CN113444678A - 制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒。所提供的制备单细胞核悬液的方法包括(1)基于组织样本，进行酶解处理，分离获得原生质体；(2)将所述原生质体利用第一溶液进行裂解处理，以便获得裂解产物，所述第一溶液包括盐酸盐缓冲液、钠离子、镁离子、表面活性剂、洋地黄皂苷和牛血清蛋白；(3)基于所述裂解产物，分离获得单细胞核悬液。所提供的单细胞测序方法包括利用上述方法制备的单细胞核悬液，进行单细胞测序。通过本发明的方法能够获得稳定的高活力的单细胞核悬液，使得细胞损伤小，可以直接用于单细胞测序实验。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒。
背景技术
单细胞测序技术经过了10余年的发展，取得了众多进展与突破，成为人类疾病、物种进化、分子育种等传统的生物学研究领域的重要工具。单细胞测序实验前，需将生物组织消化、解离，从而制备单细胞悬液作为实验材料。制备单细胞悬液的目的，是快速从组织中分离出单个细胞，同时避免细胞死亡和聚集。动物组织制备单细胞悬浮液的基本步骤包括：1)破碎固体组织材料以增加其表面积，使组织和消化酶之间的接触最大化，2)引入消化酶来消化细胞外基质，3)切割细胞与细胞之间的连接。如需开展ATAC(染色质可及性测序)等研究，则需要制备高质量单细胞核悬液，目前也是主要针对动物样本开展。
而植物样本由于具有细胞壁，目前没有稳定成熟的技术，来制备单细胞悬液并开展单细胞测序实验。针对植物样本的单细胞核悬液的制备以及单细胞测序技术，还需要进一步改进。
发明内容
本发明至少在一定程度上解决现有技术中的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒。
针对植物组织来制备单细胞核悬液，用于单细胞测序主流方案是利用植物组织制备原生质体，然后利用操作繁琐的密度梯度离心的方法获得细胞核。但是通过这种方法所获得的单细胞核悬液，其质量差，步骤繁琐，效率低。为此，发明人通过对原生质体制备细胞核的工艺条件进行优化和改进，通过溶液对原生质体进行裂解处理，能够产生具有高活力的单细胞核悬液，使得细胞的损伤小，同时能保证细胞内的遗传物质不被降解，以用于单细胞测序实验。另外，在裂解之后分离获得单细胞核悬液时，借助于流式细胞术进行细胞核的分选，能够稳定获得高质量的单细胞核悬液，且适用场景广泛，不仅适用于植物组织的单细胞核悬液的制备，还适合于动物组织的单细胞核悬液的制备。
进一步地，在利用植物样本酶解制备原生质体的过程中，通过对酶解溶液进行改进和优化，能够保证酶解过程的高效，并获得高活力的原生质体，有利于后续获得高品质的单细胞核悬液。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种制备单细胞核悬液的方法，包括：(1)基于组织样本，进行酶解处理，分离获得原生质体；(2)将所述原生质体利用第一溶液进行裂解处理，以便获得裂解产物，所述第一溶液包括盐酸盐缓冲液、钠离子、镁离子、表面活性剂、洋地黄皂苷和牛血清蛋白；(3)基于所述裂解产物，分离获得单细胞核悬液。
本发明所提供的制备单细胞核悬液的方法，其在对原生质体裂解时，应用所提供的第一溶液进行裂解处理，能够获得完整的细胞核，从而减少样本损失，且适用于不同植物组织样本和动物组织样本的处理，例如拟南芥、水稻、玉米等等，适用样本来源范围广。所提供的方法尤其适用于植物幼嫩组织，能够产生具有高活力单细胞核悬液，细胞损伤小，同时保证细胞内的遗传物质不被降解，以用于单细胞测序实验。还适用于动物组织制备单细胞核悬液。
根据本发明的实施例，以上所述制备单细胞核悬液的方法可以进一步包括如下技术特征：
根据本发明的实施例，步骤(2)中所述表面活性剂包括选自吐温20、乙基苯基聚乙二醇、脱聚乙二醇辛基苯基醚、氧胆酸钠、肌氨酸钠中的至少一种，优选包括吐温20和乙基苯基聚乙二醇。
根据本发明的实施例，步骤(3)进一步包括：(3-1)基于所述裂解产物，采用碘化丙啶染液标记，以便获得标记产物；(3-2)基于所述标记产物，采用流式细胞术分选获得细胞核，以便获得单细胞核悬液。裂解后的产物中含有细胞核和其他一些杂质，通过流式细胞术进行分选，能够获得高活性、无细胞碎片污染的单细胞核悬液，所获得的单细胞核悬液可以直接应用于单细胞测序实验。
