CN111778563A

CN111778563A - 细胞Hi-C测序文库的构建方法

Info

Publication number: CN111778563A
Application number: CN202010725027.2A
Authority: CN
Inventors: 李新; 刘贝贝; 李瑞强; 赵桂仿
Original assignee: Tianjin Novogene Biological Information Technology Co ltd
Current assignee: Tianjin Novogene Biological Information Technology Co ltd
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2020-10-16

Abstract

本发明提供了一种细胞Hi‑C测序文库的构建方法。该构建方法包括采用体积≤800μL且甲醛终浓度为1.5～2.2％的交联体系对10⁵数量级细胞进行甲醛交联固定，然后采用优化的裂解体系及温度对交联细胞进行处理，得到细胞核悬液；对细胞核进行Hi‑C文库构建得到Hi‑C测序文库；细胞膜裂解液包括终浓度分别如下的成分：pH 7.8～8.2，9～11mM的Tris‑HCl、9～11mM NaCl、0.1～0.3％的CA‑630、1×的蛋白酶抑制剂。小体积体系对低细胞起始量固定，并优化细胞膜裂解体系及反应条件，确保细胞核的完整性，提高了细胞核DNA的量及纯度，进而提高建库效率(提高有效数据的占比)。

Description

细胞Hi-C测序文库的构建方法

技术领域

本发明涉及测序文库构建领域，具体而言，涉及一种细胞Hi-C测序文库的构建方法。

背景技术

染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture，3C)是研究基因组三维结构空间互作的有利工具，近些年通过3C、4C、5C等技术延伸的Hi-C技术结合高通量测序手段可以获得全基因组三维结构的互作信息，例如常染色质与异染色质(A/B compartment)、拓扑结构域(TAD)以及染色质环(Loops)等。染色质的空间结构一直是研究的热点，基因与远端元件间的互作关系在基因表达调控和其他基因组活动中起着重要的作用。染色质相互作用的密集矩阵可用于确定染色质区域、染色体和全基因组的空间结构形态。

目前Hi-C技术已经广泛应用于生命科学和医学研究的前沿领域，常规细胞Hi-C高通量测序建库流程，首先通过甲醛固定使核内蛋白与染色质紧密结合，经过细胞裂解和四/六碱基酶对DNA的酶切后使用生物素标记的核苷酸补齐酶切产生的粘性末端；随后开始末端链接，经解交联和超声打断DNA后，利用磁珠捕获生物素标记的DNA片段，最后通过二代测序及生物信息学方法比对参考基因组，得到片段间的互作信息。

但现有的建库方法存在以下缺点：(1)常规细胞Hi-C高通量测序建库通常以10⁷个细胞进行建库，对样本量需求极大，不适用于稀缺样本建库；(2)由于建库方法的原因导致无效数据产出高，进而降低有效互作信息的数据量；(3)单次建库产出量低，无法进行高分辨率的深度测序；(4)单次建库成本高稳定性差，一旦文库构建失败，损失较大。

因此，需要对现有的细胞Hi-C高通量测序建库进行改进，降低样本起始量的同时提高测序文库的建库效率。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种细胞Hi-C测序文库的构建方法，以提高建库效率，同时降低细胞起始量。

为了实现上述目的，本发明提供了一种细胞Hi-C测序文库的构建方法，该构建方法包括：对细胞进行甲醛交联固定，得到交联细胞；对交联细胞进行裂解，得到细胞核；在细胞核内进行Hi-C文库构建，得到Hi-C测序文库；细胞为10⁵数量级的细胞，对交联细胞进行裂解，得到完整细胞核，包括：采用细胞膜裂解液对交联细胞进行重悬后置于冰上孵育25～35min，得到细胞膜裂解物；对细胞膜裂解物在0～4℃下4800～5200rpm下离心5～7min，得到细胞核沉淀物；采用预冷的1×Cutsmart对细胞核沉淀物进行洗涤后置于0～4℃下4500～5200rpm离心5～7min，得到洗涤产物；对洗涤产物采用终浓度为0.3～0.4％的SDS的1×Cutsmart溶液，在37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min后置于冰上放置2～3min，得到再裂解产物；向再裂解产物中加入终浓度为1.5～1.8％的TritonX-100，置于37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min，得到细胞核；其中，细胞膜裂解液包括终浓度分别如下的成分：pH 7.8～8.2，9～11mM的Tris-HCl、9～11mM NaCl、0.1～0.3％的CA-630、1×的蛋白酶抑制剂。

