CN114277094A - 提取植物细胞核的裂解液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于10x Genomics公司裂解液的植物细胞核提取和ATAC‑seq实验所用的裂解液。在尽量不改变原有配方基本成分的情况下，找到了各成分的合适浓度，可满足提取植物不同组织部位、发育时期、胁迫状态的细胞核。本发明首次发现需要依据物种、组织部位、植株所处发育时期和环境状态(如热、冷、盐、干旱等胁迫)调整固定时间。还首次发现植物材料固定后进行提取，并在原裂解液成分中增加β‑巯基乙醇可以用于植物细胞核提取和植物ATAC‑seq实验。经实验证实，用本发明提供的裂解液进行植物细胞核提取，得到的细胞核核膜完整，测序质量高；适用于对不同植物物种的不同的组织部位、不同的发育时期以及不同的环境状态。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于提取植物细胞核和植物ATAC-seq实验的裂解液。
背景技术：
染色质在细胞核中的状态随发育阶段或外界刺激不断变化，为了揭示与特定细胞进程、应激状态相关的表观遗传机制，需要进行染色质可及性分析测序(ATAC-seq，Assayfor Transposase-Accessible Chromatin using sequencing)。ATAC-seq需要较高纯度的细胞核。
高等动物细胞核由核膜包裹位于细胞内部，其外有细胞质和各种细胞器，细胞最外部由细胞膜与环境做出分界。因此，提取细胞核需要合适的裂解液对细胞膜进行裂解。
与动物细胞相比，植物细胞在细胞膜外还有细胞壁，并且内质网与核膜的连接更为紧密，因此，动物组织/细胞的裂解液不适用于植物。
现有技术中，常用于单细胞核ATAC-seq(染色质开放性测序)实验提取细胞核的裂解液是10x Genomics公司的裂解液配方，但是该配方的裂解液仅适用于动物(见10xGenomics网站公布的裂解液protocol)。
尚未有应用10x Genomics公司protocol所述试剂进行植物细胞核提取的报道。
由于植物细胞有细胞壁，而且其细胞膜、核膜与动物细胞有差别，10x Genomics公司的裂解液不适用于植物细胞核的提取。
并且，植物不同部位、不同发育阶段、不同环境条件的组织特性不同，同一种浓度的裂解液并不适用于不同组织。对动物细胞改变细胞膜裂解时间从而达到提取细胞核的方式不适用于植物，需对裂解液各成分的浓度进行改变。
获得细胞核悬液后需要用Tn5转座酶对染色质进行切割，其发挥作用需要合适的离子类型和浓度。为了保证Tn5转座酶发挥作用及后续建库测序质量，10x Genomics公司不建议对其所公布的protocol中的试剂成分进行更换。
因此，需要摸索适用于提取植物细胞核的裂解液，尽量不改变10x Genomics公司裂解液配方的基本成分，能够与10x Genomics公司的单细胞核测序匹配。
发明内容：
本发明的目的是研发适用于提取植物细胞核的裂解液，能够适应不同植物物种、组织部位、植株所处发育时期和环境状态(如热胁迫、冷胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等)。
具体目的是对10x Genomics公司的裂解液配方进行优化，能够与10x Genomics公司的单细胞核测序匹配，保证得到高质量的植物细胞核测序数据。
本发明以10x Genomics公司的protocol所公布的裂解液为基础，对该裂解液的每种成分进行了分析研究，在尽量不改变原有配方基本成分的情况下，改进了配方，对Tris-HCl(pH 7.4)浓度、NaCl浓度、MgCl2浓度、Tween-20浓度、NP40浓度、BSA浓度、Digitonin浓度、β-巯基乙醇浓度和固定(交联)试剂浓度进行了探索，找到了合适的浓度范围，达到了发明效果。
本发明首次发现植物材料固定后需要在10x Genomics公司裂解液原有成分中增加一种成分β-巯基乙醇。
本发明还首次发现，Digitonin可以应用于植物细胞核提取和植物ATAC-seq实验。
具体如下：
10x Genomics公司裂解液原配方如下：
Tris-HCl(pH 7.4)10mM，NaCl 10mM，MgCl2 3mM，Tween-20 0.1％，NP40 0.1％，BSA 1％，Digitonin 0.01％，其余是水。
根据材料来源的不同，使用裂解液原液或1/10裂解液(Tween-20、NP40、Digitonin的浓度为裂解液原液的1/10)，调整裂解时间对组织或细胞系的细胞膜进行裂解。
本发明对上述配方进行了分析研究，在尽量不改变原有配方基本成分的情况下，不仅对每种成分进行了研究分析，而且首次发现：
本发明发现，将植物材料进行固定后提取细胞核，并在10x Genomics公司裂解液原有成分中增加一种成分β-巯基乙醇，方可实现本发明的目的。植物材料固定时间的长短对细胞核提取影响显著。Digitonin可以用于植物细胞核提取和植物ATAC-seq实验。
因为植物细胞中含有大量的次生代谢物，β-巯基乙醇是一种强还原剂，可以中和细胞裂解时释放的氧自由基，从而避免对核膜的破坏；以往的植物裂解液中添加β-巯基乙醇是植物材料不经过固定，并且本发明添加的β-巯基乙醇浓度与已发表文章浓度(5mM)差别很大。