根据本发明的实施例，采用流式细胞术分选获得细胞核包括：基于所述标记产物，选定细胞核所在的大范围；基于所选定的细胞核所在的大范围，选定游离的、不黏连的颗粒；基于所述染液的荧光信号选定细胞核，以便获得单细胞核悬液。
根据本发明的实施例，步骤(2)中所述第一溶液包括：5～50mM盐酸盐缓冲液，5～50mM氯化钠，1～10mM氯化镁，0.1体积％～0.5体积％的吐温-20，0.2体积％～1体积％的乙基苯基聚乙二醇，0.01质量％～0.05质量％的洋地黄皂苷，和1质量％～5质量％的牛血清蛋白。由此可以获得完整的细胞核，减少样本的损失，且适用范围广。
根据本发明的优选实施例，所述第一溶液包括：10mM盐酸盐缓冲液，10mM氯化钠，3mM氯化镁，0.1体积％的吐温-20，0.5体积％的乙基苯基聚乙二醇，0.01质量％的洋地黄皂苷，和1质量％的牛血清蛋白。
根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括：(1-1)利用第二溶液对所述组织样本进行酶解处理，以便获得酶解产物，所述第二溶液包括甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液、牛血清蛋白、氯化钙和消化酶；(1-2)将所述酶解产物进行离心过滤，获得的沉淀采用第三溶液进行洗脱，以便得到原生质体，所述第三溶液包括氯化钠、氯化钙、氯化钾和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。利用含有甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液、牛血清蛋白、氯化钙和消化酶的溶液进行酶解处理，能够保证裂解过程的高效，而且可以获得更多的活细胞。在洗脱过程中所用到的第三溶液，能够提供稳定的、柔和的渗透压，能够保护脆弱的原生质体细胞膜，有效阻止细胞结构破坏及相应的核酸降解。由此不需要额外的繁琐的密度梯度离心步骤，实验结果重现性更优。
根据本发明的实施例，进一步包括：(1-3)将采用第三溶液洗脱后的洗脱产物进行离心过滤，获得的沉淀加入第四溶液重悬，以便获得原生质体悬液，所述第四溶液包括甘露醇、氯化镁和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
根据本发明的实施例，所用到的消化酶为细胞壁消化酶，包括选自纤维素酶、果胶酶、离析酶中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述消化酶包括选自纤维素酶R-10、果胶酶Y-23、纤维素酶、离析酶中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述第二溶液包括：0.3～1M甘露醇，5～50mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液，0.5质量％～5质量％的牛血清蛋白，1～5mM氯化钙。
根据本发明的优选实施例，所述第二溶液包括：0.6M甘露醇，10mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液，1％牛血清蛋白，1mM氯化钙。
根据本发明的实施例，所述第二溶液通过下述方法制备：将甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液和消化酶混合溶解，在50～60摄氏度条件下加热；冷却后与牛血清蛋白和氯化钙混合，以便获得所述第二溶液。根据本发明的实施例，所述第三溶液包括：100～200mM氯化钠，100～200mM氯化钙，3～10mM氯化钾，1～5mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液，
根据本发明的优选实施例，所述第三溶液包括：150mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾，2mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
