ta-siRNA/PDS产生得越多，则PDS mRNA减少得越多且转基因植物中光漂白表型越严重。总之，我们的数据证明改造miR173-指导的ta-siRNA下调了目的基因的表达。
实施例6：改造拟南芥属miR390调节的ta-siRNA At3g17185(TAS3)， 用于下调拟南芥植物中PDS基因的表达
实施例4中描述的相同ta-siRNA At3g17185(TAS3)被改造为靶向拟南芥属内源PDS基因(登录号#AF360196)。21-nt ta-siRNA相5’D7(+)和5’D8(+)被与拟南芥PDS基因编码区同源的21-nt序列(PDS2、PDS3和PDS4，参阅实施例5，表7)替换。这三个构建体被用作产生用于植物转化的二元载体的目的基因Gateway进入载体(表13)。TAS3/PDS表示转基因(其具有靶向PDS的改造的ta-siRNA相)，TAS3/PDS2、TAS3/PDS3和TAS3/PDS4指定要被靶向的PDS mRNA区域，即PDS2、PDS3和PDS4。
表13.含有改造的ta-siRNA(其靶向PDS mRNA)的Gateway进入载体
 构建体名称  改造的5’D7(+)序列   改造的5’D8(+)序列
 pRMW51(SEQ ID NO：186)  ttcctgaagaaaccggttcaa(PDS2)(靶向PDS 987-1007)   ttcctgaagaaaccggttcaa(PDS2)(靶向PDS 987-1007)
 pRMW52(SEQ ID NO：187)  ttacaagttaaggacatgtcg(PDS4)(靶向PDS 1394-1414)   ttacaagttaaggacatgtcg(PDS4)(靶向PDS 1394-1414)
 pRMW109(SEQ ID NO：188)  tcatatgtgttcttcagtttt(PDS3)(靶向PDS 1331-1351)   tcatatgtgttcttcagtttt(PDS3)(靶向PDS 1331-1351)
如实施例5中所述，Pc.Ubi、UK398和USP启动子被用于在拟南芥中表达TAS3/PDS。通过Gateway多位点克隆产生了六个二元载体(表14)。通过限制性酶分析和测序确认这些最终的二元表达载体。
表14.用于在拟南芥中表达TAS3/PDS的二元载体
  二元载体   5’进入载体(启动子)   目的基因载体   3’进入载体(终止子)   目的载体
  pRMW80(SEQ ID NO：189)   pRMW9(SEQID NO：30)(欧芹pUbi4-2启动子)   pRMW51(SEQ ID NO：186)(TAS3/PDS2)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  pRMW81(SEQ ID NO：190)   pRMW9(SEQID NO：30)(欧芹pUbi4-2启   pRMW52(SEQ ID NO：187)(TAS3/PDS4)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  动子)   子)
  pRMW82(SEQ ID NO：191)   pRMW31(SEQ ID NO：152)(拟南芥属pUK398启动子)   pRMW51(SEQ ID NO：186)(TAS3/PDS2)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  pRMW83(SEQ ID NO：192)   pRMW31(SEQ ID NO：152)(拟南芥属pUK398启动子)   pRMW52(SEQ ID NO：187)(TAS3/PDS4)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  PRMW110(SEQ ID NO：193)   pRMW9(SEQID NO：30)(欧芹pUbi4-2启动子)   pRMW109(SEQ ID NO：188)(TAS3/PDS3)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
  PRMW112(SEQ ID NO：194)   pRLM257(SEQ ID NO：153)(pUSP启动子)   pRMW109(SEQ ID NO：188)(TAS3/PDS3)   pRLM293(SEQ ID NO：35)(NOS终止子)   pRLM402(SEQ ID NO：174)
注意：在该表中，欧芹泛素启动子(Pc.ubi)是指欧芹pUbi4-2。
使用花浸染法(Weigel和Glazebrook，Arabidopsis.A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002))将这些改造的TAS3/PDS转化进野生型拟南芥Col-0和拟南芥突变体sgs3-12或rdr6-14中。收获除pMW110和pRMW112转基因系外的所有T1种子，表面灭菌并置于萌发培养基A-MS-007(补充有10μg/mL膦丝菌素、500μg/mLCefotaximine和2μg/mL苯菌灵的1/2MS培养基、3％蔗糖、0.5g/L MES)上。在萌发培养基上于4℃冷处理48小时后，将种子在Percival培养箱中于22℃下12小时光/12小时暗培养。在Percival培养箱中选择培养基上生长7-8天后，观察到具有光漂白表型(其为在植物中敲除或下调PDS基因的典型表型)的幼苗。这些光漂白表型似乎在更幼小的植物中更强。植物生长时其逐渐减弱。使用与实施例5所述相似的体系，我们将TAS3/PDS表型分为3类：淡绿(PG)、主要为绿色(MG)和绿色(G)。表12总结了18天龄转基因植物中的表型。
表15.显示光漂白表型的TAS3/PDS转基因植物的百分比
Figure A20068003461901321
注意：对于各构建体而言，用于分析表型的植物数量从15-37株植物变化，取决于转化效率。
来自该表的数据指示TAS3/PDS2和TAS3/PDS4均能够产生PDS相关的光漂白表型。与实施例5所述的TAS1/PDS实验中的数据一致，与PDS4相比，PDS2ta-siRNA显示在拟南芥中对沉默PDS基因具有更强的作用。
为了证实光漂白表型是否由靶向内源PDS基因的改造的ta-siRNA引起，我们还将TAS3/PDS转化进rdr6-14或sgs3-12突变体植物中，其中ta-siRNA生物发生途径由于RDR6或SGS3中的突变而被破坏。在sgs3-12或rdr6-14突变体中未观察到光漂白表型。该结果指示光漂白表象由靶向内源PDS基因的改造的ta-siRNA引起。
如实施例5中所述，内源PDS基因在转基因植物中的表达通过使用Q-RT-PCR来测量。表16显示Col-0遗传背景下的TAS3/PDS转基因植物中，PDS mRNA水平显著降低，但是在rdr6-14背景下则不降低。该结果指示内源PDS基因表达的降低通过ta-siRNA生物发生途径达成。另外，PDS基因表达降低的程度与光漂白表型相关。淡绿色植物中平均PDS基因表达水平为Col-0植物的约3.5％，在主要为绿色的植物中为Col-0植物的约10％。
表16.带有TAS3/PDS2的8周龄转基因植物的PDS Q-RT-PCR分析(针对拟南芥属肌动蛋白2被标准化)
  表型   遗传背景   转基因事件  重复1  重复2   平均   标准偏差
  淡绿   Col-0   MW80-4   0.01   0.00   0.00   0.01
  淡绿   Col-0   MW80-7   0.02   0.00   0.01   0.01
  淡绿   Col-0   MW80-10   0.00   0.00   0.00   0.00
  主要为绿色   Col-0   MW80-8   0.00   0.00   0.00   0.00
  主要为绿色   Col-0   MW80-5   0.11   0.00   0.06   0.08
