CN116694652B

CN116694652B - 大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段及干扰载体和应用

Info

Publication number: CN116694652B
Application number: CN202310958233.1A
Authority: CN
Inventors: 苏晓峰; 潘国强; 王�琦; 郭惠明; 程红梅
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Baoding Branch Biochemical Technology Co ltd
Priority date: 2023-08-01
Filing date: 2023-08-01
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2043-08-01
Also published as: CN116694652A

Abstract

本发明公开了大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段及干扰载体和应用。本发明以大丽轮枝菌VdNRPS4作为靶标基因，通过VIGS技术研究其与病原菌致病力之间的关系并利用转基因和RNAi技术相结合获得能够显著提高植物抗大丽轮枝菌的靶基因片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示。本发明进一步提供了采用所述靶基因片段构建的干扰载体。本发明提供的大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段以及采用该靶基因片段构建的干扰载体能应用于提高作物对大丽轮枝菌所导致病害的抗性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种等方面。

Description

大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段及干扰载体和应用

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌抗病原菌靶基因片段以及含有所述抗病原靶基因片段的RNA干扰载体，尤其涉及大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段以及所述RNA干扰载体在提高作物或蔬菜对大丽轮枝菌抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌抗病原菌靶基因片段及抗病性应用领域。

背景技术

棉花黄萎病（Cotton Verticillium Wilt）被称为“棉花癌症”，在很多国家使棉花平均减产10-35%，严重危害棉花生产，造成了巨大的经济损失(王孝坤, 王春燕, 谢成建.et al. 黄萎病菌致病及植物抗黄萎病分子机制研究进展. 河南农业科学, 2014, 43,1-6.)。棉花黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae），其具有很强的致病性，在整个棉花生长阶段内，它都能够进行侵染，导致棉花出现叶片萎蔫、变黄等现象；发病严重时，整个棉花叶片枯焦破碎，最终死亡。同时，它的寄主植物范围较为广泛，能够侵染的植物种类达六百多种，包括一年生草本植物、多年生草本植物和木本植物，其中不乏十字花科、茄科、菊科和蔷薇科等多种具有重要经济价值的农作物、苗木和花卉等，并且可侵染的寄主的范围还在不断扩大(Klosterman S J, Atallah Z K, Vallad G E, et al.Diversity, pathogenicity, and managementof Verticillium species. AnnualReview Of Phytopathology, 2009, 47, 39-62.)。由于大丽轮枝菌是土传植物病原真菌，防治非常困难，目前生产上还没有较好效果的防治药剂。通过对丝状真菌基因组测序，发现NRPS基因大量存在于许多真菌中，如常见的病原真菌葡萄灰霉菌(Botrytis cinerea)、植物病原真菌旋孢腔菌(Cochliobolus ativus)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等。在众多的酶中，非核糖体肽合成酶（NRPS）在病原菌与植物互作过程中扮演着相当重要的角色，可作为毒力因子可以合成多种次级代谢产物。NRPS是由多模块顺次排列组成的多功能巨酶。每一个模块负责将一个特异性的氨基酸或芳香酸底物整合到延伸的碳链中，模块的数量、排列顺序和底物特异性决定了产物的结构。有些NRPS还与其他酶系如聚酮类(polyketide)或萜类(terpenoid)合成酶系共同完成杂合分子的合成。典型的NRPS由多个模块(module)组成，这些模块按特定的空间顺序排列，每个模块由多个功能结构域(domain)或催化单元组成，结构多样的非核糖体肽在这些模块及其结构域上有序地进行合成。近期研究表明，柑橘褐斑病菌(Alternaria alternata)中的AaNPS6基因缺失获得的缺失突变体相较于野生型其菌落在PDA上呈白色绒毛状且其产孢能力下降，与其相反，野生型菌落为黑色绒毛状。更为明显的是在进行致病力分析后发现，突变体的致病力相较于野生型明显下降(LeeB N, Kroken S, Chou D, et al. Functional analysis of allnonribosomal peptide synthetases in Cochliobolus heterostrophus reveals afactor, NPS6, involved invirulence and resistance to oxidative stress.Eukaryotic Cell, 2005, 4, 545-555.)。苹果树腐烂病菌通过全基因组测序发现，腐烂菌中存在40个编码NRPS的基因，其中13个在病菌侵染枝条时呈现明显的上调表达(Zhiyuan,Yin, Huiquan, et al. Genomesequence of Valsa canker pathogens uncovers apotential adaptation of colonization of woody bark. The New phytologist,2015, 208, 1202-1216.)。初步猜测这13个NRPS基因在腐烂病菌致病过程中扮演着重要的角色，关于苹果树腐烂病菌中的NRPS基因的研究结果显示，VmNRPS12的缺失会导致腐烂病菌致病力显著性的下降(马晨琛, 李正鹏, 戴青青等. 苹果树腐烂病菌非核糖体多肽合成酶基因VmNRPS12的功能. 微生物学报, 2016, 56,1273-1281)，这一研究结果为NRPS基因在苹果树腐烂病中的研究奠定了一定的理论基础。