根据本发明的实施例，所述第四溶液包括：0.3～1M甘露醇，5～50mM氯化镁，2～10mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
根据本发明的实施例，所述第四溶液包括：0.6M甘露醇，15mM氯化镁，4mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
根据本发明的实施例，所述组织样本为植物幼嫩组织样本或者动物组织样本。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂盒，包括：第一溶液，所述第一溶液包括盐酸盐缓冲液、钠离子、镁离子、吐温20、乙基苯基聚乙二醇、洋地黄皂苷和牛血清蛋白。应用所提供的试剂盒可以用于稳定获得高质量的单细胞核悬液，且应用场景广泛，特别是所制备的单细胞核悬液可以直接用于单细胞测序，有利于单细胞测序实验的开展。
根据本发明的实施例，所提供的试剂盒进一步包括：第二溶液，所述第二溶液包括甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液、牛血清蛋白、钙离子和消化酶，所述消化酶包括选自纤维素酶、果胶酶、离析酶中的至少一种。
根据本发明的实施例，所提供的试剂盒进一步包括：第三溶液，所述第三溶液包括钠离子、钙离子、钾离子和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括：第四溶液，所述第四溶液包括甘露醇、镁离子和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种单细胞测序方法，包括：采用本发明第一方面任一实施例所述的方法制备单细胞核悬液；基于所述单细胞核悬液，进行单细胞测序。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的拟南芥根尖组织原生质体悬浮液镜检结果图，其中左图为实验组，右图为对照组，图中A为完整的原生质体结构，B为未解离开的根尖组织，C为死细胞及细胞碎片。
图2是根据本发明的实施例提供的水稻幼苗原生质体悬浮液裂解过滤后产物的镜检结果图，其中左图为实验组，右图为对照组，图中A为完整的单细胞核，B为未裂解的原生质体，C为死细胞及细胞碎片。
图3是根据本发明的实施例提供的流式细胞仪圈门方案图。
图4是根据本发明的实施例提供的水稻幼苗单细胞核悬液镜检结果图，左图为碘化丙啶组，右图为苯基吲哚组，图中A为完整的单细胞核，B为聚集结团的细胞核，C为变形破裂的细胞核，D为死细胞及细胞碎片。
图5为不同核酸染料在流式细胞仪上的检出差异，上图为采用碘化丙啶染色标记的流式检测结果，中间图为采用苯基吲哚染色标记的流式检测结果，下图为采用7-AAD染色标记的流式检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。同时对本文中的一些术语进行解释和说明，以方便本领域技术人员的理解，需要说明的是，这些解释和说明仅用于方便理解，而不应看做是对本发明保护范围的限制。
本文中，所提到的原生质体做广义解释，即包括植物细胞去掉细胞壁的原生质体以及动物细胞。本发明所提供的方法尤其适合于在植物中所提到的原生质体的制备，以及利用植物组织制备单细胞核悬液。
本文中，所提到的盐酸盐缓冲液作本领域通常理解，是指氯化氢和有机胺结合而成形成的缓冲溶液，使得溶液酸度保持在较低的范围。优选为Tris-HCl缓冲液。
本文中，所提到的脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液的pH值在5～7左右，例如可以为5.7。
本发明所提供的单细胞核悬液的方法，包括：(1)基于组织样本，进行酶解处理，分离获得原生质体；(2)将所述原生质体利用第一溶液进行裂解处理，以便获得裂解产物，所述第一溶液包括盐酸盐缓冲液、钠离子、镁离子、表面活性剂、洋地黄皂苷和牛血清蛋白；(3)基于所述裂解产物，分离获得单细胞核悬液。应用所提供的第一溶液进行裂解处理，能够保证植物细胞核保存较长时间，从而提高所制备的单细胞核悬液的细胞核活力。所制备的单细胞核悬液可以用于包括基因组学、转录组学、表观遗传学等几乎所有单细胞测序实验。所用的表面活性剂优选为吐温20和乙基苯基聚乙二醇。
