CN112813017B - 国兰原生质体瞬时表达系统及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种国兰原生质体制备及基因瞬时表达的方法及其应用。本发明通过将国兰的花瓣或叶片酶解，得到的原生质体加入W5溶液中处理，MMG溶液重悬原生质体，得到纯化的原生质体与含有目的基因的重组质粒混匀，PEG‑CaCl₂溶液处理，W5溶液终止反应，加入WI溶液避光培育，得到可检测基因瞬时表达水平的原生质体。本发明的方法得到的原生质体率和活性率最高可达3.32±2.21(10⁷/g FW)和94.66±7.28(％)，瞬时转化效率最高可达76.06±4.51(％)，可运用于花器官特征决定相关基因CsAP3和CsAP3的亚细胞定位和BiFC蛋白互作研究，为国兰功能基因组学研究提供了新方法。

Description

国兰原生质体瞬时表达系统及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种国兰原生质体瞬时表达系统及其构建方法与应用。

背景技术

兰科植物(Orchidaceae)是被子植物中最大科之一，其多数地生种原产中国，又称国兰，有两千多年的栽培历史。国兰(Chinese Cymbidium)是中国十大传统名花之一，具有浓厚的文化内涵、观赏价值和经济价值。但国兰生长周期长，转基因困难，严重阻碍了其分子生物学研究进程。因此，发明一种简单、高效的针对国兰的原生质体分离及瞬时转化技术方法具有重要意义。

原生质体是去除细胞壁由质膜包裹的细胞，具有细胞全能性，可再生成完整的植株。植物原生质体分离及瞬时转化技术是一种新近发展的分子生物学研究手段。研究人员已经陆续从玉米、水稻、大豆、木薯、葡萄、百合和梅花等植物中成功分离出原生质体，并广泛应用于蛋白亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA-蛋白互作、启动子分析以及植株再生等领域。拟南芥、烟草和水稻等模式植物的原生质体分离及瞬时表达技术较为成熟，但国兰和其他非模式植物的相关研究却少有报道。

原生质体的制备效率受物种类型、材料来源、酶解液中酶种类、酶浓度和比例、渗透压调节物质(甘露醇)的浓度以及酶解时间等条件的影响。观赏植物常选用花瓣作为原生质体制备的材料(如蝴蝶兰、百合和梅花等)，瞬时表达相关基因进行蛋白互作和表达调控相关研究能更真实地反应花细胞的表达调控模式。因此，对各个影响原生质体分离的酶解条件进行优化才能制备高浓度、高活性的植物原生质体。相对于稳定的基因表达技术(转基因等)，瞬时表达技术具有成本低、操作简单、周期短等优点。较高的原生质转化效率是基因在原生质体中瞬时高效表达的基础，是基因表达调控和蛋白-蛋白互作等相关基因功能分析的保障。聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)介导的方法是原生质体质粒DNA转化最常用的方法，而原生质体活力与浓度、质粒DNA的浓度、PEG终浓度以及转化时间等均会影响转化效率。因此，需对各个转化相关条件进行优化，才能保证相关基因的瞬时高效地表达。

目前，还没有简单、高效的国兰的原生质体分离及瞬时转化技术方法见报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法，包括如下步骤：

(1)采集国兰的花瓣或者叶片，切成细丝，放入酶解液中酶解2～6h，得到原生质体；

(2)将等量的W5溶液加入步骤(1)所述的酶解液中，过滤，离心，弃上清，加入W5溶液，0～4℃静置30min，弃上清，用MMG溶液重悬沉降的原生质体，得到纯化的原生质体；

(3)将步骤(2)中纯化的原生质体采用MMG溶液调整浓度，与预冷的含有目的基因的重组质粒混匀，加入PEG-CaCl₂溶液处理5～20min，加入W5溶液终止反应；

(4)离心，弃上清，加入WI溶液，22～24℃避光孵育12～24h，得到国兰原生质体瞬时表达系统。

步骤(1)中所述的国兰优选为墨兰；更优选为墨兰品种白墨。

步骤(1)中所述的花瓣为初花期的幼嫩花瓣；所述的叶片为幼嫩叶肉；优选为叶芽基部的幼嫩叶肉。

步骤(1)中所述的花瓣或者叶片先采用体积比为75％的乙醇浸泡2min，无菌水洗3～4次，用无菌滤纸吸干水分。

步骤(1)中所述的切成细丝是将国兰花瓣或叶肉横叶脉切成约1mm的细丝，每切3到5片换一个刀片，切好的细丝立即放入酶解液中。

步骤(1)中所述的酶解液通过如下步骤制备得到：将浓度为质量体积比0.6～2.4％的纤维素酶R-10、浓度为质量体积比0.3～1.2％的离析酶R-10、浓度为0.2～0.7mol/L的甘露醇、浓度为20mmol/L的氯化钾以及浓度为20mmol/L的MES缓冲液(PH＝5.7)混匀，55℃水浴10min，冷却至室温，加入浓度为10mmol/L的氯化钙、浓度为质量体积比0.1的牛血清蛋白(BSA)和浓度为1～20mmol/L的β-巯基乙醇，用0.45μm滤膜过滤除菌。

