CN112094845A

CN112094845A - 一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用

Info

Publication number: CN112094845A
Application number: CN202011029314.6A
Authority: CN
Inventors: 王文明; 李燕; 王贺; 赵志学; 朱勇; 樊晶; 黄衍焱; 张继伟; 赵继群; 普梅
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2040-09-27
Also published as: CN112094845B

Abstract

本发明公开了一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用，涉及转基因植物领域，该分离的核酸包括如式1所示的碱基序列：5’‑GTCCCGATCTG‑X1‑X2‑X3‑CACCAAGCGA‑3’；其中，X1选自G、A和T中的任意一种；X2选自A或T；X3选自A、T或C中的任意一种。将该分离的核酸导入植物后，尤其是在水稻中导入，能够获得产量提高、抗性增强以及生长周期缩短的转基因植物。

Description

一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及转基因植物领域，具体而言，涉及一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类由真核生物内源性表达产生的单链非编码RNA。miRNA能够以碱基互补配对的方式结合靶基因转录的mRNA，使靶基因的mRNA降解，或者抑制其翻译，从而下调目的蛋白的表达，来调节基因的表达，单个miRNA分子可调控多个靶基因，有些miRNA甚至可以调控200个以上的靶基因。但是目前仍有许多miRNA的生物学功能和相应的分子机制均处于未知状态。

miRNA的调控与各个层级的抗病反应途径具有重要关系，如miRNA能够调控某些抗病途径中的关键靶基因来抵御病菌的入侵。因此，进一步克隆与分析稻瘟病抗病反应相关的miRNA，不仅能在不同分子水平上丰富植物抗病机理，还可通过利用miRNA来指导抗病育种，为解决作物抗病性提供新思路，具有重要的应用价值。

水稻生产中，抗性、产量和生长周期往往具有相互拮抗作用。能同时促进产量、缩短生长周期并提高抗性的基因或序列，目前还没有报道。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，实施例提供了一种分离的核酸，其包括如式1所示的碱基序列；

式1：5’-GTCCCGATCTG-X1-X2-X3-CACCAAGCGA-3’；其中，X1选自G、A和T中的任意一种；X2选自A或T；X3选自A、T或C中的任意一种。

第二方面，实施例提供了一种重组载体，其包括如前述实施例所述的分离的核酸。

第三方面，实施例提供了一种缩短植物生长周期的方法，其包括：在植物中导入如前述实施例所述的分离的核酸或如前述实施例所述的重组载体。

第四方面，实施例提供了一种提高植物产量的方法，其包括：在植物中导入如前述实施例所述的分离的核酸或如前述实施例所述的重组载体。

第五方面，实施例提供了一种增强植物抗性的方法，在植物中导入如前述实施例所述的分离的核酸或如前述实施例所述的重组载体。

第六方面，实施例提供了一种转基因植物的培育方法，在植物中导入如前述实施例所述的分离的核酸或如前述实施例所述的重组载体。

第七方面，实施例提供了如前述实施例所述的分离的核酸或如前述实施例所述的重组载体在制备具有产量增加、生长周期缩短和抗性增强中的至少一种特征的转基因植物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供了一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用，该分离的核酸包括如式1所示的碱基序列。

将该分离的核酸导入植物后，尤其导入水稻后，能够获得产量提高、抗性增强以及生长周期缩短的转基因植物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例3中离体叶片伤口滴菌法进行接菌的水稻材料的示意图；

图2为实施例3中离体叶片伤口滴菌法进行接菌的接菌叶片中稻瘟菌相对生物量的分析结果；

图3为实施例4中野生型和转基因水稻开花时间分析结果；

图4为实施例4中野生型和转基因水稻的穗部示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

首先，实施例提供了一种分离的核酸，其包括如式1所示的碱基序列；式1：5’-GTCCCGATCTG-X1-X2-X3-CACCAAGCGA-3’；其中，X1选自G、A和T中的任意一种；X2选自A或T；X3选自A、T或C中的任意一种。

