CN115247145A

CN115247145A - 一种油茶花瓣原生质体的分离及瞬时转化体系构建方法

Info

Publication number: CN115247145A
Application number: CN202210724747.6A
Authority: CN
Inventors: 李宁; 林增; 黄黎君; 袁德义
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2042-06-24
Also published as: CN115247145B

Abstract

本发明公开了一种油茶花瓣原生质体的分离及瞬时转化体系构建方法。具体地公开了油茶原生质体的分离方法，包括：A1)酶裂解：将油茶花瓣撕去表皮后放入酶解液中，置于28℃黑暗条件下酶解7.5～8h，得到原生质体悬浮液；所述酶解液的组成为：3％(30g/L)纤维素酶R10、1％离析酶R10(10g/L)、0.5M甘露醇、20mMMES、20mM KCl和10mM CaCl₂，余量为水；A2)分离。本发明还提供了油茶原生质体的瞬时转化方法。本发明方法取材方便，无需无菌组培，省去大量前期准备工作，原生质体分离效率高且损失小，转化率可高达80％以上，为油茶基因功能的研究提供了强力支撑。

Description

一种油茶花瓣原生质体的分离及瞬时转化体系构建方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种油茶花瓣原生质体的分离及瞬时转化体系构建方法。

背景技术

油茶(Camellia oleifera)是山茶科山茶属的常绿小乔木，其种子可榨油(茶油)，是我国特有的木本食用油料树种，距今已有2000多年的栽培和利用历史。油茶与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物，与乌桕、油桐和核桃并称为我国四大木本油料植物。茶油具有极高的营养价值，不饱和脂肪酸含量高，耐贮藏，是优质的植物油。茶油是重要的医药、化工原材料，不仅可以食用，也可作为润滑油、防锈油用于工业；油茶饼粕的提取物中还含有角鲨烯、山茶甙、山茶皂甙等生理活性成分，具有杀菌、抗氧化、抗肿瘤和抗炎症等功能，被广泛应用在日用化学、医药、生物农药、建材化工等行业。

油茶作为重要的农业经济作物，其基因改良日益受到重视，目前虽已选育出一批优良无性系或家系良种，但具有产量稳定、抗性强、广适性好等优良性状的品种仍旧不多，相对于传统的无性系选育和杂交育种，分子育种可以针对某一特定性状进行定向改良，具有巨大的发展潜力。目前经济林学者已将遗传学、多组学及分子生物学等多种分子技术应用于油茶育种研究。迫于林木遗传转化体系受限，对于油茶这类木本植物基因功能通常使用模式植物拟南芥或烟草进行验证。但是由于基因在拟南芥或烟草中异源表达，与本体表达差异较大，无法得到准确的结果，故探索一种高效的油茶遗传转化体系对于基因功能的研究至关重要。

植物原生质体是指去除细胞壁、被质膜包裹的有生活力的植物细胞。原生质体能够直接摄取外源的DNA(质粒)，是进行遗传转化的理想受体，广泛应用于细胞生物学、组织和细胞培养、分子生物学等方面的研究。植物瞬时表达是一种将目的基因导入靶细胞，在短时间内使外源基因高效表达的技术。利用原生质体进行瞬时表达耗时短，在蛋白质定位、蛋白质相互作用、基因功能鉴定和基因编辑等方面广泛应用。目前，植物原生质体的研究主要集中在模式植物和主要粮食作物上，木本植物的相关报道较少且在油茶上还未见报道。以原生质体为受体的油茶瞬时转化体系的建立将为油茶基因功能的验证、基因表达调控、蛋白亚细胞定位、信号转导、RNA干扰(RNAi)、基因编辑等方面提供快速高效的技术手段，对油茶遗传改良和植物学研究具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种油茶花瓣原生质体的分离方法和/或高效的油茶花瓣原生质体的瞬时转化方法。本发明所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为了实现上述目的，本发明首先提供了油茶原生质体的分离方法，所述方法包括如下步骤：

A1)酶裂解：将油茶花瓣撕去表皮后放入酶解液中，置于28℃黑暗条件下酶解7.5～8h，得到原生质体悬浮液；

所述酶解液的组成可为：30g/L(3％)纤维素酶R10、10g/L(1％)离析酶R10、0.5M甘露醇、20mM MES(2-吗啉乙磺酸)、20mM KCl和10mM CaCl₂，余量为水；