Digitonin是一种非离子去垢剂，在本发明之前只用于动物细胞核的提取。在动物细胞中低浓度时能使膜上的胆固醇聚集而出现孔道，但不裂解核膜。植物细胞不含胆固醇而含甾醇，并且植物细胞与动物细胞膜结构中醇类的含量不同。本发明首次发现，Digitonin可以在植物细胞核提取和后续ATAC-seq实验中发挥作用，可以用于植物细胞核提取和植物ATAC-seq实验。
本发明还通过优化设计实验，研究了其它成分的功能以及在植物细胞核提取过程中的特点：
Tris-HCl是常用的缓冲液，对溶液的pH有较好的缓冲能力；
钠离子、氯离子对膜两侧的渗透压有影响；
镁离子与膜结构和功能的完整性有关；
Tween-20和NP40是非离子表面活性剂，对各种油脂类具有分散、增溶的作用，常用于配制组织或细胞裂解液。
根据上述分析，本发明找到了植物细胞核提取裂解液研制的关键环节：
(1)植物材料的固定时间：需要依据物种、组织部位、植株所处发育时期和胁迫状态(如热胁迫、冷胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等)进行摸索；
(2)植物组织固定后细胞核提取裂解液中需要加入β-巯基乙醇，其浓度需根据植物材料进行优化；
(3)在植物材料固定的前提下，需要对Tris-HCl(pH 7.4)、NaCl、MgCl2、Tween-20、NP40、BSA、Digitonin的浓度及pH进行优化；
本发明的有益效果：
经实验证实，本发明提供的裂解液适用于水稻不同的组织部位、所处胁迫条件(如热胁迫、冷胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等)和生长发育时期，得到的细胞核核膜完整，测序质量高。
本发明首次发现材料固定时间的长短对细胞核提取的显著影响。
本发明进行了固定不同时间长度的实验(详见对比实验1)，实验证明，超过最佳固定时间，绝大多数细胞带有细胞壁，只有个别细胞核，不能获得足够数量的细胞核用于上机，也表明大多数类型细胞的细胞核不能捕获(图3)。
本发明首次发现Digitonin可以用于植物细胞核提取和植物ATAC-seq实验。本发明进行了Digitonin浓度改变的实验(详见对比实验3)，实验证明，Digitonin浓度影响植物细胞核提取效果(图5)。
本发明首次发现β-巯基乙醇作为固定过的材料细胞核提取所用裂解液中的重要作用。
本发明进行了不加β-巯基乙醇的裂解液的实验(详见对比实验4、5)，实验证明，无论原10x Genomics公司裂解液或本发明优化其它成分浓度的裂解液，结果都是绝大多数细胞核破碎，只有个别完整细胞核，不能获得足够数量的细胞核用于上机，也表明大多数类型细胞的细胞核不能捕获(图6、图7)。
附图说明
图1是应用本发明研制的水稻根尖裂解液提取得到的可上机细胞核的显微镜照片；
图2是应用本发明研制的水稻根尖裂解液所得细胞核上机后barcode和其标记的插入片段的分布图；
图3是对比实验1杂质多的细胞核的显微镜照片；
图4是对比实验3杂质多的细胞核的显微镜照片；
图5是对比实验4核膜变形、破裂并且杂质多的细胞核的显微镜照片；
图6是对比实验5绝大多数细胞核破碎，只有个别完整细胞核的显微镜照片；
图7是对比实验6绝大多数细胞核破碎，只有少数完整细胞核的显微镜照片。
图8是应用本发明研制的热胁迫水稻根尖裂解液提取得到的可上机细胞核的显微镜照片；
图9是应用本发明研制的水稻幼穗裂解液提取得到的可上机细胞核的显微镜照片；
图10是应用本发明研制的与10x Genomics公司多组学测序(单核ATAC+单核转录组)protocol相匹配的水稻根尖裂解液提取得到的可上机细胞核的显微镜照片。
具体实施方式
实施例1 用本发明研制的裂解液进行水稻根尖细胞核提取
一、实验目的
检验本发明提供的裂解液提取水稻根尖细胞核的效果。
二、实验材料
1、水稻根尖(包括胚根和冠根)，按以下方法进行培养：
水稻种子37℃萌发2天，铺种，14小时黑暗、10小时光照，光照强度为10,000lx，(需要培养胚根时，培养3天；需要得到冠根，则培养6天)，培养液为Hogland营养液。待长出水稻根部，取根尖5mm部位，用于细胞核提取。
2、裂解液
先按表1配制基础液
表1 基础液中各成分的用量
基础液配制方法：
在离心管中先加入无酶无菌水，然后依次将上表中各成分加入离心管中；
裂解液成品配制：使用前每毫升基础液加入β-巯基乙醇5ul。
三、水稻根尖细胞核提取方法步骤
水稻胚根或冠根根尖切下5mm，放入2％甲醛中，冰上抽真空(-60kPa)5min，释放真空，共冰上放置30分钟。
匀浆器中加入裂解液，将根尖转移至匀浆器，用匀浆器对水稻根尖进行研磨；
用20um滤网过滤3次，转移到2.0ml离心管中；
4℃离心，弃上清；
用1％BSA溶液(Tris-HCl(pH 7.4)10mM，NaCl 10mM，MgCl2 3mM，BSA 1％)重悬；
在2.0ml离心管中加入80％Percoll(Percoll原液用稀释液(Tris-HCl(pH 7.4)10mM，NaCl 10mM，MgCl2 3mM)稀释)，将用1％BSA溶液重悬的细胞核轻轻铺在80％Percoll上；
4℃离心；
吸取目标层液体转移到新的2.0ml离心管中；
加入900ul的1％BSA溶液，冰上放置5分钟。
4℃离心，弃上清；
加入900ul的1x Nuclei Buffer(10x Genomics公司试剂)；
4℃离心，弃上清；
用合适体积的1x Nuclei Buffer重悬；