在本发明的至少一些实施方式中，步骤(3)进一步包括：(3-1)基于所述裂解产物，采用碘化丙啶染液标记，以便获得标记产物；(3-2)基于所述标记产物，采用流式细胞术分选获得细胞核，以便获得单细胞核悬液。以碘化丙啶作为核酸染料，相较于其他广泛应用的核酸染料，例如苯基吲哚、7-氨基放线菌素D等，具有更好的灵敏度和特异性。
可以利用流式细胞仪分选细胞核。例如可以流式细胞仪的圈门方案进行分选。所提到的流式细胞仪的圈门方案是流式细胞术中的一个术语，指的是在流式细胞仪操作软件上选定一群特定的目标颗粒。由于细胞核颗粒显著小于细胞，所以通过流式细胞仪分选单细胞核的难度很大。所以在利用流式细胞术圈门方案进行分选时，可以分成三个步骤：第一，在所有颗粒中大致选定细胞核所在范围；第二，在所选定的范围中选定游离的、不黏连的颗粒；第三，根据染料的荧光信号选定细胞核。由此，可以获得符合单细胞测序要求的单细胞核悬液。
通过流式细胞术进行细胞核分选，优化了流式细胞术圈门方案和染料选择，突破性扩大了单细胞测序技术在植物样本中的应用场景；本发明同样适用于动物细胞，也能得到良好实验结果。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
需要说明的是，下面实施例中所描述的无论是溶液A、溶液B、溶液C还是溶液D，仅用于区分不同的溶液，而不用来说明溶液的使用顺序、重要性等。正如本文在描述时所提到的第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液等，仅用于区分不同的溶液，而不用来说明溶液的使用顺序或者重要性等。
实施例1
实施例1提供了一种制备拟南芥根尖组织原生质体悬浮液的方法，所制备的原生质体悬浮液可以直接用于单细胞RNA测序实验。
设置对照组和实验组，对照组根据文献Denyer et al.,2019(SpatiotemporalDevelopmental Trajectories in the Arabidopsis Root Revealed Using High-Throughput Single-Cell RNA Sequencing.T Denyer et al.Dev Cell)提供的实验流程进行，获得原生质体悬浮液。实验所用到的溶液A、溶液B、溶液C和溶液D分别如下：
溶液A：包括0.6M甘露醇(SIGMA M1902)、10mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液(SIGMAM8250)、1质量％牛血清蛋白(SIGMA B4287)、1mM氯化钙(SIGMA C7902)和消化酶，所用到的消化酶包括1.5％质量浓度纤维素酶R-10(Duchefa Biochem.C8001.0010)和0.1％质量浓度果胶酶Y-23(Duchefa Biochem.P8004.0001)。通过下述方法制备：先将甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液和消化酶搅拌溶解，在55℃加热10min，自然冷却，再加入牛血清蛋白和氯化钙。
溶液B：包括150mM氯化钠(SIGMA71376)、125mM氯化钙、5mM氯化钾(SIGMA P5404)、2mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液(该缓冲液的pH5.7)。
溶液C：包括0.6M甘露醇、15mM氯化镁(SIGMA M2393)、4mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液(该缓冲液的pH5.7)。
实验组采用如下步骤制备原生质体悬液：
(1)将溶液A倒入干净的培养皿中。切下适量幼嫩组织(距根尖1厘米处组织)，用锋利的刀片快速切割成1mm以下的小段，转移至培养皿中。培养皿用锡纸包被以避光，放置在28℃，40-50rpm的摇床上酶解。
(2)酶解产物使用100μm滤网过滤，转移至10ml圆底离心管中，100g离心10min；
(3)弃掉上清液，缓缓加入4ml溶液B，轻轻混匀，100g离心10min；
