CN114107459B - 一种基于寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞测序方法。本发明基于该寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞转录组或染色质可及性测序方法能够一次性标记并获得从上万个到百万级别的单细胞或单细胞核的特异性转录组信息或染色质开放区域基因组信息。由于在多段barcode标记的步骤仅依靠核酸杂交，中间步骤没有使用包括T4连接酶在内的任何连接酶，而是在最后合成完整DNA链时一步聚合连接所有缺口和双链，扩大实验规模只耗费常规盐离子杂交液不耗费酶，因此大大降低了大规模高通量实验的成本，所以整套实验成本低、耗时短、不依赖仪器、通量高，在单细胞测序领域有很好的实际应用价值。

Description

一种基于寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞测序方法

技术领域

本发明涉及单细胞测序技术领域，特别是涉及一种基于寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞测序方法。

背景技术

同一组织中的细胞都存在异质性，细胞间的基因表达水平会有所不同，这很大程度上反映了细胞的蛋白表达情况，决定了不同细胞的命运与功能。因此对单个细胞进行转录组测序能鉴定细胞亚型，发现新的细胞类型及其功能。近十年来单细胞测序技术发展较为迅速，得益与两方面的技术进步。一方面二代测序仪的成本不断降低，新一代的二代测序仪从HiSeq X ten到NovaSeq，高通量测序的深度，精度不断提升。单细胞建库测序的成本也不断降低，数据质量越来越好，提升了单细胞测序的普及速度，使得更多的生物学现象被单细胞测序揭示出来。另一方面，单细胞分离的方法也在向高通量发展，最开始往往使用口吸管人力挑取单个细胞进行基因定量表达分析或者转录组建库测序，一次试验往往只能得到几十个细胞的信息，后来流式分选也达到了单细胞分选的精度，一次试验能分到数百个单细胞，而近两三年，随着微流控技术的发展，以微流控芯片与微孔板技术为代表的一系列高通量单细胞分离技术出现，并有了类似原理的单细胞测序仪器平台，实验的通量达到了一次几千上万个细胞。基于微流体技术的代表研究有Drop-seq(Macosko,E.Z.,et al.,Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells UsingNanoliter Droplets.Cell,2015.161(5):p.1202-1214.)与inDrop技术(Klein,Allon M.,et al.,Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to EmbryonicStem Cells.Cell,2015.161(5):p.1187-1201.)，基于微流体芯片技术的商用仪器则包括Fluidigm C1^TM单细胞全自动制备系统，ICELL8Single-cell System单细胞分选平台，

Single-Cell Sequencing Solution单细胞平台，以及最新的10XChromium Single Cell Gene Expression Solution平台，实验通量均可到一次几千个细胞。基于微孔板技术的代表研究有Microwell-seq技术，Seq-Well技术，而基于微孔板芯片的商用仪器有BD Rhapsody^TM Single-Cell Analysis System。实验通量同样可以达到一次几千到上万个细胞。

以上的技术都是基于分离消化或分选后的活细胞进行测序。近一两年，另一种思路也被采用于单细胞测序，那就是将细胞固定后，进行细胞内的原位转录本合成再测序，其原理与组织切片后的原位杂交技术类似，原位杂交只是用荧光寡核苷酸探针标定特定转录本，无法做到单细胞内所有转录本的测序，sci-RNA-seq([1]Cao,J.,et al.,Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellularorganism.Science,2017.357(6352):p.661-667.[2]Cao,J.,et al.,The single-celltranscriptional landscape of mammalian organogenesis.Nature,2019.566(7745):p.496-502.)与SPLiT-seq(Rosenberg,A.B.,et al.,Single-cell profiling of thedeveloping mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.Science,2018.360(6385):p.176-182.)，分别采用甲醇与甲醛固定细胞的方法，加入带标记的寡核苷酸链进行细胞内的转录组合成与测序。Sci-RNA-seq受标记组合的限制，实验通量很低，一次只能分析几百到上千个细胞。SPLiT-seq采用T4连接酶的方法连接捕获转录本后带标记的寡核苷酸序列，一次实验能分析几千上万至十万的细胞，有着通量高的优点，但由于标记不同细胞的寡核苷酸组合均需要使用T4连接酶连接，且后续cDNA扩增采用模板置换的方法，操作复杂，消耗的连接酶量随着实验分析的细胞数呈指数上升。有研究报道了基于甲醛固定的百万级小鼠胚胎图谱，通过增加标记引物数量增加了通量，同样采用T4连接酶回环连接第二段标记，但实际数据质量阈值控制较差。

