CN117363558A - 一种原生质体的制备方法和原生质体的转化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物工程技术领域，具体涉及一种原生质体的制备方法和原生质体的转化方法及其应用。该方法以避光培养的棉花下胚轴为材料，利用酶裂解法获得原生质体细胞悬浮液，随后利用PEG介导的转化方法将外源基因高效转入棉花原生质体进行瞬时表达。本发明简化了棉花下胚轴原生质体分离、纯化和转化的相关步骤，极大减少了手动操作时间，可以在5小时内快速完成棉花原生质体的制备与转化，同时还能够快速获得高产率和高活力的原生质体，并应用于蛋白质定位与互作、基因组编辑工具开发等实验。本方法使棉花的下胚轴有望成为其它植物基因异源表达的首选平台。
Description
技术领域
本申请属于生物工程技术领域，具体涉及一种原生质体的制备方法和原生质体的转化方法及其应用。
背景技术
植物的原生质体是没有细胞壁的单细胞，通过PEG介导的瞬时转化技术可以将外源质粒直接导入原生质体中进行快速的瞬时表达，因此植物原生质体可以用于研究蛋白的亚细胞定位、大分子互作、信号转导以及基因编辑等。鉴于植物原生质体在功能基因研究中的优势，目前许多物种都建立了基于PEG的原生质体转化技术。但值得一提的是，不同植物以及不同植物组织部位的原生质体制备和转化操作方法都不尽相同。因此原生质体制备和转化方法往往需要进一步优化才能达到简单高效。
目前棉花中已经报道了基于真叶、子叶、愈伤和根的原生质体纯化和转化技术。其中真叶和根的转化效率较高，超过了90%，愈伤的转化效率在35%-45%之间。但这些技术存在材料生长周期长、预处理和后续实验步骤繁琐等问题。比如愈伤组织和真叶需要较长的材料培养时间（五片真叶），而根部材料的预处理较为麻烦，比如从土壤中分离容易损伤根部或水培需要沥干水分。子叶材料的生长时间虽然较短，但棉花种壳往往限制子叶充分展开，增加预处理操作难度。棉花的下胚轴可以用于原生质体的分离，如专利申请CN202110469528中所示，但该方法仍需要培养无菌苗、预处理等，上述操作与愈伤组织相似需要无菌条件，使操作步骤变的繁琐且容易失败。目前棉花中未见下胚轴相关的其他转化方法。事实上不仅是以上提到的原生质体制备和转化技术，许多物种的原生质体制备和转化技术都存在材料生长时间久、材料预处理麻烦、纯化时间长等问题。但其优化主要是针对酶解阶段中酶解试剂的成分配比，并未对材料前处理阶段和后续整个实验流程进行简化，这导致目前缺乏简单快速的原生质体制备和转化技术。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种原生质体的制备方法和原生质体的转化方法及其应用。该方法能够快速便捷的制备原生质体并进行高效的转化，来降低原生质体技术的使用门槛。
为了达到上述目的，本发明提出了了以下技术方案：
本发明提供了一种原生质体的制备方法，所述处理方法包括以下步骤：栽培得到幼苗，对幼苗进行预处理得到预处理样品，使用酶解液酶解预处理样品得到酶解细胞，纯化酶解细胞得到原生质体。
本发明通过上述制备方法制备获得的原生质体具有产出比大、活力高的优势，同时对外源基因的转化成功率高，有重要的应用前景。
在本发明中，所述栽培包括以下步骤：取植物种子进行催芽处理，处理结束后栽培于培养土中，培养5~14天，所述培养的温度为28℃，培养的条件为避光。
本发明优选的，取健康棉花种子；使用无菌水清洗表层杂质；在量杯中加入10倍棉花体积的无菌水进行浸泡催芽，所述催芽培养的培养条件为24～28℃，浸泡时长>24h；取开口发芽的种子种入提前拌好的湿润的培养土中，置于培养箱避光培养，所述培养的培养条件为28℃；培养时间在5~14天范围内的健康的下胚轴即可作为原始材料使用。
本发明提出使用暗培养5~14天范围内的健康的下胚轴，无需清洗等额外的预处理操作，可以更快速获得大量原始材料。
在本发明中，所述预处理包括以下步骤：获取幼苗的下胚轴，将下胚轴斜切成段；所述下胚轴切段的宽度为0.5~1.0 mm。