水稻生产中，产量、抗性以及生长周期往往具有相互拮抗的作用，发明人经一系列创造性研究发现，将上述分离的核酸导入植物，尤其导入水稻后，制备的转基因植物，具有产量提高、生长周期缩短，抗性也明显增强的特点。

在一些实施方式中，上述分离的核酸还可以与荧光标记相连。

优选地，所述分离的核酸包括序列如SEQ ID No.1～13所示的碱基序列中的至少一种。

SEQ ID No.1：5’-GTCCCGATCTGGAACACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.2：5’-GTCCCGATCTGGATCACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.3：5’-GTCCCGATCTGGTACACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.4：5’-GTCCCGATCTGGTCCACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.5：5’-GTCCCGATCTGAAACACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.6：5’-GTCCCGATCTGATACACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.7：5’-GTCCCGATCTGATTCACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.8：5’-GTCCCGATCTGTAACACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.9：5’-GTCCCGATCTGTATCACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.10：5’-GTCCCGATCTGTATCACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.11：5’-GTCCCGATCTGTTTCACCAAGCGA-3’；

SEQ ID No.12：5’-GTCCCGATCTGTTACACCAAGCGA-3’。

SEQ ID No.13：5’-TTGTCCCGATCTGGAACACCAAGCGAAGCTTCGGTTCCCCTCGGAATCA-3’。

实施例提供了一种重组载体，其包括前述任一实施方式所述的分离的核酸。

优选地，重组载体选自克隆载体和表达载体。通过重组载体，可将上述任意实施方式提供的分离的核酸分子采用本领域技术人员熟知的方式导入受体细胞中，进而实现上述分离的核酸在受体细胞中的稳定表达。

实施例提供了一种缩短植物生长周期的方法，其包括：在植物中导入如前述任一实施方式所述的分离的核酸或如前述任一实施方式所述的重组载体。

任选地，所述导入的方式选自电转、转染和转化中的至少一种。

优选地，所述生长周期为开花周期。

优选地，所述植物为单子叶植物。

优选地，所述植物为水稻。

实施例提供了一种提高植物产量的方法，其包括：在植物中导入如前述任一实施方式所述的分离的核酸或如前述任一实施方式所述的重组载体。

优选地，所述植物为单子叶植物。

优选地，所述植物为水稻。

实施例提供了一种增强植物抗性的方法，在植物中导入如前述任一实施方式所述的分离的核酸或如前述任一实施方式所述的重组载体。

优选地，所述抗性指抗稻瘟病菌。

优选地，所述植物为单子叶植物。

优选地，所述植物为水稻。

实施例提供了一种转基因植物的培育方法，在植物中导入如前述任一实施方式所述的分离的核酸或如前述任一实施方式所述的重组载体。

优选地，所述植物为单子叶植物。

优选地，所述植物为水稻。

此外，实施例还提供如前述任一实施方式所述的分离的核酸或如前述实施例所述的重组载体在制备具有产量增加、生长周期缩短和抗性增强中的至少一种特征的转基因植物中的应用。

优选地，该转基因植物同时具有产量增加、生长周期缩短和抗性增强三种特征。具体地，产量增加是指：转基因植物的产量相对于野生型植物而言有所增长；同理，生长周期缩短和抗性增强均是转基因植物相对于野生型植物而言具有的特征。

优选地，所述生长周期为开花周期。

优选地，所述抗性包括对稻瘟病的抗性。

优选地，所述植物为单子叶植物。

优选地，所述植物为水稻。

实施例1

本实施例提供了一种分离的核酸M1，核酸的碱基序列如SEQ ID No.1所示。具体地，分离的核酸的序列如下：

5’-GTCCCGATCTGGAACACCAAGCGA-3’(M1序列)。

1.M1过表达载体的构建

将M1序列连接入双元载体pCAMBIA1300中进行过表达。

将上述M1序列替换拟南芥基因AtIPS1(INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION1)的CDS编码区域54-77碱基序列(5’-TTGGGCAACTTCTATCCTTTGGCA-3’)后得到一个融合DNA序列(SEQ ID No.13)，在双元载体pCAMBIA1300中利用35S启动这个融合DNA分子转录。