除转录组外，近年来染色质转座酶可接近性分析(ATAC)也逐渐从批量群体测序转向单细胞水平。与转录组不同，ATAC测序根据转座酶识别染色质无核小体聚集的开放区域，对其进行切割产生特定长度范围的片段，从而确定细胞整个基因组的开放状态，提供染色质可接近区域的信息，并揭示细胞基因转录活跃区域。有研究报道了sci-ATAC-seq与sci3-ATAC-seq，分别提供了上万和几十万细胞通量的单细胞ATAC研究。与Sci-RNA-seq类似，sci-ATAC-seq受限于组合数，通量较低且细胞间污染率较高。而sci3-ATAC-seq在前者的基础上采用了不带标签的转座酶切割后连续两轮连接的方法，提高了组合数，但由于体内两轮连接的效率问题牺牲了部分灵敏度。且所有上述组合标记方法的标记步骤都需要依赖T4连接酶来完成寡核苷酸连接标记。

发明内容

本发明提供了一种基于寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞测序方法，这种寡核苷酸链杂交标记的单细胞测序方法能够一次性获得数十万至百万细胞的特异性转录组或染色质开放可及性信息，并且不受细胞活性与状态的限制。

一种基于寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞测序方法，包括以下步骤：

(1)对细胞进行固定处理，或者先从细胞中提取细胞核，再对细胞核进行固定处理；

(2)将固定后的细胞或细胞核均匀分装到多孔板中，对于细胞在每个孔中加入一种反转录寡核苷酸序列并进行反转录；对于细胞核在每个孔中加入一种带寡核苷酸细胞标签序列的转座酶包埋复合物进行转座反应，

其中，每孔加入的一种反转录寡核苷酸序列带有：

杂交序列1；

各孔间序列不同的细胞标签1；

多聚T尾，用于与细胞中带有poly-A序列的mRNA互补配对；

每孔加入的一种带寡核苷酸细胞标签序列的转座酶包埋复合物中寡核苷酸细胞标签序列带有：

杂交序列1；

各孔间序列不同的细胞标签1；

包埋固定序列，用于与Tn5转座酶结合，所述包埋固定序列为双链结构，其中一条链与细胞标签1连接；

(3)将步骤(2)反转录后的细胞或者转座反应后的细胞核收集混合，然后再次均匀分装到多孔板中，并在每个孔中加入一种杂交寡核苷酸序列进行杂交，其中，每孔加入的一种杂交寡核苷酸序列带有：

杂交序列2，与杂交序列1为互补序列，用于与杂交序列1进行互补杂交；

各孔间序列不同的细胞标签2；

文库扩增接头1，用于作为文库扩增时引物结合的序列；

(4)杂交后，再向每孔中加入封闭寡核苷酸序列进行封闭，封闭寡核苷酸序列与杂交寡核苷酸序列中的杂交序列2为互补序列，对未与杂交序列1互补杂交的多余游离杂交序列2进行封闭；

(5)将步骤(4)封闭后的细胞或细胞核收集混合，然后再次均匀分装到多孔板中，并合成完整DNA双链，合成完整DNA双链时一步聚合连接所有缺口和双链，随后进行细胞或细胞核的解交联及裂解。

其中，对于反转录结果，缺口在第二链cDNA合成时由合成二链的cDNA聚合酶及连接酶补齐；对于转座酶反应结果，缺口由合成完整DNA双链的聚合酶及连接酶补齐；

(6)然后在每个孔中加入文库扩增引物对进行文库扩增构建测序文库，所述文库扩增引物对包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物上分别带有用来结合测序仪芯片上测序引物进行测序的文库两侧接头，