进一步地，利用细胞核DNA进行Hi-C文库构建，得到Hi-C测序文库包括：采用终浓度为0.3-0.8U/μL的核酸内切酶对细胞核DNA进行酶切片段化，得到片段化DNA；对片段化DNA进行生物素末端标记并连接，得到连接复合物；对连接复合物进行解交联，得到解交联片段；去除解交联片段中末端标记但未连接的片段，得到目标片段；使用磁珠富集生物素标记的目标片段，对目标片段依次进行末端修复加A、连接头、文库扩增及片段选择，得到Hi-C测序文库。

进一步地，核酸内切酶为4～6个碱基识别位点的核酸内切酶，优选核酸内切酶选自MboI、Dpn II、Hae III、Hind III。

进一步地，对片段化DNA进行生物素末端标记并连接，得到连接复合物包括：采用终浓度为0.03～0.05U/μL的Klenow酶和终浓度为0.01～0.02mM的dNTP，对片段化DNA进行生物素末端标记和补平，得到标记补平产物，其中，dNTP包括dCTP、dGTP、d/TTP和dATP四种，其中一种带有生物素标记；采用终浓度为3～4U/μL的T4 DNA连接酶对标记补平产物进行末端连接，得到连接复合物。

进一步地，对连接复合物进行解交联，得到解交联片段包括：采用解交联体系对连接复合物进行解交联，得到解交联片段；解交联体系包括终浓度为2～3mg/mL蛋白酶K、终浓度为0.3～0.7％的SDS及终浓度为0.9～1.1mM的EDTA。

进一步地，在进行解交联之后，以及得到解交联片段之前，构建方法还包括：采用解交联体系对连接复合物进行解交联；向解交联后的产物中加入终浓度为0.48～0.53M的NaCl，然后置于60～70℃下孵育80～100min促进解交联反应，得到促解交联产物；将促解交联产物置于20～30℃下放置3～6min，然后置于4800～5200rpm下离心5～7min，得到上清液；采用磁珠对上清液进行纯化回收，得到解交联片段。

进一步地，采用0.75～0.85倍AMPure XP磁珠对上清液进行纯化回收，得到解交联片段。

进一步地，去除解交联片段中末端标记但未连接的片段，得到目标片段包括：采用终浓度分别为0.1～0.3mM的dATP、0.1～0.3mM的dGTP、0.1～0.3mg/mL的BSA及0.02～0.05U/μL的T4 DNA聚合酶与解交联片段进行孵育，得到孵育产物；对孵育产物进行物理打断，得到打断片段；采用磁珠对打断片段中的目标长度片段进行纯化回收，得到目标片段。

进一步地，磁珠为DynabeadsTM M280 Streptavidin磁珠。

进一步地，采用0.9～1.1倍体积的DynabeadsTM M280 Streptavidin磁珠对打断片段中的目标长度片段进行纯化回收，得到目标片段。

应用本发明的技术方案，对极少量细胞(低起始量细胞)采用小体积的交联体系进行交联固定，便于在交联终止后离心即细胞可见，而利用优化的细胞膜裂解液及裂解操作条件，使得细胞裂解充分反应，且能够获得更多的完整细胞，利用这样高效分离的数量少但完整的细胞核进行后续Hi-C文库构建，在一定程度上提高了建库效率，使得有效数据的占比较高。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了本发明的Hi-C文库构建的基本流程图；

图2示出了人骨肉瘤细胞根据本发明的实施例1中条件1下制备得到的文库库检图；

图3示出了人骨肉瘤细胞根据本发明的实施例1中条件2下制备得到的文库库检图；

图4示出了人骨肉瘤细胞根据本发明的实施例1中条件3下制备得到的文库库检图；

图5示出了鸭脂肪细胞根据本发明的实施例1中条件1下制备得到的文库库检图；

图6示出了鸭脂肪细胞根据本发明的实施例1中条件1下制备得到的文库库检图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

