CN105255909A - 大丽轮枝菌寡糖基转移酶靶基因片段及其干扰载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段及其干扰载体和应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。本发明采用寄主诱导的基因沉默技术筛选寡糖基转移酶复合体STT3亚基基因中能明显降低病情指数的靶基因片段，进一步构建Gateway干扰载体，获得对病原菌抗性明显提高的稳定遗传的转基因烟草。通过病情指数、真菌生物量分析和靶基因转录水平检测，最终筛选得抗大丽轮枝菌效果最佳的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因干扰区段。本发明大丽轮枝菌相关的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段及RNA干扰载体能应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病能力以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

Description

大丽轮枝菌寡糖基转移酶靶基因片段及其干扰载体和应用

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段以及该靶基因片段所转录的RNA，还涉及含有所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的干扰载体，本发明进一步涉及所述大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段或干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)，是一种土传性病原真菌，可以危害多种经济作物、果树和观赏花卉，造成巨大的经济损失(FradinEF,ThommaBP.PhysiologyandmolecularaspectsofVerticilliumwiltdiseasescausedbyV.dahliaeandV.albo-atrum.Molecularplantpathology2006,7:71-86.PangJ,ZhuY,LiQ,etal.DevelopmentofAgrobacterium-mediatedvirus-inducedgenesilencingandperformanceevaluationoffourmarkergenesinGossypiumbarbadense.PLoSOne2013,8:e73211.)。病原菌由植物根部的伤口侵入，并在维管束系统内大量繁殖，导致植物生长发育迟缓，叶片枯萎甚至死亡(TsrorL,LevinAG.VegetativecompatibilityandpathogenicityofVerticilliumdahliaeKleb.isolatesfromOliveinIsrael.JournalofPhytopathology2003,151:451-455.)。由于病原菌在土壤内存活能力很强，周期非常长，并且主要存在于寄主的维管束系统内，因此针对此现状，采取以预防为主，综合治理的方式。植株一旦发病，目前在大田中还没有非常有效的防治措施和药剂。

众所周知，如果没有生物体内复杂的蛋白修饰及加工系统，蛋白不会发挥应有的生物学功能。在内质网膜上进行的糖蛋白的组装过程中，寡糖基转移酶复合体催化核心的寡糖基因连接到新合成的多肽上。此外，对于真核生物体来说，蛋白完全丢失N端的糖基化修饰那是非常致命的(HeleniusA,AebiM.IntracellularfunctionsofN-linkedglycans.Science2001,291:2364-2369.SilbersteinS,GilmoreR.Biochemistry,molecularbiology,andgeneticsoftheoligosaccharyltransferase.FASEBJournal1996,10:849-858.)。除了负责糖基化蛋白的生成，寡糖基转移酶复合体还在分泌蛋白调节过程中作为重要的“开关”元件(DempskiRE,ImperialiB.Oligosaccharyltransferase:gatekeepertothesecretorypathway.CurrentOpinioninChemicalBiology2002,6:844-850.)。最近，酿酒酵母的寡糖基转移酶复合体的9个亚基被全部鉴定出来，其中包括STT3亚基。其中的任何一个亚基的突变，将会造成复合体功能的丧失(KnauerR,LehleL.Theoligosaccharyltransferasecomplexfromyeast.BiochimicaBiophysicaActa1999,1426:259-273.)。STT3亚基的突变，将会影响复合体对底物的特异性识别(ZuffereyR,KnauerR,BurdaP,etal.STT3,ahighlyconservedproteinrequiredforyeastoligosaccharyltransferaseactivityinvivo.EMBOJournal1995,14:4949-4960.)。位于内膜系统STT3a亚基的突变，可以提高拟南芥对于NaCl和渗透压的敏感度(KoiwaH,LiF,McCullyMG,etal.TheSTT3asubunitisoformoftheArabidopsisoligosaccharyltransferasecontrolsadaptiveresponsestosalt/osmoticstress.PlantCell2003,15:2273-2284.)。拟南芥STT3a突变后，会减少受体类激酶表达量的减少，从而使植物的免疫力下降(SaijoY,TintorN,LuX,etal.Receptorqualitycontrolintheendoplasmicreticulumforplantinnateimmunity.EMBOJournal2009,28:3439-3449.)。酿酒酵母的STT3突变后，可以影响蛋白持的N-糖基化进程，进而影响细胞壁的合成(ChavanM,SuzukiT,RekowiczM,etal.Genetic,biochemical,andmorphologicalevidencefortheinvolvementofN-glycosylationinbiosynthesisofthecellwallbeta1,6-glucanofSaccharomycescerevisiae.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoffheUnitedStatesofAmerica2003,100:15381-15386.)。