其中，上游引物或下游引物的其中一条上带有：

各孔间序列不同的细胞标签3；

通过细胞标签1、细胞标签2和细胞标签3标识测序文库中每条序列的细胞来源。

解交联使蛋白降解，合成后的目标DNA产物脱落，对于转录组测序方案，使用文库构建试剂盒打断DNA并插入文库扩增接头，对于基因组染色质开放区域测序方案，不需要另外使用文库构建试剂盒打断DNA，目前片段在转座酶打断时已经带上文库接头。每个孔中加入区分样本的i7 index引物(引入文库i7接头)和一种P5端文库扩增引物(引入细胞标签3)进行文库扩增构建测序文库。优选的，所述细胞标签1、细胞标签2和细胞标签3均包括序列为随机合成的特异性片段，且每一种特异性片段分别存放，用于在使用时实现各孔间序列不同。

优选的，步骤(3)中，杂交寡核苷酸序列使用与文库扩增接头1序列互补配对的杂交互补退火序列进行封闭保护。杂交互补退火序列用于在补齐缺口前保护杂交寡核苷酸序列的文库扩增接头1，在二链DNA合成，缺口补齐后能形成正反两条完整的模板进行扩增。杂交互补退火序列的使用可以使得整个过程进行效果更好。

优选的，所述反转录寡核苷酸序列还带有：

分子标签，用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA。

更优选的，所述分子标签包括序列为随机合成的特异性片段，且不同序列之间混合存放。

更优选的，反转录寡核苷酸序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTNNNNNNNNnnnnnnnnnnTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，N表示A/T/C/G中的任一种，8N序列为随机合成的分子标签；n表示A/T/C/G中的任一种，10n序列为随机合成的细胞标签1；3’端V表示A/C/G中的任一种，V为随机合成；

杂交寡核苷酸序列为：5’-ACTCTGCGTTGATACCACTGCTTnnnnnnnnnnAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’，n表示A/T/C/G中的任一种，10n序列为随机合成的细胞标签2。

优选的，步骤(2)、步骤(3)和步骤(5)分装到多孔板中时，所分孔的数量均不少于96孔。更优选的，步骤(2)中分装到多孔板中时，所分孔的数量均不少于384孔；步骤(3)分装到多孔板中时，所分孔的数量均不少于768孔；步骤(5)分装到多孔板中时，所分孔的数量均不少于96孔。上述各步骤中所分孔的数量的多少可以根据实验规模自行进行设定。

优选的，步骤(1)中，待测序的细胞中含有2种或2种以上的细胞。本申请基于寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞测序方法可以实现多种细胞的同时测序。

优选的，带寡核苷酸细胞标签序列的转座酶包埋复合物中一个转座酶复合物携带两个基因片段，两个基因片段均为所述寡核苷酸细胞标签序列，或者一个基因片段为所述寡核苷酸细胞标签序列，另一个基因片段为通用型序列，通用型序列包括：

文库扩增接头2，作为文库扩增时的引物结合区域，

包埋固定序列，用于与Tn5转座酶结合，所述包埋固定序列为双链结构，其中至少一条链与文库扩增接头2连接。

更优选的，寡核苷酸细胞标签序列中一条链为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTnnnnnnnnnnAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，n表示A/T/C/G中的任一种，10n序列为随机合成的细胞标签1；另一条链为单独的包埋固定序列；

通用型序列为中一条链为5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；另一条链为单独的包埋固定序列；

其中，单独的包埋固定序列为：5'-[pho]CTGTCTCTTATACACATCT-3'，[pho]代表磷酸化修饰。

在以上方法中，来源于组织消化或培养的细胞或细胞核在使用有机溶剂固定剂固定后得到单细胞悬液，单细胞悬液需要使用40μm或更小规格(20μm)的细胞筛网过滤以去除大颗粒及细胞团块。整个实验所有步骤均在恒温箱中完成，对于转录组测序文库构建来说，加入细胞的96孔板在恒温箱中旋转混匀使逆转录，杂交，封闭等三个步骤中细胞能够在均一的环境中反应。所有细胞在逆转录(对于细胞核中转座酶可及性测序文库构建来说是：基因组打断)，杂交，cDNA合成与文库构建三步中都经历了混合-分散这样的步骤，细胞从第一轮的多个96孔板收集混匀重分配到杂交反应的多个96孔板，再收集混匀重分配到DNA合成与文库构建反应的96孔板。而在每一轮反应中，孔板中加入的寡核苷酸序列，杂交寡核苷酸序列与文库构建的标签序列是每孔特异的，每个细胞的细胞标签由第一轮寡核苷酸序列中细胞标签1，第二轮杂交寡核苷酸序列中细胞标签2，文库构建的细胞标签3三段标签排列组合构成，用于标识来源于这一个细胞的所有转录本或者基因组片段。实验中加入的细胞数远少于实际孔板中每孔加入的寡核苷酸链组成的细胞标签组合数，多个细胞在多轮混合分散后得到同一种细胞标签组合的概率极低。而分子标签由8位随机的寡核苷酸构成，其排列组合数也十分庞大达到4的8次方，仅用来标识捕获到的每一条特异的转录本。