所述的纤维素酶R-10的浓度优选为质量体积比1.2％。

所述的离析酶R-10的浓度优选为质量体积比0.6％。

所述的甘露醇的浓度优选为0.5mol/L。

所述的β-巯基乙醇浓度优选为5mmol/L。

步骤(1)中所述的酶解为避光条件下，28℃酶解6h。

步骤(2)中所述的过滤采用的滤网优选为150目的尼龙网。

步骤(2)中所述的离心为100g离心3min。

步骤(2)中所述的W5溶液通过如下步骤制备得到：浓度为154mmol/L的氯化钠、浓度为125mmol/L的氯化钙、浓度为5mmol/L的氯化钾和浓度为20mmol/L的MES缓冲液(pH＝5.7)混匀，调节pH至5.7～5.8。

步骤(2)中所述的MMG溶液通过如下步骤制备得到：浓度为0.4mol/L的甘露醇、浓度为15mmol/L的氯化镁，浓度为4mmol/L的MES缓冲液(pH＝5.7)混匀，调节pH至5.7～5.8。

步骤(2)中所述的纯化的原生质体还包括用二乙酸荧光素染色法检测活性，用血细胞计数板测定其浓度的步骤。

步骤(3)中所述的采用MMG溶液调整浓度是将原生质体浓度调整至1×10⁵～1×10⁶个/mL。

步骤(3)中所述的含有目的基因的重组质粒为：表达绿色荧光蛋白GFP的空载质粒pAN580，分别包含花器官特征决定相关基因CsAP3和CsPI完整编码序列的融合蛋白重组质粒pAN580-CsAP3和pAN580-CsPI；含有CsAP3与黄色荧光蛋白N端(YFPn)构建的融合蛋白重组质粒pSPYNE-CsAP3和含有CsPI与黄色荧光蛋白C端(YFPc)融合蛋白的重组质粒pSPYNE-CsPI。

步骤(3)中所述的PEG-CaCl₂溶液的配方为：质量体积比为20～60％的PEG4000、0.2mol/L甘露醇和0.1mol/L氯化钙；优选为质量体积比为40％的PEG4000、0.2mol/L甘露醇和0.1mol/L氯化钙；更优选为质量体积比为25％的PEG4000、0.2mol/L甘露醇和0.1mol/L氯化钙。

步骤(3)中所述的含有目的基因的重组质粒在体系中的浓度优选为20μg/20μL。

步骤(3)中所述的加入PEG-CaCl₂溶液处理为避光静置处理；处理时间优选为15min。

步骤(4)中所述的WI溶液的配方为：0.5mol/L甘露醇、20mmol/L氯化钾和4mmol/LMES(pH＝5.7)。

步骤(4)中所述的离心为100g离心3min。

一种国兰原生质体瞬时表达系统，通过上述构建方法制备得到。

上述国兰原生质体瞬时表达系统在利用国兰细胞表达外源蛋白中的应用。

上述国兰原生质体瞬时表达系统在目的基因功能研究中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.采用本发明的方法在制备墨兰原生质体的过程中，酶解液中最佳的纤维素酶R-10浓度为1.2％(m/v)，最佳的离析酶R-10浓度为0.6％(m/v)，最适宜的β-巯基乙醇浓度为5mmol/L，最适宜的酶解时间为6h；花瓣的最适宜的甘露醇浓度为0.5mol/L，叶肉的最适宜的甘露醇浓度为0.4mol/L；得到的墨兰花瓣及叶片的原生质体密度和活性显著提高。

2.本发明的方法在原生质体纯化的过程中，将等量的W5溶液加入到含有墨兰原生质体的酶解液中，用150目网筛过滤，100g离心3min离心，弃上清，加入适量W5溶液，重复一次，0～4℃静置30分钟，弃上清，用适量MMG溶液重悬沉降的原生质体，得到的原生质体的破裂显著减少，原生质体的密度和活性显著提高。

3.本发明的方法操作简单、转化效率高，所用质粒DNA为2.5μg时，国兰原生质体转化效率即可达到10％左右，可应用于亚细胞定位、蛋白互作[双分子荧光互补(Bimolecularfluorescent complimentary,BiFC)]和基因表达调控等国兰基因的功能分析，为国兰功能基因组学研究提供了新的方法。

附图说明

图1为用于原生质体制备的墨兰花瓣及花瓣细丝照片图；其中，A为用于原生质体制备的墨兰花瓣照片图；B为用于原生质体制备的墨兰花瓣细丝照片图。

图2为实施例1中制备的墨兰花瓣原生质体照片图；其中，A为分离后的墨兰花瓣原生质体照片图；B为纯化后的墨兰花瓣原生质体用血细胞计数器进行浓度检测；C为经0.2％(m/v)二乙酸荧光素染色后的墨兰花瓣原生质体照片图。

图3为实施例2中墨兰花瓣的原生质体瞬时转化及蛋白表达结果图；其中，A为荧光场下墨兰花瓣原生质体GFP瞬时转化及蛋白表达照片图；B为明场下墨兰花瓣原生质体照片图；C为荧光场和明场的叠加下墨兰花瓣原生质体照片图。

图4为实施例2中墨兰花瓣原生质体瞬时转化条件对转化效率的影响结果图；其中，A为质粒DNA浓度对原生质体转化效率的影响结果图；B为PEG4000终浓度对原生质体转化效率的影响结果图；C为PEG-CaCl₂处理时间对原生质体转化效率的影响结果图。

