CN113717978B

CN113717978B - 降低棉花棉酚含量的sgRNA及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN113717978B
Application number: CN202111291205.6A
Authority: CN
Inventors: 程红梅; 周利利; 郭惠明; 王娅丽; 陆国清; 孙国清
Original assignee: Sanya National Academy Of Southern Propagation Chinese Academy Of Agricultural Sciences; Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Sanya National Academy Of Southern Propagation Chinese Academy Of Agricultural Sciences; Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-11-03
Also published as: CN113717978A

Abstract

本发明公开了降低棉花棉酚含量的sgRNA及其表达载体和应用。本发明设计了特异靶向GhCAD1‑A或GhCAD1‑C以及同时靶向GhCAD1‑A和GhCAD1‑C的多个sgRNA最终筛选获得了编辑效率较高的sgRNA，其中，特异靶向GhCAD1‑A的sgRNA4辑植株种子棉酚含量显著降低，而叶片棉酚含量无明显变化；特异靶向GhCAD1‑C的sgRNA8编辑植株种子和叶片含量均显著降低；同时靶向GhCAD1‑A和GhCAD1‑C的sgRNA6编辑植株种子和叶片棉酚含量更显著降低，且这些突变可稳定遗传至下一代。本发明所提供的sgRNA在培育低酚棉新品种、提高棉籽中营养物质利用率等方面具有应用前景。

Description

降低棉花棉酚含量的sgRNA及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及CRISPR/Cas9技术的sgRNA（small guide RNA），尤其涉及降低棉花棉酚含量的sgRNA及其表达载体，本发明进一步涉及它们在降低棉花棉酚含量或培育低棉酚含量棉花新品种中的应用，属于降低棉花棉酚含量的sgRNA及其应用领域。

背景技术

棉花不仅是纤维作物，也是油料作物。棉籽中富含蛋白质（23%）和脂肪酸（20%），然而棉酚的存在使得棉籽中丰富的营养物质不能被人和单胃动物利用。棉酚是一种黄色二聚倍半萜烯化合物，是棉属植物所特有的次生代谢物。棉酚及其相关的萜类化合物存在于棉花色素腺体中，遍布整个棉花植株。作为一种植保素，棉酚在植物抗虫抗病等方面有着非常重要的作用。棉酚可有效减少棉铃虫等害虫对棉花的伤害（Bell, A.A. and R.D.Stipanovic, Biochemistry of disease and pest resistance in cotton.Mycopathologia, 1978. 65(1-3): p. 91-106.）。棉酚对枯萎病菌等病菌的生长有抑制作用，可增强棉花对枯萎病等多种病害的抵抗能力（Hedin, P.A., W.L. Parrott, and J.N.Jenkins, Relationships of Glands, Cotton Square Terpenoid Aldehydes, and Other Allelochemicals to Larval Growth of Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Economic Entomology, 1992. 85(2): p. 359-364.）。并且因为棉酚对某些动物有毒害作用，因此可降低食草动物对棉花的侵害（Mellon, J.E., etal., Growth inhibitory effects of gossypol and related compounds on fungal cotton root pathogens. Letters in Applied Microbiology, 2014. 59(2): p. 161-168.）。此外，棉酚在医疗卫生领域也具有重要的应用价值。棉酚是非激素类的男性避孕药，可抑制精子的产生和活性。棉酚具有抗肿瘤的作用，可抑制癌细胞的生长并诱导癌细胞凋亡。不仅如此，棉酚对人类免疫缺陷病毒（HIV）和H5N1流感病毒等也具有一定抗性。

棉花杜松稀合酶（GhCAD）是棉酚生物合成途径中的一个限速酶。1995年，陈晓亚等在亚洲棉中克隆并鉴定出杜松稀合酶基因（Xiaoya Chen, et al., Cloning andHeterologous Expression of a Second (+)-δ-Cadinene Synthase from Gossypiumarboreum. Journal of Natural Products, 1996. 59(10): p. 944-51.）。1996年Davis等首次从无腺体棉中分离克隆出杜松烯合酶基因（Davis E M, Tsuji J, Davis G D, etal. Purification of (+)-δ-cadinene synthase, a sesquiterpene cyclase frombacteria-inoculated cotton foliar tissue[J]. Phytochemistry, 1996, 41(4):1047-1055.）。Southern杂交结果表明，杜松烯合酶基因在棉花基因组中有多个拷贝，是一个拥有众多成员的多基因家族（Xiaoya Chen, et al., Cloning and HeterologousExpression of a Second (+)-δ-Cadinene Synthase from Gossypium arboreum.Journal of Natural Products, 1996. 59(10): p. 944-51.）。