本发明采用的两段分子标记寡核苷酸序列包含多个功能区，转录组所用序列包含文库扩增接头序列、杂交序列、3段细胞标签、分子标签，多聚T尾序列。染色质可及性所用序列包括包埋固定序列、3段细胞标签、杂交序列、文库扩增接头序列。基于该寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞转录组或染色质可及性测序方法能够一次性标记并获得从上万个到百万级别的单细胞或单细胞核的特异性转录组信息或染色质开放区域基因组信息。和类似已发表方法(sci-RNA-seq，sci-ATAC-seq)比较，由于在多段barcode标记的步骤仅依靠核酸杂交，中间步骤没有使用包括T4连接酶在内的任何连接酶，而是在最后合成完整DNA链时一步聚合连接所有缺口和双链，扩大实验规模只耗费常规盐离子杂交液不耗费酶，因此大大降低了大规模高通量实验的成本，所以整套实验成本低、耗时短、不依赖仪器、通量高，在单细胞测序领域有很好的实际应用价值。

附图说明

图1为本申请转录组测序的实验流程示意图。

图2为本申请染色质开放可及性测序的实验流程示意图。

图3为实施例3中人鼠混合细胞转录本分布(UMI)与物种间交叉污染率。

图4为实施例5中人鼠混合细胞基因组开放区域捕获片段read读数(UM)的物种间交叉污染率。

图5为实施例5中人鼠混合细胞基因组开放区域在转录起始位点(TSS)上下游富集程度(左：人类细胞数据；右：小鼠细胞数据)。

图6为实施例5中人鼠混合细胞基因组插入片段分布长度(左：人类细胞数据；右：小鼠细胞数据)。

图7为实施例5中人293T细胞捕获富集基因组开放区域峰(红色)与已发表人293T群体染色质开放区域标准数据库峰(蓝色)重合程度。

图8为实施例5中人293T细胞捕获富集基因组开放区域峰在9号染色体的覆盖区域(CHATAC_human，下)与已发表人293T群体染色质开放区域标准数据库峰在9号染色体的覆盖区域(bulk_human，上)分别同基因组9号染色体(Mix.Human.Refseq)基因组数据的比较。

图9为实施例6中成体蝾螈80万单细胞转录组数据分群示意图。

图10为实施例7中成体蝾螈12万单细胞染色质开放区域数据分群示意图。

具体实施方式

实施例1

三段寡核苷酸序列，保存与工作浓度配制

(1)384种反转录寡核苷酸序列保存液配制25μM工作液浓度保存于-80度冰箱。其序列为：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTNNNNNNNNnnnnnnnnnnTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，N表示A/T/C/G中的任一种，8N为随机合成的分子标签；n表示A/T/C/G中的任一种，10n为随机合成的384种细胞标签1；3’端V表示A/C/G中的任一种，V为随机合成；

(2)768种杂交寡核苷酸序列配制25μM工作液。其序列为：5’-ACTCTGCGTTGATACCACTGCTTnnnnnnnnnnAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’，n表示A/T/C/G中的任一种，10n为随机合成的768种细胞标签2。25μM工作液退火配制过程：768种该序列(100μM)分别与杂交互补退火序列：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(100μM)等量混合并加入无酶水成25μM混合溶液，置于PCR仪中，95度2分钟，以0.1度每秒速度降温至25度，保存于-80度冰箱。

(3)封闭寡核苷酸序列用双蒸水稀释到55μM工作液浓度保存于-80度冰箱。其序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT。作为封闭工作液。