在本申请一种优选的实施例中，提供了一种细胞Hi-C测序文库的构建方法，该构建方法包括：对细胞进行甲醛交联固定，得到交联细胞；对交联细胞进行核质分离，得到完整细胞核；在细胞核内进行Hi-C文库构建，得到Hi-C测序文库；细胞为10⁵数量级的细胞，使用甲醛交联固定(优选为不超过800μL的小体积体系，其中甲醛终浓度为1.5～2.2％)，对交联细胞进行细胞膜裂解，得到(完整)细胞核，细胞核包括：采用细胞膜裂解液对交联细胞进行重悬后置于冰上孵育25～35min，每隔10分钟用枪小心混匀一次，充分裂解细胞膜，得到细胞膜裂解物；对细胞膜初裂解物在0～4℃下4800～5200rpm下离心5～7min，得到细胞核沉淀物；采用预冷的1×Cutsmart对细胞核沉淀物进行洗涤后置于0～4℃下4500～5200rpm离心5～7min，得到洗涤产物；对洗涤产物采用终浓度为0.3～0.4％的SDS的1×Cutsmart溶液，在37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min后置于冰上放置2～3min；(避免使用终浓度高于0.5％的SDS或高温条件孵育，否则会使细胞核裂解)向细胞核悬液中加入终浓度为1.5～1.8％的TritonX-100，置于37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min；其中，细胞膜裂解液包括终浓度分别如下的成分：9～11mM Tris-HCl(pH 7.8～8.2)、9～11mM NaCl、0.1～0.3％的CA-630、1×蛋白酶抑制剂。

上述Hi-C测序文库构建方法中，对极少量细胞(低起始量细胞)采用小体积的交联体系进行交联固定，便于在交联终止后离心即细胞可见，而利用优化的细胞膜裂解液及裂解操作条件，使得细胞裂解充分反应，且能够获得更多的完整细胞，利用这样高效分离的数量少但完整的细胞核进行后续Hi-C文库构建，在一定程度上提高了建库效率，使得有效数据的占比较高。

上述甲醛交联固定步骤中，采用小体积体系进行交联固定能够有效提高有效数据的占比。除此之外，还可以在甲醛交联固定之前，采用乙二醇双(EGS)进行初固定。比如采用1.5mM的乙二醇双(EGS)固定液重悬细胞，室温下12rpm振荡45min以混匀细胞；随后，使用终浓度为1％的甲醛再次固定，混匀后在室温下12rpm振荡20min，使用甘氨酸进行中和。采用该方法对细胞进行固定后，虽在一定程度上会增加反式互作率，但有助于进一步降低文库产出的无效数据率，提高有效数据占比。

上述文库构建步骤中，利用细胞核进行Hi-C文库构建的步骤包括：对细胞核内的DNA进行酶切片段化，得到片段化DNA；对片段化DNA进行生物素末端标记并连接，得到连接复合物；对连接复合物进行解交联，得到解交联片段；去除解交联片段中末端标记但未连接的片段，得到目标片段；对目标片段依次进行末端修复加A、连接头、文库扩增及片段选择，得到Hi-C测序文库。

在一种优选的实施例中，上述核酸内切酶的工作浓度(即终浓度)为0.3～0.8U/μL。核酸内切酶的具体种类不限，可以根据实际需要进行合理选择。通常选择4～6个碱基识别位点的核酸内切酶，优选核酸内切酶选自MboI、Dpn II、Hae III及Hind III。理论上，识别位点碱基数目越少的内切酶，在基因组上的识别位点就相对越多，从而将基因组打断后产生的片段就越多，反之就相对越少。

对片段化DNA进行生物素末端标记并连接，得到连接复合物的步骤，本申请进一步对各种标记体系和连接体系进行优化，并获得了更优的去除和连接效果。在本申请一种优选的实施例中，对片段化DNA进行生物素末端标记并连接，得到连接复合物的步骤包括：采用终浓度为0.03～0.05U/μL Klenow酶和终浓度为0.01～0.02mM的dNTP，对片段化DNA进行生物素末端标记和补平，得到标记补平产物，其中，dNTP包括dCTP、dGTP、d/TTP和dATP四种，其中一种带有生物素标记；采用终浓度为3～4U/μL的T4 DNA连接酶对标记补平产物进行末端连接，得到连接复合物(近端互作DNA连接复合物)。