(4)弃掉上清液，缓缓加入4ml预冷的溶液C；轻轻混匀，100g离心10min；
(5)重复步骤(4)；
(6)弃掉上清液，将沉淀重悬于500μl溶液C中，并使用40μm滤网过滤，获得原生质体悬浮液。
所获得的各悬浮液分别进行如下处理，实验结果如下：
取两组所获得的原生质体悬浮液各5μl，掺入5μl台盼蓝(碧云天C0011)染液，显微镜下观察，结果见图1所示。其中图1中左图为实验组所获得的原生质体，右图为对照组所获得的原生质体，图1中A为完整的原生质体结构，B为未离开的根尖组织，C为死细胞及细胞碎片。
经统计计算，实验组所得原生质体22万个，活率89％；对照组所得原生质体14万个，活率57％。由于开展单细胞测序实验一般要求细胞数2万个以上，细胞活率达到80％以上，所以经过对照组所获得的原生质体很难直接用于开展下游的单细胞测序实验。
另外，对照组含大量细胞碎片与结团，原生质体活率低，无法展开下游单细胞RNA测序实验；如果增加密度梯度离心等步骤，会延长实验时间，并进一步损伤细胞结构，带来实验结果的随机偏差。
实验组相较于对照组，采用不同的溶液进行酶解，而且进行避光酶解，保证了裂解过程的高效，能够获得更多的活细胞。且利用溶液B和溶液C进行洗脱纯化，能够保护脆弱的原生质体细胞膜，有效阻止了细胞结构破坏及相应的核酸降解。实验组所获得的原生质体悬浮液无需进一步处理即可展开下游实验，更好的代表了拟南芥根尖组织中细胞的多样性，而且获得的转录组数据更能够真实的还原其在组织中的表达水平；由于实验步骤统一、易操作，实验结果重现性更优。
实施例2
实施例2提供了一种制备水稻幼苗单细胞核悬液的方法，用于单细胞核RNA及ATAC测序实验。应用该实施例所制备的单细胞核悬液可以用于包括基因组学、转录组学、表观遗传学等几乎所有单细胞测序实验。
实验设置对照组和实验组，对照组根据文献Lu et al.,2017(Combining ATAC-seq With Nuclei Sorting for Discovery of Cis-Regulatory Regions in PlantGenomes.Z Lu et al.Nucleic Acids Res)提供的实验流程进行。
实施例2实验所用到的溶液B、溶液C分别与实施例1相同。
所用到的溶液A包括：0.6M甘露醇(SIGMA M1902)、10mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液(SIGMA M8250)、1质量％牛血清蛋白(SIGMA B4287)、1mM氯化钙(SIGMA C7902)和消化酶，所含有的消化酶为1.5％质量浓度的纤维素RS(Yakult Honsha)和0.75％质量浓度的离析酶(Yakult Honsha)。溶液A通过下述方法制备：将甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液和消化酶搅拌溶解，在55℃加热10min，自然冷却，再加入牛血清蛋白和氯化钙。
所用到的溶液D包括：10mM盐酸盐缓冲液(INVITROGEN 15567-027)、10mM氯化钠、3mM氯化镁、0.1％吐温-20(BBI T0777-500ML)、0.5％乙基苯基聚乙二醇(SIGMA74385-500ML)、0.01％洋地黄皂苷(INVITROGEN BN2006)和1％牛血清蛋白。
实验组采用如下步骤制备原生质体悬液：
(1)将溶液A倒入干净的培养皿中。切下适量幼嫩组织(11-13天水稻幼苗叶鞘组织)，用锋利的刀片快速切割成1mm以下的小段，转移至培养皿中。培养皿用锡纸包被以避光，放置在28℃，40-50rpm的摇床上，酶解适量时间；
(2)酶解产物使用100μm滤网过滤，转移至10ml圆底离心管中，100g离心10min；
(3)弃掉上清液，缓缓加入4ml溶液B；轻轻混匀，100g离心10min；
(4)弃掉上清液，缓缓加入4ml预冷的溶液C；轻轻混匀，100g离心10min；
(5)重复步骤(4)；
(6)弃掉上清液，将沉淀重悬于500μl溶液C，使用40μm滤网过滤。
获得原生质体悬浮液后，继续采用如下步骤制备单细胞核悬液：
(7)取原生质体悬浮液100g离心10min，弃掉上清液，将沉淀溶于500μl溶液D，冰上孵育6-10min，进行裂解(孵育时长以观察细胞核数目与状态为准)，获得裂解产物；