  主要为绿色   Col-0   MW80-6   0.02   0.00   0.01   0.01
  绿色   rdr6   MW80-1   0.08   0.00   0.04   0.06
  绿色   rdr6   MW80-2   0.17   0.06   0.12   0.08
  绿色   Col-0   MW82-1   0.26   0.02   0.14   0.17
  绿色   Col-0   MW82-2   0.06   0.00   0.03   0.04
  绿色   Col-0   MW82-7   0.05   0.02   0.04   0.02
  绿色   Col-0   MW82-8   0.05   0.01   0.03   0.03
  绿色   Col-0   MW82-9   0.23   0.19   0.21   0.02
  绿色   rdr6   MW82-1   0.35   0.30   0.33   0.03
  绿色   rdr6   MW82-2   0.31   0.27   0.29   0.03
  绿色   Col-0   1   0.28   0.20   0.24   0.06
  绿色   Col-0   2   0.16   0.17   0.17   0.01
  绿色   rdr6   1   0.24   0.20   0.22   0.03
  绿色   rdr6   2   0.18   0.15   0.17   0.02
注意：MW80转基因植物是用pRMW80转化的。
MW82转基因植物是用pRMW82转化的。
除以下例外以外，基本如实施例5，使用实时PCR方法在植物MW80-4、MW80-7、MW80-10、MW80-8、MW80-5和MW80-6中检测PDS2ta-siRNA。起始材料为每个样品3μg总RNA，其在H2O中稀释到45lμL。如实施例5中所述对RNA样品进行Dnase处理和聚(A)加尾。使用来自斯莱特因(Statagene)的Miracle miRNA分离试剂盒(货号400815)的试剂纯化聚(A)加尾的反应。向每份100μL的聚(A)加尾反应中添加260μL的裂解缓冲液和40μL的2M乙酸钠。加入933μL 100％ETOH并将混合物转移至收集管中的离心杯上，并在16,000×g离心30秒将聚(A)加尾的RNA结合在离心杯上。用600μL低盐洗涤缓冲液将离心杯洗涤3次。用100μL预热到60℃的H2O洗脱聚(A)加尾的RNA。用JD-dT#77引物(SEQ ID NO：205)(实施例5)使用英俊(Invitrogen)的SuperScript IIIFirst-Strand Synthesis SuperMix(货号18080-400)如下反转录纯化的聚(A)加尾的RNA。向8μL纯化的聚(A)加尾的RNA中加入1μL JD-dT#77引物(50μM)和1μL退火缓冲液，并将混合物在65℃加热5分钟然后置于冰上。向混合物中加入10μL 2×First Strand Reaction Mix和2μLSuperscript III/RNaseOUT酶混合物。反应在42℃下孵育1小时，在85℃7分钟终止反应。
如实施例5中所述通过实时PCR检测PDS2ta-siRNA，除了使用的正向寡聚物为MW-P129(5’-TTCAATTCCTGAAGAAACCGG-3’)(SEQ ID：203)和MW-P99(GAAAGTGACTACATCGGGGAA)(SEQ ID NO：202)(实施例5)。MW-P129最3’端的16个核苷酸与PDS121nt ta-siRNA的碱基1-16相同，MW-P99与拟南芥属miR166相同并用作实验的阳性对照。用ABI 7000使用参数5分钟95℃(15秒95℃、1分钟60℃)40个循环进行实时PCR。使用Ct值计算，将每个植物的PDS2ta-siRNA的相对量针对miR166标准化。
表17.带有pRMW80的TAS3/PDS2转基因植物中PDS2ta-siRNA的相对量。
  表型   转基因事件   PDS2ta-siRNA的相对量
  淡绿   MW80-4   16.9
  淡绿   MW80-7   6.8
  淡绿   MW80-10   3.8
  主要为绿色   MW80-8   7.0
  主要为绿色   MW80-5   1.0
  主要为绿色   MW80-6   1.7
表17中的结果证实TAS3/PDS2转基因植物中ta-siRNA/PDS的产生。总之，我们的数据证明改造miR390指导的ta-siRNA下调了目的基因的表达。
实施例7：改造玉米ta-siRNA基因，以调节玉米中DsRed2报道基因的表达
合成具有BamHI位点(GGATCC)和PstI位点(CTGCAG)(分别位于5’和3’端)的完整玉米ta-siRNA初级转录物或前-ta-siRNA/miR390(SEQ IDNO：1，见实施例1)。为了便于对换(swapping)含有改造的21-nt相的片段，通过将TCTGGT改变为TCTAGA在D8(+)相上游创建XbaI位点(TCTAGA)。通过BamHI和PstI消化释放前-ta-siRNA/miR390，并将其在BamHI-PstI位点亚克隆进pRLM269中，产生pRPR57(SEQ ID NO：44)。pRPR57具有两个重组位点用于随后的Gateway多位点克隆，attL1位点接近BamHI位点，attL2位点接近PstI位点。
合成侧翼为XbaI和PstI位点的两个对换DNA片段。第一个片段在XbaI和Pst I之间含有与pRPR57(SEQ ID NO：44)相同的序列，除了5’D7(+)和5’D8(+)序列被改变为5’D7(+)dsRed  2-2(5’-ttgtagatgaagcagccgtcc 3’；SEQ ID NO：45)和5’D8(+)dsRed 2-2(5’ttgtagatgaagcagccgtcc 3’；SEQ ID NO：45)。XbaI-PstI片段被pRPR57(SEQ ID NO：44)中的XbaI-PstI片段替换，得到pRPR58(SEQ ID NO：46)。第二个片段在XbaI和PstI之间含有与pRPR57(SEQ ID NO：44)相同的序列，除了5’D7(+)和5’D8(+)序列被改变为5’D7(+)dsRed 2-1(5’-ttgaagcgcatgaactcggtg-3’；SEQ ID NO：47)和5’D8(+)dsRed 2-2(5’-ttgtagatgaagcagccgtcc-3’；SE Q ID NO：45)。XbaI-PstI片段被pRPR57(SEQ ID NO：44)中的XbaI-PstI片段替换，得到pRPR59(SEQ ID NO：48)。XbaI-PstI片段与pRPR57(SEQ ID NO：44)中的XbaI-PstI片段对换，得到pRPR59(SEQ ID NO：48)。pRPR58(SEQ ID NO：46)中改造的5’D7(+)和5’D8(+)靶向在位置342-362bp的DsRed2，而pRPR59(SEQ IDNO：48)中改造的5’D7(+)和5’D8(+)分别靶向DsRed2的位置26-44bp和342-362bp。
按照推荐的方案(英俊(Invitrogen)货号52884)通过将三个进入载体和一个目的载体在LR反应中结合，经由多位点Gateway克隆构建二元表达载体。最终二元载体的质量通过限制性酶消化、PCR、测序或本领域任何合适的分子生物学工具确定。使用的进入和目的载体为：
·pRLM283(SEQ ID NO：49)含有侧翼为两个重组位点attB4和attB1的甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子。
·pRLM336(SEQ ID NO：50)含有侧翼为两个重组位点attB4和attB1的Glb1启动子。
·pRPR56(SEQ ID NO：51)含有稻叶绿体蛋白质12-样(Os.CP12)启动子和来自金属硫蛋白基因的第一个内含子，其侧翼为重组位点attL4和attR1。
