CN111424022A

CN111424022A - 大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用

Info

Publication number: CN111424022A
Application number: CN202010534157.8A
Authority: CN
Inventors: 苏晓峰; 郭惠明; 程红梅
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2040-06-12
Also published as: CN111424022B

Abstract

本发明公开了大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用。本发明采用寄主诱导的基因沉默技术以高致病力的大丽轮枝菌株为材料构建多个针对大丽轮枝菌靶标基因外切葡聚糖酶的烟草脆裂病毒干扰质粒，通过农杆菌注射的方法转化本氏烟草并进行大丽轮枝菌接种，将其中可以明显降低植物病情指数的靶标区段构建Gateway干扰载体获得稳定遗传的转基因植物，通过病情指数以及分子生物学手段检测真菌生物量以及靶标基因的转录水平筛选到效果最佳的干扰区段。本发明所筛选得到的VdEG靶基因片段以及采用该靶基因片段所构建的Gateway干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

Description

大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段以及含有所述靶基因片段的干扰载体，本发明进一步涉及所述大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段以及所述干扰载体在提高植物对病原菌抗性中的应用，属于大丽轮枝菌抗病原菌靶基因片段及应用领域。

背景技术

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）是一种危害极其严重土传维管束真菌病害，寄主范围非常广泛，能侵染棉花、向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等两百多种经济作物，给中国乃至世界造成极大的经济损失（HillocksI R. Cotton diseases. Centre Agriculture BioscienceInternational, 1992: 240 ~ 257.），而且其后期产生的微菌核可以在极其恶劣的环境下存活数年甚至更长的时间（Klosterman SJ, Atallah ZK, Vallad GE, Subbarao KV:Diversity, pathogenicity, and management of Verticillium species. Ann RevPhytopathol 2009,47:39 – 62.），主要存在于土壤耕作层，是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和初侵染源，用药剂难于防治，成为农业物生产发展的瓶颈（Fradin EF, ThommaBP: Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused byV. dahliae and V. albo-atrum. Mol Plant Pathol 2006, 7:71 – 86.)。鉴于其严重的危害性，探究大丽轮枝菌致病机理和寄主与病原菌之间的相互作用机制一直是研究的热点（Luo X, Xie C, Dong J, Yang X, Sui A. Interactions between Verticillium dahliae and its host: vegetative growth, pathogenicity, plant immunity.Applied microbiology and biotechnology 2014, 98: 6921-6932.）。如何增强寄主植物体对大丽轮枝菌的抗病性是急待解决的问题。

棉花黄萎病（Verticillium Wilt of cotton）被称为“棉花癌症”，在全国范围内每年造成的经济损失可高达3亿美元，是棉花生产上最重要的病害之一。棉花黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae），在整个棉花生长阶段内，它都能够进行侵染；发病严重时，整个棉花叶片枯焦破碎，脱落成光杆。同时，它的寄主范围广泛，可侵染的植物种类达六百多种，包括十字花科、茄科、菊科和蔷薇科等多种具有重要经济价值的农作物、苗木和花卉等植物，并且可侵染的寄主的范围还在不断扩大（Klosterman, S. J.; Atallah,Z. K.; Vallad, G. E.; Subbarao, K. V., Diversity, pathogenicity, andmanagement of Verticillium species. Annu. Rev. Phytopathol. 2009,47, 39-62.）。由于病原菌可经封传播且在统管束系统中存在，所以防治起来非常困难，目前生产上还没有有效的防治药剂。

细胞壁作为植物防御的第一道屏障，在抵御病原菌侵染中发挥着重要作用。在与寄主植物长期的互作和进化过程中，病原菌逐渐形成了一套复杂的侵染机制，能够分泌大量的细胞壁降解酶（CWDEs）来降解细胞壁中的某些成分。该酶系在真菌侵染寄主植物时发挥着非常重要的作用，往往为病原菌毒性因子的必要成分，可协助病原真菌侵入寄主的根部从而到达维管束系统中，以利于病原菌自身的侵染、定殖和营养吸收，进而破坏内部的果胶和形成胼胝体，与病原真菌致病力高低有密切关系（Mendgen, K.; Hahn, M., Plantinfection and the establishment of fungal biotrophy. Trends Plant Sci. 2002,7 (8), 352-356.）。

细胞壁降解酶中的大丽轮枝菌外切葡聚糖酶基因（Exoglucanase，VdEG）属于GH7家族蛋白一员；其蛋白三维构象主要包括β-三明治（β-sandwich）结构和环形区域（loop）。环形区域延伸至β-三明治结构内部，形成一个隧道（tunnel），隧道末端含有催化残基Glu228、Asp230和Glu233，同时4个纤维素结合残基Trp54、Trp56、Trp385和Trp394则位于隧道内部。以前对于外切葡聚糖酶的研究，主要集中于酶学方面的，对其在致病力方面的作用研究较少。