用血球计数板计数，调整细胞核浓度。
四、实验结果
得到的细胞核核膜完整(图1)，测序质量高(图2)。
五、结论
本发明提供的水稻根尖固定时间和细胞核提取裂解液适合水稻根尖细胞核提取，而且最适时间和浓度为：
2％甲醛固定时间为30分钟；
Tris-HCl(pH 7.4)10mM，
NaCl 10mM，
MgCl2 3mM，
Tween-20 0.2％，
NP40 0.2％，
BSA 1％，
Digitonin 0.0075％，
β-巯基乙醇5ul/ml
对比实验1：2％甲醛固定时间改变
2％甲醛固定时间变为3小时，所用裂解液以及其它实验条件与实施例1一致。
结果：细胞壁去除效果差，获得的细胞核杂质多，不宜进行后续步骤(图3)。
对比实验2：Tween-20和NP40浓度改变
Tween-20和NP40浓度分别为0.1％(为10x Genomics公司裂解液所用的浓度)，所用裂解液中其它成分以及其它实验条件与实施例1一致。
结果：细胞壁去除效果差，获得的细胞核杂质多，不宜进行后续步骤(图4)。
对比实验3：Digitonin浓度改变
Digitonin浓度为0.01％(为10x Genomics公司裂解液所用的浓度)，所用裂解液中其它成分以及其它实验条件与实施例1一致。
结果：细胞壁去除效果差，并且有的核膜变形、破裂，获得的细胞核杂质多，不宜进行后续步骤(图5)。
对比实验4：不加β-巯基乙醇(1)
不加β-巯基乙醇，所用裂解液中其它成分以及其它实验条件与实施例1一致。
结果：绝大多数细胞核破碎，只有个别完整细胞核，不能获得足够数量的细胞核用于上机，也表明大多数类型细胞的细胞核不能捕获(图6)。
对比实验5：不加β-巯基乙醇(2)
不加β-巯基乙醇，所用裂解液中其它成分与10x Genomics公司裂解液一致，其它实验条件与实施例1一致。
结果：绝大多数细胞核破碎，只有少数完整细胞核，不能获得足够数量的细胞核用于上机，也表明大多数类型细胞的细胞核不能捕获(图7)。
实施例2 用本发明研制的裂解液进行胁迫条件下(本实施例是热胁迫)水稻根尖细胞核提取
一、实验目的
研制不同胁迫条件(如热胁迫、冷胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等)水稻细胞核提取的裂解液。
检验本发明研制的热胁迫水稻根尖裂解液提取热胁迫水稻根尖细胞核的效果。
二、实验材料
1、水稻根尖(包括胚根和冠根)，按以下方法进行培养：
水稻种子37℃萌发2天，10:00铺种，14小时黑暗、10小时光照，光照强度为10,000lx，(需要培养胚根时，培养3天；需要得到冠根，则培养6天)，培养液为Hogland营养液。
2、水稻根尖的处理方法
在水稻种子生长的第3天(或第6天)，7:00将其放入45℃培养箱，10:00取根尖5mm部位，用于细胞核提取。
3、裂解液
先按表2配制基础液
表2 基础液中各成分的用量
基础液配制方法：
在离心管中先加入无酶无菌水，然后依次将上表中各成分加入离心管中；
裂解液成品配制：使用前每毫升基础液加入β-巯基乙醇5ul。
三、水稻根尖细胞核提取方法步骤
与实施例1相同。
四、实验结果
得到的细胞核核膜完整(图8)，可用于上机。
五、结论
本发明的裂解液适用于不同胁迫条件(如热胁迫、冷胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等)水稻细胞核提取。
实施例3 用本发明研制的裂解液进行水稻其他组织细胞核提取
一、实验目的
研制水稻不同组织细胞核提取的裂解液。
检验本发明研制的水稻幼穗裂解液提取水稻幼穗细胞核的效果。
二、实验材料
1、水稻幼穗按以下方法进行培养：
水稻种子于5月份种植于北京户外大田，待幼穗长到0.5-1cm长时取出用于提取细胞核。
2、裂解液
先按表3配制基础液
表3 基础液中各成分的用量
基础液配制方法：
在离心管中先加入无酶无菌水，然后依次将上表中各成分加入离心管中；
裂解液成品配制：使用前每毫升基础液加入β-巯基乙醇5ul。
三、水稻幼穗细胞核提取方法步骤
水稻幼穗切碎，放入2％甲醛中，冰上抽真空(-60kPa)5min，释放真空，共冰上放置40min。
其余实验条件与实施例1相同。
四、实验结果
得到的细胞核核膜完整(图9)，可用于上机。
五、结论
本发明的裂解液适用于水稻不同组织细胞核提取。
实施例4 用本发明提供的裂解液开发方法开发的与10x Genomics公司多组学测序(单核ATAC+单核转录组)protocol相匹配的水稻根尖裂解液进行水稻根尖细胞核提取。
一、实验目的
检验当裂解液中增加其他抑制剂成分时本发明提供的细胞核提取裂解液开发方法是否适用。
二、实验材料
1、水稻根尖(包括胚根和冠根)，按以下方法进行培养：
与实施例1相同。
2、裂解液
先按表4配制基础液
表4 基础液中各成分的用量
基础液配制方法：
在离心管中先加入无酶无菌水，然后依次将上表中各成分加入离心管中；
裂解液成品配制：使用前每毫升基础液加入β-巯基乙醇5ul。
三、水稻根尖细胞核提取方法步骤
与实施例1相同。
四、实验结果
得到的细胞核核膜完整(图10)，可用于上机。
五、结论
当裂解液中增加其他抑制剂成分时本发明提供的细胞核提取裂解液开发方法依然适用。
Claims (10)
1.一种用于提取植物细胞核和植物ATAC-seq实验的裂解液，其特征是含有β-巯基乙醇，且用于植物材料固定后进行提取。