上述对连接复合物进行解交联，得到解交联片段可以采用在现有的解交联方式基础上进行改进得到。发明人在优化过程中，发现采用现有的仅用蛋白酶进行解交联的解交联体系，虽然也能够使蛋白结构松动，使与其结合的DNA释放出来，但存在解交联不彻底，无法将蛋白全部释放，进而释放获得的DNA量也相对有限。比如，现有技术中有采用蛋白酶K多次或者较长时间(比如过夜等16-24小时)的解交联处理等方式均存在上述问题。即使与采用更精细的传统的酚-氯仿抽提DNA，及异丙醇沉淀DNA等DNA的提取方式相结合，也难以提高DNA的收率。因为，如果蛋白酶K解交联不彻底，那么后续酚-氯仿抽提的DNA也仅是水相中的已经释放的DNA，而未解交联的与蛋白交联在一起的部分DNA仍然无法抽提和沉淀得到。

为了进一步提高现有解交联的程度，以释放获得更多DNA，同时也为了避免未解交联的蛋白对后续的建库及测序效果产生不利影响，在本申请一种优选的实施例中，该步骤包括：采用解交联体系对连接复合物进行解交联，得到解交联片段；解交联体系包括终浓度为2～3mg/mL蛋白酶K、终浓度为0.3～0.7％的SDS及终浓度为0.9～1.1mM(更优选为1mM)的EDTA。采用该浓度范围的蛋白酶K、SDS及EDTA形成的解交联体系在55℃孵育下使蛋白质逐步松散、降解，DNA从蛋白中充分释放出来。

在另一种优选的实施例中，在利用解交联体系对连接复合物进行解交联之后，以及得到解交联片段之前，该构建方法还包括：向解交联反应体系中加入终浓度为0.48～0.53M的NaCl，置于60～70℃以上孵育80～100min可促进解交联反应，得到促解交联产物；将促解交联产物置于20～30℃下放置3～6min，然后置于4800～5200rpm下离心5～7min，得到上清液；采用磁珠对上清液进行纯化回收，得到解交联片段。此处NaCl在上述温度范围内可降低蛋白与DNA的结合程度，促进解交联反应进行；采用磁珠(优选为0.75～0.85倍AMPure XP)对上清液进行纯化回收，得到解交联片段。

上述去除解交联片段中末端标记但未连接的片段，得到目标片段包括：采用终浓度分别为0.1～0.3mM的dATP、0.1～0.3mM的dGTP、0.1～0.3mg/mL的BSA及0.02～0.05U/μL的T4 DNA聚合酶与解交联片段进行孵育，得到孵育产物；对孵育产物进行物理打断，得到打断片段；采用磁珠对打断片段中的目标长度片段进行纯化回收，得到目标片段；采用磁珠对打断片段中的目标长度片段进行纯化回收，得到目标片段。

优选地，上述磁珠为DynabeadsTM M280 Streptavidin磁珠。更优选地，采用0.9～1.1倍体积的DynabeadsTM M280 Streptavidin磁珠对打断片段中的目标长度片段进行纯化回收，得到目标片段。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。需要说明的是，以下实施例中按照图1所示流程进行构建操作，其中各步骤中的备注是指常规Hi-C的文库构建操作条件。

实施例1

1细胞固定

(1)细胞计数后重悬于750μL细胞完全培养基，加入41.7μL 37％甲醛(终浓度2％)，室温固定15分钟(每隔1-2分钟颠倒一次)。备注：细胞计数后重悬于10ml 1x PBS，加入278μL 37％甲醛(终浓度1％)，室温固定10分钟。

(2)加入83.25μL 2.5M甘氨酸溶液，轻轻混匀后室温静置5分钟，然后冰上放置15分钟。备注：加入555μL 2.5M甘氨酸溶液，轻轻混匀室温静置5分钟，然后冰上保存。