实施例2

固定细胞试剂与杂交液配制。

洗液均为现配现用(×表示浓度倍数，1×为一倍浓度)：

(1)洗液1：1×PBS(磷酸盐缓冲液)+1％DEPC(焦碳酸二乙酯)；

(2)洗液2：1×PBS(磷酸盐缓冲液)(1％牛血清白蛋白+1％RNA酶抑制剂)；

(3)甲醛固定液：4％甲醛溶液(用1X磷酸盐缓冲液稀释37％甲醛溶液)；

(4)杂交工作液：25％甲酰胺，2×饱和柠檬酸钠，1×杂交封闭液5μl，1×磷酸盐缓冲液。

其中，杂交封闭液配制100×浓度保存，包括：葡聚糖1g，聚乙烯吡咯烷酮1g，牛血清白蛋白1g，双蒸水定容至50ml。

实施例3

物种混合(人293T细胞系和鼠3T3细胞系)细胞实验(单细胞转录组测序)

按照图1方法流程，甲醛固定液冰上预冷，胰酶消化上述两种细胞系，500g离心5min(离心步骤下同)，用1×PBS(磷酸盐缓冲液)洗一次，离心。过40μM细胞筛，用1ml 1×PBS(磷酸盐缓冲液，含0.05U/μl RNA酶抑制剂)重悬细胞，加入3ml预冷甲醛固定液，冰上固定15分钟。加入含10μl 10％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)的洗液2混匀室温处理透细胞膜3min。离心，用500μl无酶水重悬细胞，加入3ml 0.1N盐酸二次透化细胞5分钟，加入3.5ml含35μl10％Triton X-100的Tris-HCl(pH8.0)离心。过40μM细胞筛，细胞用洗液2重悬计数。取经过计数的人293T细胞与鼠3T3细胞(各10万)混合进行细胞固定步骤，计数过筛后平均加入到96孔板中。使用排枪加入如下逆转录反应体系。

(1)逆转录反应

每孔加入：

每孔总体系为5μl，置于旋转混匀仪中42度恒温反应1.5小时。

(2)细胞聚合-分散杂交反应

逆转录反应完成后将96孔板置于冰上2min，收集细胞到EP管，500g离心5min。用杂交液重悬细胞按每孔4μl细胞的体积重新加到新的96孔板中。

每孔杂交体系：4μl细胞(杂交液重悬)加1μl杂交工作液，即杂交寡核苷酸序列25μM工作液(实施例1中(2)，此例中加入96种)。

每孔体系共5μl，置于旋转混匀仪中进行杂交反应。42度恒温15分钟，然后37度恒温反应1小时。杂交反应完成后，取出多个96孔板，准备加入封闭工作液(实施例1中(3)。

(3)封闭反应

每孔封闭反应体系：5μl杂交后的细胞悬液；1μl封闭工作液(55μM)。

置于旋转混匀仪中，封闭反应，恒温37度反应1小时。

(4)封闭反应完成后，将细胞收集到一个EP管，500g离心5min，用杂交液重悬并重复离心洗细胞1-2次，过40μM细胞筛计数，再用双蒸水重悬，根据细胞数将细胞重新平均分到新的96孔板中，每孔体系20μl。

(5)解交联，裂解并纯化cDNA

每孔解交联反应体系：20μl细胞悬液；5μl蛋白酶K；25μl 2X裂解液(20μM TrispH8.0，400mM NaCl，100mM EDTA，4.4％SDS)。混匀离心，置于55度与金属浴反应2小时，300rpm旋转。

反应完成后，每孔加入45μl VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化磁珠，室温孵育8分钟，置于磁力架上吸弃上清，用200μl 80％乙醇洗磁珠两次，每次静置30秒。室温干燥3-5分钟，加入25μl水重悬，每孔取出24μl重悬产物于新的96孔板。

(6)磷酸化反应

每孔磷酸化反应体系：

2.75μl 10X T4 ligase Buffer with ATP；24μl步骤5重悬产物；0.5μl T4 PNK激酶。

将孔板置于PCR仪中，37℃反应30分钟。

(7)第二链cDNA合成

每孔第二链cDNA合成体系：27.25μl步骤6磷酸化反应体系；7.5μl 5×2nd StrandSynthesis Buffer(Takara)；0.75μl dNTP Mixture(10mM each)(Takara)；0.5μl E.coliRNase H/E.coli DNA Ligase Mixture(Takara)；0.5μl E.coli DNA Polymerase I(20U/μl)(Takara)。