图5为实施例2中，对墨兰原生质体表达GFP、CsAP3与GFP融合蛋白、CsPI与GFP融合蛋白的荧光观测照片图；标尺为50μm。

图6为用于原生质体制备的墨兰叶肉及叶肉细丝照片图；其中，A为用于原生质体制备的墨兰叶芽基部幼嫩叶肉照片图；B为用于原生质体制备的墨兰叶肉细丝照片图。

图7为实施例3中分离后的叶肉原生质体照片图；其中，A为分离纯化后的墨兰叶肉原生质体照片图；B为经0.2％(m/v)FDA染色后的墨兰叶片原生质体照片图。

图8为实施例4中，墨兰叶肉原生质体瞬时转化及蛋白表达结果图；其中，A为荧光场下墨兰叶肉原生质体GFP瞬时转化及蛋白表达照片图；B为明场下的墨兰叶肉原生质体照片图；C为荧光场和明场的叠加下墨兰叶肉原生质体照片图；标尺为50μm。

图9为实施例4中，墨兰基因CsAP3和CsPI所编码蛋白的互作分析结果图；标尺为50μm。

具体实施例

下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1墨兰花瓣原生质体的制备

(1)材料选择及处理

选取无病害、无畸形、无胁迫的传统品种‘白墨’墨兰健康植株(材料来源为广东省农科院环境园艺研究所增城宁西国兰种植基地)，将初花期的幼嫩花瓣用75％(v/v)的乙醇浸泡2min消毒，无菌水冲洗3-4遍，无菌滤纸吸干水分备用。

(2)酶解及原生质体分离

将消毒清洗后的约1g墨兰花瓣用手术刀片横叶脉切成约1mm的细丝，且为避免细胞受损，每切3到5片花瓣即换一个刀片。切好的花瓣细丝(图1)立即放入盛有20mL酶解液的200mL无菌锥形瓶中，用封口膜密封，置于恒温摇床上(28℃、30rpm)避光酶解，设定不同的酶解时间(2h、4h、6h和8h)。

按如下方法配置原生质体酶解液：加入纤维素酶R-10(3个浓度梯度(m/v)：0.6％、1.2％和2.4％)、离析酶R-10(3个浓度梯度(m/v)：0.3％、0.6％和1.2％)、甘露醇(6个浓度梯度：0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L和0.7mol/L)、氯化钾浓度为20mmol/L、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES，PH＝5.7)浓度为20mmol/L，55℃水浴10min，冷却至室温，加入的氯化钙浓度为10mmol/L、牛血清蛋白(BSA)浓度为0.1％(m/v)和β-巯基乙醇(5个浓度梯度0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L和10mmol/L)，用0.45μm滤膜过滤除菌。

(3)原生质体纯化

把获得的含有墨兰花瓣原生质体的酶解液加入等量的W5溶液，并用W5溶液润湿的150目尼龙网筛过滤。滤液50g离心3min，弃上清，再加入30mL预冷的W5溶液，轻柔重悬原生质体沉淀，在冰上(0～4℃)静置30分钟，在不触碰原生质体的情况下，尽可能吸弃上清，然后用适量MMG溶液轻柔重悬原生质体。

按照如下浓度配置W5溶液：154mmol/L的氯化钠、125mmol/L的氯化钙、5mmol/L的氯化钾，20mmol/L的MES(pH＝5.7)，调节pH至5.7～5.8。

按照如下浓度配置MMG溶液：0.4mol/L的甘露醇、15mmol/L的氯化镁，4mmol/L的MES(pH＝5.7)，调节pH至5.7～5.8。

(4)原生质体的密度测定及活性检测

用血细胞计数板测定和计算墨兰花瓣原生质体的密度和得率，具体方法如下：在干净的血球计数板计数区盖一块盖玻片，沿盖玻片边缘滴入一滴原生质体悬浮液，并用吸水纸吸去多余悬液，静置2min，将其置于显微镜的载物台上，计数5个计数格内的完整原生质体个数(N)。所测悬浮液中原生质体密度(个/mL)＝N/2×10⁵，原生质体得率(个/g FW)＝悬浮液中原生质体密度*悬浮液体积/酶解所用花瓣鲜重。

用0.2％(m/v)二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate，FDA)染色法测定原生质体的活性，具体方法如下：溶解2mg FDA溶于1mL丙酮中，4℃避光贮存。吸取9μL原生质体提取液，滴于载玻片上，加入1μL 0.2％(m/v)的FDA溶液，静置5min，于荧光显微镜下观察(蓝色激发块)。发绿色荧光的为有活力的原生质体，没有产生荧光的原生质体无活力。选取3个视野，分别以与明场和荧光场下拍照，并计数有活力的原生质体的数目(图2)。原生质体活性率(％)＝(视野1产生荧光的原生质体数目/视野1原生质体总数目+视野2产生荧光的原生质体数目/视野2原生质体总数目+视野3产生荧光的原生质体数目/视野3原生质体总数目)/3。用MMG溶液调整纯化的花瓣原生质体浓度至1×10⁵～1×10⁶个/mL。

(5)酶解液中酶浓度和比例对原生质体得率和活性的影响

为了提高所分离原生质体的得率和活性，对酶解液中纤维素酶R-10设置了3个浓度梯度(m/v)：0.6％、1.2％和2.4％；离析酶R-10设置3个浓度梯度(m/v)：0.3％、0.6％和1.2％，共9个酶浓度组合；在甘露醇浓度为0.5mol/L及未加入β-巯基乙醇的情况下，酶解时间为6h。酶解后对所得原生质体进行纯化，浓度检测和活性检测。结果发现：当纤维素酶R-10浓度(m/v)为1.2％、离析酶R-10浓度(m/v)为0.6％时，原生质体得率和活性均较高，分别为7.45±0.17(10⁶/g FW)和92.32±4.47(％)(表1)。