·pRLM293(SEQ ID NO：35)含有侧翼为重组位点attB2和attB3的NOS终止子。
·pRLM217(SEQ ID NO：52)是含有以下成分且侧翼为重组位点attL4和attR1的目的载体。玉米泛素和内含子启动子，大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]作为选择标记，和章鱼碱合酶3终止子。
pRLM373(SEQ ID NO：53)通过pRLM283、pRPR57、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向预测的编码生长素应答因子(ARF4)的内源基因。
pRLM376(SEQ ID NO：54)通过pRLM283、pRPR58、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向DsRed2(BD生物科学公司(BD Biosciences)，货号632404)报道基因(位置341-362bp)。
pRLM379(SEQ ID NO：55)通过pRLM283、pRPR59、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向DsRed2报道基因(分别为位置26-44bp和341-362bp)。
pRLM374(SEQ ID NO：56)通过pRLM336、pRPR57、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于玉米(玉米(Zea mays)；Zm)Glb1启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向编码ARF4的内源基因。
pRLM377(SEQ ID NO：57)通过pRLM336、pRPR58、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于玉米Glb1启动子和NOS终止子的调控下。Glb1启动子仅在玉米胚中有活性。改造的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向胚中的DsRed2报道基因(位置341-362bp)。
pRLM380(SEQ ID NO：58)通过pRLM336、pRPR59、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于玉米球蛋白1(Glb1)启动子和NOS终止子的调控下。Glb1启动子仅在玉米胚中有活性。改造的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向胚中的DsRed2报道基因(分别为位置26-44bp和341-362bp)。
pRLM375(SEQ ID NO：59)通过pRPR56、pRPR57、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于具有稻金属硫蛋白(Os.MET)内含子1的Os.CP12启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向编码ARF4的内源基因。
pRLM378(SEQ ID NO：60)通过pBPSPR056、pRPR58、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于Os.CP12启动子和NOS终止子的调控下。Os.CP12启动子仅在玉米叶中有活性。改造的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向叶中的DsRed2报道基因(位置341-362bp)。
pRLM381(SEQ ID NO：61)通过pRPR56、pRPR59、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于Os.CP12启动子和NOS终止子的调控下。Os.CP12启动子仅在玉米叶中有活性。改造的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向叶中的DsRed2报道基因(分别为位置26-44bp和341-362bp)。
所有的二元载体被在此转化进入带有RLM185(SEQ ID NO：111)的转基因纯合玉米株系中，其中dsRed表达位于ScBV(甘蔗杆状病毒)组成型启动子的调控下。
为了测定改造的ta-siRNA对dsRed表达的作用，从带有以下组构建体之一的选定的转基因事件中收集叶样品：(1)RLM185和RLM373、(2)RLM185和RLM376或(3)RLM 185和RLM379。RLM373被用作阴性对照。使用成像分析仪器Typhoon 9400(GE，Piscataway，NJ)在叶中检查到dsRed荧光时，在含有ta-siRNA构建体的转基因事件中未观察到dsRed表达的显著降低。该结果与miRNA谱数据(miR390在玉米叶中不表达)一致。因此，ta-siRNA/dsRed不能被产生从而下调dsRed表达。
实施例8：改造玉米ta-siRNA基因，以调节玉米八氢番茄红素去饱和酶基因的表达
使用与实施例5中所述相似的策略来制造含有改造的ta-siRNA的二元表达载体，所述改造的ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶mRNA(登录号L39266)。例如，可以合成侧翼为XbaI和PstI位点的一个对换DNA片段，pRPR34(SEQ ID NO：62)。制造了用于Gateway克隆的两个进入载体。PRPR21(SEQ ID NO：141)与pRPR57相同，除了5’D7(+)和5’D8(+)相序列均被PDS-3(5’-TAGATAGAAACCTTCGATAGG-3’；SEQ ID NO：63)替换。PRPR22(SEQ ID NO：65)与pRPR57相同，除了天然的5’D7(+)序列被改变为5’D7(+)PDS-5(5’-ttcacggcaaagcttgtatag-3’；SEQ ID NO：64)，天然的5’D8(+)序列被改变为5’D8(+)PDS-3(5’-TAGATAGAAACCTTCGATAGG-3’；SEQ  ID  NO：63)。Ta-siRNA/PDS-5靶向玉米PDS mRNA位置147-167。Ta-siRNA/PDS-3靶向玉米PDS mRNA位置1585-1605。
PRLM423(SEQ ID NO：142)通过pRLM283、pRPR21、pRLM293和pRLM217的GateWay多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶。
PRLM424(SEQ ID NO：66)通过pRLM283、pRPR22、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶。
PRLM427(SEQ ID NO：143)通过pRPR56、pRPR21、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于Os.CP12启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向叶的玉米八氢番茄红素去饱和酶。
PRLM428(SEQ ID NO：67)通过pRPR56、pRPR22、pRLM293和pRLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于Os.CP12启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向叶的玉米八氢番茄红素去饱和酶。
构建了与RPR57相同的一系列质粒，除了系列中的每个质粒含有一个玉米(Zm)前-ta-siRNA/miR390相(5’D2(+)、5’D3(+)、5’D4(+)、5’D5(+)、5’D6(+)、5’D7(+)或5’D8(+))被替换为Zm PDS-3。每个相替换通过PCR使用RPR57作为模板产生，然后将RPR57中XbaI和KpnI之间或HinDIII和KpnI之间的序列与PCR产物中相似区域对换(见表18)。