本发明优选的，根据苗的大小，取适量培养的棉花幼苗，置于无菌过滤吸水纸上，切除胚根和子叶，对伸长的下胚轴使用刀片斜切成均匀的切段，并转移至无菌培养皿中。
在本发明中，所述酶解液与解预处理样品的体积重量比为5mL：1g。
在本发明中，所述酶解的条件为黑暗，酶解的温度为室温，酶解的时间为3h；所述酶解过程包括以下步骤；将酶解液浸没预处理样品，于室温黑暗的环境下酶解3h。
本发明优选的，按特定浓度和配比称取酶解液的各试剂加入到无菌管，混合后置于55℃水浴锅加热并冷却至室温使用，加热期间进行多次上下震荡混匀操作；使用配套的注射器和0.45μm纤维素微孔滤膜过滤器缓慢地对冷却至室温的酶解液进行过滤，滤液置于干净的无菌培养皿中，同时将对应配比的经过预处理的下胚轴切段（预处理样品）加入培养皿中并轻轻摇晃，使酶解液完全浸没所有下胚轴切段；将上述培养皿用锡纸完全覆盖，于24～28℃室温环境下在水平摇床上以50rpm速度轻摇，根据下胚轴使用量酶解处理3h；酶解完成后，所取材料释放出原生质体细胞到溶液中后，溶液呈现出明显的黄色。
在本发明中，所述纯化包括以下步骤；
将酶解细胞与W5溶液混合后依次进行过滤和离心处理得到沉淀，将沉淀与W5溶液混合得到纯化的原生质体细胞液；所述酶解细胞与W5溶液的体积比为1：1；所述离心的温度为4℃，离心的转速为720 rpm，离心的时间为2 min，离心的升降速均为1。
本发明优选的，酶解结束后对处理得到酶解细胞液加入刚从4℃环境取出的W5溶液以终止酶解反应，轻摇混匀后对原生质体混合液进行过滤，以去除残留的细胞碎片和其他杂质，所述过滤器为40μm细胞过滤器；将过滤后的原生质体混合液水平缓慢加入至无菌离心管，于离心机温度4℃、升速为1、降速为1的条件下离心，以沉淀原生质体并分离出W5和酶解混合上清液；离心完成后缓慢取出离心管，小心地吸弃上清，收集到纯净的原生质体细胞沉淀；再次加入W5溶液并轻摇混匀得到纯化的原生质体细胞液。
本发明还提供了一种原生质体的转化方法，所述转化方法包括以下步骤；
离心纯化的原生质体细胞液取沉淀（即原生质体），使用MMg溶液重悬沉淀得到原生质体MMg悬浮液，将质粒加入原生质体MMg悬浮液中，混匀后避光静置10min得到原生质体质粒混合液；静置结束后向原生质体质粒混合液加入PEG溶液室温避光孵育20~30min，孵育结束后加入W5溶液并进行离心处理得到沉淀，向沉淀中加入W5溶液避光静置过夜，完成原生质体的转化。
经过实验比较，发现两次离心最佳的条件分别为4℃，720 rpm，2 min，升降速均为1和4℃，400 g，5 min，升降速均为1。离心完成后缓慢取出离心管，注意小心地吸弃上清。
用MMg溶液重悬原生质体时，所述最终重悬的原生质体密度为1～2×105/mL。
所述原生质体由上述任一项制备方法制备得到的。
本发明优选的，将MMg溶液与原生质体混合得到原生质体MMg悬浮液，将原生质体MMg悬浮液分装取样，加入相应配比的待转化的质粒载体，轻摇混匀，置于温度为24～28℃条件下避光静置；所述原生质体MMg悬浮液和载体的配比为原生质体MMg悬浮液：载体≈10:1；所述避光静置时长为10min；对静置后的原生质体和质粒混合液，水平加入一定量配比的新鲜配制的PEG溶液并缓慢地将其移至管底，轻摇混匀，避光环境下孵育；所述PEG溶液和原生质体质粒混合液的配比为PEG溶液：原生质体质粒混合液=1:1；将上述避光静置的原生质体PEG混合液中缓慢加入1 mL W5溶液停止转化，于离心机温度4℃、升速为1、降速为1的条件下离心，以沉淀原生质体并分离出PEG和W5上清液；小心地吸弃上清，再次收集到纯净的原生质体细胞沉淀；再次加入W5溶液，轻摇混匀后避光保存。
在本发明中，所述MMg溶液包括以下组分：D-甘露醇、MgCl2和MES；
用MMg溶液将重悬的原生质体密度为1～2×105/mL
所述PEG溶液与混合液的体积比例为1：1。
本发明还提供了上述转化方法在简化原生质体转化流程中的应用。进一步的，所述应用包括蛋白的亚细胞定位、大分子互作、信号转导和基因编辑。