2.权利要求1所述的裂解液，β-巯基乙醇的浓度为1ul/ml-20ul/ml。
3.权利要求2所述的裂解液，还含有以下成分：
Tween-20 0.01％-1％，NP40 0.01％-1％，Digitonin 0.001％-0.03％。
4.权利要求1所述的裂解液，由以下成分组成：
Tris-HCl(pH 7.4)1mM-50mM，
NaCl 1mM-50mM，
MgCl2 1mM-40mM，
Tween-20 0.01％-1％，
NP40 0.01％-1％，
BSA 0.2％-3％，
Digitonin 0.001％-0.03％，
β-巯基乙醇1ul/ml-20ul/ml。
5.β-巯基乙醇在用固定试剂固定过的植物材料中提取细胞核中的应用，所述固定试剂选自甲醛、甲醇或Lomant试剂。
6.Digitonin在提取植物细胞核和植物ATAC-seq实验中的应用。
7.权利要求1所述的裂解液在染色质开放性测序中的应用。
8.权利要求1所述的裂解液在植物细胞核提取中的应用。
9.一种提取植物细胞核的方法，其特征是提取前应用固定试剂对植物材料进行固定，所述固定试剂选自甲醛、甲醇或Lomant试剂；并使用含有β-巯基乙醇和Digitonin的裂解液进行提取。
10.权利要求9所述提取植物细胞核的方法，所述固定试剂是1％-4％甲醛，固定时间是15-45分钟。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024066317A1 (zh) * | 2022-09-28 | 2024-04-04 | 上海欧易生物医学科技有限公司 | 一种适用于猕猴桃根组织单细胞测序的植物细胞核制备以及悬液优化方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105925564A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-09-07 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 提取植物基因组dna的方法 |
| CN108130323A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-06-08 | 奥明（杭州）基因科技有限公司 | 一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法 |
| CN109706236A (zh) * | 2019-02-02 | 2019-05-03 | 南京农业大学 | 一种利用微球菌核酸酶鉴定植物基因组开放性染色质位点的方法 |
| CN109880887A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-14 | 嘉兴菲沙基因信息有限公司 | 一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法 |
| CN109988745A (zh) * | 2018-01-03 | 2019-07-09 | 复旦大学 | 一种细胞核的提取方法 |
| CN110268059A (zh) * | 2016-07-22 | 2019-09-20 | 俄勒冈健康与科学大学 | 单细胞全基因组文库及制备其的组合索引方法 |
| CN111073953A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-28 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种适合植物的Hi-C高通量测序建库方法 |
| CN111139214A (zh) * | 2020-01-06 | 2020-05-12 | 中国科学院植物研究所 | 用于提取细胞核的液体及其应用 |
| CN111440759A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-24 | 河南农业大学 | 同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法 |
| CN111763721A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-13 | 武汉爱基百客生物科技有限公司 | 一种适用于植物的ATAC-seq方法 |
| CN111778563A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-10-16 | 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 | 细胞Hi-C测序文库的构建方法 |
| CN113444678A (zh) * | 2020-03-26 | 2021-09-28 | 武汉华大医学检验所有限公司 | 制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒 |
-
2021