表18.用于Gateway克隆的进入载体
构建体名称   用序列替换的Zm前-ta-siRNA/miR390相   用下述序列替换相序列  用分别的PCR产物对换RPR57区
  RJM128(SEQ  IDNO：114)   5’D2(+)(5’-ccagccttctgcatccaccta-3’)   Zm PDS-3(SEQID NO：63) XbaI-KpnI
  RJM129(SEQ  IDNO：115)   5’D3(+)(5’-gtcccgatattgccgtgtttg-3’)   Zm PDS-3(SEQID NO：63) XbaI-KpnI
  RJM130(SEQ IDNO：116)   5’D4(+)(5’-ttcccactacatgcaggatca-3’)   Zm PDS-3(SEQID NO：63) XbaI-KpnI
  RJM131(SEQ IDNO：117)   5’D5(+)(5’-tcgcatcccttgtttccttct-3’)   Zm PDS-3(SEQID NO：63) HinDIII-KpnI
  RJM132(SEQ IDNO：118)   5’D6(+)(5’-cactctgtgtctgcatccttc-3’)   Zm PDS-3(SEQID NO：63) XbaI-KpnI
  RJM133(SEQ IDNO：119)   5’D7(+)(5’-ttcttgaccttgtaaggctct-3’)   Zm PDS-3(SEQID NO：63) HinDIII-KpnI
  RJM134(SEQ IDNO：120)   5’D8(+)(5’-ttcttgaccttgtaaggcctc-3’)   Zm PDS-3(SEQID NO：63) XbaI-KpnI
二元载体通过Gateway多位点克隆从RJM128、RJM129、RJM130、RJM131、RJM132、RJM133和RJM134制造而来。
RJM145(SEQ ID NO：126)通过RLM283、RJM128、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D2(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM146(SEQ ID NO：127)通过RLM283、RJM129、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D3(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM147(SEQ ID NO：128)通过RLM283、RJM130、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D4(+)taa-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM148(SEQ ID NO：129)通过RLM283、RJM131、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D5(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM149(SEQ ID NO：130)通过RLM283、RJM132、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D6(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM150(SEQ ID NO：131)通过RLM283、RJM133、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM151(SEQ ID NO：132)通过RLM283、RJM134、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM137(SEQ ID NO：133)与RPR57相同，除了Zm前-ta-siRNA/miR390(SEQ ID？？？)的147bp 5’D2(+)到5’D8(+)被来自玉米八氢番茄红素去饱和酶编码序列(SEQ ID？？？)的147bp序列替换。使用ZmPDS1cDNA和RPR57作为模板，使用PCR产生147bp D2-D8相的替换。通过将RPR57中XbaI和KpnI限制性位点之间的序列用该PCR产物中类似的序列对换构建RJM137。
二元载体RJM154(SEQ ID NO：134)通过RLM283、RJM137、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D2(+)到5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶mRNA(位置1522-1668)。
为了普遍地表达miR390，通过从头合成和随后的分子克隆，使用玉米(Zm)miR390(5’aagctcaggagggatagcgcc 3’；SEQ ID NO：144)和miR390star(5’ggcgctatctatcctgagctc 3’；SEQ ID NO：145)序列分别替换玉米miR166前体(SEQ ID NO：146)中的miR166和miR166star。pRCB10(SEQ ID NO：147)通过Gateway多位点克隆构建，其中改造的Zm miR390的表达位于ScBV启动子和NOS终止子调控下。
pRLM423(SEQ ID NO：142)单独或与RCB10一起被转化入野生型玉米中。对共转化而言，将用RLM423转染的农杆菌与用RCB10转染的农杆菌以1∶1的比例混合，混合的农杆菌的终浓度为OD600是1.0。pRLM423具有D-丝氨酸脱水酶(dsdA)作为用于玉米转化的可选择标记基因。RCB10包含乙酰羟酸合酶(AHAS)作为可选择的标记基因。当愈伤组织被置于选择培养基和随后的再生培养基上时，带有RLM423的推定的转基因愈伤组织不能再生(见表19)，而带有对照载体RLM373(即无ta-siRNA替换)的转基因事件显示正常的生长和再生。
表19：RLM423和RCB10转基因事件的再生
构建体 对dsdAa培养基选择   对dsdA和AHASb培养基选择 对AHASc培养基选择 能够再生的愈伤组织数量 检查的愈伤组织数量
  RLM423   是   无   ～100
  RLM423和RCB10   是   无   ～40
  RLM423和RCB10 是 无 ～125
  RLM423和RCB10   是   30％   ～40
a10mM(终浓度)D-丝氨酸、b10mM(终浓度)D-丝氨酸和500nM(终浓度)Pursuit、c500nM(终浓度)Pursuit
数据指示miR390-指导的ta-PDS siRNA产生抑制了植物再生。这由内源miR390促成，因为只带有RLM423的转基因愈伤组织不能再生。MiR390主要在玉米胚胎发生愈伤组织中表达，其触发了含有RLM423的转基因愈伤组织中的ta-PDS siRNA生产。结果PDS(植物再生的关键基因)在愈伤组织中的表达被下调。转化时PDS在植物再生中的重要作用进一步受到使用除草剂氟啶酮(1-甲基-3-苯基-5-3-(三氟甲基)苯基|-41H|-吡啶酮)下调其表达的实验的支持。当野生型愈伤组织被置于含这类特异靶向PDS的除草剂的培养基上时，再生率随着除草剂浓度提高(0、20nM、40nM、50nM、75nM和100nM)而下降。在75nM和以上，再生被完全抑制。
实施例9：改造玉米ta-siRNA初级转录物中的miR390靶位点
这是为了测试玉米ta-siRNA初级转录物中的miR390结合位点被另一miRNA互补位点替换后，改造的ta-siRNA初级转录物仍然能够起始ta-siRNA以下调目的基因的表达。