上述操作流程共分为五个部分，播种，预处理，酶解，纯化和转化。详情见图1，其中转化例图使用水稻的核定位MYB转录因子基因转化原生质体后的GFP荧光观察图。
上述溶液的配制包括以下四种：
酶解液：0.75%Macerozyme离析酶R-10、1.5%Cellulase纤维素酶R-10、0.4M D-甘露醇、10mM CaCl2、20mM KCl、20mM MES（pH 5.7）和1%BSA牛血清白蛋白溶液；
W5溶液：154mM NaCl、5mM KCl、125mM CaCl2和20mM MES（pH 5.7）；
MMg溶液：400mM D-甘露醇、15mM MgCl2、4mM MES（pH 5.7）；
PEG溶液：200mM D-甘露醇、100mM CaCl2和40% PEG4000。
本发明除了使用上述配制溶液外所需要的试剂较为简单易得，主要包括无菌水、量杯、培养土、无菌过滤吸水纸、无菌刀片、0.45μm纤维素微孔滤膜过滤器，细胞过滤器，且操作难度低。
现有技术中的模式植物拟南芥、水稻等成熟的原生质体转化技术已经被广泛应用于其它植物基因的异源表达研究。此处以引用已超过2000次的Dr. Sheen实验室建立的简单高效的拟南芥原生质体方法为例展示常规操作中一个标准的原生质体制备和转化流程。
主要包括以下步骤：
拟南芥的播种和生长花费时间＞4周；收集100~150片健康的叶子，切成特定规格（0.5~1毫米）的叶条，此步骤花费时间约0.5~1小时；酶解时需要先真空渗透30分钟，然后再进行酶解，此步骤花费时间＞4小时；纯化原生质体时，需要置于冰上30分钟沉淀原生质体再进行其余处理，此步骤花费时间＞1小时；原生质体进行转化时，花费时间＞1小时。
由实际操作可知，本发明提供的方案无需长达几周的材料生长时间和严格的取材时间，在5-14天之间都可以取材提取原生质体。同时，本方案可在5小时内快速完成棉花原生质体的制备与转化，大大缩短了实验耗时。本发明提供的方案的实际操作流程所花时间估算如下；预处理<0.5小时，酶解3小时，纯化<0.5小时，转化<1小时。相较于现有技术中植物原生质体的制备和转化所用的时间，本发明的简化的点在于材料预处理时不用进行复杂的清洗等操作，大大减少了预处理材料的时间，同时酶解在3小时以内即可完成，纯化和转化过程中，通过一系列的优化也有效压缩了时间，如使用离心代替冰上放静置沉淀原生质体；以及最佳离心速度的摸索和高效试剂地配比。
本发明的有益效果为：本发明通过一系列步骤优化，最终建立了一套快速的棉花原生质体制备和转化方法。利用该方法可以快速的在较宽泛的取材时间内获得高产率和高活力的原生质体，并应用于蛋白质定位与互作、基因组编辑工具开发等实验。本方法有效降低了原生质体转化技术的使用难度，有效节约了实验人员的时间，并有望成为其它植物基因异源表达的首选平台。
附图说明
图1为本发明所述一种快速高效的棉花原生质体制备和转化方法的流程图；
图2为本发明使用荧光素二乙酸盐（FDA）试剂检测原生质体的活力的荧光观察图；
图3为本发明所述棉花原生质体制备和原生质体瞬时表达应用于亚细胞定位实验观察图；图中从左到右依次为GhHOX3-EGFP蛋白，核定位的H2B-mCherry蛋白，明场和两种荧光蛋白共定位的结果；
图4为本发明所述棉花原生质体制备和原生质体瞬时表达应用于基因编辑实验的结果图。
具体实施方式
为清楚明白地理解本发明的目的和技术方案的优化，以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步地解释说明。此处所描述的具体实施例仅为作详细阐释之用，并不用于限定本发明，本领域技术人员对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均应属于本发明的保护范围。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
下述实施例中的实验方法均为常规方法；下述实施例中所用的仪器设备均为实验室常规仪器设备。
生物材料：
下述实施例中所用棉花种质材料和相关质粒均由实验室提供。