SEQ ID No.13：5’-TTGTCCCGATCTGGAACACCAAGCGAAGCTTCGGTTCCCCTCGGAATCA-3’。

具体原理是参照Franco-Zorrilla(2007)，Yijun Meng(2012)等的发现：拟南芥基因IPS1(INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION1)的编码区(CDS区域)，从54-77碱基序列(5’-TTGGGCAACTTCTATCCTTTGGCA-3’)可以与miR399碱基序列反向互补配对(5’-TGCCAAAGGAGAATTGCCCTG-3’)，并且在miR399的切割位点多了3个碱基，配对时这3个碱基会形成一个泡状突起，从而限制住miR399。将M1序列通过重叠PCR的方式替换AtIPS1中与miR399结合的那段序列，获得融合的DNA分子(SEQ ID No.13)，然后再将融合的DNA分子连入植物双元表达载体pCAMBIA1300。

1.1设计引物进行PCR扩增

以拟南芥IPS1的cDNA为模板，用引物IPS1-KpnI-F1(GGGGTACCCCTGGCCATCCCCTAGCTAGGT)和M168-IPS1-BamHI/BglII-R1(ATCTTCGCTTGGTGCTCCAGATCGGGACGGATCCTTTCTAGAGGGAGATAAACAAAAC)进行PCR扩增，以及F2(GGATCCGTCCCGATCTGGAGCACCAAGCGAAGATCTAGCTTCGGTTCCCCTCGGAAT)和IPS1-SpeI-R2(GGACTAGTCCCGGAAGCAAATTTACATGCACT进行PCR扩增，分别扩增出需要重叠的片段(为了可以直接将M1片段直接克隆到IPS1的载体上，在重组位点上分别加入了BamHI/BglII的酶切位点)，将PCR产物回收，将两个产物混合后作为模板，用引物IPS1-KpnI-F1(GGGGTACCCCTGGCCATCCCCTAGCTAGGT)和IPS1-SpeI-R2(GGACTAGTCCCGGAAGCAAATTTACATGCACT进行PCR扩增，获得M1序列替代miR399靶位点的融合DNA分子(SEQ ID No.13)。然后通过酶切连接，将融合的DNA分子连入植物双元表达载体pCAMBIA1300。PCR体系见表1。

表1 PCR体系

10×ExTaq PCR缓冲液	5μL
		dNTP(10mM)	5μL
正向引物(10μM)	1μL
		反向引物(10μM)	1μL
ExTaq酶	0.5μL
		cDNA模板	5μL
ddH<sub>2</sub>O	补充至50μL

反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；72℃终延伸5min；12℃，2min。共跑34个循环。

1.2目的片段的回收

获得的目的片段用E.Z.N.A.^TM Gel Extraction Kit(OMEGA公司生产)胶回收试剂盒纯化回收，操作流程参照说明书。

1.3大肠杆菌质粒的提取

将带有质粒pCAMBIA1300的大肠杆菌在含有50mg/L卡拉霉素(Kalamycin)的液体LB培养基中过夜培养，培养条件为37℃，200rpm。获得的菌液使用E.Z.N.A.^TM质粒小提试剂盒(OMEGA公司生产)提取质粒。操作流程参照说明书。

1.4酶切目的片段和载体

酶切体系参照表2。

表2酶切体系

目的片段或载体	不超过1μg
		Kpn1	2μL
Spe1	2μL
		10×Cutsmart缓冲液	4μL
ddH<sub>2</sub>O	补充至40μL

37℃过夜酶切，酶切产物胶回收后用来做连接。

1.5连接

连接体系如表3所示。

表3连接体系

载体	2μL
		目的片段	4μL
Ligation hign(高效率连接试剂)	16μL

16℃连接30min，连接产物用来转化大肠杆菌。

1.6感受态制备以及转化

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

从-80℃冰箱取出的大肠杆菌，在LB固体培养基上划线，37℃培养至长出单菌落；挑长势较好的单菌落于250mL LB液体培养基中，28℃，200rpm培养12h，直至OD600为0.3左右；将菌液冰浴30min，4℃，4000rpm离心10min，收集菌体；加入15mL预冷的TB(含0.1MCaCl₂)溶液重悬菌体，然后缓慢加入1.5mL DMSO，冰上放置10min；将菌体分装于预冷的1.5mL EP管中，每管100μL，液氮速冻并保存于-80℃。