通过对大丽轮枝菌的基因组序列分析发现共存在6个NRPS基因，VdNRPS4基因是其中之一。迄今为止，未见VdNRPS4基因与大丽轮枝菌的致病力密切相关的报道，更未有从VdNRPS4基因中筛选获得抗病靶基因片段并构建干扰载体应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性的有关报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病靶基因片段；

本发明的目的之二是提供含有所述大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病靶基因片段的RNA干扰载体；

本发明的目的之三是将所述大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病靶基因片段以及含有该靶基因片段的RNA干扰载体应用于植物抗病或构建获得抗病的转基因植物新品种。

为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

本发明首先公开了能够提高植物抗病原菌的大丽轮枝菌VdNRPS4靶基因片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示；优选的，所述大丽轮枝菌VdNRPS4靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明还公开了含有所述的大丽轮枝菌VdNRPS4靶基因片段的RNA干扰载体以及含有所述RNA干扰载体的宿主细胞。

此外，由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示的靶基因片段所转录的dsRNA也属于本发明的保护范围之内。

本发明所述大丽轮枝菌VdNRPS4靶基因片段能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致的疾病的抗病性，包括以下步骤：（1）构建含有所述大丽轮枝菌VdNRPS4靶基因片段的RNA干扰载体；（2）将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

优选的，一种构建所述RNA干扰载体的方法，包括：通过BP反应，将所述的大丽轮枝菌VdNRPS4靶基因片段连接至pDONR207中再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中得到Gateway干扰载体。

本发明所述RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致的疾病的抗病性，包括以下步骤：（1）将所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（2）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

本发明中所述的大丽轮枝菌所导致的病害优选为棉花黄萎病。

本发明进一步公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤：（1）构建含有所述大丽轮枝菌VdNRPS4靶基因片段的RNA干扰载体；（2）将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。

所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可适用于转化的植物或植物细胞的类型而变化；将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化和直接基因转移等。

本发明所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物或蔬菜，包括：烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种。

本发明采用寄主诱导的基因沉默技术（Host-induced gene silencing，HIGS），以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，构建多个针对大丽轮枝菌非核糖体肽合成酶2（non-ribosomal peptide synthetase 3,NRPS4, VDAG_05314）的烟草脆裂病毒（tobaccorattle virus，TRV）干扰质粒。通过农杆菌注射的方法转化本氏烟草（Nicotina benthamiana），并进行大丽轮枝菌接种，将其中可以明显降低植物病情指数的靶标片段构建Gateway干扰载体，获得稳定遗传的转基因植物。通过病情指数以及分子生物学手段检测真菌生物量以及靶标基因的转录水平，筛选到效果最佳的干扰片段（其核苷酸序列为SEQID No.1所示）。本发明筛选得到的大丽轮枝菌VdNRPS4靶基因片段以及应用该靶基因片段所构建的RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致疾病的抗病性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“RNA干扰（RNA interference, RNAi）”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。