使用与实施例5所述相似的策略制造二元表达载体。合成侧翼为XbaI和PstI位点的两个对换DNA片段。第一个片段pRPR35(SEQ ID NO：68)在XbaI和Pst I之间含有与pBPSPR057(SEQ ID NO：44)相同的序列，除了D7(+)和D8(+)序列被改变为5’D7(+)dsRed 2-25’-ttgtagatgaagcagccgtcc3’和5’D8(+)dsRed 2-2(5’ttgtagatgaagcagccgtcc 3’；SEQ ID NO：45，见实施例7)和miR390结合位点5’3’被替换为miR166结合位点(5’-GGGGAATGAAGCCTGGTCCGA-3’；SEQ  ID  NO：69)；与Zm.miR1665’TCGGACCAGGCTTCATTCCCC3’；SEQ ID NO：70互补。XbaI-PstI片段与pBPSPR057(SEQ ID NO：44，见实施例7)中的XbaI-PstI片段对换，得到pRPR36(SEQ ID NO：71)。第二个片段pRPR37(SEQ IDNO：72)含有与pRPR35相同的序列，除了miR390结合位点被改变为miR167结合位点(5’-ACAGATCATGCTGGCAGCTTCA-3’；SEQ ID NO：73)，其与Zm.miR167(5’-TGAAGCTGCCAGCATGATCTGT-3’；SEQ IDNO：74)互补。pRPR37(SEQ ID NO：72)的XbaI-PstI片段与pRPR57(SEQID NO：44)中的XbaI-PstI片段对换，得到pRPR38(SEQ ID NO：75)。
pRPR39(SEQ ID NO：76)通过pRPR283、pRPR36、pRPR293和pRPR217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。因为Zm.miR166前体仅在叶和雄花穗中表达，所以改造的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA在这些组织中产生并靶向叶和雄花穗中的DsRed2基因(位置342-362)表达。
pRPR47(SEQ ID NO：77)通过pRPR283、pRPR38、pRPR293和pBPSLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。因为Zm.miR167前体主要在种子中表达，所以改造的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA在种子中产生并靶向种子中的DsRed2基因(位置342-362)表达。
许多其它的组织特异性miRNA列于以下的表格(表7、8A、8B和9)和文献与数据库(Zhang等人，(2005)Cell Research 15：336-360)和两个公开网站(http://asrp.cgrb.oregonstate.edu/db/和http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)。克隆和随后的miRNA测序期间，一些miRNA克隆在末端(特别是3’端)显示了不同的核苷酸，其在本文用小写字母表示。miRNA的3’端通常较不重要。
Figure A20068003461901451
Figure A20068003461901461
Figure A20068003461901471
Figure A20068003461901481
Figure A20068003461901501
Figure A20068003461901521
Figure A20068003461901561
ta-siRNA初级转录物中的下游miR390结合位点(5’-CCTTCTATCCCTCCTGAGCTA-3’)被miR156、miR159、miR166和miR172的玉米内源miRNA结合位点替换(表23)。代替靶向dsRed报道基因，具有备选的miRNA结合位点的玉米(Zm)前-ta-siRNA/miR390被修饰，使得天然的5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA被改造的ta-siRNA(其靶向玉米内源八氢番茄红素去饱和酶(PDS))替换。
表23：靶基因中的玉米miRNA结合位点
miRNA结合位点 miRNA结合位点序列   含有miRNA结合位点的玉米mRNA的Genbank登录号   玉米内源mRNA中结合位点的位置
miR156   5’-GTGCTCTCTCTCTTCTGTCAA-3’(SEQ ID NO：148) AJ011619 559-579
miR159   5’-TGGAGCTCCCTTCACTC-CAAG-3’((SEQ ID NO：149) CN844582 601-621
miR166   5’-CTGGGAT-GAAGCCTGGTCCGG-3’((SEQ ID NO：150) AY501430 635-655
miR172   5’-CTGCAGCATCATCAG-GATTCC-3’((SEQ ID NO：151) AY714877 4258-4278
构建与RPR57相同的质粒，除了该系列中的每个质粒含有下游miR390结合位点被miR156、miR159、miR166或miR172结合位点替换，和5’D8(+)相被Zm PDS-3(SEQ ID NO：63)替换，以及5’D7(+)相被ZmPDS-3或Zm PDS-5(SEQ ID NO：64)替换。每个相替换通过PCR使用RLM423或RLM424作为模板产生，然后将RPR57的XbaI与KpnI之间的序列用PCR产物中相似区域替换(表24)。
表24：用于Gateway克隆的进入载体
构建体名称  构建中使用的PCR模板   替换miR390结合位点的miRNA结合位点   5’D7(+)和5’D8(+)相替换
  RJM135((SEQ IDNO：121) RLM423 miR172 5’D7(+)＝Zm PDS-35’D8(+)＝Zm PDS-3
  RJM136((SEQ IDNO：122) RLM424 miR172 5’D7(+)＝Zm PDS-55’D8(+)＝Zm PDS-3
  RJM140((SEQ IDNO：123) RLM423 miR156 5’D7(+)＝Zm PDS-35’D8(+)＝Zm PDS-3
  RJM141((SEQ IDNO：124) RLM423 miR159 5’D7(+)＝Zm PDS-35’D8(+)＝Zm PDS-3
  RJM142((SEQIDNO：125) RLM423 miR166 5’D7(+)＝Zm PDS-35’D8(+)＝Zm PDS-3
二元表达载体通过Gateway多位点克隆从RJM135、RJM136、RJM140、RJM141和RJM142制造而来。
RJM152(SEQ ID NO：213)通过RLM283、RJM135、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM153(SEQ ID NO：135)通过RLM283、RJM136、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605和？？？-？？？)。
RJM156(SEQ ID NO：136)通过RLM283、RJM140、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM157(SEQ ID NO：137)通过RLM283、RJM141、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM158(SEQ ID NO：138)通过RLM283、RJM142、RLM293和RLM217的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