转化感受态细胞：

将冻存的感受态细胞在冰上充分溶解，吸取50μL感受态细胞，然后加入连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min；42℃热激45s，迅速放冰上静置2min；加入600μL液体LB培养基，37℃，200rpm孵育1h；4000rpm离心1min收集菌体，加入100μL液体LB培养基重悬菌体，然后涂于含有50mg/L卡那霉素的固体LB培养基上，37℃过夜培养。

1.7菌液PCR检测

分别挑取5～6个单菌落于2mL EP管中，分别加入500μL含有抗生素的液体LB，充分震荡后于37℃培养2～3h，吸取2μL菌液作为模板，跑PCR筛选阳性克隆，PCR体系如表4所示(F：AAGGCTGATTCAGACTGCGAG；Rbs-R为载体上设计的引物：5’-CGAAACCGATGATACGAACGAAAG-3’)。

表4 PCR体系

10×Easy Taq Buffer	2μL
		dNTP(10mM)	2μL
F(正向引物)	0.5μL
		Rbs-R(反向引物)	0.5μL
Easy Taq Enzyme	0.2μL
		模板	2μL
ddH<sub>2</sub>O	补充至20μL

反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；72℃终延伸5min；12℃，2min。共跑30个循环。通过电泳检测，是否有大小符合的目的条带。挑选带有目的基因的菌液送公司测序。

1.8转化农杆菌

农杆菌感受态细胞制备：

从-80℃冰箱取出的农杆菌(EHA105或GV3101)，在YM固体培养基上划线，28℃培养至长出单菌落；挑长势较好的单菌落于250mL YM液体培养基中，28℃，200rpm培养12h，至到OD600为0.5左右；摇好的菌液在冰上放置30min，然后将菌液分装到预冷的1.5mL EP管中，4℃，5000rpm离心5min，弃掉上清；每管分别加入400μL 0.1M预冷的CaCl₂，轻轻混匀；冰上放置30min，4℃，5000rpm离心5min，弃掉上清；每管分别加入100μL预冷的0.1M CaCl₂，液氮速冻后冻存于-80℃。

转化农杆菌：将冻存的感受态细胞在冰上充分溶解，吸取30μL感受态细胞，然后加入1μL公司返还的测序正确的质粒(步骤1.7获得的)，轻轻混匀；冰上放置5min，液氮速冻8min，然后在37℃中热激5min；加入500μL液体LB培养基，28℃孵育2h；吸取100μL菌液均匀涂到含有卡那霉素和利福平的固体LB培养基上，28℃倒置培养。

1.9农杆菌菌液PCR检测

操作步骤与上述大肠杆菌菌液PCR(步骤1.7)基本一致，区别在于，农杆菌摇菌用的LB培养基中除了含有卡那霉素还含有利福平，另外农杆菌的培养温度是28℃。鉴定为阳性的农杆菌就可以用作水稻遗传转化。

实施例2

本实施例提供转基因水稻的制备。

2.1各种培养基的配制

基本培养基：MS和N6粉(Phytotechnology Lab公司生产)。

愈伤组织诱导培养基(1L)：N6(4g)，蔗糖(30g)，肌醇(0.1g)，酸水解酪蛋白(0.3g)，脯氨酸(0.5g)，谷氨酰胺(0.5g)，2,4-D(2mg)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8。