以前对于寡糖基转移酶复合体STT3亚基的研究，主要集中于酶学方面的基本性质(如酶在新合在蛋白质的加工、细胞壁合在以及信号传导中的作用等)，在真菌中的研究较少，尤其是其与致病性之间的关系。因此，以大丽轮枝菌的寡糖基转移酶复合体STT3亚基作为靶基因，研究其与病原菌致病力之间的关系，筛选得到与抗大丽轮枝菌相关的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段，对于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性将具有重要的意义。

发明内容

本发明目的之一是提供大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段以及所转录的RNA；

本发明所目的之二是提供含有所述大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的RNA干扰载体和宿主细胞；

本发明目的之三是将所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段或其转录的RNA应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性或构建获得抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段，其核苷酸序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示；优选的，所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的核苷酸序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示；最优选的，所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示。

本发明采用寄主诱导的基因沉默技术(Host-inducedgenesilencing)，以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，根据大丽轮枝菌STT3编码序列信息(其核苷酸序列为SEQIDNo.6所示)，设计5对引物，克隆获得针对靶基因的5个不同区段，其核苷酸序列分别为SEQIDNo.1-5所示。本发明进一步将克隆获得的大丽轮枝菌基因的5个靶标片段分别构建至TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体并转化农杆菌，用于本氏烟草的注射，从注射VIGS干扰载体后的第7天进行大丽轮枝菌接种。病情指数分析结果表明，与空载相比，注射真菌靶基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；其中分别注射VIGS系列载体VIGS-1(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示)、VIGS-4(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示)、VIGS-5(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.5所示)的烟草，病情指数一直保持在较低水平，初步说明靶标片段的引入与病原菌的致病性存在一定关系，它们可以降低植物的病情指数。

此外，由SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段所转录的RNA也自然包含在本发明的保护范围之内。

本发明所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段或所述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段所转录的RNA能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括以下步骤：(1)构建含有所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的RNA干扰表达载体；(2)将所构建的RNA干扰表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

本发明进一步公开了含有所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因的RNA干扰载体以及含有所述RNA干扰载体的宿主细胞。

构建含有所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因的RNA干扰载体的方法为本领域技术人员所熟知，优选为Gateway技术，只需BP反应和LR反应就可以完成RNA干扰表达载体的构建。

优选的，一种构建RNA干扰表达载体的方法，包括：通过BP反应，将所述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中，得到Gateway干扰载体。

本发明所述RNA干扰载体也能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括以下步骤：(1)将所述RNA干扰表达载体转化到植物或植物细胞中；(2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

本发明还公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤：(1)构建含有所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的RNA干扰表达载体；(2)将所构建的RNA干扰表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。

本发明所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化和直接基因转移等。

本发明所述植物包括：大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物，包括：棉花、烟草、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。

本发明根据瞬时转化的烟草病情指数的变化，选择核苷酸序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的寡糖基转移酶复合体STT3亚基三个DNA区段，用于Gateway干扰载体的构建。通过BP反应和LR反应，将上述3个靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上，形成含有真菌靶基因的植物转化载体，转化至农杆菌，用于本氏烟草转化，最终获得转基因烟草。