- 2021-12-24 CN CN202111600813.0A patent/CN114277094B/zh active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105925564A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-09-07 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 提取植物基因组dna的方法 |
| CN110268059A (zh) * | 2016-07-22 | 2019-09-20 | 俄勒冈健康与科学大学 | 单细胞全基因组文库及制备其的组合索引方法 |
| CN108130323A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-06-08 | 奥明（杭州）基因科技有限公司 | 一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法 |
| CN109988745A (zh) * | 2018-01-03 | 2019-07-09 | 复旦大学 | 一种细胞核的提取方法 |
| CN109706236A (zh) * | 2019-02-02 | 2019-05-03 | 南京农业大学 | 一种利用微球菌核酸酶鉴定植物基因组开放性染色质位点的方法 |
| CN109880887A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-14 | 嘉兴菲沙基因信息有限公司 | 一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法 |
| CN111073953A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-28 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种适合植物的Hi-C高通量测序建库方法 |
| CN111139214A (zh) * | 2020-01-06 | 2020-05-12 | 中国科学院植物研究所 | 用于提取细胞核的液体及其应用 |
| CN111440759A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-24 | 河南农业大学 | 同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法 |
| CN113444678A (zh) * | 2020-03-26 | 2021-09-28 | 武汉华大医学检验所有限公司 | 制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒 |
| CN111763721A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-13 | 武汉爱基百客生物科技有限公司 | 一种适用于植物的ATAC-seq方法 |
| CN111778563A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-10-16 | 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 | 细胞Hi-C测序文库的构建方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FENG D 等: "Chromatin accessibility illuminates single-cell regulatory dynamics of rice root tips", 《BMC BIOL》, vol. 20, no. 1, pages 1 - 12 * |
| LU Z 等: "Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes", 《NUCLEIC ACIDS RES》, vol. 45, no. 6, pages 1 - 13 * |
| MARAND AP 等: "A cis-regulatory atlas in maize at single-cell resolution", 《CELL》, vol. 184, no. 11, pages 1 - 37 * |
| THIBIVILLIERS SB 等: "Isolation of Plant Nuclei Compatible with Microfluidic Single-nucleus ATAC-sequencing", 《BIO PROTOC》, vol. 11, no. 23, pages 1 - 11 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024066317A1 (zh) * | 2022-09-28 | 2024-04-04 | 上海欧易生物医学科技有限公司 | 一种适用于猕猴桃根组织单细胞测序的植物细胞核制备以及悬液优化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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