A2)分离：将步骤A1)获得的原生质体悬浮液过滤，收集滤液离心，收集原生质体沉淀，然后在所述原生质体沉淀中加入W5溶液，冰浴30分钟，弃上清液，得到油茶原生质体。

进一步地，所述油茶花瓣可为新鲜油茶花瓣。

进一步地，所述油茶花瓣可为盛开一至三天的新鲜油茶花瓣。

上述方法中，所述W5溶液的组成可为：2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mMKCl，余量为水。

上述方法中，所述方法还包括将所述油茶原生质体重悬于MMG溶液，得到油茶原生质体悬浮液，所述MMG溶液的组成可为：4mM MES、0.4M甘露醇和15mM MgCl₂，余量为水。

上述方法中，步骤A2)中所述过滤可采用孔径为70微米的滤网进行。

上述方法中，步骤A2)中所述收集滤液离心的条件可为：700rpm离心2min。

本发明还提供了一种油茶原生质体的瞬时转化方法，所述方法包括如下步骤：

B1)转化：将待转化质粒与所述油茶原生质体悬浮液混合，加入PEG溶液，室温(20～25℃)孵育，得到孵育混合物；

B2)培养：在所述孵育混合物中加入W5溶液终止反应，离心收集沉淀，再加入WI溶液，遮光培养，完成油茶原生质体的转化。

上述瞬时转化方法中，所述PEG溶液中含有PEG4000，所述PEG溶液中PEG4000的浓度为200g/L。

上述瞬时转化方法中，所述PEG溶液的组成为：200g/L PEG4000、0.2mM甘露醇和100mM CaCl₂，余量为水。

上述瞬时转化方法中，所述待转化质粒与所述油茶原生质体悬浮液的质量体积比可为10～20ug:200ul。

进一步地，上述瞬时转化方法中，所述待转化质粒与所述油茶原生质体悬浮液的质量体积比可为20ug:200ul、19ug:200ul、18ug:200ul、17ug:200ul、16ug:200ul、15ug:200ul、14ug:200ul、13ug:200ul、12ug:200ul、11ug:200ul或10ug:200ul。

上述瞬时转化方法中，B1)中所述室温孵育为室温孵育15min，B2)中所述遮光培养为25℃、遮光培养12～16h；所述W5溶液的组成为：2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mMKCl，余量为水；所述WI溶液的组成为：4mM MES、0.5mM甘露醇和20mM KCl，余量为水。

进一步地，所述待转化质粒可为35S-GFP载体和/或pB7WGF2-CoTGA2。

进一步地，所述35S-GFP载体与所述油茶原生质体悬浮液的质量体积比可为10ug:200ul。

进一步地，所述pB7WGF2-CoTGA2载体与所述油茶原生质体悬浮液的质量体积比可为20ug:200ul。

本发明还提供了所述油茶原生质体的分离方法和/或所述油茶原生质体的瞬时转化方法在基因功能的验证、基因表达调控、蛋白亚细胞定位、信号转导、RNA干扰和/或基因编辑中的应用。

本发明所述油茶原生质体可为油茶花瓣原生质体。

在本发明的一个实施方案中，所述油茶花瓣原生质体的分离方法包括如下步骤：

(1)材料获取：挑选刚刚盛开一至三天的新鲜油茶花花瓣；

(2)酶裂解：将油茶花花瓣表面水分吸干，撕去表皮将其放入酶解液中，然后置于28℃黑暗条件下酶解7.5～8h，得到原生质体悬浮液；

所述酶解液(即原生质体酶裂解液，表1)的组成为：3％(30g/L)纤维素酶R10、1％离析酶R10(10g/L)、0.5M甘露醇、20mM MES(2-吗啉乙磺酸)、20mM KCl和10mM CaCl₂，余量为水；

(3)分离：用1mL W5溶液润洗孔径为70μm(微米)的滤网，过滤收集原生质体悬浮液，700rpm离心2min，弃去上清液，剪去枪尖在原生质体沉淀中缓慢的加入5mL W5溶液悬浮原生质体，置于冰上30分钟，弃去上清，得到油茶原生质体沉淀；最后将所述油茶原生质体沉淀重悬于MMG溶液，分离得到油茶原生质体悬浮液；

所述W5溶液(即W5缓冲液，表2)的组成为：2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量为水；所述MMG溶液(即MMG缓冲液，表3)的组成为：4mM MES、0.4M甘露醇和15mM MgCl₂，余量为水。