(3)将样品溶液400g离心5分钟(4℃)，弃上清。

(4)用500μL PBS重悬细胞，并转移至1.5mL离心管中。400g，4℃离心5分钟，弃上清，重复操作一次，收集固定好的细胞。

2分离完整细胞核和DNA酶切

(1)配置细胞膜裂解液(表1)，用25μL裂解液重悬交联后的细胞，充分混匀，立即冰上孵育30分钟，每10分钟混匀一次。备注：配置表2所示细胞裂解液，用550μL的裂解液重悬交联细胞，小心混合，冰上孵育30分钟。

表1：裂解液配方

备注：裂解液配方(常规Hi-C)

表2：

(2)将裂解液转入1.5mL离心管，4℃5000rpm，离心5分钟。

(3)弃上清，沉淀用200μL预冷的1×Cutsmart洗涤1次，离心条件：4℃5000rpm，5分钟。备注：用500μL 1x NEBuffer 2洗涤2次，离心条件：室温，5000rpm(常规细胞Hi-C)

(4)弃上清，每管加入184μL 1×Cutsmart重悬细胞核，混匀后加入5.5μL 10％SDS(终浓度0.3％)，混匀后放置在37℃金属浴中900rpm振荡1小时，结束后立刻置于冰上3分钟。备注：弃上清，每管加入362μL 1x NEBuffer 2重悬细胞，混匀后加入38μL 1％SDS(终浓度0.1％)，混匀后放置在65℃金属浴孵育10分钟，结束后立即置于冰上保存，(常规细胞Hi-C)。

(5)向每管中加入37.5μL 10％TritonX-100(终浓度1.65％)，用枪轻轻吹吸混匀，37℃金属浴孵育1小时(900rpm振荡)。备注：向每管中加入44μL 10％TritonX-100(终浓度1％)，小心混匀，立即进行下步操作(常规细胞Hi-C)

(6)加入(条件1)100U四碱基酶MboI(0.4U/μL)、(条件2)50U四碱基酶MboI(0.2U/μL)、(条件3)50U四碱基酶MboI(0.1U/μL)，用枪轻轻吹吸混匀。之后置于金属浴中37℃900rpm振荡过夜酶切，65℃度孵育20分钟(灭活Mbo I)之后在室温下放置5分钟。备注：加入400U HindIII(1U/μL)，小心混匀，置于37℃培养箱旋转过夜酶切，无灭活过程(常规细胞Hi-C)。

3.生物素标记DNA末端，稀释和连接

(1)配制补平末端及生物素标记体系：

表3：补平末端及生物素标记体系

备注：补平末端及生物素标记体系(常规细胞Hi-C)

表4：

(2)将该体系加入到酶切之后的体系中，37℃金属浴孵育45分钟。(每5分钟颠倒混匀一次)

(3)75℃，20分钟灭活酶；灭活后25℃，5分钟平衡至室温(或立即置于冰上)。备注：加入86μL 10％SDS进行灭活酶，小心混匀，置于65℃孵育30分钟(常规Hi-C方法)

(4)向补平末端体系(共256μL)中加入连接体系，置于金属浴中，20℃孵育30分钟。(每5分钟颠倒混匀一次)。备注常规：向补平末端及生物素标记体系中加入连接体系，置于16℃孵育4小时。

表5：.连接反应体系

备注：连接反应体系(常规Hi-C)

表6：

(5)连接之后5000rpm 4℃离心5分钟，弃上清。备注：无离心弃上清过程，裂解过程导致细胞全部裂解，无细胞核沉淀，无法弃上清分离(常规细胞Hi-C)

(6)解交联：预先配制解交联体系，55℃金属浴孵育30分钟进行解交联反应。备注：向上述反应体系中加入50μL 10mg/ml的蛋白酶K，65℃过夜孵育，第二天再加入50μL 10mg/ml的蛋白酶K，65℃继续孵育2小时(常规细胞Hi-C)。

表7.解交联体系

(7)加入10μL 5M NaCl，65℃金属浴孵育90分钟后于室温放置5分钟。

(8)反应结束后，5000rpm室温离心5分钟，弃沉淀，取上清100μL进行AMPure XP磁珠纯化。

(9)加入80μL AMPure XP磁珠(0.8倍)纯化，彻底混匀(用枪吹打混匀)，室温孵育5分钟。(XP磁珠需要提前半个小时从冰箱拿出平衡至室温)。备注：酚氯仿-乙醇沉淀法(常规细胞Hi-C)