(8)使用40μm滤网过滤，获得过滤产物，并镜检观察；
(9)同时将所获得的过滤产物5μl碘化丙啶(INVITROGEN BMS500PI)染液标记，室温孵育10min，离心重悬至500μl；
(10)上流式细胞仪(SONY SH800S)，分选适量细胞核，收集至500μl溶液D。
实验结果如下：
原生质体悬浮液裂解后，所获得的裂解产物，使用40μm滤网过滤，镜检观察，结果见图2，图中A为完整的单细胞核，B为未裂解的原生质体，C为死细胞及细胞碎片。
经统计计算，实验组所得单细胞核43万个，活率66％；对照组所得单细胞核3万个，活率13％。由于开展单细胞核测序实验一般要求细胞核数2万个以上，细胞核活率达到80％以上；对照组单细胞核质量极差，已无法继续下游单细胞测序实验。
其中图3为流式细胞仪圈门方案图，其中图3中上图为在所有颗粒中大致选定细胞核所在的大范围，中间图为在上图圈定的颗粒中选定游离的、不黏连的颗粒，下图为根据荧光信号选定细胞核。实验组分选后的单细胞核悬液离心重悬至10μl溶液D，镜检计数，结果见图4所示。其中图4中左图为采用碘化丙啶进行染色标记的结果，右图为采用苯基吲哚进行染色标记的结果。图4中A为完整的单细胞核，B为聚集结团的细胞核，C为变形破裂的细胞核，D为死细胞及细胞碎片。经统计计算，采用碘化丙啶染色，所得单细胞核7万个，活率94％，达到单细胞核测序实验要求。
另外，发明人比较了采用不同核酸染料在流式细胞仪上的检出差异，其结果如图5所示，图5中上图为碘化丙啶，中间图为苯基吲哚(DAPI，INVITROGEN 62248)，下图为7-氨基放线菌素D(7-AAD，INVITROGEN 00-6993-50)，其中DAPI染色结果中含弱阳性峰、特异性差，导致分选结果中含大量细胞碎片；7-氨基放线菌素D荧光信号弱，阳性信号占比仅为PI组61.3％，导致细胞核回收效率低。因此采用碘化丙啶进行染色，得到的单细胞核悬液细胞碎片最少、无细胞核结团、单细胞核最完整且数目最多。
综上，与对照组相比，实验组使用本发明，首先制备了更高质量的原生质体悬浮液；其次，基于本发明的方法制备原生质体悬浮液，而且采用流式细胞术分选细胞核的技术路线，得到了高活性、无细胞碎片污染的单细胞核悬液。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种制备单细胞核悬液的方法，其特征在于，包括：
(1)基于组织样本，进行酶解处理，分离获得原生质体；
(2)将所述原生质体利用第一溶液进行裂解处理，以便获得裂解产物，所述第一溶液包括盐酸盐缓冲液、钠离子、镁离子、表面活性剂、洋地黄皂苷和牛血清蛋白；
(3)基于所述裂解产物，分离获得单细胞核悬液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括：
(3-1)基于所述裂解产物，采用碘化丙啶染液标记，以便获得标记产物；
(3-2)基于所述标记产物，采用流式细胞术分选获得细胞核，以便获得单细胞核悬液；
任选地，采用流式细胞术分选获得细胞核包括：
基于所述标记产物，选定细胞核所在的大范围；
基于所选定的细胞核所在的大范围，选定游离的、不黏连的颗粒；
基于所述染液的荧光信号选定细胞核，以便获得单细胞核悬液；
任选地，步骤(2)中所述表面活性剂包括选自吐温20、乙基苯基聚乙二醇、脱聚乙二醇辛基苯基醚、氧胆酸钠、肌氨酸钠中的至少一种；优选包括吐温20和乙基苯基聚乙二醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述第一溶液包括：
5～50mM盐酸盐缓冲液，
5～50mM氯化钠，
1～10mM氯化镁，
0.1体积％～0.5体积％的吐温-20，
0.2体积％～1体积％的乙基苯基聚乙二醇，
0.01质量％～0.05质量％的洋地黄皂苷，和
1质量％～5质量％的牛血清蛋白；
优选地，所述第一溶液包括：
10mM盐酸盐缓冲液，
10mM氯化钠，
3mM氯化镁，
0.1体积％的吐温-20，
0.5体积％的乙基苯基聚乙二醇，
0.01质量％的洋地黄皂苷，和
1质量％的牛血清蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括：