主要试剂：
下述实施例中的国产试剂D-Mannitol、MES、BSA、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、40 μm 细胞过滤器，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；下述实施例中的进口试剂纤维素酶R-10和离析酶R-10购自Yakult,Tokyo,Japan，纤维素微孔过滤器购自MilliporeSigma，Burlington，MA，US，PEG4000购自sigma。
实施例1
快速的棉花原生质体转化方法应用于亚细胞定位实验
在本实施事例中，通过本发明的快速原生质体制备和转化方法来研究GhHOX3蛋白的亚细胞定位情况。通过将包含GhHOX3-EGFP和核定位的H2B-mCherry质粒共转化原生质体后的共定位情况，来确认棉花GhHOX3蛋白是否定位与细胞核。
具体实施过程简介如下，细节部分如说明书所述：
（一）播种
选取浸泡24小时的健康脱绒棉花种子播种，并置于暗培养条件下生长，培养5天时收集伸长的下胚轴用于原生质体制备。
（二）预处理
将下胚轴置于无菌滤纸上通过刀片切样处理为0.5-1mm切段。
（三）酶解
将上述步骤预处理后的样品置于新鲜配制的过滤酶解液中摇晃均匀，随后置于黑暗条件下的摇床上水平震荡酶解3小时。
（四）纯化
酶解结束后对上述步骤处理得到酶解细胞液加入等量W5溶液以终止酶解反应，随后对原生质体混合液进行过滤。对过滤后的混合液进行低速离心，小心地吸弃上清，再次加入W5溶液并轻轻摇晃收集得到原生质体细胞液。期间配制PEG转化试剂。再次离心，小心地吸弃上清，加入1 mL MMg溶液轻晃混匀，使原生质体细胞重悬。
取重悬过的原生质体悬浮液并加入10mg/mL(1%)的荧光素二乙酸盐（FDA）母液使其稀释到0.01%，轻摇混匀；置于温度为24～28℃条件下反应5分钟；取10μL于细胞计数板，使用荧光显微镜观察染色后的原生质体活性，计数视野下的发绿光细胞数量与总细胞数量，显微观察实验重复三次，取百分比平均值估算原生质体活性度。原生质体的活力的荧光观察图如图2所示。
（五）转化
取100μL原生质体重悬液分装到2 mL离心管。加入10μL GhHOX3-EGFP质粒和10 μLH2B-mCherry质粒（质粒的浓度大于200 ng/μL），轻弹混匀，避光静置10分钟。然后加入等量PEG溶液，轻弹混匀，在避光的室温环境下孵育20分钟。孵育结束后，加入1 mL W5溶液终止转化。轻摇混匀后，离心，吸弃上清。再次加入100μL W5溶液，轻弹混匀后置于室温避光孵育。
（六）荧光观察
避光过夜后，在激光共聚焦显微镜下对转化后的原生质体进行细胞观察。如图3所示，共转化GhHOX3-GFP和H2B-mCherry质粒的原生质体在相应的激发光下出现绿色和红色荧光，表明两个质粒成功共转化入原生质体中。GhHOX3蛋白的绿光与核定位的H2B蛋白红光重合，表明GhHOX3定位于细胞核。该实验也表明通过本发明的原生质体制备和转化方法，仅需使用少量的质粒就能完成亚细胞定位实验。
实施例2
快速的棉花原生质体转化方法应用于基因编辑研究
在本实施事例中，将靶向GhOKRA基因启动子区的CRISPR/Cas9质粒转化进入原生质体，转化后的原生质体提取基因组DNA，使用基因特异性的引物扩增GhOKRA基因启动子区序列，通过Hi-TOM测序的方式鉴定GhOKRA启动子区是否产生了靶向的基因编辑。
具体实施过程简介如下，细节部分如说明书所述：
（一）播种
选取浸泡24小时的健康脱绒棉花种子播种，并置于暗培养条件下生长，培养5天s时收集伸长的下胚轴用于原生质体制备。
（二）预处理
将下胚轴置于无菌滤纸上通过刀片切样处理为0.5-1mm切段。
（三）酶解
将上述步骤预处理后的样品置于新鲜配制的过滤酶解液中摇晃均匀，随后置于黑暗条件下的摇床上水平震荡酶解3小时。
（四）纯化
