CN107267549A - 一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法 - Google Patents

一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，包括：1）以中山杉生长30天长势良好的组培苗幼嫩叶片为材料，对材料进行30h的黑暗预处理；2）对叶肉原生质体进行分离和纯化；3）从15~20mL过夜培养菌液抽提50~80μg质粒，质粒为载体p2FGW7.0；4）PEG介导进行原生质体转化。本发明的中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，其操作简单易行，除可以获得大量、完整、纯净的中山杉叶肉原生质体外，还可以达到高达80%的质粒转化率。从而解决了无法深入研究中山杉基因功能的难题，也为其他针叶树种原生质体瞬时表达体系建立提供一定的参考及借鉴，将在林木基因工程领域有重要的应用价值。

Description

一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的 方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种中山杉品种406（Taxodium hybrids‘zhongshansha406’）叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法。
背景技术
植物原生质体即指“通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分细胞物质”，换言之原生质体就是除去全部细胞壁的“细胞”，仍具有细胞全能性。近年来，随着基因组学和蛋白质组学的发展，植物原生质体的瞬时表达已被科学家们广泛利用进行基因功能高通量分析，由于原生质体的代谢过程、对植物激素的应答、以及对环境因素的反应都与完整的植物细胞或组织细胞完全相同，因此原生质体为我们提供了一个分析植物信号转导途径的方便而有力的工具。这项技术己经被广泛的应用于启动子活性分析，基因亚细胞定位以及蛋白质间的相互作用等。而目前植物原生质体的研究主要集中于草本模式植物拟南芥、烟草，木本模式植物杨树等一些双子叶植物中。
中山杉是江苏省中国科学院植物研究所从落羽杉×墨杉杂交组合中选育出来的优良无性系，具有速生，耐水淹，耐盐碱，抗病虫害，干形优美等特点。目前中山杉的生理学，形态学研究已经获得一定成果，但是同大多数针叶树种一样，由于其遗传转化体系尚不成熟，造成中山杉分子生物学相关功能研究受到限制。
发明内容
发明目的：针对现在技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化方法。本发明的另一目的是提供一种中山杉品种406叶肉原生质体质粒高效转化的方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，包括以下步骤：
1）以中山杉生长30天长势良好的组培苗幼嫩叶片为材料，对材料进行30h的黑暗预处理；
2）对叶肉原生质体进行分离和纯化；
3）从15~20mL过夜培养菌液抽提50~80μg质粒，质粒为载体p2FGW7.0；
4）PEG介导进行原生质体转化。
步骤2）中，具体操作：
1）用刀片将中山杉片从叶柄上迅速分离下来，轻轻将叶片切成0.5-1mm宽的叶条；
2）配制酶液：500μL 200mM MES溶液，3.75mL 0.8 M甘露醇，500μL 0.2M KCl，25μLddH2O混合后，70℃水浴10 min后，立即加入150μL纤维素酶Cellulase，75μL果胶酶Pectinase，55℃水浴15min，0.20mm的膜过滤灭菌，酶液应新鲜制备，且呈浅棕色；
3）将叶片切好后舒展地放入酶液中，25℃恒温培养箱中暗陪5小时酶解，当酶解液体变绿时，轻轻摇晃培养容器促使原生质体释放出来；
4）沿培养容器边沿轻轻加入预冷的10 mL W5溶液，稀释含有原生质体的酶液；
5）轻轻混匀后，使用200目的筛子过滤除去未酶解的叶子以及杂质；
6）将滤液加入50mL的圆底离心管，4℃，900rpm离心5min，沉淀原生质体；
7）小心除去上清后，用5 mL W5溶液重悬沉淀在圆底管底部的原生质体；
8）普通光学显微镜下使用血球计数器观察计数；
9）冰上静止30 min，再次去除上清，然后用适量的MMG溶液重悬原生质体，使其终浓度达到6×105/mL，用于后期的质粒转化。
步骤3）中，具体操作：
1）向吸附柱CP4中加入500μL的平衡液BL，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
2）取5~15mL过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm 离心1 min，尽量吸除上清；
3）向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL 溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀；
4）向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6~8 次使菌体充分裂解；
5）向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6~8 离心管底部形成沉淀；