附图说明

图1 为VIGS载体信息。

图2 为VIGS不同区段扩增结果；M：marker，1-5为针对VdNRPS4基因的不同区段扩增结果。

图3 为VIGS干扰载体菌液扩增验证结果；M为marker，N为阴性对照，1-4（第1片段）、5-8（第2片段）、9-12（第3片段）、13-16（第4片段）和17-20（第5片段）分别为针对VdNRPS4基因构建VIGS质粒的菌液扩增结果。

图4 为本氏烟草的病情指数统计结果。

图5 为RNAi扩增结果；M为marker，1、2、3分别为针对VdNRPS4-1、VdNRPS4-2、VdNRPS4-5的扩增条带。

图6 为RNAi载体信息。

图7 为转基因阳性烟草PCR检测结果；M：marker，1-4（第1片段）、5-8（第2片段）、9-12（第5片段）为转基因阳性烟草，WT为野生型烟草。

图8为转基因烟草病情指数分析结果。

图9为植物体内真菌生物量分析结果。

图10为植物体内真菌靶标基因表达量分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1大丽轮枝菌VdNRPS4抗病原菌靶基因片段的筛选、RNA干扰载体的构建和转烟草抗病性验证

材料与方法

（1）材料

烟草：本氏烟草（Nicotiana benthamiana）品系。

培养条件：种植于高温高压灭菌的混合营养土（芳洁营养土：蛭石 = 1：1）中，温度23 ± 2℃，相对湿度75 ± 5%，光周期L：D为16 h：8 h。

（2）菌株和质粒

棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）V991，高致病力落叶型菌株，由中国农科院植物保护研究所简桂良研究员惠赠。

病毒载体：烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）双元载体（TRV1与TRV2）由清华大学刘玉乐教授惠赠。

农杆菌：菌株GV3101和LBA4404，由本实验室保存。

植物稳定遗传载体：pDONR207和pK7GWIWG2(I),0载体由本实验室保存。

（3）真菌的培养以及植物接种方式

将大丽轮枝菌孢子培养于液体CM培养基中，25℃振荡培养5-7天。经5层纱布过滤，离心收集孢子，用蒸馏水稀释，并在显微镜下观察，将孢子浓度调整至10⁶个/mL后备用。

当本氏烟草的叶片长至6-8片真叶时，选取长势一致的幼苗进行接种。用镊子从根部将幼苗挖出，并在蒸馏水中清洗根部泥土。将幼苗根部完全浸泡于稀释好的10⁶个/mL孢子悬液或蒸馏水中2 min后，尽快将幼苗移回原来的塑料钵中，并浇水，使土壤湿润，进行病情指数统计。

（4）植物病情指数统计

根据相关文献（Wang HM, Lin ZX, Zhang XL, et al. Mapping andquantitative trait loci analysis ofVerticilliumwilt resistance genes incotton. Journal of IntegrativePlant Biology, 2008, 50(2): 174- 182.）并做出适当调整，制定本实验中本氏烟草感染大丽轮枝菌的病情等级（表1）。

表1 病情指数统计

反应级	症状
		0级	叶片上无病斑
1级	1或2枚叶片出现萎凋
		2级	3-5枚叶片出现萎凋
3级	大部分叶片出现萎凋
		4级	植株萎凋枯死或即将萎凋枯死

病情指数计算公式如下（公式1）：

公式1 ：病情指数= [Ʃ (植株症状级别对应株数 × 植株症状级别) / (总株数× 4) ]× 100。

（5） VIGS干扰载体的构建

为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌非核糖体肽合成酶2（non-ribosomal peptide synthetase 3,NRPS4, VDAG_05314）的编码序列，设计两对特异性引物，引物两端含有EcoR I和BamH I酶切位点（如表2），分别对目的片段进行扩增。然后利用l%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并进行片段回收。将目的片段以及载体分别进行酶切反应，并利用T₄连接酶将其构建至TRV2载体中。最后，利用酶切以及测序分析，将验证好的阳性质粒转化至农杆菌GV3101中。