发明内容

本发明的目的之一是提供大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段；

本发明的目的之二是提供含有所述大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段的干扰载体；

本发明的目的之三是将所述大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段以及含有该靶基因片段的干扰载体应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性或构建获得抗大丽轮枝菌感染的转基因植物新品种。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了能够提高植物抗病原菌的大丽轮枝菌VdEG靶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示；优选的，所述靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明还公开了含有所述的大丽轮枝菌VdEG靶基因片段的干扰载体以及含有所述干扰载体的宿主细胞。

此外，由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的靶基因片段所转录的RNA也自然包含在本发明的保护范围之内。

本发明所述大丽轮枝菌VdEG靶基因片段能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括以下步骤：（1）构建含有所述大丽轮枝菌VdEG靶基因片段的干扰载体；（2）将所构建的干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

优选的，一种构建所述干扰表达载体的方法，包括：通过BP反应，将所述的大丽轮枝菌VdEG靶基因片段连接至pDONR207中再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中，得到Gateway干扰载体。

本发明所述干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括以下步骤：（1）将所述干扰载体转化到植物或植物细胞中；（2）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

本发明进一步公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤：（1）构建含有所述大丽轮枝菌VdEG靶基因片段的干扰载体；（2）将所构建的干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。

所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移等。

本发明所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物，包括：烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。

本发明采用寄主诱导的基因沉默技术（Host-induced gene silencing），以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，构建多个针对大丽轮枝菌靶标基因外切葡聚糖酶（exoglucanase，VDAG 02898.1）的烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）干扰质粒。通过农杆菌注射的方法转化本氏烟草（Nicotina benthamiana）并进行大丽轮枝菌接种，将其中可以明显降低植物病情指数的靶标区段构建Gateway干扰载体，获得稳定遗传的转基因植物，进一步通过病情指数以及分子生物学手段检测真菌生物量以及靶标基因的转录水平，筛选到效果最佳的干扰区段。本发明所筛选得到的大丽轮枝菌VdEG靶基因片段以及应用该靶基因片段所构建的Gateway干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

本发明整体技术方案详述

本发明根据大丽轮枝菌VdEG编码序列信息，设计引物，扩增获得针对靶标基因的4个不同区段（其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示）。通过BamH I和EcoR I将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中成为VIGS系列RNAi载体。通过酶切和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致，然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101用于本氏烟草的注射。从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明接种后的第7天本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，选择了从注射VIGS系列载体后的第7天，进行10⁶个/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的第10天（days post-inoculation，dpi）、11 dpi和12 dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果显示：与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。部分基因组烟草中，病情指数一直保持在较低水平，初步说明靶标片段的引入可以降低植物的病情指数。

本发明通过VIGS筛选的方法获得了可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段，为了进一步验证VdEG与病原菌致病性之间的关系以及干扰后能显著降低病原菌致病力的区段，获得稳定遗传的转基因本氏烟草，本试验进一步设计了针对靶标基因的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。通过BP反应和LR反应，将克隆获得的2个VdEG靶标片段（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3）连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上，形成含有真菌靶标基因的植物转化载体。为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因VdEG的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草。对获得的含有dsVdEG的阳性转基因烟草进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后第10天、第11天和第12天进行病情指数分析。从病情指数分析结果可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约60-85%。提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。结果表明，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，约为野生型的10-25%。病情指数统计以及真菌生物量分析，可以明显观察到RNAi-VdEG-1组转基因烟草对病原菌具有更强的抗性。

为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约65%。同时，图片显示RNAi-VdEG-1转基因烟草的抗病性明显优于野生型以及RNAi-VdEG-3转基因烟草，这说明VdEG基因的区段1（其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示）作为靶标片段设计dsRNA可以达到最佳的干扰效果，从而可以有效降低病原菌的致病力。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992)；Rossolini等人, Mol Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“RNA干扰（RNA interference, RNAi）”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同原序列的基因表达沉默的现象。

附图说明

图1 VIGS载体信息。

图2 VIGS不同区段扩增结果；M：marker，1-4为针对VdEG基因的不同区段扩增结果。

图3 VIGS干扰载体酶切验证；M为marker，1-4为针对VDEG基因构建VIGS质粒的酶切结果。

图4病情指数统计。

图5 RNAi扩增结果；M为marker，1和2为针对VdEG的扩增条带。

图6 RNAi载体信息。

图7转基因阳性烟草PCR检测；M：marker，1-5为RNAi-VdEG-1转基因烟草，6-10为RNAi-VdEG-3转基因烟草；wt为野生型烟草。

图8转基因烟草病情指数分析。

图9植物体内真菌生物量分析。

图10植物体内真菌靶标基因表达量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段的筛选、干扰载体的构建和转烟草抗病性应用