侵染培养基(1L)：酵母提取物(3g)，胰蛋白胨(5g)，高温高压灭菌后加入40mg AS，调pH＝5.5。

共培养培养基(1L)：MS(4.4g)，蔗糖(30g)，2,4-D(2mg)，D-Sorbitol(50g)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后加入40mg的AS。

筛选培养基(1L)：MS(4.4g)，蔗糖(30g)，2,4-D(2mg)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后加入400mg羧苄青霉素和50mg潮霉素。

预分化培养基(1L)：MS(4.4g)，蔗糖(30g)，D-Sorbitol(50g)，6-BA(3mg)，NAA(0.5mg)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后加入200mg羧苄青霉素和25mg潮霉素。

再分化培养基(1L)：MS(4.4g)，蔗糖(30g)，D-Sorbitol(50g)，6-BA(2mg)，NAA(0.05mg)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后加入200mg羧苄青霉素和25mg潮霉素。

生根培养基(1L)：MS(2.2g)，蔗糖(30g)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后倒入组培瓶。

2.2诱导愈伤组织

将种子去壳，称取24g左右的种子，用50mL 75％酒精处理1min，用无菌蒸馏水洗3遍；用加了适量Tween20的2.5％次氯酸钠消毒10min，然后用无菌蒸馏水清洗种子至没有泡沫；在超净台中将种子用2.5％的次氯酸钠再次消毒10min，然后用无菌蒸馏水将种子表面的次氯酸钠尽量清洗掉，用无菌的滤纸尽量吸掉种子表面的液体；用镊子消毒过的种子均匀地摆到N6培养基上，然后放到30℃的培养箱进行暗培养，大约需要10d左右，将愈伤组织从种子上剥离下来进行下一步操作。

2.3农杆菌侵染水稻愈伤组织

从-80℃冰箱取出的带有重组质粒的农杆菌，在YM固体培养基(含Kan/Rif/Gm)上划线，28℃培养2d，然后挑取少量菌到3mL的YM液体培养基(含Kan/Rif/Gm)中，28℃，200rpm过夜培养；吸取1mL菌液于50mL侵染培养基中，8℃，200rpm培养，OD不超过0.1；将剥好的愈伤组织浸泡到侵染液中，28℃，140rpm，侵染30min；倒掉侵染液，将愈伤组织转移到无菌滤纸上，尽量将愈伤组织表面的侵染液吹干；然后将愈伤组织转移到共培养培养基上，22℃暗培养3d。

2.4筛选与分化

将愈伤转移到筛选培养基上，30℃暗培养至少30d，中间需要更换一次培养基；然后将愈伤转移到预分化培养基上，30℃光照培养15d，之后愈伤转移到再分化培养基上，30℃光照培养至有绿色小芽冒出。

2.5生根

将分化出的小芽转移到生根培养基上，30℃光照培养，待苗子长到大约10cm左右时进行炼苗，然后移栽到土壤中。

3.筛选鉴定阳性转基因苗

3.1潮霉素初筛

潮霉素溶液配制：6-BA(1mg/L)，Hyg(30mg/L)，调pH至6.0左右；选取2～3cm转基因苗的叶片，并取同时期的野生型叶片做对照，用马克笔做上标记，泡到潮霉素溶液中，30℃光照培养3～4d，观察如果叶片变褐色则说明不具有潮霉素抗性，即没有转入目标载体或者目标载体没有工作，反之，叶片依然嫩绿则表明有目的载体转入。

3.2通过PCR鉴定阳性转基因苗

使用目的片段的正向引物和载体上的反向引物Rbs-R进行PCR扩增，体系参照1.7中的PCR扩增体系。

3.3水稻总RNA的提取

取适量水稻叶片于2.0mL EP管中，加入钢珠，放入液氮中速冻，用植物组织破碎仪将叶片组织充分破碎，然后加入1mL Trizol混匀；加入0.2mL三氯甲烷，剧烈震荡2min，室温放置10min；4℃，13000g离心15min，样品分成三层，吸取上层水相到1.5mL的EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒几次，室温静置20～30min；4℃，13000g离心10min，去上清，加入预冷的DEPC 75％的乙醇，洗涤两次；短离心，然后将残余在EP管中的酒精吸干净，在37℃烘箱中放置5min至酒精充分吹干；加入50μL DEPC水溶解RNA，然后用分光光度计检测总RNA的浓度及质量，其中波长260/280的比值在2.0左右质量最好。