表2 扩增大丽轮枝菌非核糖体肽合成酶2的特异性引物

注：加粗斜体处为酶切位点。

其中，由引物VIGS-VdNRPS4-1扩增得到大丽轮枝菌非核糖体肽合成酶2抗病菌靶标基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，由引物VIGS-VdNRPS4-2扩增得到大丽轮枝菌非核糖体肽合成酶2抗病菌靶标基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，由引物VIGS-VdNRPS4-3扩增得到大丽轮枝菌非核糖体肽合成酶2抗病菌靶标基因的核苷酸序列为SEQID No.3所示，由引物VIGS-VdNRPS4-4扩增得到大丽轮枝菌非核糖体肽合成酶2抗病菌靶标基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，由引物VIGS-VdNRPS4-5扩增得到大丽轮枝菌非核糖体肽合成酶2抗病菌靶标基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。

（6） VIGS转化方法

将含有阳性质粒的农杆菌单克隆放于LB液体培养基（25 µg/mL Rif和50 µg/mLKan）中，28℃摇床过夜培养。次日将菌液（比例为2%）加入LB液体培养基中再次培养，振荡培养至OD₆₀₀为0.5 - 0.6时，低温离心收集菌体，弃去废液，将菌体重悬于注射基质（10 mMMES、10 mM MgCl₂、100µM 乙酰丁香酮）中，调整OD₆₀₀至0.8 - 1.0。把两种农杆菌菌株（TRV1与TRV2+靶标基因片段）以1：1混合，在室温中静置3 - 5 h，不要摇动。最后利用注射器将农杆菌混合液注射于最嫩的叶片中。

（7）稳定遗传载体的构建

为了获得稳定遗传的含有靶标基因dsRNA的本氏烟草，对能够明显提高植物对病原菌抗性的DNA区段，重新设计引物（两端含有部分BP位点），然后再用attb引物进行扩增（表3），用于稳定遗传干扰载体的构建。通过BP反应，将靶标序列连接至pDONR207中；然后通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中；最后将构建好的载体转化至农杆菌LBA4404中。

表3 稳定遗传干扰引物信息

（8）本氏烟草的转化

将种在MS基本培养基上的本氏烟草叶片，切成0.4 × 0.6 cm大小的小段（除去边缘和主要叶脉），放入OD₆₀₀为0.1-0.2的含有阳性质粒的农杆菌LBA4404菌液中浸泡5 min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液。然后将小叶片置于铺有一层滤纸的烟草芽分化培养基（MS + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2 mg/L）上进行培养，25℃暗室内培养3天。将经过共培养的烟草外植体转移到含有相应抗生素的筛选培养基（MS +NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2 mg/L +Kan 100 mg/L + Carb 500 mg/L）中进行培养，光照周期为16 h光照/8 h黑暗。2 - 3周后待抗性芽生长至1 - 2 cm高时，用无菌手术刀切下小芽转入生根培养基（MS + Kan 100mg/L + Carb 500 mg/L）中诱导生根，1 ~ 2周后就会有不定根形成。然后提取转基因植物DNA，并进行PCR检测（表4），获得转基因阳性植株。

表4 检测引物信息

（9）真菌生物量检测

为了比较转基因本氏烟草与野生型本氏烟草中病原菌的生物量变化，利用qRT-PCR测定不同植物基因型根部大丽轮枝菌的生物量。提取接菌12天本氏烟草根部总DNA，以大丽轮枝菌内部转录间隔区ITS为靶标片段，同时以本氏烟草的持家基因actin为持家片段，进行相对定量测定（如表5）。

qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2^-∆∆Ct法进行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

表5 荧光定量引物信息

（10）靶标基因的表达量分析

为了确定本氏烟草抗性的提高与靶标基因的下降存在一定的关系，利用用qRT-PCR进一步测定本氏烟草中靶标基因的转录水平。提取接菌12天本氏烟草根中总RNA，并进行反转录分析。以病原菌中VdNRPS4基因的编码序列设计引物作为目的片段（表6），同时以病原菌actin作为持家片段，进行转录水平的相对定量测定。