表1酶解液中酶浓度和比例对原生质体得率和活性的影响

注：所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值±标准差表示；C为纤维素酶R-10，M为离析酶R-10。

(6)酶解液中甘露醇浓度对原生质体得率和活性的影响

为了提高所分离原生质体的得率和活性，对酶解液中甘露醇设置了6个浓度梯度：0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L和0.7mol/L。纤维素酶R-10浓度为1.2％(m/v)、离析酶R-10浓度为0.6％(m/v)、β-巯基乙醇浓度为5mmol/L，酶解时间为6h。酶解后对所得原生质体进行纯化，浓度检测和活性检测，结果发现：当甘露醇浓度为0.5mol/L时，原生质体得率和活性均较高，分别为8.88±0.58(10⁶/g FW)和93.62±1.74(％)(表2)。

表2酶解液中甘露醇浓度对原生质体得率和活性的影响

注：所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值±标准差表示。

(7)酶解时间对原生质体得率和活性的影响

为了提高原生质体的得率和活性，设置了4个不同的酶解时间：2h、4h、6h和8h。β巯基乙醇浓度为5mmol/L。纤维素酶R-10浓度为1.2％(m/v)、离析酶R-10浓度为0.6％(m/v)、甘露醇浓度为0.5mol/L。酶解后对所得原生质体进行浓度检测和活性检测，结果显示：酶解时间为6h时，原生质体得率和活性均较高，分别为6.33±0.64(10⁷/g FW)和95.46±4.62(％)(表3)。

表3酶解液中酶解时间对原生质体得率和活性的影响

注：所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值±标准差表示；

(8)酶解液中β-巯基乙醇浓度对原生质体得率和活性的影响

为了提高所分离原生质体的得率和活性，对酶解液中β-巯基乙醇设置了5个浓度梯度：0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L和10mmol/L。纤维素酶R-10浓度为1.2％(m/v)、离析酶R-10浓度为0.6％(m/v)、甘露醇浓度为0.5mol/L、酶解6h。酶解后对所得原生质体进行纯化、浓度检测和活性检测，结果发现：当β-巯基乙醇浓度为5mmol/L时，原生质体得率和活性均较高，分别为3.32±2.21(10⁷/g FW)和94.66±7.28(％)(表4)。

表4酶解液中β-巯基乙醇浓度对原生质体得率和活性的影响

注：所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值±标准差表示。

综上所述，墨兰花瓣原生质体酶解液中，最佳的纤维素酶R-10浓度为1.2％(m/v)，最佳的离析酶R-10浓度为0.6％(m/v)，最适宜的甘露醇浓度为0.5mol/L，最适宜的酶解时间为6h，最适宜的β-巯基乙醇浓度为5mmol/L。当墨兰花瓣原生质体制备过程中满足以上酶解条件时，原生质体得率和活性率能达到最高，分别为3.32±2.21(10⁷/g FW)和94.66±7.28(％)，能满足后续原生质体基因瞬时表达等相关应用的要求。

实施例2墨兰花瓣原生质体基因瞬时表达

(1)含有目的基因的重组质粒制备

用于墨兰花瓣原生质体瞬时转化及蛋白表达的质粒包括只表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pAN580(由本实验室保存，载体构建方法见本实验室发表文章“Fengxi Yang；Genfa Zhu；Yonglu Wei；Jie gao；Gang Liang；Lingyuan peng；Chuqiao Lu；JianpengJin.Low-temperature-induced changes in the transcriptome reveal a major roleof CgSVP genes in regulating flowering of Cymbidium goeringii.BMC Genomics,20(1):53.2019”)、表达包含花器官特征决定相关基因CsAP3与GFP的融合蛋白、CsPI9与GFP融合蛋白的重组质粒pAN580-CsAP3和pAN580-CsPI。

重组质粒pAN580-CsAP3和pAN580-CsPI的构建方法如下：提取墨兰品种白墨的植物总RNA，反转录合成第一链cDNA；根据基因CsAP3和CsPI9的全长编码序列，设计含同源重组序列的特异引物(表5)。以合成的cDNA为模板，用特异引物PAN580-CsAP3-F和PAN580-CsAP3-R、PAN580-CsPI-F和PAN580-CsPI-R进行PCR扩增。质粒pAN580经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切后，同PCR产物一起进行割胶回收和纯化，之后用无缝克隆试剂盒SeamlessAssembly Cloning Kit(CloneSmarter C5891-25,美国)把CsAP3和CsPI9的全长编码序列克隆到质粒pAN580中，分别得到表达CsAP3-GFP融合蛋白和CsPI-GFP的融合蛋白的重组质粒pAN580-CsAP3和pAN580-CsPI。之后将重组质粒分别转化入DH5α大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司CB101-01,北京)，挑取单克隆进行测序验证，对测序验证正确的菌株进行质粒大提，及质粒浓缩后，用于原生质体转化。