在本发明的一个实施方案中，所述油茶花瓣原生质体的瞬时转化方法包括如下步骤：

(1)转化：分别将待转化质粒(35S-GFP 10ug或pB7WGF2-CoTGA2 20ug)加入2mL离心管中，剪去枪尖吸取200ul所述原生质体悬浮液加入，轻柔地上下颠倒3次混匀；同样剪去枪尖再加入220ul的PEG溶液，轻柔地上下颠倒10次混匀，然后室温静置孵育15min，得到孵育混合物；

所述PEG溶液(即PEG(20％)缓冲液，表5)的组成为：200g/L的PEG4000、0.2mM甘露醇和100mM CaCl₂，余量为水；

(2)培养：在孵育混合物中加入800ul的W5溶液轻柔地上下颠倒10次终止反应，700rpm离心1min反复三次，第一次吸去1000ul上清；第二次吸去200ul上清，最后用无菌注射器吸净上清收集沉淀(即经过瞬时转化的油茶花瓣原生质体)；再加入250ul WI溶液悬浮所述转化的油茶花瓣原生质体，25℃、遮光培养12～16h，得到成功转化的原生质体。

所述WI溶液(即WI缓冲液，表4)的组成为：4mM MES、0.5mM甘露醇和20m M KCl，余量为水。

所述W5溶液的组成为：2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量为水。

本发明所述35S-GFP载体记载在如下文献中：Li N,Yuan D,Huang LJ.Development of a Gateway-compatible two-component expression vector systemfor plants[J].Transgenic Research,2019,28(5-6):1-12.

所述质粒pB7WGF2-CoTGA2是基于gateway克隆的方法将CoTGA2基因重组入最终载体pB7WGF2中，即将pB7WGF2载体的attR1和attR2识别位点间的片段替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA片段(即CoTGA2基因)，保持pB7WGF2载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组质粒。

所述pB7WGF2载体记载在如下文献中：Karimi et al.GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.Trends Plant Sci.2002；7(5):193-195.

本发明的有益效果：本发明方法相较于油茶叶片革质、多纤维，分离原生质体的难度高；组织培养需要大量前期准备材料的工作，每次制备都需要无菌操作，操作复杂且耗时，特别是愈伤组织原生质体对材料要求高，需要特定的愈伤材料，并建立悬浮体系辅助酶解；而花瓣的质地柔软，取材方便，不需要经过特殊处理和一系列培养过程就可以获得高产量的原生质体，原生质体的分离效率高且损失小。本发明通过优化酶浓度组合、渗透压等酶解条件建立了一种简便、快捷、高效的油茶花瓣原生质体分离方案，我们优化聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化的影响因素，包括PEG4000浓度和质粒DNA量，首次建立了高效、稳定的油茶花瓣原生质体的转化方法，原生质体的转化率可高达80％以上，为油茶基因功能的研究提供了强力支撑。

附图说明

图1为花瓣不同方式处理后示意图。

图2为酶解液配比对原生质体的影响。

图3为甘露醇浓度对原生质体的影响。

图4为刚刚盛开一至三天的新鲜油茶花花瓣。

图5为100μm标尺下的油茶花瓣原生质体数量和活力检测。

图6为不同浓度质粒对原生质体瞬时转化率的影响。

图7为不同浓度PEG4000对原生质体瞬时转化率的影响。

图8为100μm标尺下的35S-GFP在油茶花瓣原生质体中亚细胞定位示意图。

图9为20μm油茶花瓣原生质体瞬时转化CoTGA2基因的共聚焦激光扫描显微镜检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中用到的主要试剂如表1～5所示。

表1原生质体酶裂解液

注：表1中原生质体酶裂解液现配现用。

表2 W5缓冲液

表3 MMG缓冲液

表4 WI缓冲液

表5 PEG(20％)缓冲液

注：表2～5中缓冲液保存于4℃。

实施例1、探究影响原生质体分离的因素

要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。本实施例考察了材料不同处理方式、酶解液配比和甘露醇浓度对原生质体的影响：

(1)材料不同处理方式对原生质体的影响

取4～5片油茶花瓣分别采用切细条、切出伤口、撕去表皮(简称撕皮法)的方法处理，然后加入5mL酶解液中。酶解液中，纤维素酶R10质量浓度为3％(30g/L)，离析酶R10浓度1％(10g/L)，甘露醇为0.5M，酶解8h。