酶解结束后对上述步骤处理得到酶解细胞液加入等量W5溶液以终止酶解反应，随后对原生质体混合液进行过滤。对过滤后的混合液进行低速离心，小心地吸弃上清，再次加入W5溶液并轻轻摇晃收集得到原生质体细胞液。期间配制PEG转化试剂。再次离心，小心地吸弃上清，加入1 mL MMg溶液轻晃混匀，使原生质体细胞重悬。
（五）转化
取100μL原生质体重悬液分装到2 mL离心管。加入10μL靶向GhOKRA基因启动子区的CRISPR/Cas9质粒（质粒的浓度大于500ng/μL），轻弹混匀，避光静置10分钟。然后加入等量PEG溶液，轻弹混匀，在避光的室温环境下孵育20分钟。孵育结束后，加入1 mL W5溶液终止转化。轻摇混匀后，离心，吸弃上清。再次加入100μL W5溶液，轻弹混匀后置于室温避光孵育。
（六）基因编辑样品的处理和分析
避光孵育3天，转化样品置于离心机12000 rpm离心3分钟，吸弃上清。通过DNA提取试剂盒提取原生质体DNA。
提取后的DNA通过PCR方式靶向扩增GhOKRA基因的启动子区序列。
所使用的PCR扩增引物如下：
Hi-pOKRA-T3 F：
5’- ggagtgagtacggtgtgctgagtcatgcaaggacgaagattcag-3’，SEQ ID NO.1；
Hi-pOKRA-T3 R：
5’-gagttggatgctggatggtaaaagagaattggaaatgaacaatcatgggtctc -3’，SEQ IDNO.2。
PCR反应体系如表1所示，PCR扩增程序如表2所示。
表1 PCR反应体系
表2 PCR扩增程序
通过琼脂糖凝胶电泳确定目标条带扩增成功后，通过Hi-TOM测序平台进行测序。测序结果与GhOKRA基因启动子区进行序列比对，分析编辑结果。
如图4所示，设计的gRNA PAM位点前的第四个碱基位置出现了不同类型的插入或缺失，表明GhOKRA基因启动子位置被成功的编辑。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种原生质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：栽培得到幼苗，对幼苗进行预处理得到预处理样品，使用酶解液酶解预处理样品得到酶解细胞，纯化酶解细胞得到原生质体；
所述栽培包括以下步骤：取植物种子进行催芽处理，处理结束后栽培于培养土中，培养5~14天，所述培养的温度为28℃，培养的条件为避光；
所述预处理包括以下步骤：获取幼苗的下胚轴，将下胚轴斜切成均匀的切段；
所述下胚轴切段的宽度为0.5~1.0 mm；
所述酶解液与解预处理样品的体积重量比为5mL：1g；
所述酶解的条件为黑暗，酶解的温度为室温，酶解的时间为3h；
所述纯化包括以下步骤：
将酶解细胞与W5溶液混合后依次进行过滤和离心处理得到沉淀，将沉淀与W5溶液混合得到纯化的原生质体细胞液；
所述酶解细胞与W5溶液的体积比为1：1；
所述离心的温度为4℃，离心的转速为720 rpm，离心的时间为2 min，离心的升降速均为1。
2.一种原生质体的转化方法，其特征在于，所述转化方法包括以下步骤；
离心纯化的原生质体细胞液取沉淀，使用MMg溶液重悬沉淀得到原生质体MMg悬浮液，将质粒加入原生质体MMg悬浮液中，混匀后避光静置10min得到原生质体质粒混合液；静置结束后向原生质体质粒混合液加入PEG溶液室温避光孵育20~30min，孵育结束后加入W5溶液并进行离心处理得到沉淀，向沉淀中加入W5溶液避光静置过夜，完成原生质体的转化；
所述原生质体由权利要求1所述的制备方法制备得到的；
所述离心的温度为4℃，离心力为400g，离心的时间为5min，离心的升降速均为1；
所述PEG溶液与原生质体质粒混合液的体积比例为1：1。
3.权利要求1所述的制备方法和2所述的转化方法在简化原生质体转化流程中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括蛋白的亚细胞定位、大分子互作、信号转导和基因编辑。
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