表5构建墨兰叶肉原生质体瞬时转化的重组质粒引物序列

(2)墨兰花瓣原生质体转化及蛋白表达

将实施例1步骤(4)获得的密度为1×10⁵～1×10⁶个/mL的墨兰花瓣原生质体取200μL，与20μL预冷的含有目的基因的重组质粒pAN580-CsAP3和pAN580-CsPI(设置6个浓度梯度：5μg/20μL、10μg/20μL、20μg/20μL、40μg/20μL、60μg/20μL和80μg/20μL)柔和混匀，然后加入220μL一定浓度的PEG-CaCl₂溶液，室温避光静置5～25min后(设置5个时间梯度：5min、10min、15min、20min和25min)，加入440μL实施例1步骤(3)制备的W5溶液终止反应，100g离心3min，弃上清，重复一次，最终加入1mL的WI溶液，置于6孔细胞培养板中，23℃避光过夜培育(12～24h)。按如下方法配置PEG-CaCl₂溶液：20％～60％(m/v)的聚乙二醇4000(设置5个终浓度梯度：20％、30％、40％、50％和60％)、0.2mol/L甘露醇和0.1mol/L氯化钙；现用现配，且保证其充分溶解，用0.45μm滤膜过滤除菌，室温保存。

按如下方法配置WI溶液：0.5mol/L甘露醇、20mmol/L氯化钾和4mmol/L MES(pH＝5.7)，高压蒸汽灭菌，4℃保存。

(3)墨兰花瓣原生质体基因瞬时表达的检测

通过荧光显微镜观察GFP的绿色荧光，计算原生质体的转化效率，进而判定目的基因在墨兰花瓣原生质体瞬时表达水平。具体方法如下：将步骤(2)中过夜培养的含有原生质体的WI溶液50g离心3min，去掉部分上清，加入200μL的WI溶液，重悬原生质体；吸取20μL原生质体悬浮液于载玻片上，在荧光显微镜(Axio Observer A1)下观察原生质体的状态和蛋白表达情况。随机选取3个视野，分别在明场和荧光场(绿色激发块，484nm激发光)下拍照，并统计有荧光的原生质体数目和比例(图3)。则原生质体转化效率(％)＝具有荧光的原生质体数目/原生质体总数目×100％。

(4)对墨兰花瓣原生质体瞬时转化条件的优化

为了提高原生质体的转化效率，对质粒DNA浓度、PEG4000终浓度(w/v)、PEG-CaCl₂的处理时间进行了优化。结果如图4所示，适宜的质粒浓度为20μg/20μL，最佳的PEG4000浓度为25％(w/v)，最好的PEG-CaCl₂处理时间为15min。墨兰花瓣原生质体瞬时转化效率最高可达76.06±4.51(％)，并能应用于墨兰花器官特征决定相关基因的亚细胞定位等研究。

(5)亚细胞定位分析

通过用激光共聚焦显微镜(LSM 710)观察GFP、CsAP3与GFP融合蛋白、CsPI与GFP融合蛋白的绿色荧光在原生质体细胞核、细胞质和细胞膜等部位的表达，进行CsAP3和CsPI蛋白的亚细胞定位分析。具体方法如下：将步骤(2)中过夜培养的含有原生质体的WI溶液于50g离心3min，去掉部分上清，加入200μL的WI溶液重悬原生质体，并加入一定量的DAPI细胞核DNA染色剂；吸取20μL原生质体悬浮液于载玻片上，在激光共聚焦显微镜(LSM 710)下观察原生质体的状态和蛋白表达情况。如图5所示，CsAP3-GFP和CsPI-GFP融合蛋白表达位置与DAPI的显色位置一致，说明这两个融合蛋白均定位于细胞核中。

实施例3墨兰叶肉原生质体的制备

(1)材料选择及处理

从墨兰生长环境适宜的玻璃温室，选取无病害、无畸形、无胁迫的健康墨兰品种白墨植株初花期的叶芽基部幼嫩叶肉，用75％(v/v)的乙醇浸泡2min消毒，用无菌水冲洗3-4遍后，用无菌滤纸吸干水分备用。

(2)酶解及原生质体分离

把消毒清洗后的约1g墨兰叶肉用手术刀片横叶脉切成约1mm的细丝，且为避免细胞受损，每切3到5片叶肉换一个刀片。切好的叶肉细丝(图6)立即放入盛有20mL酶解液的200mL无菌锥形瓶中，用封口膜密封，置于恒温摇床上(28℃、30rpm)避光酶解，设定不同的酶解时间(2h、4h、6h和8h)。

按如下方法配置原生质体酶解液：纤维素酶R-10(3个浓度梯度(m/v)：0.6％、1.2％和2.4％)、离析酶R-10(3个浓度梯度(m/v)：0.3％、0.6％和1.2％)、甘露醇(6个浓度梯度：0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L和0.7mol/L)、氯化钾浓度为20mmol/L、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES，PH＝5.7)浓度为20mmol/L，55℃水浴10min，冷却到室温，加入的氯化钙浓度为10mmol/L、牛血清蛋白(BSA)浓度为0.1％和β-巯基乙醇(5个浓度梯度1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L和20mmol/L)，用0.45μm滤膜过滤除菌。

(3)原生质体纯化

把获得的含有墨兰叶肉原生质体的酶解液，加入等量的W5溶液，用W5溶液润湿的150尼龙网筛过滤。滤液以50g离心3min，弃上清，再加入30mL冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体沉淀。在冰上静置30分钟，在不触碰原生质体的情况下，尽可能吸弃上清，然后用适量MMG溶液轻柔重悬原生质体。

按照如下浓度配置W5溶液：154mmol/L的氯化钠、125mmol/L的氯化钙、5mmol/L的氯化钾、20mmol/L的MES(pH＝5.7)，调节PH至5.7～5.8。