3.4去除基因组DNA

消化体系如表5所示。

表5消化体系

RNA	20μg
		10×DNase buffer	5μL
DNase	5μL
		DEPC水	补充至50μL

37℃水浴80min；

将50μL的体系用DEPC水扩大至600μL，加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液(其中，苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1)，剧烈震荡2min，静置10min；4℃，13000g离心10min，将上清转移到新的EP管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后静置20min；4℃，13000g离心10min，弃掉上清，加入预冷的75％DEPC乙醇，洗涤两次；短离心，然后将残余在EP管中的酒精吸干净，在37℃烘箱中放置5min至酒精充分吹干；加入50μL DEPC水溶解RNA。

3.5miRNAs反转录

由于miRNA很短，不能在上面设计特异的引物，所以需要将总RNA添加一个poly(A)的尾巴。反应体系如表6。

表6反应体系

总RNA	1μg
		5×miRNA反应缓冲液	2.5μL
25mM MnCl<sub>2</sub>	1.25μL
		ATP	0.5μL
Poly A聚合酶	0.25μL
		DEPC水	补充至12.5μL

在37℃水浴锅中孵浴15min后，立即进行First-Strand cDNA Synthesis(第一链cDNA合成)。取4μl上面加了polyA的反应产物(Polyadenylated RNA，聚腺苷酸化的RNA)进行第一链cDNA合成，反应体系如表7所示。

表7反应体系

Polyadenylated RNA	4μL
		退火缓冲液	1μL
通用RT引物(25μM)	2μL
		DEPC水	补充至8μL

65℃处理5min，冰上放置1min；加入10μL 2×First-Strand Reaction Mix和2μL

III RT/RNase OUT^TM Enzyme Mix，50℃孵育50min，然后85℃，5min终止反应，用无菌ddH₂O稀释至100μL。

3.6荧光实时定量PCR(qRT-PCR)鉴定miRNAs的表达量

qRT-PCR使用KOD SYBR qPCR Mix，体系如表8所示。M引物为：5’-TCGCTTGGTGCAGATCGGGAC-3’

表8

2×KOD SYBR qPCR Mix	5μL
		M引物(10mM)	0.25μL
Universal qPCR(10mM)	0.25μL
		cDNA	2.5μL
ddH<sub>2</sub>O	补充至10μL

qPCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s；60℃复性和延伸30s(重复40个循环)，溶解曲线65℃至95℃。每个反应设3个重复，选用水稻snRNA U6作为内参。

3.7RNA反转录并检测其靶基因AGO1的表达量

反转录使用TOYOBO公司生产的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix试剂盒，具体操作如下：

把总RNA在65℃条件下变性5min，立即置于冰上冷却；去除基因组DNA反应，体系如表9所示：

表9体系

4×DN Master Mix(含gDNA清除剂)	2μL
		总RNA	≤0.5μg
DEPC水	补充至8μL

37℃反应5min；再加入2μL 5×RT Master MixⅡ，37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min，产物稀释5倍，用做qPCR反应。qPCR反应体系如表10所示。

表10 qPCR反应体系

2×KOD SYBR qPCR Mix	5μL
		靶基因-正向引物(10mM)	0.25μL
靶基因-反向引物(10mM)	0.25μL
		cDNA	2.5μL
ddH<sub>2</sub>O	补充至10μL