⒈材料和方法

⑴材料

烟草：本氏烟草（Nicotiana benthamiana）品系。

培养条件：种植于高温高压灭菌的混合营养土（芳洁营养土：蛭石 = 1：1）中，温度23 ± 2℃，相对湿度75 ± 5 %，光周期L：D为16 h：8 h。

⑵菌株和质粒

棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）V991，高致病力落叶型菌株，由中国农科院植物保护研究所简桂良研究员惠赠。

病毒载体：烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）双元载体（TRV1与TRV2）由清华大学刘玉乐教授惠赠。

农杆菌：菌株GV3101 和LBA4404，由本发明人实验室保存。

植物稳定遗传载体：pDONR207和pK7GWIWG2(I),0载体由本发明人实验室保存。

⑶真菌的培养以及植物接种方式

将大丽轮枝菌孢子培养于液体CM培养基中，25℃振荡培养5-7天。经5层纱布过滤，离心收集孢子。用蒸馏水稀释，并在显微镜下观察，将孢子浓度调整至10⁶个/mL后备用。

当本氏烟草的叶片长至6 - 8片真叶时，选取长势一致的幼苗进行接种。用镊子从根部将幼苗挖出，并在蒸馏水中清洗根部泥土。将幼苗根部完全浸泡于稀释好的10⁶个/mL孢子悬液或蒸馏水中2 min后，尽快将幼苗移回原来的塑料钵中，并浇水，使土壤湿润，进行病情指数统计。

⑷植物病情指数统计

根据相关文献（Wang HM, Lin ZX, Zhang XL, Chen W, Guo XP, Nie YC, Li YH.2008. Mapping and quantitative trait loci analysis of verticillium wiltresistance genes in cotton. Journal of Integrative Plant Biology 50: 174-182.）并做出适当调整，制定本试验中本氏烟草感染大丽轮枝菌的病情等级（如表1）。病情指数计算公式如下（公式1）：

⑸VIGS干扰载体的构建

为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌外切葡聚糖酶（exoglucanase，VDAG 02898.1）的编码序列，设计4对特异性引物，引物两端含有EcoRI和BamHI酶切位点（如表2），分别对目的片段进行扩增。然后利用l％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并进行片段回收。将目的片段以及载体分别进行酶切反应，并利用T₄连接酶将其构建至TRV2载体中。最后，利用酶切以及测序分析，将验证好的阳性质粒转化至农杆菌GV3101中。

⑹VIGS转化方法

将含有阳性质粒的农杆菌单克隆放于LB液体培养基（25 µg/mL Rif和50 µg/mL Kan）中，28℃摇床过夜培养。次日将菌液（比例为2%）加入LB液体培养基中再次培养，振荡培养至OD₆₀₀为0.5-0.6时，低温离心收集菌体。弃去废液，将菌体重悬于注射基质（10 mM MES、10mM MgCl₂、100µM 乙酰丁香酮）中，调整OD₆₀₀至0.8-1.0。把两种农杆菌菌株（TRV1与TRV2+靶标基因片段）以1：1混合，在室温中静置3-5 h，不要摇动，最后利用注射器将农杆菌混合液注射于最嫩的叶片中。

⑺稳定遗传载体的构建

为了获得稳定遗传的含有靶标基因dsRNA的本氏烟草，对能够明显提高植物对病原菌抗性的DNA区段，重新设计引物（两端含有部分BP位点），然后再用attb引物进行扩增（如表3），用于稳定遗传干扰载体的构建。通过BP反应，将靶标序列连接至pDONR207中；然后通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中，最后将构建好的载体转化至农杆菌LBA4404中。

⑻本氏烟草的转化

将种在MS基本培养基上的本氏烟草叶片，切成0.4×0.6 cm大小的小段（除去边缘和主要叶脉），放入OD₆₀₀为0.1-0.2的含有阳性质粒的农杆菌LBA4404菌液中浸泡5 min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液。然后将小叶片置于铺有一层滤纸的烟草芽分化培养基（MS+ NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2 mg/L）上进行培养，25℃暗室内培养3天。将经过共培养的烟草外植体转移到含有相应抗生素的筛选培养基（MS + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2 mg/L + Kan100 mg/L + Carb 500 mg/L）中进行培养，光照周期为16 h光照/8 h黑暗。2-3周后待抗性芽生长至1 - 2 cm高时，用无菌手术刀切下小芽转入生根培养基（MS + Kan 100 mg/L +Carb 500 mg/L）中诱导生根，1 ~2周后就会有不定根形成。然后提取转基因植物DNA，并进行PCR检测（如表4），获得转基因阳性植株。