6）将上一步收集的上清液分次加入过滤柱Cs，12000rpm 离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4 中；
7）12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中；
8）向吸附柱CP4 中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中；
9）向吸附柱CP4 中加入600μL 漂洗液PW，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中；
10）向吸附柱CP4 中加入600μL漂洗液PW，12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液；
11）将吸附柱CP4 重新放回收集管中置于12000rpm 离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；
12）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100~300μLddH2O洗脱，室温放置2min，12000rpm离心lmin将质粒溶液收集到离心管中。
步骤4）中，具体操作：
1）加入20μL的已提纯的质粒（10-20ug）至2mL离心管中；
2）加入200μL的已经分离纯化的中山杉叶肉原生质体，轻柔混合；
3）加入220μL的PEG溶液，0.2 M mannitol，100 mM CaCl2），轻柔拍打离心管完全混合；
4）黑暗环境中，冰浴诱导转化混合物5-15分钟；
5）室温下用800 μL的W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应；
6）室温下用台式离心机1000rpm，离心6min，然后利用移液枪轻轻去除上清；
7）用200μL的WI溶液（4 mM MES，0.5 M mannitol，20 mM KCl （pH 5.7））轻柔重悬原生质体于多2mL的离心管中；
8）室温下黑暗培养，诱导原生质体表达转化的载体18小时以上；
9）荧光显微镜下观察GFP标签的表达。
有益效果：与现有技术相比，本发明的中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，其操作简单易行，除可以获得大量、完整、纯净的中山杉叶肉原生质体外，还可以达到高达80%的质粒转化率。从而解决了无法深入研究中山杉基因功能的难题，也为其他针叶树种原生质体瞬时表达体系建立提供一定的参考及借鉴，将在林木基因工程领域有重要的应用价值。
附图说明
图1是组培苗幼嫩叶片材料图；
图2是含有的植物瞬时表达载体的元件图；
图3是酶解时间对中山杉叶肉原生质体分离的影响图；
图4是中山杉原生质体酶解体系优化前后的对比图；
图5是中山杉叶肉原生质体转化情况（GFP）图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例中的测定方法如下：
原生质体产量测定：原生质体产量，即每克鲜重材料所制备的原生质体的量，采用血球计数板进行计数。吸取少量原生质体悬浮液（20μL）滴加在血球计数板上，当原生质体充满计数室后，在显微镜下观察计数。依次逐个计数中央大方格内25个中方格内的原生质体数，重复3次，然后按照下式计算出每毫升中原生质体数量。
原生质体密度（个/mL）=大方格内（0.lmm3，即0.1μL）的原生质体数×104
原生质体产量（个/g）=[原生质体密度（个/mL） ×原生质体悬浮液总体积（mL）]/制备原生质体所用材料鲜重（gFW）
实施例1 原生质体分离与纯化
1、材料的选择与预处理
一般而言，要想获得产量高、活性强、完整的原生质体，一般会选择角质化、纤维化低的幼嫩组织，且易获得的材料。本发明选择中山杉生长30天长势良好的组培苗幼嫩叶片材料（如图1所示），为了提高原生质体分离的效率和活性，需要对材料进行30h的黑暗预处理（将组培苗放置恒温培养箱中，25℃遮光生长30h）。
2、中山杉叶肉原生质体的分离与纯化
1）用刀片将中山杉片从叶柄上迅速分离下来，轻轻将叶片切成0.5-1mm宽的叶条。
2）配制酶液：500μL 200mM MES溶液，3.75mL 0.8 M甘露醇，500μL 0.2M KCl，25μLddH2O混合后，70℃水浴10 min后，立即加入150μL纤维素酶Cellulase，75μL果胶酶Pectinase，55℃水浴15min，0.20mm的膜过滤灭菌，酶液应新鲜制备，且呈浅棕色。
3）将叶片切好后舒展地放入酶液中，25℃恒温培养箱中暗陪5小时酶解，当酶解液体变绿时，轻轻摇晃培养容器促使原生质体释放出来。
4）沿培养容器边沿轻轻加入预冷的10 mL W5（2mM MES，154mM NaCl，125mMCaCl2，5 mM KCl （pH 5.7））溶液，稀释含有原生质体的酶液。
5）轻轻混匀后，使用200目的筛子过滤除去未酶解的叶子以及杂质。
6）将滤液加入50mL的圆底离心管，4℃，900rpm离心5min，沉淀原生质体。
7）小心除去上清后，用5 mL W5溶液重悬沉淀在圆底管底部的原生质体。
8）普通光学显微镜下使用血球计数器观察计数。