目前，多个CADS基因已经被克隆，经过对已经克隆的棉花杜松稀合酶基因序列分析发现，都具有萜类合成酶DDXXD和RR₍₈₎W结构域，均含有6个内含子，并且核苷酸序列和内含子位置具有较高保守性。该基因家族包括五个亚家族：CAD-A、CAD-B、CAD-C、CAD-D、CAD-E。目前对CAD-A和CAD-C亚家族的研究较多，Cad1-A与Cad1-C同源性达70%，A亚家族成员只有一个CAD1-A，CAD-C亚家族成员较多（cad1-C1, cad1-C2，cad1-C3，cad1-C4，cad1-C14），序列相似性高达90%，根据它们在基因组染色体上位置的分布表明它们很有可能来自一次或多次的基因复制（Chen F, D Tholl, Bohlmann J , et al. The family of terpenesynthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolismthat is highly diversified throughout the kingdom[J]. Plant Journal, 2011, 66(1):212-229；Cai Y, Xie Y , Liu J . Glandless seed and glanded plant researchin cotton. A review[J]. Agronomy for Sustainable Development, 2010, 30(1):181-190.）。另外，A亚家族与C亚家族基因的表达模式有不同。梁婉琪等通过对亚洲棉不同组织的RT-PCR和转基因原位杂交结果表明，CAD1-C亚家族基因在棉株的根、茎、叶、铃和种子中均有一定量的表达，而CAD1-A基因主要在种子和根表达（梁婉琪,谭晓萍,陈晓亚.亚洲棉(+)-S-杜松稀合成酶基因CAD1-A的分离及其在幼苗中的表达特征分析[J].中国科学:C辑,2000, 2(30): 145-153.）。

CRISPR/Cas9技术是一种高效快捷的基因定点编辑技术，已广泛应用于动植物研究中。sgRNA（small guide RNA）是CRISPR/Cas9技术的重要组成部分，有效的sgRNA对编辑的成功非常重要，sgRNA的脱靶问题普遍存在，任何设计获得特异性好的sgRNA，成为CRISPR/Cas9技术能否成功的重要因素。通常会设计多个sgRNA进行筛选，但是棉花原生质体提取较难，转化效率低，不能很好的用于检测编辑效率，陆地棉是异源四倍体作物，其基因组包含A和D两个基因组，多数基因为多拷贝，且棉花遗传转化周期长，也增加获得相应材料的困难。

发明内容

本发明的目的之一是提供能够高效降低棉花棉酚含量的sgRNA；

本发明的目的之二是提供含有所述sgRNA的表达载体；

本发明的目的之三是将所述sgRNA以及含有该sgRNA的表达载体应用于降低棉花棉酚含量或培育低棉酚含量的棉花新品种。

为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

本发明首先公开了降低棉花棉酚含量的sgRNA，其核苷酸序列选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、或SEQ ID No.8中的任何一种；优选的，所述sgRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8中的任何一种；最优选的，所述sgRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。

本发明还公开了含有所述降低棉花棉酚含量的sgRNA的表达载体；优选的，所述的表达载体是CRISPR/Cas9基因编辑载体。

本发明进一步公开了将上述的sgRNA或其表达载体应用于降低棉花棉酚含量，包括：（1）构建含有所述sgRNA的基因编辑载体；（2）将所构建的基因编辑载体转化到棉花或棉花细胞中，所得到突变体棉花的叶片或种子中棉酚含量显著降低。

本发明进一步提供了一种培育低棉酚含量棉花新品种的方法，包括：构建所述的sgRNA的基因编辑载体；将该基因编辑载体转入受体植物棉花中，筛选得到叶片或种子中棉酚含量显著降低的棉花新品种。