RJM160(SEQ ID NO：139)通过RLM283、RJM140、RLM293和RLM218的Gateway多位点克隆构建。前-ta-siRNA的表达位于ScBV启动子和NOS终止子的调控下。5’D7(+)和5’D8(+)ta-siRNA靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶基因(位置1585-1605)。
实施例10：拟南芥属和玉米中的miR173和miR390谱
通过来自不同植物物种的数据采掘鉴定了编码miR390的DNA序列，所述物种包括拟南芥(SED ID NO：215-216)、甜杨(Populus balsamifera)(SEQ ID NO：217-220)、稻(SED ID NO：221)、芜青(Brassica rapa)(SEQID NO：222)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(SEQ ID NO：223)和玉米(SEQ ID NO：210)。通过DNA序列同源性搜索从内部玉米转录物组数据库中鉴定了玉米miR390前体。其长度为1,119bp并在前体的3’端多聚腺苷酸化。使用测序技术，通过所谓的Hyseq-技术的杂交来表征玉米miR390前体的表达模式。结果指示miR390前体主要在愈伤组织中表达和在种仁中中等水平表达(表25)。
表25：玉米miR390前体的表达模式
  文库名称   文库别名   标准化的克隆分布   相对表达
  AC073   茎   0   0
  AC079   雄花穗   0   0
  AC080   穗R1   0   0
  AC081   种仁R3   0   0
  AC082   叶前花(leaves preflower)   0   0
  AC083   不成熟穗   0   0
  AC084 种仁胚原基   0   0
  AC085 叶种仁填充(leaves kernel fill)   0   0
  AC086 种仁R4   1   0.0910
  AC087 种仁b73   1   0.0910
  AC089 根   0   0
  AC088 穗期的茎   0   0
  AC093 茎.冷   0   0
  AC094 种仁R2   0   0
  AC096 种仁.mo17   0   0
  AC095 种仁R5   0   0
  AC105 愈伤组织agro   2   0.1820
  AC107 愈伤组织   5   0.4550
  AC113 枝条干旱   1   0.0910
  AC118 根干旱   0   0
  AC120 根低氮   0   0
  AC121 枝条低氮   0   0
通过使用由应用生物系统公司(Applied Biosystems)开发的技术和方案(Chen等人，2005Nucleic Acids Research 33：e179)构建MiR390谱。简言之，在16℃30分钟、42℃30分钟和85℃5分钟的条件下，在15μL反转录(RT)反应中使用5ng的总RNA，该反应含有miRNA特异性茎-环RT引物和MultiScribe反转录酶(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，P/N：4319983)。RT反应后，使用miRNA特异引物和探针在95℃10分钟，95℃15秒、60℃60秒共40个循环的循环条件下进行PCR。分析了来自总计13个不同的玉米组织或阶段的总RNA提取物。玉米甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)亚基C被用作在不同组织样品间标准化miRNA表达的内部对照。结果指示在胚胎发生愈伤组织中检测到最高的miR390表达，然后依次是种仁(R3和R4阶段)和胚。MiR390在叶中几乎检测不到。来自miR390前体和成熟形式的表达谱几乎彼此相同(表25和26)。
表26：玉米中的miR390谱
  RNA文库码和组织   重复1   重复2   均值   标准偏差
  AC89(根)   17.86   22.16   20.01   3.04
  AC79(雄花穗)   38.80   36.60   37.70   1.56
  AC94(R2期种仁)   0.03   0.02   0.03   0.01
  AC81(R3期种仁)   399.31   360.76   380.04   27.25
  AC86(R4期种仁)   290.64   253.90   272.27   25.98
  AC95(R5期种仁)   7.36   9.50   8.43   1.51
  AC80(穗)   0.29   0.31   0.30   0.02
  AC82(较低叶)   1.56   1.45   1.51   0.08
  AC85(较高叶)   0.37   0.32   0.34   0.04
  AC118(根，干旱条件)   1.16   1.19   1.18   0.02
  胚胎   76.70   78.46   77.58   1.24
  I型愈伤组织   1033.15   655.39   844.27   267.11
  II型愈伤组织   499.83   369.01   434.42   92.51
上述方法和方案也用于描绘miR173和miR390在不同类型的拟南芥属组织(包括叶、根、茎、花和长角果)中的表达水平。十天龄的拟南芥属幼苗也包括在实验中。如实施例5所述，肌动蛋白2被用作内源对照。表27和表28中的结果指示miR173和miR390都在长角果中最为富集。在花中检测到第二高的表达水平。它们在营养组织中保持低水平，miR173比miR390水平相对较高。
表27：拟南芥属组织中miR173谱(针对拟南芥属肌动蛋白2标准化)。
  组织   重复1   重复2   均值   标准偏差
  叶   243.80   248.03   245.91   3.00
  茎   48.98   49.52   49.25   0.38
  根   263.48   234.43   248.96   20.54
  花   334.10   293.93   314.01   28.41
  长角果   53679.24   49684.78   51682.01   2824.50
  幼苗   138.02   115.02   126.52   16.27
表28：拟南芥属组织中miR390谱(针对拟南芥属肌动蛋白2标准化)。
  组织   重复1   重复2   均值   标准偏差
  叶   101.59   97.79   99.69   2.68
  茎   13.99   12.99   13.49   0.70
  根   33.43   23.60   28.52   6.95
  花   193.66   160.56   177.11   23.40
  长角果   6201.22   49684.78   51682.01   2824.50
  幼苗   138.02   5374.39   5787.80   584.66
实施例11：拟南芥属中改造的TAS1对内源PDS基因表达的组织特 异性下调
为了研究改造的ta-siRNA是否能够以组织特异的方式下调基因表达，我们使用了叶优选的启动子UK398(实施例3)来驱动拟南芥属中TAS1/PDS基因的表达。UK398启动子从拟南芥中分离。使用该启动子的GUS基因表达分析指示其在叶中具有强和普遍的表达，但是在花的一些部分(如萼片和心皮)中也具有弱表达。提取来自T1植物叶和花的总RNA并使用与实施例5所述相同的Q-RT-PCR操作分析PDS水平。使用肌动蛋白2作为内部对照。如表29所示，与野生型植物相比，转基因叶中内源PDS水平降低，但是其在花中大致维持野生型水平。该结果指示受叶优选启动子驱动的改造的TAS1/PDS可下调内源PDS基因，优选在叶中而不在花中。