将孔板置于PCR仪中，16度反应2小时，70度10分钟失活酶，最后10度恒温保存。

反应结束后的每孔体系中加入36.5μl VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化磁珠，室温孵育8分钟，置于磁力架上吸弃上清，用200μl 80％乙醇洗磁珠两次，每次静置30秒。室温干燥3-5分钟，用13μl水重悬，取11μl纯化后cDNA于新的孔板准备文库构建，另取1μl用Qubit3.0荧光剂测定浓度，确认文库构建转座酶使用量。

(8)测序文库构建

使用诺唯赞公司TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina建库试剂盒，按照说明书方法进行操作，文库构建步骤如下：

1、室温解冻5×TTBL，上下颠倒混匀后备用。确认5×TS是否处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀。如有沉淀，37℃加热并涡旋振荡充分混匀，沉淀即可溶解。

2、96孔板中每孔加入如下体系：5×TTBL 4μl；DNA 11μl；TTE Mix 5μl；加ddH₂O至20μl。

3、使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。

4、将反应管置于PCR仪中，运行如下反应程序：105℃热盖；55℃ 10min；10℃维持保存。

5、反应完成后立即向产物中加入5μl 5×TS，使用移液器轻轻吹打充分混匀，置于室温放置5min。

6、PCR富集，孔板中每孔加入如下体系：

文库扩增P5序列如下：

5’-[phos]AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACnnnnnnnnnnACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’，n表示A/T/C/G中的任一种，为随机合成的细胞标签3。

I7 index引物为TruePrep Index Kit V3 for Illumina(TD203-01)中24种文库i7扩增引物，用来在测序时平衡文库信号组合。

使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应板置于PCR仪中，运行如下反应程序：105℃热盖；72℃ 3min；98℃ 30sec；98℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸3min，共6个循环；72℃延伸5min；4℃维持保存。

7、反应结束后，每孔加入0.8X VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化磁珠(40μl)，室温孵育8分钟，置于磁力架上吸弃上清，用200μl 80％乙醇洗beads两次，每次静置30S。室温干燥3-5分钟。用20μl双蒸水洗脱，每孔取18μl洗脱产物置于新的孔板，进行第二轮扩增。

反应体系如下：

第一轮扩增洗脱产物 18μl；

2100Mix引物 2μl；

KAPA HiFi HotStart ReadyMix 20μl

2100Mix引物(10μM)工作液序列和配制方法如下如下：

将2100-p5引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’(100μM)与2100-p7引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’(100μM)等量混合配成10μM混合液

使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应板置于PCR仪中，运行如下反应程序：105℃热盖；72℃ 5min；98℃ 30sec；98℃变性10sec，66℃退火30sec，72℃延伸1min，共8个循环；72℃延伸5min；4℃维持保存。

反应完成后，加入两轮磁珠分选纯化300-500bp文库片段，分选纯化步骤如下：

每孔加入第一轮VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化磁珠，加入量为0.5X(20μl)，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心转移上清至新的灭菌96孔板中，丢弃磁珠。

每孔加入第一轮VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化磁珠，加入量为0.5X(20μl)，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。保持反应管始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30sec，小心移除上清，重复洗一次共洗两次。保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠约5min。将反应管从磁力架上取出，加入15μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中，-20℃保存。使用Qubit 3.0荧光剂测定文库浓度，用Qseq100进行长度分布检测。测序文库使用Illumina HiSeq X ten测序平台PE150测序模式，返回原始fastq数据进行根据三段寡核苷酸序列筛分，根据随机序列位置提取细胞标签，比对Read2到人和小鼠参考基因组得到基因表达谱，进一步分析其中不同物种细胞单个细胞内检测到的转录本数量与单个细胞内污染交叉物种细胞转录本的情况，结果如图3所示，可知两种细胞基因表达情况平均转录本接近3000，物种间转录组交叉污染率约为3％，说明该方法的细胞交叉污染率低，检测转录本数量和灵敏度高。