其中，sgRNA的基因编辑载体可以按照本领域的常规构建方法得到。

本发明中所述的转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物（单子叶植物或双子叶植物）或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的基因提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株（McCormick et al.Plant CellReports . 1986. 5:81-84）。

由于GhCAD1-A和GhCAD1-C基因表达模式不同，本发明设计了多个特异靶向GhCAD1-A或GhCAD1-C的sgRNA以及同时靶向GhCAD1-A和GhCAD1-C的sgRNA并最终筛选获得了编辑效率较高的sgRNA，其中，与野生型植株相比，特异靶向GhCAD1-A的sgRNA4（SEQ IDNo.4）编辑植株种子棉酚含量显著降低，而叶片棉酚含量无明显变化；特异靶向GhCAD1-C的sgRNA8（SEQ ID No.8）编辑植株种子和叶片含量均显著降低；同时靶向GhCAD1-A和GhCAD1-C的sgRNA6（SEQ ID No.6）编辑植株种子和叶片棉酚含量更显著降低，并且这些突变可稳定遗传至下一代，本发明对培育低酚棉新品种、提高棉籽中营养物质利用率等方面具有重要应用前景。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“sgRNA”：small guide RNA，即向导RNA。

术语“PAM”：protospacer adjacent motif。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992)；Rossolini等人, Mol Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语 “转化”指将编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

附图说明

图1 本发明靶标位点(sgRNA1-sgRNA9)示意图。

图2 p2301-sgRNA(1-9)-Cas9表达载体示意图。

图3 转p2301-sgRNA(4/6/8)-Cas9 T0代阳性植株检测电泳图；其中P为质粒阳性对照；WT为野生型。

图4 转p2301-sgRNA(4/6/8)-Cas9的T1代植株叶片棉酚含量检测。

图5 转p2301-sgRNA(4/6/8)-Cas9的T1代植株种子棉酚含量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

生物材料和试剂

植物材料：陆地棉受体品种Coker312(R15)。

菌株与质粒：本实验所用载体为AtU6-26-sgRNASK、35s-cas9SK（由朱健康实验室惠赠）和pCAMBIA2301（由本发明人实验室保存），所用大肠感受态E.coli DH5α购自全式金（北京）生物公司，农杆菌LBA4404菌株由本发明人实验室保存。

主要试剂：实验所用的高保真2× Phanta Max Master Mix购自南京诺唯赞生物技术有限公司；KpnⅠ酶、SalⅠ酶、EcoRⅠ酶和T₄连接酶购自NEB公司、pEASY-T1 simplecloning vector购自全式金（北京）生物公司。

实施例1 GhCAD基因靶位点的设计

陆地棉的A-和D-亚基因组中各含有一个GhCAD1-A：Gh_A13G1207和Gh_D13G1503，而GhCAD1-C基因在陆地棉基因组中有多个拷贝(Gh_A04G0198、Gh_A04G1289、Gh_A04G1295、Gh_A04G1296、Gh_D05G3504、Gh_D05G3506、Gh_D05G3507 、Gh_D05G3508)。首先对上述基因序列进行序列比对，在GhCAD1-A基因和GhCAD1-C基因序列相似性较高的区域设计了2个20nt的sgRNA，在二者序列相似性较低的区域分别设计4个特异敲除GhCAD1-A和3个GhCAD1- C基因的sgRNA。图1是9个靶标位点(sgRNA1-sgRNA9)的示意图。

表1 GhCAD1-A基因和GhCAD1-C基因的sgRNA序列

表1说明：有下划线的碱基序列为PAM（protospacer adjacent motif）。

实施例2 CRISPR/Cas9表达载体的构建

CRISPR/Cas9表达载体构建中所用引物的序列为表2所示。

表2 CRISPR/Cas9表达载体构建所用引物

CRISPR/Cas9表达载体的具体构建步骤如下：

（1）将20nt的靶标位点通过重叠PCR将各sgRNA加入到AtU6-sgRNA片段上，第一次PCR扩增出两个小片段，片段1用引物U6-26-F和各自相应的sg-R，片段2用引物各自相应的sg-F和U6-26-R，PCR反应体系如表3所示。