(10)将样品管放置在磁力架上，吸附3分钟左右直至液体澄清。

(11)弃上清，样品管仍在磁力架上，加入200μL 80％乙醇(不用混匀)，室温孵育30秒。

(12)重复(11)操作一次。(80％乙醇需要现配现用)

(13)弃上清，样品管仍在磁力架上，打开样品管盖干燥磁珠3-5分钟。

(14)取下磁力架上的样品管，用44μL洗脱缓冲液(EB，Elution Buffer)洗脱磁珠(加入EB之后用枪吹打混匀)，室温孵育5分钟；随后，加入1μL 1mg/mL RNAse A，置于37℃孵育30分钟。

(15)将样品管放置在磁力架上，孵育直到液体澄清，取出上清。

(16)取1μL上清进行Qubit定量。

4.除去末端标记但未连接的DNA

(1)取上述中间产物，配成以下体系：

表8.连接反应体系

备注：连接反应体系(常规细胞Hi-C)

表9：

(2)PCR仪中12℃孵育2个小时，4℃保存。

(3)取1μL进行Qubit定量。

(4)用超声(Biorupter)打断回收产物，用NF-水补足体积至60μL，打断条件：开15秒、停45秒，共7个循环。

5.目标区域捕获

(1)震荡重悬Dynabeads^TM M280 Streptavidin磁珠，吸取20μL至1.5mL样品管中，将样品管放置在磁力架上1-2分钟，待液体澄清后，小心丢弃上清。

(2)用50μL结合缓冲液(Binding Buffer)洗涤磁珠，用枪吹打混匀重悬后磁力架分离1分钟，弃上清；重复洗涤一次，最后用60μL Binding Buffer重悬磁珠。

(3)经超声打断的样品60μL，直接加入上步纯化好的60μL磁珠(1倍)，小心混匀后室温孵育20分钟。

6末端修复加A

(1)上述反应结束后，将样品管放置在磁力架上放置2分钟，待澄清后，弃上清。

(2)使用诺禾致源试剂盒(PT069)进行建库，用200μL洗涤缓冲液I(WashingBuffer I)洗涤两次，再用200μL EB洗涤两次，去上清。(洗的时候需要用枪吹打混匀，然后直接放在磁力架上，去上清后，再洗第二次)

表10：末端修复加A反应体系

(3)将体系加入磁珠中，转移至PCR管，PCR仪中37℃孵育30分钟，72℃孵育30分钟后4℃保存。

(4)配制加接头体系：

表11：加接头体系

(5)PCR仪中20℃孵育30分钟。

7文库PCR

(1)将以上反应体系放入新的1.5mL离心管中，用200μL Washing Buffer I洗涤两次，用200μL洗涤缓冲液II(Washing Buffer II)洗涤一次(尽量快)，最后用200μL EB洗涤两次。(洗的时候需要用枪吹打混匀，然后直接放在磁力架上，去上清后，再洗第二次)

(2)配制PCR体系：

表12：PCR体系

表13：PCR程序

(3)下机浓度检测。

8.文库片段选择

(1)加入新鲜水使样品体积达到50μL。

(2)加入28.5μL AMPure XP磁珠，充分混匀后室温孵育5分钟。

(3)将样品管放置在磁力架上，吸附直到液体澄清。

(4)转移上清液到一个新的样品管中，并加入9μL AMPure XP磁珠，充分混匀，室温孵育5分钟。

(6)将样品管放置在磁力架上，吸附直到液体澄清。

(7)弃上清，样品管仍在磁力架上，加入200μL 80％的乙醇，室温孵育30秒。重复操作一次。

(8)弃掉上清，样品管仍在磁力架上，室温开盖孵育3-5分钟，晾干乙醇。

(9)用12μL EB将DNA从磁珠上洗脱下来，充分混匀后室温孵育3分钟，放回磁力架上吸附直到液体澄清，取出上清。

(10)取1μL进行Qubit定量。

利用实施例1中本申请中的不同优选条件下的文库构建方法，对人骨肉瘤细胞进行了Hi-C测序文库的构建。从图2(条件1)、图3(条件2)和图4(条件3)人骨肉瘤细胞的库检图中可以看出，文库大小集中在400-700bp之间，满足文库片段分布要求。对文库测序下机数据进行分析，结果如下：