本发明进一步对含有寡糖基转移酶复合体STT3亚基基因不同区段dsRNA的阳性转基因烟草进行大丽轮枝菌接种和病情指数分析。结果表明，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约55-80％。通过提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析，结果表明转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，仅为野生型的30-50％。通过病情指数统计、真菌生物量分析以及靶基因的表达量分析结果，可以明显观察到RNAi-4组(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示)转基因烟草对病原菌具有更强的抗性，说明寡糖基转移酶复合体STT3亚基基因的区段4(核苷酸序列为SEQIDNo.4所示)作为靶标片段设计dsRNA，可以达到最佳的干扰效果，从而可以有效降低病原菌的致病力。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明采用寄主诱导的基因沉默技术(Host-inducedgenesilencing)，以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，根据大丽轮枝菌STT3编码序列信息，设计5对引物，克隆获得针对靶基因的5个不同区段，从中筛选获得了能够明显降低植物病情指数的3个靶标区段，进一步构建载体，获得稳定遗传的转基因植物。通过病情指数分析以及检测真菌生物量和靶基因的转录水平，筛选到效果最佳的干扰区段，其核苷酸序列为SEQIDNo.4所示。本发明所述与抗大丽轮枝菌相关的寡糖基转移酶复合体STT3亚基基因靶基因片段以及RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,NucleicAcid.Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes.8:91-98(1994))。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“RNA干扰(RNAinterference,RNAi)”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。

附图说明

图1为VIGS载体信息；

图2为VIGS不同区段扩增结果；其中，M：marker；1-5为针对寡糖基转移酶复合体STT3亚基基因的不同区段扩增结果；

图3为VIGS干扰载体酶切验证；其中，M为marker；1-5为针对寡糖基转移酶复合体STT3亚基基因构建VIGS质粒的酶切结果；

图4为病情指数统计；

图5为RNAi扩增结果；其中，M为marker；1，2，3为针对寡糖基转移酶复合体STT3亚基的扩增条带；

图6为RNAi载体信息；其中，A：pDONR207载体信息；B：pK7GWIWG2(I),0载体信息；

图7为转基因阳性烟草PCR检测；其中，M：marker，1-4为转基因烟草，wt为野生型烟草，N为阴性对照；

图8为转基因阳性烟草PCR检测；其中，M：marker，1-4为转基因烟草，wt为野生型烟草，N为阴性对照；

图9为转基因阳性烟草PCR检测；其中，M：marker，1-4为转基因烟草，wt为野生型烟草，N为阴性对照；

图10为转基因烟草病情指数分析；

图11为植物体内真菌生物量分析；

图12为真菌体内靶基因相对表达量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料

1.1烟草

本氏烟草(Nicotianabenthamiana)品系。

培养条件：种植于高温高压灭菌的混合营养土(芳洁营养土：蛭石＝1：1)中，温度23±2℃，相对湿度75±5％，光周期L：D为16h：8h。

1.2菌株和质粒

棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)V991，高致病力落叶型菌株，由中国农科院植保所简桂良研究员惠赠。

病毒载体：烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)双元载体(TRV1与TRV2)由清华大学刘玉乐教授惠赠。

农杆菌：菌株GV3101和LBA4404，由本发明人实验室保存。

植物稳定遗传载体：pDONR207和pK7GWIWG2(I),0载体由本发明人实验室保存。

实施例1大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因筛选

1、实验方法

1.1VIGS干扰载体的构建

为了筛选获得干扰效果最佳的靶基因区段，根据大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基(oligosaccharyltransferaseSTT3subunit，VDAG_03232.1)的编码序列，设计5对特异性引物(表1)，引物两端含有EcoRI和BamHI酶切位点，分别对目的片段进行PCR扩增。然后利用l％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并进行片段回收。将目的片段以及载体分别进行酶切反应，并利用T₄连接酶将其构建至TRV2载体中。最后，利用酶切以及测序分析，将验证好的阳性质粒转化至农杆菌GV3101中。