9）冰上静止30 min，再次去除上清，然后用适量的MMG（4 mM MES，0.4 Mmannitol，15-100mM MgCl2 / CaCl2 （pH 5.7））溶液重悬原生质体，使其终浓度达到6×105/mL，用于后期的质粒转化。
实施例2
1、质粒提取
本实施例中用于转化的载体p2FGW7.0为商业载体，载体图如图2所示，该载体含有一个组成型强表达启动子P35S，可以在原生质体内部高效表达，含有一个Egfp标签，可以在紫外灯下照射下观察到绿色荧光信号。使用天根公司生产的小提中量试剂盒提取包含载体的质粒，一般15~20mL过夜培养菌液可以抽提50~80μg左右质粒。
1）柱平衡步骤：向吸附柱CP4中加入500μL的平衡液BL，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2）取5~15mL过夜培养的含有p2FGW7.0为载体的菌液（菌液浓度控制在0.3-1.5OD），加入离心管中，12000rpm 离心1 min，尽量吸除上清。
3）向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL 溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
4）向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6~8 次使菌体充分裂解。
5）向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6~8 离心管底部形成沉淀。
6）将上一步收集的上清液分次加入过滤柱Cs，12000rpm 离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4 中。
7）12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中。
8）向吸附柱CP4 中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中。
9）向吸附柱CP4 中加入600μL 漂洗液PW，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中。
10）向吸附柱CP4 中加入600μL漂洗液PW，12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液。
11）将吸附柱CP4 重新放回收集管中置于12000rpm 离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
12）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100~300μLddH2O洗脱，室温放置2min，12000rpm离心lmin将质粒溶液收集到离心管中。
2、PEG介导的原生质体转化
1）加入20μL的已提纯的质粒（10-20ug）至2mL离心管中。
2）加入200μL的已经分离纯化的中山杉叶肉原生质体，轻柔混合。
3）加入220μL的PEG溶液（30~40% （wt/vol） PEG4000，0.2 M mannitol，100 mMCaCl2），轻柔拍打离心管完全混合。
4）黑暗环境中，冰浴诱导转化混合物5-15分钟。
5）室温下用800 μL的W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。
6）室温下用台式离心机1000rpm，离心6min，然后利用移液枪轻轻去除上清。
7）用200μL的WI溶液（4 mM MES，0.5 M mannitol，20 mM KCl （pH 5.7））轻柔重悬原生质体于多2mL的离心管中。
8）室温下（20-25℃）黑暗培养，诱导原生质体表达转化的载体18小时以上。
9）荧光显微镜（OLYMPUS BX51，Japan）下观察GFP标签的表达。
本实施例以其他植物叶肉原生质体转化体系为基础，进行优化，最终建立了稳定且高效的中山杉叶肉原生质体转化体系。由图4可见：中山杉叶肉原生质体转化体系转化效率一般可达到80%以上，为后期针叶树种基因亚细胞定位，启动子活性分析，蛋白互作等研究的开展提供了坚实的保障。
实施例3
本发明以中山杉406 组培苗的叶片为材料，以哈佛大学shen J 实验室2007 年在Nature Protocol 上发表的拟南芥叶肉原生质体转化体系为基础，进行中山杉叶肉原生质体酶解体系的优化，纤维素酶从1%~4%每1%设置一个梯度，果胶酶从0.5%~2%每0.5%设置一个梯度，共16组酶液配比，酶解12小时后观察酶解情况并计数，每次计数重复三次，结果如表1所示，显示：当纤维素酶为3%，果胶酶为1.5%，酶解效果最好。
表1 不同酶组合及浓度对中山杉培苗原生质体产量（×106/gFW）的影响
酶解时间对中山杉叶肉原生质体分离的影响：如果酶解时间太短，不仅浪费材料，而且原生质体得率也低；酶解时间太长，酶液的毒害作用增强，原生质体破碎，活力降低。在不同酶液配比对叶肉原生质体分离及活力的影响结果基础上，每间隔1小时（共6小时）对原生质体产量进行计数，每次计数重复三次。结果如图3所示，显示：酶解5小时，效果最好。
中山杉叶肉原生质体转化含有瞬时表达载体p2FGW7.0的质粒成功后，暗培养20h，在紫外灯照射下，绿色荧光被激发，如图5所示，可以观察到原生质体细胞核、细胞质、细胞膜均均有荧光产生。

Claims (4)