⑼真菌生物量检测

为了比较转基因本氏烟草与野生型本氏烟草中病原菌的生物量变化，利用qRT-PCR测定不同植物基因型根部大丽轮枝菌的生物量。提取接菌12天本氏烟草根部总DNA，以大丽轮枝菌内部转录间隔区ITS为靶标片段，同时以本氏烟草的持家基因actin为持家片段，进行相对定量测定（如表5）。

qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2^-∆∆Ct法进行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

⑽靶标基因的表达量分析

为了确定本氏烟草抗性的提高与靶标基因的下降存在一定的关系，利用qRT-PCR进一步测定本氏烟草中靶标基因的转录水平。提取接菌12天本氏烟草根中总RNA，并进行反转录分析。以病原中VdEG基因的编码序列设计引物作为目的片段（表6），同时以病原菌actin作为持家片段，进行转录水平的相对定量测定。

⒉试验结果

⑴大丽轮枝菌VdEG干扰载体的构建

本试验采用清华刘玉乐老师提供的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）载体（图1）。TRV的cDNA位于双35S启动子和胭脂碱合成酶终止子（nopaline synthaseterminator，NOSt）之间。TRV1包含了病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNApolymerase，RdRp）、可移动蛋白（Movement Protein，MP）、16 kDa富含半胱氨酸区域等其它元件。TRV2包含病毒的衣壳蛋白（coat protein，CP）、多克隆位点（multiple cloningsite，MCS）等其它元件。多克隆位点的引入，方便了外源基因的插入。

根据大丽轮枝菌VdEG编码序列信息，设计引物，扩增获得针对靶标基因的4个不同区段（图2）。

通过BamH I和EcoR I将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中成为VIGS系列RNAi载体。通过酶切和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致（图3）。然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101用于本氏烟草的注射。

⑵本氏烟草的病情指数分析

从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明接种后的第7天本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，选择了从注射VIGS系列载体后的第7天，进行10⁶个/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的第10天（days post-inoculation，dpi）、11 dpi和12 dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果显示（图4）：与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。部分基因组烟草中，病情指数一直保持在较低水平，初步说明靶标片段的引入可以降低植物的病情指数。

⑶转基因植株的获得

通过VIGS筛选的方法，获得了可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段。为了进一步验证VdEG与病原菌致病性之间的关系以及干扰后能显著降低病原菌致病力的区段，获得稳定遗传的转基因本氏烟草，本试验进一步设计了针对靶标基因的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。从电泳图5中可以发现明亮的目的条带。通过进一步的DNA测序、比对后发现，序列与靶标序列完全一致。

通过BP反应和LR反应，将克隆获得的2个VdEG靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0（图6）上，形成含有真菌靶标基因的植物转化载体。为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因VdEG的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草（图7）。

⑷转基因烟草的抗病性分析

对获得的含有dsVdEG的阳性转基因烟草，进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后第10天、第11天和第12天进行病情指数分析。从图8可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约60-85%。提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。图9表明，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，约为野生型的10-25%。病情指数统计以及真菌生物量分析，可以明显观察到RNAi-VdEG-1组转基因烟草对病原菌具有更强的抗性。

为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约65%（图10）。同时，图片显示RNAi-VdEG-1组转基因烟草的抗病性明显优于野生型以及RNAi-VdEG-3转基因烟草，这说明VdEG基因的区段1（SEQ ID No.1）作为靶标片段设计dsRNA，可以达到最佳的干扰效果，从而可以有效降低病原菌的致病力。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用