表3 PCR反应体系

PCR程序：95℃ 5min；然后95℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 30sec，共30个循环；最后72℃ 5min，4℃，保存。

（2）通过引物U6-26-F和U6-26-R将第一个小片段和第二个小片段连接起来，获得片段3，PCR反应体系如表4所示。

表4 PCR反应体系

（3）将片段3克隆到pEASY-T1 simple cloning vector上，连接体系如表5所示。

表5 连接体系

25℃孵育15min冰上静置5min。

（4）热击至大肠感受态，卡那霉素筛选，PCR阳性鉴定，M13F （M13F：CATTTTGCYGCCGGTCA）作为正向引物测序，获得正确的克隆子。

（5）载体酶切，用KpnⅠ和SalⅠ两种限制性内切酶酶切步骤（4）获得的质粒和AtU6-sgRNA-35s-Cas9-sk载体，酶切体系如表6所示。

表6 酶切体系

37℃孵育3h。

（6）连接（5）获得的双酶切DNA片段，连接体系如表7所示。

表7 连接体系

室温孵育20min。

（7）热击至大肠感受态，卡那霉素筛选，PCR阳性鉴定，U6-26-F作为正向引物测序，获得正确的克隆子。

（8）载体酶切，用KpnⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶酶切（7）获得的质粒和pCambia2301载体，酶切体系如表8所示。

表8 酶切体系

37℃孵育3h。

（9）连接步骤（8）获得的双酶切DNA片段，连接体系如表9所示。

表9 连接体系

（10）热击至感受态，卡那霉素筛选，PCR阳性鉴定，2301-F（2301-F：GTTGGCCGATTCATTAATGC）作为正向引物测序，获得正确的克隆子，即为p2301-sgRNA-Cas9表达载体。

按照上述方法，本实施例构建获得了9个CRISPR/Cas9表达载体p2301-sgRNA(1-9)-Cas9（图2）。

实施例3 CRISPR/Cas9表达载体转化棉花、棉花突变体的鉴定及棉酚含量检测

1 试验方法

1.1 CRISPR/Cas9表达载体转化棉花

将实施例2所构建得到的基因编辑表达载体导入农杆菌，利用农杆菌介导棉花遗传转化，步骤如下：

（1）选取陆地棉Coker312（R15）作为遗传转化受体材料。将成熟饱满的R15种子于0.1%的升汞溶液中浸泡5min，然后用无菌水清洗3至5遍。

（2）将无菌处理后的种子置于MS培养基中，在28℃，16h光照/8h黑暗的培养箱中培养一周。一周后，生长出的无菌幼苗作为农杆菌侵染的材料。

（3）9个p2301-sgRNA-Cas9载体分别通过电击转化至农杆菌LBA4404菌株中并扩大培养收集菌体，接着用1/2MS溶液稀释菌体至OD600=0.4-0.5，作为侵染液。

（4）在无菌条件下将棉花幼苗下胚轴切段，并置于浸染液中震荡5分钟。将侵染后的茎段放在无菌滤纸上晾干，再放入共生培养基中，在28℃条件下暗培养两天，接着将茎段转入抗性愈伤诱导培养基中继代培养3-4轮，每轮3周，直至诱导愈伤产生。