表14：

表15：10万人骨肉瘤细胞测序数据统计

如表14和表15所示，上述10万个人骨肉瘤细胞所构建的文库产出的数据中，条件2和条件3无效数据产出较高，重复率高于20％，且有效互作信息数据低于条件1。

实施例2

利用实施例1中本申请1中的优选条件1下的文库构建方法，对鸭脂肪细胞进行了Hi-C测序文库的构建。从图5和图6鸭脂肪细胞的库检图中可以看出，文库大小集中在400-700bp之间，满足文库片段分布要求。对文库测序下机数据进行分析，结果如下：

表16：

表17：鸭脂肪细胞测序数据统计

如表16和表17所示，上述10万个鸭脂肪细胞所构建的文库产出的数据中，无效数据产出仅为1％，重复率低于20％，且有效互作信息数据高达到50％-60％以上。

实施例3

本发明方法(10万细胞)与常规细胞Hi-C方法(500万细胞)的文库数据比较如表18所示：

表18：

如表18所示，使用本发明方法的10万个细胞起始量Hi-C文库数据，与500万个细胞起始量的常规Hi-C方法所构建的文库数据相比，有效互作信息数据达到60％以上，且无效数据比例更低。

为进一步获得更优的交联固定处理效果，发明人还对低起始量细胞的交联固定方法进行了筛选，具体见如下实施例。

实施例4：

使用小鼠肝细胞比较本发明条件1方法、EGS甲醛双交联固定和常规Hi-C法的优势，结果如表19所示：

(EGS甲醛双交联法：用1.5mM的乙二醇双(EGS)固定液重悬细胞，室温下12rpm振荡45min以混匀细胞；随后，使用终浓度为1％的甲醛再次固定，混匀后在室温下12rpm振荡20min，使用甘氨酸进行中和，后续实验方法与本发明条件1相同)。

表19：

如表19所示，EGS甲醛交联法在一定程度上会增加反式互作率，但也能够降低无效数据，提高有效数据的占比。但而常规细胞Hi-C法无论dup率、数据有效率、无效数据还是有效数据结果均较本申请的条件1的数据差。

从上述数据结果可以看出，本申请的文库建库文法具有以下几方面优势：

(1)起始量仅为10⁵个细胞进行高通量测序建库，较常规细胞Hi-C高通量测序建库的10⁶～10⁷个细胞建库，达到降低了样本的使用量；而且，为稀缺样本需要更低起始量的细胞进行建库提供了可能(目前对起始量低至10⁵个细胞级别建库方法基本还没有)。

(2)本申请在裂解反应体系中，使用0.3％左右的SDS进行处理，更适用于不同物种的细胞核质分离，而采用0.3％左右的SDS于37℃孵育条件下裂解可保证细胞核不被破坏，使后续反应维持在细胞核中进行，从而减少不同细胞之间的染色质相互连接，提高细胞核内的染色质有效数据产出量。

(3)本申请所使用的酶切、生物素标记、连接以及解交联体系最大程度优化了每个过程的反应条件，使无效末端去除更彻底，解交联释放的DNA更充分，进而显著提高有效互作数据产出。

(4)本申请所使用的方法文库产出量高，单次建库足够用于500G以上的深度测序，有利于高分辨率的精确分析，避免重复建库造成误差和经济上的浪费；

(5)本申请使用的方法单次建库的物料总成本(846元)远低于常规细胞Hi-C建库的成本(1475元)。

综上可知，本申请的方法是一种低成本、低起始量且高效的细胞Hi-C高通量测序建库方法，适用于生命科学及医学领域三维基因组空间结构的互作信息研究，且适用于所有的动物细胞Hi-C高通量测序建库。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种细胞Hi-C测序文库的构建方法，所述构建方法包括：