<130> BJ-2002-200429A-L

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 456

<212> DNA

<213> Verticillium dahliae

<400> 1

agacacatcc tcccctcacc tggaaggact gctcatccgg cacatgcagc gatgttcaag 60

gctccgtcgt cgttgacgcc aactggcgtt gggtccacgc agttggcggc tacgagaact 120

gctacgacgg caacgactgg accggtctct gcactggagc cgacgactgc gcgaagaact 180

gcgcggttga gggtgagaac tatgcgacga catatggcat cacaacgagc ggcaacgccc 240

tgcgcctcaa ctttgtgacc gagcaccagt acggcacaaa tgtcgggtct aggacctacc 300

tactgcagga tgacgagacg taccaaatgt tcacgctgct gaacaacgag ttctcgttca 360

cggttgacct gtcgacggtc gagtgtggaa tcaacagcgc gctctacttt gtgcccatga 420

agcctgatgg cggcaagagc gatgagccga acaacg 456

<210> 2

<211> 447

<212> DNA

<213> Verticillium dahliae

<400> 2

tgaccgagca ccagtacggc acaaatgtcg ggtctaggac ctacctactg caggatgacg 60

agacgtacca aatgttcacg ctgctgaaca acgagttctc gttcacggtt gacctgtcga 120

cggtcgagtg tggaatcaac agcgcgctct actttgtgcc catgaagcct gatggcggca 180

agagcgatga gccgaacaac gctgcaggcg ccaagtacgg tgtcggttac tgcgactccc 240

agtgcgcccg ggacctgaag tttgtcaacg gcaagggaaa cattgagggc tggacccctt 300

ctgcgaccga tcccgcctct ggtgttggca atctcggtgc ttgctgcgct gagattgatg 360

tctgggagtc aaacgcctgg tcgtacgcct tgacgcccca cggttgcgag gacaacaact 420

accacgtctg tggcgatggt gccattg 447

<210> 3

<211> 420

<212> DNA

<213> Verticillium dahliae

<400> 3

ctctggtgtt ggcaatctcg gtgcttgctg cgctgagatt gatgtctggg agtcaaacgc 60

ctggtcgtac gccttgacgc cccacggttg cgaggacaac aactaccacg tctgtggcga 120

tggtgccatt gagtgcggcg gcacgtactc gcaggatcgc tttgctggca agtgtgatgc 180

caatggctgc gactacaacc cttaccgtct cggcaacccc gagttctacg gcaagaacaa 240

ggtcgtcaac accaacgagc cgttcaccgt tgtgactcga ttctctccca acgagctgtc 300

gacgacattc atccagaacg atgaggtcat tgaggtcccg gtgcccaatt cggagggcgt 360

ccccagcgac agcaacacgg tcaacccgga gtactgcaca gcctacaaca ttgcgtggga 420

<210> 4

<211> 405

<212> DNA

<213> Verticillium dahliae

<400> 4

acattcatcc agaacgatga ggtcattgag gtcccggtgc ccaattcgga gggcgtcccc 60

agcgacagca acacggtcaa cccggagtac tgcacagcct acaacattgc gtgggacgag 120

cgtgacaggc aggccgagat tggcggcttc ggcgccctca acagcgccct cgccctgccc 180

atggttgtcg ttctgtccat ttgggccgat cactacgcca atatgctttg gctcgactcg 240

atttacccgc ctgaggaccc caccaagccc ggcgcggccc gcggcgcgtg ccccacggac 300

tctggtgtcc cctcggctgt cattgcgcag aacccgagcg cgcacgtcgt ctggtccgac 360

attcgctacg gccccatcgg ctcgacctac gacattcctg cgtaa 405

Claims

1.大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）外切葡聚糖酶抗病原菌靶基因片段，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。

2.按照权利要求1所述的大丽轮枝菌外切葡聚糖酶抗病原菌靶基因片段，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

3.由权利要求1或2所述大丽轮枝菌外切葡聚糖酶抗病原菌靶基因片段所转录的RNA。

4.含有权利要求1或2所述大丽轮枝菌外切葡聚糖酶抗病原菌靶基因片段的RNA干扰载体；优选的，所述RNA干扰载体是Gateway干扰载体。

5.一种构建权利要求4所述RNA干扰载体的方法，其特征在于，包括：将权利要求1或2所述的大丽轮枝菌外切葡聚糖酶抗病原菌靶基因片段插入到Gateway干扰载体，即得；

优选的，通过BP反应，将权利要求1或2所述的大丽轮枝菌外切葡聚糖酶抗病原菌靶基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中得到Gateway干扰载体。

6.权利要求1或2所述大丽轮枝菌外切葡聚糖酶抗病原菌靶基因片段在提高植物对大丽轮枝菌抗病性中的应用。

7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建含有权利要求1或2所述大丽轮枝菌外切葡聚糖酶抗病原菌靶基因片段的Gateway干扰载体；（2）将所构建的Gateway干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

8.权利要求4所述RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌的抗病性中的应用，包括：（1）将所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（2）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

9.一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建含有权利要求1或2所述大丽轮枝菌外切葡聚糖酶抗病原菌靶基因片段的RNA干扰载体；（2）将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。

10.按照权利要求6或8所述的应用，其特征在于，所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物；优选为农作物，包括：烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。