实施例4

带寡核苷酸细胞标签序列的转座酶及工作液浓度配制和保存：

(1)384种转座酶包埋接头序列保存液配制1.4μM工作液浓度保存于-80度冰箱。其序列和配制方法如下：

Tn5 primerA：5'-[pho]CTGTCTCTTATACACATCT-3'，[pho]代表磷酸化修饰。该序列为转座酶包埋识别固定序列。

Tn5 primerB：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTnnnnnnnnnnAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，n表示A/T/C/G中的任一种，10n为随机合成的细胞标签1，有384种组合。

Tn5 primerC：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’。该序列为文库i7接头序列。

将Tn5 primerA(50μM)，Tn5 primerB(25μM)，Tn5 primerC(25μM)混合，置于PCR仪中95度2分钟并以0.1度/秒降温速度降至25度，用无酶水稀释成1.4μM工作液。

(2)2μg/μl Tn5裸酶(诺维赞)稀释至53.4ng/μl，与1.4μM酶切反应寡核苷酸序列工作液在30℃孵育1h后于-20℃冰箱保存。

染色质可及性测序标记方案反应液、洗液配置(X表示浓度倍数，1X为一倍浓度)：

(1)洗液：10mM Tris-HCl pH7.4+10mM NaCl+3mM MgCl₂+0.1％Tween-20+1％BSA+双蒸水

(2)取核裂解液：洗液1+0.1％IGEPAL CA-630+0.01％洋地黄皂苷

(3)2X酶切反应液：20mM Tris-HCl pH7.6+10mM MgCl₂+20％二甲基甲酰胺+双蒸水

(4)2X酶切反应中止液：25ml 40mM EDTA+3.9μl 6.4M亚精胺

(5)1X杂交液：50mM Tris-HCl+10mM MgCl₂+10mM DTT+0.1％Tween20+1％BSA+双蒸水

染色质可及性测序标记方案细胞核提取与固定操作步骤：

取液氮磨碎的组织粉末或单细胞悬液离心后沉淀，用1ml取核裂解液重悬，轻轻吹匀5-10次，冰上裂解3-5min，随后加入5ml洗液终止反应，过40μm细胞筛，500g/5min离心(同后续离心)。在不扰动沉淀前提下加入1ml洗液，再次离心，弃上清。加入5ml 1X PBS溶液，随后加入140μl 37％甲醛溶液，轻轻吹匀5次，室温10min固定细胞，期间吹打2次。固定后加入250μl 2.5M甘氨酸水溶液进行终止，吹打数次，室温5min后置于冰上15min彻底终止固定。固定后离心，弃上清，加入1ml洗液重悬沉淀，并用40μm滤网再次过滤去除团块，之后计数。取目标数量细胞核，离心，沉淀可用于后续酶切反应。

实施例5

物种混合(人293T细胞系和鼠3T3细胞系)细胞实验(染色质可及性测序)

按照图2的流程，将消化下来的两种细胞系裂解细胞膜得到细胞核进行固定，取固定后细胞核数量1∶1的人293T细胞核与鼠3T3细胞核(各约10万)，用酶切体系重悬后平均加入96孔板中。