表29：改造的TAS1/PDS2对内源PDS表达的组织特异性下调(#61植物)。
  RNA样品   重复1   重复2   均值   标准偏差
  #61-1叶   0.70   0.50   0.60   0.14
  #61-2叶   0.10   0.07   0.08   0.02
  #61-3叶   0.07   0.05   0.06   0.01
  Col-0叶   0.45   0.37   0.41   0.05
  Col-0叶   0.45   0.23   0.34   0.16
  #61-1花   0.57   0.52   0.54   0.04
  #61-2花   0.58   0.58   0.58   0.00
  #63-1花   0.50   0.33   0.42   0.12
  Col-0花   0.62   0.51   0.56   0.07
  Col-0花   0.54   0.25   0.40   0.20
使用实时PCR方法(实施例6)在来自植物#61-1、#61-2和#61-3的叶和花组织中进行PDS2ta-siRNA检测。总RNA用DNase处理，加聚(A)尾，并将聚(A)加尾的RNA如(实施例6)中所述反转录。用于PDS2ta-siRNA检测的实时PCR如实施例6所述进行，除了使用正向引物MW-P94(5’-ATTCATTCCTGAAGAAACCGG-3’)(SEQ ID NO：204)和MW-P99(GAAAGTGACTACATCGGGGAA)(SEQ ID NO：202)(实施例5)。MW-P94最3’端的16个核苷酸与PDS221nt ta-siRNA的碱基1-16相同，MW-P99与拟南芥属miR166相同并用作实验的阳性对照。在来自植物61-2和61-3的叶和花组织中可检测到PDS2ta-siRNA，但在植物61-1的叶或组织中检测不到。通过将8μL 61-2叶和花实时PCR产物在15％丙烯酰胺凝胶上电泳、EtBr染色并观察正确尺寸的PCR产物来确认PDS2ta-siRNA检测。如通过EtBr染色评价的，来自花的PDS2ta-siRNA PCR产物的强度大约为叶PCR产物的20％。这提示PDS2-ta-siRNA的生产在花中比叶中低得多，因此花中没有显著的PDS mRNA减少。花中少量PDS2ta-siRNA的检测与UK398启动子在花中的弱活性一致。
来自dsRNA的siRNA通常引起全身的基因沉默，然而这些结果提示改造的ta-siRNA仅在ta-siRNA高水平表达的组织中下调其靶基因的表达。
下表中同一行中的构建体名称可以互换并涉及相同的序列：
Figure A20068003461901641

Claims (37)

1.沉默或减弱至少一种靶基因表达的方法，所述方法包括向所述植物或其部分引入或在其中表达包含经修饰的ta-siRNA序列的嵌合核糖核苷酸序列，其中所述序列与天然的ta-siRNA序列相比，通过至少将所述天然ta-siRNA的一个相域替换为下述序列而被修饰，所述序列基本与所述靶基因互补并与所述天然ta-siRNA是异源的。
2.权利要求1的方法，其中所述天然ta-siRNA序列中的微小RNA结合位点已被下述序列替换，所述序列与小RNA序列基本互补，所述小RNA序列能够识别其它RNA序列并介导其切割。
3.权利要求2的方法，其中所述小RNA选自微小RNA，和存在于植物中的siRNA。
4.权利要求1到3中任一项的方法，其中所述天然ta-siRNA由选自以下的序列描述：
a)SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列，和
b)与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列具有至少60％同一性的序列，和
c)在一定条件下与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列或其互补序列杂交的序列，所述条件等价于当使用至少100个核苷酸长度的DNA探针时，在68℃下在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在包含1×SSC和0.1％SDS的溶液中于室温下洗涤。
5.权利要求1到4中任一项的方法，其中所述修饰的ta-siRNA由下述序列描述，所述序列包含至少一个选自以下的序列：
a)SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列，和
b)由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的至少50个连续核苷酸组成的片段，
c)与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列具有至少60％同一性的序列，和
d)在一定条件下与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或20所述序列的序列或其互补序列杂交的序列，所述条件等价于当使用至少100个核苷酸长度的DNA探针时，在68℃下在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/mL变性的鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在包含1×SSC和0.1％SDS的溶液中于室温下洗涤。
6.权利要求1到5中任一项的方法，其中待替换的所述ta-siRNA的相域选自：
a)来自SEQ ID NO：1的核苷酸688到708、667到687、646到666、625到645、604到624、583到603、562到582和/或541到561所述组的相域，和
b)来自SEQ ID NO：2的核苷酸585到605、564到584、543到563、522到542和/或501到521所述组的相域，和
c)来自SEQ ID NO：3的核苷酸525到546、504到524、483到503、462到482、441到461、420到440和/或399到419所述组的相域，和
d)来自SEQ ID NO：4的核苷酸591到612、570到590、549到569、528到548、507到527、486到506、465到485和/或444到464所述组的相域，和
e)来自SEQ ID NO：5的核苷酸595到616、574到594、553到573、532到552、511到531、490到510、469到489和/或448到468所述组的相域，和
f)来自SEQ ID NO：6的核苷酸396到416、375到395、354到374、333到353、312到332、291到311、270到290和/或249到269所述组的相域，和
g)来自SEQ ID NO：7的核苷酸469到489、448到468、427到467、406到426、385到405、364到384、343到363和/或322到342所述组的相域，和
h)来自SEQ ID NO：8的核苷酸482-503、461-481、440-460、419-439和/或398-418所述组的相域，和
i)来自SEQ ID NO：9的核苷酸504到525、483到503、462到482、441到461、420到440、399到419、378到398和/或357到377所述组的相域，和
j)来自SEQ ID NO：10的核苷酸510-531、489-509、468-488、447-467、426-446和/或405-425所述组的相域，和
k)来自SEQ ID NO：11的核苷酸301到322、280到300、259到279、238到258、217到237、196到216、175到195和/或154到174所述组的相域，和
l)来自SEQ ID NO：12的核苷酸373到393、352到372、331到351、310到330、289到309、268到288、247到267和/或226到246所述组的相域，和