表10中的靶基因选自AGO1a、AGO1b、AGO1c和AGO1d中的任意一种。靶基因的引物如表11所示。

表11靶基因的引物序列

AGO1a-F	CTGTTATCTAAGACGGAACGACCT
		AGO1a-R	TGATTTGAGTAGCCACACTGAAAG
AGO1b-F	GCTGTTGGACTATTCTGGGTATTG
		AGO1b-R	TCTTCAAGCACAACAAAGGTCC
AGO1c-F	AAATCCCATAATAATCTGCCAGC
		AGO1c-R	GATGAAATGCTCAAGCCCAG
AGO1d-F	CTACTACTGCTTCGCTTGGCTACT
		AGO1d-R	GAAATAGAATGGTGTGTCCCAGA

qPCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s；60℃复性和延伸30s(重复40个循环)，溶解曲线65℃至95℃。每个反应设3个重复，选用水稻基因ubiquitin(UBQ)作为内参。

3.8统计分析

本实验中所有涉及到的统计学分析全部使用软件SPSS19.0，用野生型WT或者LTH为标准，对各处理进行多重比较分析(LSD Duncan)，分析各处理之间的显著性差异，P＜0.01。

实施例3

鉴定水稻对稻瘟病的抗性。

4.1水稻材料培养

将实施例2提供的转基因水稻和/或野生型水稻的水稻种子装入网袋，做上标记，浸泡于10％的过氧化氢中，37℃过夜，然后用清水冲洗干净，用清水继续37℃浸泡至种子露白，期间每天早晚各换一次水。将花卉营养土加水搅拌均匀，然后将种子种到上面，再往上面盖一层营养土，盖上透明盖子，放到26℃，湿度80％的短日照人工气候室培养。

4.2稻瘟病菌培养

将活化好的稻瘟病菌接种到燕麦培养基上，28℃，湿度80％，暗培养直到长满菌丝，然后加入适量无菌蒸馏水，用玻璃片将表面的菌丝挂掉，敞开盖子，光照培养3～4d就会有大量孢子产生。

4.3水稻接种稻瘟病菌

可通过离体叶片伤口滴菌法和/或喷雾接菌法进行稻瘟病菌的接种。在其他实施例中，也可以采用田间注射接种法或水稻叶鞘接种法进行接种。

离体叶片伤口滴菌法：在分蘖期，取一段4～5cm的水稻叶片，用白枪头在上面均匀地戳上3个伤口，然后浸泡到6-BA(1mg/L)溶液中，注意伤口尽量保持一致；称取0.25g明胶置于100mL无菌蒸馏水中，加热直至融化，待冷却后就可以用来洗孢子；纱布将菌丝过滤掉，然后在显微镜下用血球计数板估计孢子浓度，将孢子浓度稀释到5×10⁵/mL；每个伤口滴10μL孢子液，然后将接种后的叶片放到28℃，黑暗处理24h，之后将光照调至正常光周期；5～6d后观察伤口的发病情况，拍照并测量病斑的大小。

喷雾接菌法：收集孢子的方法同上；取4叶期的水稻幼苗放到大塑料盆里，用喷雾器将孢子液均匀地喷到叶片上，用塑料薄膜把口封好，26℃黑暗处理24h，然后将光照调至正常光周期；观察叶片的发病情况。分别取0，6，12，24和48h的水稻叶片保存于-80℃，用来检测防御相关基因的表达量；取72h和96h发病的叶片用于DAB和台盼蓝染色。

4.5水稻对稻瘟病抗性鉴定

3叶期的水稻幼苗喷雾接种稻瘟病菌一周后，观察水稻叶片，采用离体叶片伤口滴菌法进行接菌(Guy11、97-27-2和NC-34)的水稻材料的示意图请参照附图1。

需要说明的是，Guy11是国际通用接菌的稻瘟病菌株株系，97-27-2和NC-34是从四川盆地水稻基地分离筛选出来的稻瘟病菌株。图1中，NPB为对照，M1-1、M1-2和M1-3均为M1序列的转基因单株材料。