采用体积≤800μL且甲醛终浓度为1.5～2.2％的交联体系对10⁵数量级的细胞进行甲醛交联固定，得到交联细胞；

对所述交联细胞进行裂解，得到细胞核；

利用所述细胞核进行Hi-C文库构建，得到所述Hi-C测序文库；

其特征在于，对所述交联细胞进行裂解，得到细胞核包括：

采用细胞膜裂解液对所述交联细胞进行重悬后置于冰上孵育25～35min，得到细胞膜裂解物；

对所述细胞膜裂解物在0～4℃下4800～5200rpm下离心5～7min，得到细胞核沉淀物；

采用预冷的1×Cutsmart对所述细胞核沉淀物进行洗涤后置于0～4℃下4500～5200rpm离心5～7min，得到洗涤产物；

对所述洗涤产物采用终浓度为0.3～0.4％的SDS的1×Cutsmart溶液，在37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min后置于冰上放置2～3min，得到再裂解产物；

向所述再裂解产物中加入终浓度为1.5～1.8％的TritonX-100，置于37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min，得到所述细胞核；

其中，所述细胞膜裂解液包括终浓度分别如下的成分：pH 7.8～8.2，9～11mM的Tris-HCl、9～11mM NaCl、0.1～0.3％的CA-630、1×的蛋白酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用所述细胞核进行Hi-C文库构建，得到所述Hi-C测序文库包括：

采用终浓度为0.3-0.8U/μL的核酸内切酶对所述细胞核中的DNA进行酶切片段化，得到片段化DNA；对所述片段化DNA进行生物素末端标记并连接，得到连接复合物；

对所述连接复合物进行解交联，得到解交联片段；

去除所述解交联片段中末端标记但未连接的片段，得到目标片段；

对所述目标片段依次进行末端修复加A、连接头、文库扩增及片段选择，得到所述Hi-C测序文库。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述核酸内切酶为4～6个碱基识别位点的核酸内切酶，优选所述核酸内切酶选自MboI、Dpn II、Hae III、Hind III。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，对所述片段化DNA进行生物素末端标记并连接，得到连接复合物包括：

采用终浓度为0.03～0.05U/μL的Klenow酶和终浓度为0.01～0.02mM的dNTP，对所述片段化DNA进行生物素末端标记和补平，得到标记补平产物，其中，所述dNTP包括dCTP、dGTP、d/TTP和dATP四种，其中一种带有生物素标记；

采用终浓度为3～4U/μL的T4 DNA连接酶对所述标记补平产物进行末端连接，得到所述连接复合物。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，对所述连接复合物进行解交联，得到解交联片段包括：

采用解交联体系对所述连接复合物进行解交联，得到解交联片段；

所述解交联体系包括终浓度为2～3mg/mL蛋白酶K、终浓度为0.3～0.7％的SDS及终浓度为0.9～1.1mM的EDTA。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，在采用所述解交联体系对所述连接复合物进行解交联之后，以及得到所述解交联片段之前，所述构建方法还包括：

向解交联后的产物中加入终浓度为0.48～0.53M的NaCl，然后置于60～70℃下孵育80～100min促进解交联反应，得到促解交联产物；

将所述促解交联产物置于20～30℃下放置3～6min，然后置于4800～5200rpm下离心5～7min，得到上清液；

采用磁珠对所述上清液进行纯化回收，得到所述解交联片段。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，采用0.75～0.85倍AMPure XP磁珠对所述上清液进行纯化回收，得到所述解交联片段。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，去除所述解交联片段中末端标记但未连接的片段，得到目标片段包括：

采用终浓度分别为0.1～0.3mM的dATP、0.1～0.3mM的dGTP、0.1～0.3mg/mL的BSA及0.02～0.05U/μL的T4 DNA聚合酶与所述解交联片段进行孵育，得到孵育产物；

对所述孵育产物进行物理打断，得到打断片段；

采用磁珠对所述打断片段中的目标长度片段进行纯化回收，得到所述目标片段。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述磁珠为DynabeadsTMM280Streptavidin磁珠。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，采用0.9～1.1倍体积的所述DynabeadsTMM280 Streptavidin磁珠对所述打断片段中的目标长度片段进行纯化回收，得到所述目标片段。