1.一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）以中山杉生长30天长势良好的组培苗幼嫩叶片为材料，对材料进行30h的黑暗预处理；
2）对叶肉原生质体进行分离和纯化；
3）从15~20mL过夜培养菌液抽提50~80μg质粒，质粒为载体p2FGW7.0；
4）PEG介导进行原生质体转化。
2.根据权利要求1所述的中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，其特征在于，步骤2）中，具体操作：
1）用刀片将中山杉片从叶柄上迅速分离下来，轻轻将叶片切成0.5-1mm宽的叶条；
2）配制酶液：500μL 200mM MES溶液，3.75mL 0.8 M甘露醇，500μL 0.2M KCl，25μLddH2O混合后，70℃水浴10 min后，立即加入150μL纤维素酶Cellulase，75μL果胶酶Pectinase，55℃水浴15min，0.20mm的膜过滤灭菌，酶液应新鲜制备，且呈浅棕色；
3）将叶片切好后舒展地放入酶液中，25℃恒温培养箱中暗陪5小时酶解，当酶解液体变绿时，轻轻摇晃培养容器促使原生质体释放出来；
4）沿培养容器边沿轻轻加入预冷的10 mL W5溶液，稀释含有原生质体的酶液；
5）轻轻混匀后，使用200目的筛子过滤除去未酶解的叶子以及杂质；
6）将滤液加入50mL的圆底离心管，4℃，900rpm离心5min，沉淀原生质体；
7）小心除去上清后，用5 mL W5溶液重悬沉淀在圆底管底部的原生质体；
8）普通光学显微镜下使用血球计数器观察计数；
9）冰上静止30 min，再次去除上清，然后用适量的MMG溶液重悬原生质体，使其终浓度达到6×105/mL，用于后期的质粒转化。
3.根据权利要求1所述的中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，其特征在于，步骤3）中，具体操作：
1）向吸附柱CP4中加入500μL的平衡液BL，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
2）取5~15mL过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm 离心1 min，尽量吸除上清；
3）向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL 溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀；
4）向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6~8 次使菌体充分裂解；
5）向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6~8 离心管底部形成沉淀；
6）将上一步收集的上清液分次加入过滤柱Cs，12000rpm 离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4 中；
7）12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中；
8）向吸附柱CP4 中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中；
9）向吸附柱CP4 中加入600μL 漂洗液PW，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中；
10）向吸附柱CP4 中加入600μL漂洗液PW，12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液；
11）将吸附柱CP4 重新放回收集管中置于12000rpm 离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；
12）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100~300μLddH2O洗脱，室温放置2min，12000rpm离心lmin将质粒溶液收集到离心管中。
4.根据权利要求1所述的中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，其特征在于，步骤4）中，具体操作：
1）加入20μL的已提纯的质粒（10-20ug）至2mL离心管中；
2）加入200μL的已经分离纯化的中山杉叶肉原生质体，轻柔混合；
3）加入220μL的PEG溶液，0.2 M mannitol，100 mM CaCl2），轻柔拍打离心管完全混合；
4）黑暗环境中，冰浴诱导转化混合物5-15分钟；
5）室温下用800 μL的W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应；
6）室温下用台式离心机1000rpm，离心6min，然后利用移液枪轻轻去除上清；
7）用200μL的WI溶液（4 mM MES，0.5 M mannitol，20 mM KCl （pH 5.7））轻柔重悬原生质体于多2mL的离心管中；
8）室温下黑暗培养，诱导原生质体表达转化的载体18小时以上；
9）荧光显微镜下观察GFP标签的表达。
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