表1STT3基因不同区段引物信息

注：加粗、斜体处为酶切位点。

1.2VIGS转化方法

将含有TRV1与TRV2+靶基因片段阳性质粒的农杆菌单克隆放于LB液体培养基(25μg/mLRif和50μg/mLKan)中，28℃摇床过夜培养。次日将菌液(比例为2％)加入LB液体培养基中再次培养，振荡培养至OD600为0.5-0.6时，低温离心收集菌体。弃去废液，将菌体重悬于注射基质(10mMMES、10mMMgCl₂、100μM乙酰丁香酮)中，调整OD600至0.8-1.0。把两种农杆菌菌株(TRV1与TRV2+靶基因片段)以1：1混合，在室温中静置3-5h，不要摇动。最后利用注射器将农杆菌混合液注射于最嫩的叶片中。

1.3真菌的培养以及植物接种方式

将大丽轮枝菌孢子培养于液体CM培养基中，25℃振荡培养5-7天。经5层纱布过滤，离心收集孢子。用蒸馏水稀释，并在显微镜下观察，将孢子浓度调整至10⁶个/ml后备用。

当本氏烟草的叶片长至6-8片真叶时，选取长势一致的本氏烟草幼苗进行大丽轮枝菌接种。用镊子从根部将幼苗挖出，并在蒸馏水中清洗根部泥土。将幼苗根部完全浸泡于稀释好的10⁶个/mL孢子悬液或蒸馏水中2min后，尽快将幼苗移回原来的塑料钵中，并浇水，使土壤湿润。

1.4植物病情指数统计

根据相关文献(WangHM,LinZX,ZhangXL,etal.MappingandquantitativetraitlocianalysisofVerticilliumwiltresistancegenesincotton.JournalofIntegrativePlantBiology2008,50:174-182.)，并做出适当调整，制定出了本氏烟草感染大丽轮枝菌的病情等级(表2)。病情指数计算公式如下：

病情指数＝[∑(number×level)/(totalplant×highestlevel)]×100

表2病情指数统计

2、实验结果

2.1大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基干扰载体的构建

本发明采用的为清华刘玉乐老师提供的烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)载体(图1)。TRV的cDNA位于双35S启动子和胭脂碱合成酶终止子(nopalinesynthaseterminator，NOSt)之间。TRV1包含了病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase，RdRp)、可移动蛋白(MovementProtein，MP)、16kDa富含半胱氨酸区域等其它元件。TRV2包含病毒的衣壳蛋白(coatprotein，CP)、多克隆位点(multiplecloningsite，MCS)等其它元件。多克隆位点的引入，方便了外源基因的插入。

本发明根据大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基编码序列信息(其核苷酸序列为SEQIDNo.6所示)，设计引物，扩增获得针对靶基因的5个不同区段(图2)，其核苷酸序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示。

通过BamHI和EcoRI将克隆获得的大丽轮枝菌基因的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体。通过酶切和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致(图3)。然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101，用于本氏烟草的注射。

2.2本氏烟草的病情指数分析

从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明，接种后的第7天，本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，本发明选择了从注射VIGS系列载体后的第7天，进行10⁶个/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的第10天(dayspost-inoculation，dpi)、11dpi和12dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果显示(图4)，与空载相比，注射真菌靶基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。部分基因组烟草中，即分别注射了VIGS系列载体VIGS-1(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示)、VIGS-4(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示)、VIGS-5(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.5所示)，病情指数一直保持在较低水平，初步说明靶标片段的引入与病原菌的致病性存在一定关系，它们可以降低植物的病情指数。

实施例2Gateway干扰载体的构建及植物转化

1、实验方法

1.1稳定遗传载体的构建

为了获得稳定遗传的含有靶基因dsRNA的本氏烟草，根据实施例1瞬时转化的烟草病情指数的变化，对能够明显提高植物对病原菌抗性的三个DNA区段(核苷酸序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示)，重新设计引物(两端含有部分BP位点)，然后再用attb引物进行扩增(表3)，用于稳定遗传干扰载体的构建。根据BP反应，将靶标序列连接至pDONR207中；然后通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中。最后将构建好的载体转化至农杆菌LBA4404中。