按照如下浓度配置MMG溶液：0.4mol/L的甘露醇、15mmol/L的氯化镁、4mmol/L的MES(pH＝5.7)，调节pH至5.7～5.8。

(4)原生质体的密度测定及活性检测

用血细胞计数板测定和计算墨兰叶肉原生质体的密度和得率，具体方法如下：在干净的血球计数板计数区盖一块盖玻片，沿盖玻片边缘滴入一滴原生质体悬浮液，并用吸水纸吸去多余悬液。静置2min，将其置于显微镜的载物台上，计数5个计数格内的完整原生质体个数(N)。则所测悬浮液中原生质体密度(个/mL)＝N/2×10⁵，原生质得率(个/g FW)＝悬浮液中原生质体密度×悬浮液体积/酶解所用叶肉鲜重

用0.2％(m/v)FDA染色法测定原生质体的活性，具体方法如下：溶解2mg FDA溶于1mL丙酮中，4℃避光贮存。吸取9μL原生质体提取液，滴于载玻片上，加入1μL的0.2％的FDA溶液，静置5min，于荧光显微镜下观察(蓝色激发块)。发绿色荧光的为有活力的原生质体,没有产生荧光的原生质体无活力。选取3个视野，分别以与明场和荧光场下拍照，并计数有活力的原生质体的数目(图7)。原生质体活性率(％)＝(视野1产生荧光的原生质体数目/视野1原生质体总数目+视野2产生荧光的原生质体数目/视野2原生质体总数目+视野3产生荧光的原生质体数目/视野3原生质体总数目)/3。用MMG溶液调整纯化的叶肉原生质体其密度至1×10⁵～1×10⁶个/mL。

(5)墨兰叶肉原生质体酶解条件优化

对墨兰叶肉原生质体酶解条件进行了优化。实验设置同实施例1墨兰花瓣原生质体酶解条件优化实验。结果显示：酶解液中最佳的纤维素酶R-10和离析酶R-10的浓度分别为1.2％(m/v)和0.6％(m/v)，最适宜的甘露醇浓度为0.4mol/L，最适宜的酶解时间为6h，最适宜的β-巯基乙醇浓度为5mmol/L。当国兰叶肉原生质体制备过程中满足以上优化的酶解条件时，原生质体得率和活性率能达到最高，分别为2.50±0.60(10⁷/g FW)和92.09±5.14(％)，能满足后续原生质体基因瞬时表达等相关应用的要求。

实施例4墨兰叶肉原生质体基因瞬时表达

(1)含有目的基因的重组质粒制备

用于墨兰叶肉原生质体瞬时转化及蛋白表达的质粒，包括只表达GFP的质粒pAN580、表达包含花器官特征决定相关基因CsAP3与黄色荧光蛋白N端(YFPn)融合蛋白的重组质粒pSPYNE-CsAP3、CsPI与黄色荧光蛋白C端(YFPc)融合蛋白的重组质粒pSPYCE-CsPI。

重组质粒pSPYNE-CsAP3和pSPYCE-CsPI的构建方法如下：提取国兰品种白墨的总RNA，并反转录合成第一链cDNA；根据基因CsAP3和CsPI的编码序列，设计含同源重组序列的特异引物(表6)。以合成的cDNA为模板，用特异引物pSPYNE-CsAP3-F和pSPYNE-CsAP3-R、pSPYCE-CsPI-F和pSPYCE-CsPI-R分别进行PCR扩增。质粒pAN580经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切后，同PCR产物一起进行割胶回收和纯化，之后用无缝克隆试剂盒SeamlessAssembly Cloning Kit(CloneSmarter C5891-25,美国)把CsAP3和CsPI的PCR产物分别克隆到质粒pSPYNE和pSPYCE中。重组质粒pSPYNE-CsAP3能表达包含花器官特征决定相关基因CsAP3与黄色荧光蛋白N端(YFPn)的融合蛋白，重组质粒pSPYCE-CsPI能表达CsPI9与黄色荧光蛋白C端(YFPc)的融合蛋白。之后将重组质粒转化入DH5α大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司CB101-01,北京)，挑取单克隆进行测序验证，对测序验证正确的菌株进行质粒大提，质粒浓缩后备用。

表6构建墨兰叶肉原生质体瞬时转化的重组质粒引物序列

(2)墨兰叶肉原生质体瞬时转化及蛋白表达

将实施例3步骤(4)获得的密度为1×10⁵～1×10⁶个/mL的墨兰叶肉原生质体取200μL，与20μL预冷的含有目的基因的重组质粒(设置6个浓度梯度：5μg/20μL、10μg/20μL、20μg/20μL、40μg/20μL、60μg/20μL和80μg/20μL，BiFC分析转化时质粒pSPYNE-CsAP3和pSPYCE-CsPI各加10μL)，柔和混匀，然后加入220μL一定浓度的PEG-CaCl₂溶液，室温避光静置5～25min后(设置5个时间梯度：5min、10min、15min、20min和25min)，加入440μL实施例3步骤(3)制备的W5溶液终止反应，50g离心3min离心，弃上清，加入1mL的WI溶液，置于6孔细胞培养板中，23℃避光培育12-24h。

按如下方法配置PEG-CaCl₂溶液：20％～60％(m/v)的聚乙二醇4000(设置5个浓度梯度：20％、30％、40％、50％和60％)、0.2mol/L甘露醇和0.1mol/L氯化钙，现用现配，且保证其充分溶解，用0.45μm滤膜过滤除菌，室温保存。