4.6q-PCR检测稻瘟病菌的生物量

取伤口滴菌发病后的叶片，提取DNA；用水稻基因ubiquitin(UBQ)作为内参，检测稻瘟病菌的特异基因Pot2的相对表达量，qPCR体系同表10的体系。

采用离体叶片伤口滴菌法进行接菌的接菌叶片(M1-1、M1-2和M1-3均为M1转基因材料)中，稻瘟菌相对生物量的分析结果依次如图2所示。由图2可知，实施例2提供的转基因水稻的抗性显著优于野生型水稻。

实施例4

水稻产量的测定以及农艺形状的观察。

水稻理论测产是指在水稻成熟以后快要收割前，按一定规则，选取一定面积的区块计量有效穗数，选择一定数量有代表性的稻穗进行取样并计量实粒数和结实率，测得干谷粒的千粒重，进而计算出每亩产量。因收割损耗等原因，水稻的理论产量与实际产量不一定完全重合，一般地，实际产量为理论产量的80％～100％。根据栽培方式及田块形状大小等不同因素，理论测产取样的方式也不同，取样时应遵循代表性和适量性原则。

实际测产

实际产量(g/株)＝单株稻谷重量

单位：取样稻谷重量g，取样为单株。数据统计来自10株重复结果。字母代表差异显著性分析结果，P值为小于0.05。

水稻材料三年单株产量分析结果如表12所示。

表12水稻材料三年单株产量分析

表12中，a、b、c和ab代表差异性显著。

由表12可知，相对于野生型水稻而言，转基因水稻的产量能增产5％～50％左右。

野生型和转基因水稻开花时间分析结果如附图3所示。由图3可知，相对于野生型水稻的开花时间而言，转基因水稻的开花时间缩短了4～7天。

野生型和转基因水稻的穗部示意图请参照附图4所示。由图4可知，转基因水稻穗成熟显著早于野生型。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtcccgatct ggaacaccaa gcga 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcccgatct ggatcaccaa gcga 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcccgatct ggtacaccaa gcga 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcccgatct ggtccaccaa gcga 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcccgatct gaaacaccaa gcga 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcccgatct gatacaccaa gcga 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcccgatct gattcaccaa gcga 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtcccgatct gtaacaccaa gcga 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtcccgatct gtatcaccaa gcga 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcccgatct gtatcaccaa gcga 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcccgatct gtttcaccaa gcga 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtcccgatct gttacaccaa gcga 24

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgtcccgat ctggaacacc aagcgaagct tcggttcccc tcggaatca 49

Claims

1.一种分离的核酸，其特征在于，其包括如式1所示的碱基序列；

式1：5’-GTCCCGATCTG-X1-X2-X3-CACCAAGCGA-3’；其中，X1选自G、A和T中的任意一种；X2选自A或T；X3选自A、T或C中的任意一种；

2.一种重组载体，其特征在于，其包括如权利要求1所述的分离的核酸。

3.一种缩短植物生长周期的方法，其特征在于，其包括：在植物中导入如权利要求1所述的分离的核酸或如权利要求2所述的重组载体。

4.根据权利要求3所述的缩短植物生长周期的方法，其特征在于，所述生长周期为开花周期；

优选地，所述植物为单子叶植物；

优选地，所述植物为水稻。

5.一种提高植物产量的方法，其特征在于，其包括：在植物中导入如权利要求1所述的分离的核酸或如权利要求2所述的重组载体；

优选地，所述植物为单子叶植物；

优选地，所述植物为水稻。

6.一种增强植物抗性的方法，其特征在于，在植物中导入如权利要求1所述的分离的核酸或如权利要求2所述的重组载体；

优选地，所述抗性包括对稻瘟病菌的抗性；

优选地，所述植物为单子叶植物；

优选地，所述植物为水稻。

7.一种转基因植物的培育方法，其特征在于，在植物中导入如权利要求1所述的分离的核酸或如权利要求2所述的重组载体；

优选地，所述植物为单子叶植物；

优选地，所述植物为水稻。

8.如权利要求1所述的分离的核酸或如权利要求2所述的重组载体在制备具有产量增加、生长周期缩短和抗性增强中的至少一种特征的转基因植物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生长周期为开花周期。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物；

优选地，所述植物为水稻。