表6 荧光定量引物信息

实验结果

（1）大丽轮枝菌VdNRPS4干扰载体的构建

本实验采用清华刘玉乐老师提供的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）载体（图1）。TRV的cDNA位于双35S启动子和胭脂碱合成酶终止子（nopalinesynthaseterminator，NOSt）之间。TRV1包含了病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNApolymerase，RdRp）、可移动蛋白（MovementProtein，MP）、16 kDa富含半胱氨酸区域等其它元件。TRV2包含病毒的衣壳蛋白（coat protein，CP）、多克隆位点（multiple cloningsite，MCS）等其它元件。多克隆位点的引入，方便了外源基因的插入。

根据大丽轮枝菌VdNRPS4编码序列信息，设计引物，扩增获得针对靶标基因的5个不同区段（图2）。

通过BamH I和EcoR I将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体。通过菌液扩增和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致（图3）。然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101，用于本氏烟草的注射。

（2）本氏烟草的病情指数分析

从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明接种后的第7天，本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，选择了从注射VIGS系列载体后的第7天，进行10⁶个/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的第10天（days post-inoculation，dpi）、11 dpi和12 dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果为图4所显示：与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。VdNRPS4-1、VdNRPS4-2以及VdNRPS4-5三组烟草中，病情指数一直保持在较低水平，初步说明这三段靶标片段的引入可以降低植物的病情指数。

（3）转基因植株的获得

通过VIGS筛选的方法，获得了3个可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段。为了进一步验证VdNRPS4与病原菌致病性之间的关系以及干扰后能显著降低病原菌致病力的区段，获得稳定遗传的转基因本氏烟草，设计了针对靶标基因的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段，从扩增的电泳图（图5）中可以发现明亮的目的条带。通过进一步的DNA测序、比对后发现，序列与靶标序列完全一致。

通过BP反应和LR反应，将克隆获得的3个VdNRPS4靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0（图6）上，形成含有真菌靶标基因的植物转化载体。

为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因VdNRPS4的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草（图7）。

（4）转基因烟草的抗病性分析

对获得的含有dsVdNRPS4-1、dsVdNRPS4-2、dsVdNRPS4-5的阳性转基因烟草，进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后第10天、第11天和第12天进行病情指数分析。从图8中可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约40-85%。提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。根据图9可见，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，约为野生型的20-40%。病情指数统计以及真菌生物量分析，可以明显观察到转基因阳性烟草对病原菌具有更强的抗性。

为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约50-80%（图10）。同时，图片显示RNAi-VdNRPS4转基因烟草的抗病性明显优于野生型烟草。并且根据三个材料的病情指数、真菌量和靶标基因表达量检测，表明VdNRPS4基因的区段1（其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示）作为靶标片段设计dsRNA，可以达到最佳的干扰效果，从而可以有效降低病原菌的致病力。

Claims

1.大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.由权利要求1所述的大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段所转录的dsRNA。

3.含有权利要求1所述的大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段的RNA干扰载体；其中，所述RNA干扰载体是Gateway干扰载体。

4.一种构建权利要求3所述RNA干扰载体的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段插入到Gateway干扰载体，即得。

5.权利要求1所述大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段在提高植物对大丽轮枝菌所导致病害抗性中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建含有权利要求1所述大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段的Gateway干扰载体；（2）将所构建的Gateway干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌所导致病害抗性提高的转基因植物。

7.权利要求3所述的RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌所导致疾病的抗性中的应用，包括：（1）将所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（2）筛选获得对大丽轮枝菌所导致疾病抗性提高的转基因植物。

8.一种培育抗大丽轮枝菌所导致病害的转基因植物品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建含有权利要求1所述大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段的RNA干扰载体；（2）将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌所导致疾病的抗性提高的转基因植物品种。

9.根据权利要求5或7所述的应用，其特征在于，所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，包括但不限于烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种。