（5）获得的抗性愈伤转到分化培养基中生长4-5个月，再转到胚性愈伤诱导培养基中继代培养，每隔一月继代一次，直到不定芽产生。

（6）将不定芽切下转至生根培养基中培养获得棉花幼苗，最后将幼苗转到土壤中生长至成苗获得T0代再生植株。

1.2再生材料阳性鉴定

利用T-DNA上的序列进行转基因植株的阳性鉴定，扩增得到691bp的片段，检测引物如表10所示。

表10 再生苗鉴定引物

表11 PCR扩增体系

PCR程序：95℃ 5min；然后95℃ 30sec，64℃ 30sec，72℃ 30sec，共30个循环；最后72℃ 5min，4℃，保存。

1.3 Hi-TOM测序检测突变

首先提取样品DNA，在各sgRNA所在的位置附近设计特异性引物，sgRNA位于正向或反向引物10~100 bp范围内。由于sgRNA1与sgRNA4，sgRNA2与sgRNA3，sgRNA5与sgRNA6位置离得较近，因此设计了三对引物扩增目的片段，Hi-sgRNA1&4F及R扩增sgRNA1与sgRNA4所在序列，Hi-sgRNA2&3F及R扩增sgRNA2与sgRNA3所在序列，Hi-sgRNA5&6F及R扩增sgRNA5与sgRNA6所在序列，sgRNA7、sgRNA8、sgRNA9所在序列也分别设计了引物扩增。

表12 Hi-TOM扩增引物

表13 PCR扩增体系

PCR程序：95℃ 5min；然后95℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 30sec，共30个循环；最后72℃ 5min，4℃，保存。将获得的PCR产物送测序。

1.4 棉酚含量检测

1.4.1棉酚的提取

(1)将样品置于液氮中研磨，取一定量的样品粉末于2ml的离心管中；

(2)加入1ml的棉酚提取液，并充分震荡10min;

(3)4℃ 12000rpm/min离心10min，取上清于新的离心管中；

(4)用1ml注射器吸取上清，用0.22μm的滤膜过滤至棕色液相小瓶中。

叶片和种子所用的棉酚提取液不同，叶片组织用的提取液为乙腈:0.1%甲酸水（1:1），种子用的提取液是乙醇，所用的流动相为乙腈（A）：0.1%甲酸水（B）。

1.4.2棉酚的测定方法

色谱条件

色谱柱：Agilent C18色谱柱（2.1mm×75mm, 2.7μm）；泵流速为0.5ml/min；进样量15μl；柱温为室温；梯度洗脱程序：0~4min，50%A；4~6min 95% A；

质谱条件

电离方式：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；扫描模式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（EIS）：3500v; 离子源温度：300℃；定量分析的离子对m/z517.1/230.9(碰撞电压43v)。

2结果与分析

2.1愈伤组织GhCAD1基因编辑效率检测

农杆菌侵染3个月后，分别随机选取10个转化p2301-sgRNA(1-9)-Cas9的愈伤组织，提基因组DNA用于检测编辑效率。用表12的引物进行PCR扩增并测序。结果表明只靶向GhCAD1-A基因的sgRNA3和sgRNA4，靶向GhCAD1-C基因的sgRNA5和sgRNA6以及同时靶向GhCAD1-A与GhCAD1-C基因的sgRNA7和sgRNA8在目标靶点均成功发生了突变，而sgRNA1、sgRNA2和sgRNA9未检测到突变（表14）。由于愈伤组织可能并非由同一个细胞分裂产生，因此其编辑类型多样，包括碱基的插入缺失等，同时也有未编辑的野生型序列。随机抽取的10个愈伤组织编辑效率为10%至80%。针对各基因设计的sgRNA选择突变效率高的sgRNA，即sgRNA4、sgRNA6和sgRNA8的愈伤系进行继代并获得再生植株。

表14 愈伤突变检测

2.2 T0代植株阳性材料鉴定及GhCAD1-A和GhCAD1-C基因的编辑情况

对来自sgRNA4、sgRNA6和sgRNA8转化的愈伤系经过继代产生的再生苗，提取基因组DNA，并用表10中的引物进行PCR鉴定。sgRNA4、sgRNA6、sgRNA8均获得两个转基因株系（图3），根据突变的基因和位点，对获得的T0代转基因系分别命名为A4-1、A4-2、AC6-1、AC6-2、C8-1 、C8-2，通过表12中的引物对各材料的靶位点所在片段进行扩增，Hi-TOM测序结果表明针对GhCAD1-A基因设计的sgRNA4获得的A4-1和A4-2植株均在A和D基因组靶位点上发生了突变；针对GhCAD1-C基因设计的sgRNA8所获得C8-1和C8-2植株在A基因组和D基因组的靶位点均检测到突变；同时编辑GhCAD1-A和GhCAD1-C的sgRNA6获得的AC6-2植株中AD基因组上的GhCAD1-A和GhCAD1-C基因均发生突变，且有大片段的插入缺失（表15）。上述结果说明，本发明设计的分别针对GhCAD1-A和GhCAD1-C基因突变的sgRNA是有效的。此外还获得了其他突变类型的材料，sgRNA具有多种基因编辑类型，所获得的大部分材料都有野生型序列，为后代产生新的编辑类型创造了条件。