表3、稳定遗传干扰引物信息

1.2本氏烟草的转化

取生长在MS基本培养基上的本氏烟草叶片，除去边缘和主要叶脉，切成0.4×0.6cm大小的小段，放入OD600为0.1-0.2的含有阳性质粒的农杆菌LBA4404菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液。然后将小叶片置于铺有一层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+NAA0.2mg/L+6-BA2mg/L)上进行培养，25℃暗室内培养3天。将经过共培养的烟草外植体转移到含有相应抗生素的筛选培养基(MS+NAA0.2mg/L+6-BA2mg/L+Kan100mg/L+Carb500mg/L)中进行培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。2-3周后待抗性芽生长至1-2cm高时，用无菌手术刀切下小芽转入生根培养基(MS+Kan100mg/L+Carb500mg/L)中诱导生根，1～2周后就会有不定根形成。然后提取转基因植物DNA，并进行PCR检测(表4)，获得转基因阳性植株。

表4、检测引物信息

1.3真菌生物量检测

为了比较转基因本氏烟草与野生型本氏烟草中病原菌的生物量变化，本发明利用qRT-PCR测定不同植物基因型根部大丽轮枝菌的生物量。提取接菌12天本氏烟草根部总DNA，以大丽轮枝菌内部转录间隔区ITS为靶标片段，同时以本氏烟草的持家基因actin为持家片段，进行相对定量测定(表5)。

qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2^-ΔΔCt法进行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

表5荧光定量引物信息

1.4靶基因的表达量分析

为了确定本氏烟草抗性的提高与靶基因的下降存在一定的关系，本发明利用qRT-PCR进一步测定本氏烟草中靶基因的转录水平。提取接菌12天本氏烟草根中总RNA，并进行反转录分析。以病原中STT3基因的编码序列设计引物作为目的片段(表6)，同时以病原菌actin作为持家片段，进行转录水平的相对定量测定。

qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2^-ΔΔCt法进行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

表6荧光定量引物信息

2、实验结果

2.1转基因植株的获得

通过VIGS筛选的方法，获得了可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段。为了进一步验证寡糖基转移酶复合体STT3亚基与病原菌致病性之间的关系，以及干扰后能显著降低病原菌致病力的区段，并获得稳定遗传的转基因本氏烟草，本发明设计了针对靶基因的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。从电泳图5中可以发现明亮的目的条带。通过进一步的DNA测序、比对后发现，序列与靶标序列完全一致。

通过BP反应和LR反应，将克隆获得的3个寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上(图6)，形成含有真菌靶基因的植物转化载体。

为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶基因STT3的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草(图7、8、9)。

2.2转基因烟草的抗病性分析

对获得的含有寡糖基转移酶复合体STT3亚基不同区段dsRNA的阳性转基因烟草，进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后第10天、第11天和第12天进行病情指数分析。从图10可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约55-80％。

提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。从图11可以看出，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，仅为野生型的30-50％。

病情指数统计以及真菌生物量分析，可以明显观察到RNAi-4组转基因烟草对病原菌具有更强的抗性。

2.3靶基因的表达量分析

为了进一步验证植物病情指数降低与靶基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶基因表达量下降了约30-50％(图12)。这说明STT3基因的区段4(核苷酸序列为SEQIDNo.4所示)作为靶标片段设计dsRNA，可以达到最佳的干扰效果，从而可以有效降低病原菌的致病力。

Claims (10)

1.大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示；优选的，其核苷酸序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示。

2.由权利要求1所述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段所转录的RNA。

3.含有权利要求1所述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的RNA干扰载体；优选的，所述RNA干扰载体是Gateway干扰载体。

4.一种构建权利要求3所述RNA干扰载体的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段插入到Gateway干扰载体，即得；

优选的，通过BP反应，将权利要求1所述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中，得到Gateway干扰载体。

5.权利要求1所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段或权利要求2所述的RNA在提高植物对大丽轮枝菌的抗病性中的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有权利要求1所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

7.权利要求3所述RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌的抗病性中的应用。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求3所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

9.一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有权利要求1所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。

10.按照权利要求5或7所述的应用，其特征在于，所述植物包括：大丽轮枝菌的寄主植物；优选的，所述植物包括：棉花、烟草、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。