在显微镜下观察酶解情况，采用切细条、切出伤口的方法处理油茶花瓣，花瓣褐化严重，细胞损伤较大，撕皮法处理花瓣基本无褐化，酶解后在显微镜下观察有较好的细胞存在，减少了原生质体损失，所以选用撕皮法处理原生质体较好，花瓣不同方式处理后示意图如图1所示，其中图1中A表示撕皮法；图1中B表示切出伤口的方法；图1中C表示切细条的方法。

(2)酶解液配比对原生质体的影响

取大小状态相似的2片油茶花瓣分别加入2.5mL酶解液中。所述酶解液为纤维素酶R10浓度为1％(10g/L)、2％(20g/L)、3％(30g/L)，离析酶R10浓度1％(10g/L)、2％(20g/L)俩俩组合，甘露醇浓度均为0.4M，酶解8h。实验结果如图2所示，结果表明，不同浓度组合的酶解液，其原生质体产量有很大的不同，当纤维素酶R10浓度为3％，离析酶R10浓度1％时，酶解8h，酶解效果最好，原生质体的产量可以达到9.34×10⁶/g FW。

(3)甘露醇浓度对原生质体的影响

取大小状态相似的2片油茶花瓣分别加入2.5mL酶解液中。所述酶解液为纤维素酶R10浓度为3％(30g/L)，离析酶R10浓度1％(10g/L)，甘露醇浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M，酶解8h。实验结果如图3所示，结果表明，不同浓度的甘露醇，其原生质体活性有很大的不同，当甘露醇浓度为0.5M酶解效果最好，活力更高，原生质体的产量可以达到1.42×10⁷/g FW，活力达到88％。

实施例2、油茶花瓣原生质体的分离方法

(1)材料获取：挑选刚刚盛开一至三天的新鲜油茶花花瓣，如图4所示；

(2)酶裂解：将油茶花瓣表面水分吸干，撕去表皮将其放入酶解液中，然后置于28℃黑暗条件下酶解7.5～8h，得到原生质体悬浮液；

所述酶解液(即原生质体酶裂解液，表1)的组成为：3％(30g/L)纤维素酶R10、1％(10g/L)离析酶R10、0.5M甘露醇、20mM MES(2-吗啉乙磺酸)、20mM KCl和10mM CaCl₂，余量为水；

(3)分离：用1mL W5溶液润洗孔径为70μm(微米)的滤网，过滤收集原生质体悬浮液，700rpm离心2min，弃上清液，剪去枪尖在原生质体沉淀中缓慢的加入5mL W5溶液重悬原生质体，置于冰上30分钟，弃去上清，得到油茶原生质体沉淀。最后将油茶原生质体重悬于MMG溶液，制备得到油茶花瓣原生质体悬浮液；

W5溶液(即W5缓冲液，表2)的组成为：2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mMKCl，余量为水；MMG溶液(即MMG缓冲液，表3)的组成为：4mM MES、0.4M甘露醇和15mM MgCl₂，余量为水。

(4)原生质体的计数：用移液枪(剪去枪尖)吸取50ul步骤(3)中W5重悬后的原生质体，滴加在16×25型血球计数板上，盖上盖玻片，在普通光学显微镜下观察并计数。每次计数三遍，取平均值。原生质体产量[原生质体个数/g FW]＝酶溶液中产生的原生质体数量/酶溶液中使用花瓣的鲜重。

(5)原生质体活力的检测：将FDA溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中，配制成5mg/mL的溶液。在100ul步骤(3)中W5重悬后的原生质体中滴加2ul FDA进行染色，黑暗条件静置5min，在荧光显微镜下观察和拍照。原生质体活力(％)＝(荧光原生质体数量/原生质体总数)×100％。原生质体数量和活力检测如图5所示。

实施例3、影响原生质体瞬时转化的因素

(1)不同浓度质粒对原生质体瞬时转化率的影响

分别将4、6、8、10ug待转化质粒(35S-GFP)加入2mL离心管中，剪去枪尖吸取200ul实施例2中得到的原生质体悬浮液加入，轻柔地上下颠倒3次混匀，再加入220ul的质量分数为40％的PEG4000溶液，轻柔地上下颠倒10次混匀，然后室温(20～25℃)静置培养15min，加入800ul的W5溶液终止反应，700rpm离心加入250ul WI溶液悬浮转化的油茶花瓣原生质体，25℃、遮光培养12～16h，得到成功转化的原生质体。实验结果如图6所示，结果表明质粒的浓度越高，原生质体的转化效率越高。