(1-1)利用第二溶液对所述组织样本进行避光酶解处理，以便获得酶解产物，所述第二溶液包括甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液、牛血清蛋白、钙离子和消化酶；
(1-2)将所述酶解产物进行离心过滤，获得的沉淀采用第三溶液进行洗脱，以便得到原生质体，所述第三溶液包括钠离子、钙离子、钾离子和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液；
任选地，进一步包括：
(1-3)将采用第三溶液洗脱后的洗脱产物进行离心过滤，获得的沉淀加入第四溶液重悬，以便获得原生质体悬浮液，所述第四溶液包括甘露醇、镁离子和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述消化酶包括选自纤维素酶、果胶酶、离析酶中的至少一种；
任选地，所述消化酶包括选自纤维素酶R-10、果胶酶Y-23、纤维素酶、离析酶中的至少一种；
任选地，所述组织样本为植物幼嫩组织或者动物组织样本。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包括：
0.3～1M甘露醇，
5～50mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液，
0.5质量％～5质量％的牛血清蛋白，
1～5mM氯化钙；
任选地，所述第二溶液包括：
0.6M甘露醇，
10mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液，
1％牛血清蛋白，
1mM氯化钙；
任选地，所述第二溶液通过下述方法制备：
将甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液和消化酶混合溶解，在50～60摄氏度条件下加热；
冷却后与牛血清蛋白和氯化钙混合，以便获得所述第二溶液。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第三溶液包括：
100～200mM氯化钠，
100～200mM氯化钙，
3～10mM氯化钾，
1～5mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液，
优选地，所述第三溶液包括：
150mM氯化钠，
125mM氯化钙，
5mM氯化钾，
2mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第四溶液包括：
0.3～1M甘露醇，
5～50mM氯化镁，
2～10mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液；
优选地，所述第四溶液包括：
0.6M甘露醇，
15mM氯化镁，
4mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括：
第一溶液，所述第一溶液包括盐酸盐缓冲液、钠离子、镁离子、吐温20、乙基苯基聚乙二醇、洋地黄皂苷和牛血清蛋白；
任选地，进一步包括：
第二溶液，所述第二溶液包括甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液、牛血清蛋白、钙离子和消化酶，所述消化酶包括选自纤维素酶、果胶酶、离析酶中的至少一种；
任选地，进一步包括：
第三溶液，所述第三溶液包括钠离子、钙离子、钾离子和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液；
任选地，进一步包括：
第四溶液，所述第四溶液包括甘露醇、镁离子和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。
10.一种单细胞测序方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1～8中任一项所述的方法制备单细胞核悬液；
基于所述单细胞核悬液，进行单细胞测序。
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