按如下方法配置WI溶液：0.4mol/L甘露醇、20mmol/L氯化钾和4mmol/L MES(pH＝5.7)，高压蒸汽灭菌，4℃保存。

(3)墨兰叶肉原生质体基因瞬时表达的检测

通过荧光显微镜观察GFP的绿色荧光，计算原生质体的转化效率，进而判定目的基因在墨兰叶肉原生质体瞬时表达水平。具体方法如下：原生质体培养液于50g离心3min，去掉部分上清，加入200μL的WI溶液，重悬原生质体；吸取20μL原生质体悬浮液于载玻片上，在荧光显微镜(Axio Observer A1)下观察原生质体的状态和蛋白表达情况(图8)。随机选取3个视野，分别在明场和荧光场(黄色激发块，514nm激发光)下拍照，并统计有荧光的原生质体数目和比例。原生质体转化效率(％)＝具有荧光的原生质体数目/原生质体总数目×100％。

(4)质粒DNA浓度对墨兰叶肉原生质体瞬时转化效率的影响

为了提高原生质体的转化效率，对质粒DNA设置了6个浓度梯度：5μg/20μL、10μg/20μL、20μg/20μL、40μg/20μL、60μg/20μL和80μg/20μL。转化培养后进行转化效率统计，如表7所示，转化效率随质粒DNA浓度的提高而提高当质粒浓度达到20μg时，转化效率达到77.31±2.52(％)，能满足亚细胞定位等应用对原生质体转化效率及瞬时表达水平的要求；当质粒浓度提高到30μg和40μg时，转化效率提高不足达到10％。出于节约成本的需要，以20μg(20μL)作为墨兰叶肉原生质体瞬时转化较适宜的质粒浓度。

表7质粒DNA浓度对国兰叶肉原生质体瞬时转化效率的影响

注：所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值±标准差表示。

(5)PEG浓度对墨兰叶肉原生质体瞬时转化效率的影响

为了提高原生质体的转化效率，对转化过程中PEG4000终浓度(w/v)设置了5个梯度：10％、20％、25％、30％、35％和40％。转化培养后进行转化效率统计，如表8所示，当PEG4000浓度为10％～25％时，转化效率随PEG4000浓度的提高而提高，当PEG4000浓度达到25％时，转化效率达到最高，为79.09±1.57(％))，但当PEG4000浓度再提高时完整原生质体的数目减少。为了兼顾转化效率及原生质体的完整性，以25％作为墨兰叶肉原生质体瞬时转化较适宜的PEG4000终浓度(w/v)。

表8 PEG4000浓度对墨兰叶肉原生质体瞬时转化效率的影响

注：所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值±标准差表示；

(6)转化时间对墨兰叶肉原生质体瞬时转化效率的影响

为了提高原生质体的转化效率，对转化过程中PEG-CaCl₂的处理的时间设置了5个梯度：5min、10min、15min、20min和25min。转化培养后进行转化效率统计，如表9所示，当PEG-CaCl₂处理时间为5～15min时，转化效率随PEG4000处理时间的延长而提高，当PEG4000浓度达到15min时，转化效率达到最高，为72.48±3.87(％)，但当PEG4000浓度再提高时完整原生质体的数目减少。为了兼顾转化效率及原生质体的完整性，以15min作为墨兰叶肉原生质体瞬时转化最佳的PEG-CaCl₂处理时间。

表9转化时间对墨兰叶肉原生质体瞬时转化效率的影响

注：所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值±标准差表示。

综上所述，本发明对墨兰叶肉原生质体瞬时转化条件优化结果显示：最佳的质粒浓度为20μg，最佳的PEG4000浓度为25％，最佳的PEG4000浓度为15min。当墨兰叶肉原生质体瞬时转化过程中，满足以上优化的酶解条件时，转化效率最高，达到79.09±1.57(％)，能满足BiFC等相关应用的要求。

(7)双分子荧光互补分析

通过用激光共聚焦显微镜(LSM 710)观察CsAP3与黄色荧光蛋白N端(YFPn)融合蛋白、CsPI与黄色荧光蛋白C端(YFPc)融合蛋白在原生质体细胞核、细胞质和细胞膜等部位的表达，进行CsAP3和CsPI的BiFC蛋白互作分析。具体方法如下：原生质体培养液于100g离心3min，去掉部分上清，加入200μL的WI溶液，重悬转化后过夜培养的原生质体，并加入一定量的DAPI细胞核染色剂；吸取20μL原生质体悬浮液于载玻片上，在激光共聚焦显微镜(LSM710)下观察原生质体的状态和蛋白表达情况。如图9所示，共转化重组质粒pSPYNE-CsAP3和pSPYCE-CsPI的原生质体细胞能观察到荧光，且荧光位置与DAPI的显色位置一致，说明CsAP3-2和CsPI9所编码的蛋白在细胞核中存在蛋白互作关系。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广东省农业科学院环境园艺研究所

<120>国兰原生质体瞬时表达系统及其构建方法与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PAN580-CsAP3-F