(2)不同浓度PEG4000对原生质体瞬时转化率的影响

将10ug待转化质粒(35S-GFP)加入2mL离心管中，剪去枪尖吸取200ul所述的原生质体悬浮液加入，轻柔地上下颠倒3次混匀，再分别加入220ul质量分数分别为10％、20％、30％、40％、50％和60％的PEG4000的PEG缓冲液，室温静置培养15min，加入800ul的W5溶液终止反应，700rpm离心加入250ul WI溶液悬浮转化的油茶花瓣原生质体，25℃、遮光培养12～16h，得到成功转化的原生质体。实验结果如图7所示，结果显示PEG4000质量分数为20％(对应的PEG4000的浓度为200g/L)的转化效率最佳，可达到80％。

实施例4、油茶花瓣原生质体的瞬时转化方法

经过实施例3的条件优化，PEG介导的油茶花瓣原生质体瞬时转化方法，包括如下步骤：

(1)转化：分别将待转化质粒(35S-GFP 10ug)加入2mL离心管中，剪去枪尖吸取200ul实施例2制备的原生质体悬浮液加入，轻柔地上下颠倒3次混匀，同样剪去枪尖再加入220ul的PEG溶液，轻柔地上下颠倒10次混匀，然后室温静置孵育15min，得到孵育混合物；

其中PEG溶液(即PEG(20％)缓冲液，表5)的组成为：200g/L PEG4000、0.2mM甘露醇和100mM CaCl₂，余量为水；

(2)培养：在孵育混合物中加入800ul的实施例2中的W5溶液(表2)轻柔地上下颠倒10次终止反应，700rpm离心1min反复三次，第一次吸去1000ul上清；第二次吸去200ul上清，最后用无菌注射器吸净上清收集沉淀(即经过瞬时转化的油茶花瓣原生质体)；再加入250ul WI溶液悬浮转化的油茶花瓣原生质体，25℃、遮光培养12～16h，得到成功转化的原生质体；

所述可用于油茶花瓣原生质体转化的质粒载体是35S-GFP载体,用量为10ug；所述WI溶液(即WI缓冲液，表4)的组成为4mM MES、0.5mM甘露醇和20mM KCl，余量为水。所述W5溶液(即W5缓冲液，表2)的组成为：2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量为水；

所述35S-GFP载体记载在如下文献中：Li N,Yuan D,Huang L J.Development ofa Gateway-compatible two-component expression vector system for plants[J].Transgenic Research,2019,28(5-6):1-12.

(3)油茶花瓣原生质体的瞬时转化效率的测定和结果

在LEICA TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜下观察GFP荧光信号，35S-GFP蛋白成功在油茶花瓣原生质体中表达，转化率在80％以上，激光共聚焦显微镜观察35S-GFP在原生质体瞬时表达示意图如图8所示。

实施例5、油茶花瓣原生质体瞬时转化CoTGA2基因的方法。

PEG介导的油茶花瓣原生质体瞬时转化CoTGA2基因方法，包括如下步骤：

(1)转化：将待转化质粒pB7WGF2-CoTGA2 20ug加入2mL离心管中，剪去枪尖吸取200ul所述原生质体悬浮液加入，轻柔地上下颠倒3次混匀；同样剪去枪尖再加入220ul的PEG溶液，轻柔地上下颠倒10次混匀，然后室温静置孵育15min，得到孵育混合物；

其中所述PEG溶液的组成为：200g/L PEG4000(20％PEG4000)、0.2mM甘露醇和100mM CaCl₂，余量为水；

CoTGA2基因是油茶抗病相关的转录因子的基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。

(2)培养：在孵育混合物中加入800ul的W5溶液(表2)轻柔地上下颠倒10次终止反应，700rpm离心1min反复三次，第一次吸去1000ul上清；第二次吸去200ul上清，最后用无菌注射器吸净上清收集沉淀(即经过瞬时转化的油茶花瓣原生质体)；再加入250ul WI溶液悬浮所述转化的油茶花瓣原生质体，25℃、遮光培养12～16h，得到成功转化的原生质体。

所述WI溶液(即WI缓冲液，表4)的组成为4mM MES、0.5mM甘露醇和20mM KCl，余量为水。所述W5溶液(即W5缓冲液，表2)的组成为：2mM MES、154mM N aCl、125mM CaCl₂和5mMKCl，余量为水。