m)来自SEQ ID NO：13的核苷酸445到465、424到444、403到423、382到402、361到381、340到360、319到339和/或298到318所述组的相域，和
n)来自SEQ ID NO：14的核苷酸203到224、182到202、161到181、140到160、119到139、98到118、77到97和/或56到76所述组的相域，和
o)来自SEQ ID NO：15的核苷酸1084到1105、1063到1083、1042到1062、1021到1041、1000到1020、9799到999、958到978和/或937到957所述组的相域，和
p)来自SEQ ID NO：16的核苷酸436到456、457到477、478到498、499到519、520到540、541到561、562到582和/或583到603所述组的相域，和
q)来自SEQ ID NO：17的核苷酸592到612、613到633、634到654、655到675、676到696和/或697到717所述组的相域，和
r)来自SEQ ID NO：18的核苷酸556到576、577到597、598到618、619到639、640到660和/或661到681所述组的相域，和
s)来自SEQ ID NO：19的核苷酸226到246、247到267、268到288、289到309、310到330和/或331到351所述组的相域，和
t)来自SEQ ID NO：20的核苷酸1013到1033、992到1012、971到991、950到970、929到949、908到928，887到907和/或866到886所述组的相域。
7.权利要求1到6任一项的方法，其中待替换的微小RNA结合位点选自：
a)SEQ ID NO：1的核苷酸698到718所述的结合位点，和
b)SEQ ID NO：2的核苷酸594到615所述的结合位点，和
c)SEQ ID NO：3的核苷酸536到556所述的结合位点，和
d)SEQ ID NO：4的核苷酸601到622所述的结合位点，和
e)SEQ ID NO：5的核苷酸605到626所述的结合位点，和
f)SEQ ID NO：6的核苷酸405到426所述的结合位点，和
g)SEQ ID NO：7的核苷酸478到499所述的结合位点，和
h)SEQ ID NO：8的核苷酸492到512所述的结合位点，和
i)SEQ ID NO：9的核苷酸514到535所述的结合位点，和
j)SEQ ID NO：10的核苷酸521到541所述的结合位点，和
k)SEQ ID NO：11的核苷酸311到332所述的结合位点，和
l)SEQ ID NO：12的核苷酸382到403所述的结合位点，和
m)SEQ ID NO：13的核苷酸454到475所述的结合位点，和
n)SEQ ID NO：14的核苷酸213到234所述的结合位点，和
o)SEQ ID NO：15的核苷酸1094到1115所述的结合位点，和
p)SEQ ID NO：16的核苷酸424到445所述的结合位点，和
q)SEQ ID NO：17的核苷酸580到601所述的结合位点，和
r)SEQ ID NO：18的核苷酸544到565所述的结合位点，和
s)SEQ ID NO：19的核苷酸214到235所述的结合位点，和
t)SEQ ID NO：20的核苷酸1022到1043所述的结合位点。
8.权利要求1到7中任一项的方法，其中靶基因选自植物内基因、转基因或来自感染植物的病原体的基因。
9.权利要求8的方法，其中感染植物的病原体选自病毒、真菌、细菌、昆虫和线虫。
10.权利要求3的方法，其中存在于植物中的微小RNA选自内源植物微小RNA和转基因微小RNA。
11.权利要求10的方法，其中微小RNA为组织特异表达的、空间调节的、发育调节的和/或受生物或非生物胁迫因素调节的。
12.权利要求10或11的方法，其中微小RNA由任意的SEQ ID NO：78、79、80、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109和/或110描述，或所述微小RNA来自前体序列。
13.权利要求3到12中任一项的方法，其中与微小RNA基本互补的序列在其整个序列上与微小RNA序列的互补序列相比，具有至少60％的同一性或不多于6个错配。
14.权利要求13的方法，其中所述错配主要在对应于所述微小RNA 3’区的区域中。
15.权利要求1到14中任一项的方法，其中所述嵌合核糖核苷酸序列的表达通过使用DNA表达盒来实现，所述表达盒包含在植物中有功能的启动子序列，所述启动子序列与编码所述嵌合核糖核苷酸序列的核苷酸序列有效连接。
16.权利要求15的任一项的方法，其中所述启动子选自组成型启动子、组织特异性或组织偏好型启动子，和诱导型启动子，发育调节的启动子，和由生物或非生物胁迫因素调节的启动子。
17.权利要求1到16中任一项的方法，其中沉默或减弱所述靶基因导致农学性状。
18.权利要求17的方法，其中所述农学性状选自疾病抗性、杀虫剂抗性、针对生物或非生物胁迫的抗性和改良的营养价值。
19.权利要求1到18中任一项的方法，其中靶基因选自蛋白质、肽、脂肪酸、脂类、蜡、油、淀粉、糖、糖类、香料、调味剂、毒素、类胡萝卜素、激素、多聚体、黄酮类化合物、贮存蛋白、酚酸、生物碱、木质素、鞣质、纤维素、糖蛋白和糖脂的合成和/或降解所涉及的基因。
20.嵌合核糖核苷酸序列，所述嵌合核糖核苷酸序列包含经修饰的ta-siRNA序列，其中所述序列与天然的ta-siRNA序列相比，通过至少将所述天然ta-siRNA的一个相域替换为下述序列而被修饰，所述序列基本与靶基因互补并与所述天然ta-siRNA是异源的。
21.权利要求20的嵌合核糖核苷酸序列，其中所述天然ta-siRNA序列中的微小RNA结合位点已被下述序列替换，所述序列与小RNA序列基本互补，所述小RNA序列能够识别其它RNA序列并介导其切割。
22.权利要求21的嵌合核糖核苷酸序列，其中所述小RNA选自微小RNA和存在于植物中的siRNA。
23.权利要求22的嵌合核糖核苷酸序列，其中所述微小RNA如权利要求10到14中任一项所定义。
24.权利要求20到22中任一项的嵌合核糖核苷酸序列，其中所述靶基因选自植物中的基因，或感染植物的病原体的基因。
25.权利要求20到23中任一项的嵌合核糖核苷酸序列，其中
a)天然ta-siRNA序列如权利要求4中定义，和/或
b)修饰的ta-siRNA序列如权利要求5中定义，和/或
c)待替换的所述ta-siRNA的相域如权利要求6中定义，和/或
d)待替换的微小RNA结合位点如权利要求7中定义。
26.脱氧核糖核苷酸序列，其编码权利要求20到24中任一项所述的嵌合核糖核苷酸序列。
27.表达构建体，其包含启动子序列和与之功能连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码权利要求20到24中任一项所述的嵌合核糖核苷酸序列。
28.权利要求16的表达构建体，其中启动子为在植物中有功能的启动子。
29.包含权利要求20到25中的序列，或权利要求26或27的表达构建体的表达载体。
30.转化的细胞或非人生物，其包含权利要求20到25中的序列、权利要求26或27的表达构建体或权利要求28的表达载体。
31.权利要求29的转化的细胞或非人生物，其包含插入其基因组中的所述表达构建体或表达载体。
32.权利要求29或30的转化的细胞或非人生物，其中所述细胞或生物选自哺乳动物、细菌、真菌、线虫或植物细胞和生物。
33.权利要求29到31中任一项的转化的细胞或非人生物，其中所述细胞或生物选自单子叶植物和双子叶植物。
34.权利要求31或32的植物的经转化的种子。
35.包含Seq ID No.：210、215、216、217、218、219、220、221、222和/或223或其衍生物的表达构建体。
36.Seq ID No.210、215、216、217、218、219、220、221、222和/或223或其衍生物表达微小RNA的用途。
37.权利要求35的用途，其中miR390或其衍生物被表达。
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