表15 T0代植株突变统计

表15的说明：“-”、“+”以及n分别代表碱基缺失、插入和无编辑。

2.3 T1代植株编辑情况

利用Hi-TOM技术对表16的T1代植株GhCAD1-A和GhCAD1-C基因突变情况进行检测，本发明获得了单独突变GhCAD1-A基因的T1代材料，这两个材料的AD基因组上的GhCAD1-A基因均发生突变，其中A4-1-3和A4-2-1材料是纯合突变；单独突变GhCAD1-C基因的T1代材料在AD基因组上检测到突变且大部分为纯合的。以及同时突变两个基因的T1代编辑材料在AD基因组上均有突变，其中AC6-2-1为纯合突变（表16）。说明本发明设计的sgRNA产生的突变可以遗传，且通过自交T1代材料的突变类型较T0代减少，并且趋于纯合。

表16 T1代植株编辑类型统计

表16的说明：“-”、“+”以及n分别代表碱基缺失、插入和无编辑。

2.4 T1代编辑植株棉酚含量测定

取野生型（R15）棉株和T1代转基因棉株的倒三叶和种子进行棉酚检测。野生型、A4-1-3、C8-2-1、AC6-2-1的叶片棉酚含量分别为0.75μg/mg，0.66ug/mg、0.23μg/mg，0.32μg/mg，只有GhCAD1-A基因突变的材料A4-1-3叶片棉酚含量与野生型相比无明显变化，GhCAD1-C基因突变材料和GhCAD1-A和GhCAD1-C基因同时突变材料的叶片棉酚含量显著降低（图4）。

野生型、A4-1、C8-2、AC6-2的种子中棉酚含量分别为1.22μg/mg、0.59μg/mg、0.42μg/mg、0.33μg/mg，突变体材料种子中的棉酚含量均显著低于野生型，这说明靶向GhCAD1-A基因的sgRNA4可有效降低棉花种子中棉酚的含量而叶片棉酚含量无明显变化，靶向GhCAD1-C基因的sgRNA8降低整株棉花的棉酚含量，同时靶向GhCAD1-A 和GhCAD1-C基因的sgRNA6更进一步降低棉花棉酚含量（图5）。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

三亚中国农业科学院国家南繁研究院

<120> 降低棉花棉酚含量的sgRNA及其表达载体和应用

<130> BJ-2002-210902A-L

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

gattttcatc ccggtatttg ggg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

gaaggctatt tttggataat ggg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

gttgacaaaa gtcatagcaa tgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

gggtcgattt tcggatgaaa tgg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

gcaagagata gagtggttga agg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

gagtggttga aggctatttt tgg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 7

gattttcagc ctagcatttg ggg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 8

gttgacaaaa gtgatagcaa tgg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 9

gctaatgcat tgccaacttg tgg 23

Claims

1.降低棉花棉酚含量的sgRNA，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6或SEQ ID No.8中的任何一种。

2.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。

3.含有权利要求1或2所述sgRNA的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体是CRISPR/Cas9基因编辑载体。

5.权利要求1或2所述sgRNA在降低棉花叶片或种子棉酚含量中的应用。

6.权利要求3所述的表达载体在降低棉花叶片或种子棉酚含量中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求1所述sgRNA的基因编辑载体；(2)将所构建的基因编辑载体转化到棉花中得到棉花突变体，突变体棉花中叶片或种子棉酚含量降低。

8.一种低棉酚含量棉花新品种的培育方法，其特征在于，包括：构建含有权利要求1所述sgRNA的基因编辑载体；将该基因编辑载体转入受体植物棉花中，筛选得到叶片或种子棉酚含量降低的棉花新品种。