(3)检测：在LEICA TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜下成功观察到位于细胞核的GFP-CoTGA2融合蛋白荧光信号，与CoTGA2作为转录因子在油茶细胞的细胞核中发挥功能，结果如图9所示。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南林业科技大学

<120> 一种油茶花瓣原生质体的分离及瞬时转化体系构建方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1008

<212> DNA

<213> 油茶（Camellia oleifera）

<400> 1

atggcagctg ccagtcctct aactgatacc tcaacagacg tggatacaga tgagaaaaat 60

caaaggtttg aaatgggtca atcgaatgct cttgtggcct ctgattcaag cgacagatca 120

aaggagaaaa cattggatca gaagacgtta aggaggcttg ctcagaatcg tgaagctgcc 180

agaaaaagcc gattgagaaa aaaagcctat gtacaacagc tggagagcag ccggctgaag 240

ctgacccaac ttgagcagga gctgcagcga gcccgccagc agggaatatt catttcaaac 300

tcaggagatc agtcctccca ttcatcgggt ggaaatgggg ccttggcatt taatgcagaa 360

tatgcacgat ggatggaaga gcacaatcag cagataaatg agcttagggc agcggtcaat 420

tcacatgcaa gcgacactga acttcgtact attgtggata gtgtcatcac acaatttgat 480

gatgttttca ggctgaaagg caatgcagcc aaggctgatg ttttccacat attgtcaggg 540

atgtggaaaa cacccgcaga acggtgtttt atgtggatcg gtggcttccg ctcctctgaa 600

cttctcaaac tcctcgtgaa tcaattagag cctctgacgg aacaacaatt aatggccatc 660

tacaacttac agcaatcatc acagcaagcg gaggacgcac tctctcaggg tatggaagca 720

ttgcagcaat ctctgtctga gacattggcc agtggatctt cttcgggccc atcaggatca 780

tcaggaaatg tggcaaatta tatgggtcaa atggcaatgg ccatggggaa gttaggaact 840

cttgagggtt ttgtccgtca ggctgatagt ttgcgacaac aaacgctaca acaaatgcat 900

cgtatactga caaccagaca atcagcccga gccctccttg cgataaatga ctatttctcc 960

cgacttcgag cccttagttc tctctggcac gccaggccac gggagtga 1008

Claims

1.油茶原生质体的分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

所述酶解液的组成为：30g/L纤维素酶R10、10g/L离析酶R10、0.5M甘露醇、20mM MES、20mM KCl和10mM CaCl₂，余量为水；

A2)分离：将步骤A1)获得的原生质体悬浮液过滤，收集滤液离心，收集沉淀，然后在所述沉淀中加入W5溶液，冰浴30分钟，弃上清液，得到油茶原生质体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述W5溶液的组成为：2mM MES、154mMNaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量为水。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述油茶原生质体重悬于MMG溶液，得到油茶原生质体悬浮液，所述MMG溶液的组成为：4mM MES、0.4M甘露醇和15mM MgCl₂，余量为水。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，步骤A2)中所述过滤采用孔径为70微米的滤网进行。

5.油茶原生质体的瞬时转化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

B1)转化：将待转化质粒与权利要求3中所述油茶原生质体悬浮液混合，加入PEG溶液，室温孵育，得到孵育混合物；

6.根据权利要求5所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述PEG溶液中含有PEG4000，所述PEG溶液中PEG4000的浓度为200g/L。

7.根据权利要求5或6所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述PEG溶液的组成为：200g/L PEG4000、0.2mM甘露醇和100mM CaCl₂，余量为水。

8.根据权利要求5-7中任一所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述待转化质粒与所述油茶原生质体悬浮液的质量体积比为10～20ug:200ul。

9.根据权利要求5-8中任一所述的瞬时转化方法，其特征在于，B1)中所述室温孵育为室温孵育15min，B2)中所述遮光培养为25℃、遮光培养12～16h；所述W5溶液的组成为：2mMMES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量为水；所述WI溶液的组成为：4mM MES、0.5mM甘露醇和20mM KCl，余量为水。

10.权利要求1-4中任一所述方法和/或权利要求5-9中任一所述的瞬时转化方法在基因功能的验证、基因表达调控、蛋白亚细胞定位、信号转导、RNA干扰和/或基因编辑中的应用。