<400> 1

cttaagtccg gagctagctc tagagatggg gagagggaag atag 44

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PAN580-CsAP3-R

<400> 2

tcgcccttgc tcaccatgga tccagcgaga cgcagatcat gagg 44

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PAN580-CsPI-F

<400> 3

cttaagtccg gagctagctc tagagatggg acgtggaaag atag 44

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PAN580-CsPI-R

<400> 4

tcgcccttgc tcaccatgga tcccttgttt ccctgcaagt tg 42

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pSPYNE-CsAP3-F

<400> 5

tggagagaac acgggggact ctagaatggg gagagggaag atagag 46

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pSPYNE-CsAP3-R

<400> 6

gtcgacagta ctatcgatgg atccagcgag acgcagatca tgagg 45

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pSPYCE-CsPI-F

<400> 7

tggagagaac acgggggact ctagaatggg acgtggaaag atag 44

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pSPYCE-CsPI-R

<400> 8

gtcgacagta ctatcgatgg atcccttgtt tccctgcaag ttg 43

Claims (7)

1.一种国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）采集国兰的花瓣或者叶片，切成细丝，放入酶解液中酶解2~6h，得到原生质体；

（2）将等量的W5溶液加入步骤（1）所述的酶解液中，过滤，离心，弃上清，加入W5溶液，0~4℃静置30 min，弃上清，用MMG溶液重悬沉降的原生质体，得到纯化的原生质体；

（3）将步骤（2）中纯化的原生质体采用MMG溶液调整浓度，与预冷的含有目的基因的重组质粒混匀，加入PEG-CaCl₂溶液处理5~20min，加入W5溶液终止反应；

（4）100 g离心3 min，弃上清，加入1 mL的WI溶液，22~24℃避光孵育12~24 h，得到国兰原生质体瞬时表达系统；

步骤（1）中所述的国兰为墨兰；

步骤（1）中所述的花瓣为初花期的幼嫩花瓣；所述的叶片为叶芽基部的幼嫩叶肉；

步骤（1）中所述的酶解液通过如下步骤制备得到：将浓度为质量体积比1.2%的纤维素酶R-10、浓度为质量体积比0.6%的离析酶R-10、浓度为0.4或0.5 mol/L的甘露醇、浓度为20mmol/L的氯化钾以及pH=5.7、浓度为20 mmol/L的MES缓冲液混匀，55℃水浴10 min，冷却至室温，加入浓度为10 mmol/L的氯化钙、浓度为质量体积比0.1的牛血清蛋白和浓度为5mmol/L 的 β-巯基乙醇，用0.45 μm滤膜过滤除菌；其中；原生质体来自国兰的花瓣时，甘露醇的浓度为0.5 mol/L；原生质体来自国兰的叶片时，浓度为0.4 mol/L；

步骤（2）中所述的W5溶液通过如下步骤制备得到：浓度为154 mmol/L的氯化钠，浓度为125 mmol/L的氯化钙，浓度为5 mmol/L的氯化钾和pH=5.7、浓度为20 mmol/L的MES缓冲液混匀，调节pH至5.7~5.8；

步骤（2）和（3）中所述的MMG溶液通过如下步骤制备得到：浓度为0.4 mol/L的甘露醇，浓度为15 mmol/L的氯化镁，pH=5.7、浓度为4 mmol/L的MES缓冲液混匀，调节pH至5.7~5.8；

步骤（3）中，

原生质体来自国兰的花瓣时，含有目的基因的重组质粒为含有花器官特征决定相关基因CsAP3和CsPI完整编码序列的重组质粒pAN580-CsAP3和pAN580-CsPI；

原生质体来自国兰的叶片时，含有目的基因的重组质粒为含有CsAP3与黄色荧光蛋白N端融合蛋白的重组质粒pSPYNE-CsAP3以及含有CsPI与黄色荧光蛋白C端融合蛋白的重组质粒pSPYNE-CsPI；

步骤（3）中所述的PEG-CaCl₂溶液的配方为：质量体积比为25%的PEG4000、0.2 mol/L甘露醇和0.1 mol/L氯化钙；

步骤（3）中所述的加入PEG-CaCl₂溶液处理为避光静置处理；处理时间为15 min；

步骤（3）中所述的含有目的基因的重组质粒在体系中的浓度为20 μg/20 mL；

步骤（4）中所述的WI溶液的配方为：0.5 mol/L甘露醇，20 mmol/L氯化钾和pH=5.7、4mmol/L MES缓冲液。

2.根据权利要求1所述的国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的酶解为避光条件下，28℃酶解6 h。

3.根据权利要求1所述的国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的国兰为墨兰品种白墨。

4.根据权利要求1所述的国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的花瓣或者叶片先采用体积比为75%的乙醇浸泡2 min，无菌水洗3~4次，用无菌滤纸吸干水分；

步骤（1）中所述的切成细丝是将国兰花瓣或叶肉横叶脉切成约1 mm的细丝，每切3到5片换一个刀片，切好的细丝立即放入酶解液中；

步骤（2）中所述的过滤采用的滤网为150目的尼龙网；

步骤（2）中所述的离心为100 g离心3min；

步骤（2）中所述的纯化的原生质体还包括用二乙酸荧光素染色法检测活性，用血细胞计数板测定其浓度的步骤；

步骤（3）中所述的采用MMG溶液调整浓度是将原生质体浓度调整至1×10⁵~1×10⁶个/mL。

5.一种国兰原生质体瞬时表达系统，通过权利要求1~4任一项所述的构建方法制备得到。

6.权利要求5所述的国兰原生质体瞬时表达系统在利用国兰细胞表达外源蛋白中的应用。

7.权利要求6所述的国兰原生质体瞬时表达系统在目的基因功能研究中的应用。

Images