(1)Tn5酶切反应

酶切体系/每孔：

细胞核在酶切体系内被分到孔内后，用排枪吸取1.5μl带反应寡核苷酸序列的转座酶工作液到孔板内，并轻轻吹匀5次，置于55℃的PCR仪中反应半小时；

反应完成后取出96孔板/384孔板，用排枪每孔加入25μl 2X酶切反应中止液，轻轻吹匀，置于37℃烘箱反应15min

(2)细胞聚合-分散杂交反应

酶切反应完成后将96孔板置于冰上2min，收集细胞到EP管中，500g/5min离心，用杂交液重选细胞按每孔8μl细胞的体积重新加到新的96孔板中。

杂交体系/每孔：8μl细胞(杂交液重悬)；2μl杂交工作液(25μM X 384种)。

其序列和配制方式与实施例1中相同。

每孔体系共10μl，置于旋转混匀仪进行37℃恒温杂交反应，时长1.5小时。杂交反应完成后，取出96孔板/384孔板，准备加入封闭工作液。

(3)封闭反应

每孔封闭反应体系：10μl杂交后的细胞悬液；1μl封闭工作液(55μM)。

其序列与实施例1中相同。

置于旋转混匀仪进行37℃恒温杂交反应，时长0.5小时。

(4)封闭反应完成后，细胞收集到15ml离心管中，500g/5min离心，弃上清，并用洗液重复离心洗细胞1-2次，过40μm细胞滤网，再用40μl洗液重悬。

(5)磷酸化反应

配置磷酸化反应体系：

60μl磷酸化反应体系加入40μl细胞悬液，混匀后置于旋转混匀仪进行37℃恒温磷酸化反应，时长0.5小时。

(6)磷酸化反应后加入1ml洗液，500g/5min离心，弃上清，用1ml洗液重悬，过40μm细胞滤网，随后细胞计数重新平均分到新的96孔板中，每孔8μl。

(7)缺口修复反应

配置缺口修复反应体系：

混匀后，用排枪按每孔2μl加入上述96孔板，置于37℃进行缺口修复反应1小时

(8)解交联、释放酶切片段，纯化产物

每孔裂解反应体系：

混匀离心，置于55℃PCR仪内反应1小时。

反应完成后，每孔加入18μl VAHTS DNA Clean Beads(诺维赞)纯化磁珠，室温孵育8min，置于磁力架吸弃上清，用200μl 80％乙醇溶液洗磁珠2次，每次静置30秒。室温干燥3-5min，加入11μl水重悬，每孔取出10μl重选产物于新的96孔板。

(9)测序文库扩增

PCR反应体系/每孔：

文库扩增P5-S序列，i7 index引物与实施例3中相同。

混匀离心，将96孔板置于PCR仪，运行如下程序：

105℃热盖；72℃ 5min；98℃ 30sec；98℃变性10sec，66℃退火30sec，72℃延伸1min，共12个循环；72℃延伸5min；4℃维持保存。

反应完成后，将所有产物收集到若干EP管，先用移液器量取其总体积(A)，随后加入两轮磁珠分选纯化200-700bp文库片段：

每孔加入第一轮VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化磁珠，加入量为0.5A，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心转移上清至新的EP管中，丢弃磁珠。

每孔加入第二轮VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化磁珠，加入量为A，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。保持反应管始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30sec，小心移除上清，重复洗一次共洗两次。保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠约5min。将反应管从磁力架上取出，加入15μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中，-20℃保存。使用Qubit 3.0荧光剂测定文库浓度，可取1μl文库使用Agilent 2100Bioanalyzer进行长度分布检测。

测序文库使用HiSeq X ten测序平台，PE150测序模式，返回原始fastq数据进行筛分，同实施例3根据随机碱基位置提取单细胞标签，裁剪文库接头序列，将剩余read1及read2插入片段比对至人和小鼠参考基因组，得到单个细胞内物种DNA比对reads在物种交叉污染率，结果如图4所示，物种间基因组reads交叉污染率约为3％，说明该方法检测基因组染色质开放程度的单细胞物种交叉污染比例较低，且检测reads数平均值约为30000，检测灵敏度高。通过将人和鼠的细胞的reads做转录起始位点(TSS)富集分析，如图5所示，说明检测到的片段在转录开放起始区域富集程度很高。富集到的片段长度分布如图6所示，说明在100bp以下的开放区域显著富集DNA片段，随着跨多个核小体长度片段长度增加，片段富集程度降低。进一步通过与数据库群体水平293T细胞的染色质开放数据进行比较，如图7所示，该方法(左侧)与数据库群体水平的片段峰重合程度高，且有更多特异检测到片段峰，说明该方法的灵敏度在单细胞水平较高且检测到的开放片段与数据库群体检测水平数据重合程度高。在染色体分辨率上将该方法检测到的开放区域峰与数据库群体水平293T细胞的染色质开放数据进行覆盖度比较，如图8所示，在人8号染色体上，该方法检测的单细胞水平数据与群体水平数据峰值覆盖水平高度一致，说明该方法检测的染色质开放信息稳定可靠。

实施例6

取成体蝾螈5只，取其18主要组织(心脏，肝脏，肾脏，大脑，眼睛，前肢，后肢，皮肤，尾巴，肠，泄殖腔，胃，外鳃，肺，胰腺，肾上腺，膀胱，性腺)进行酶消化获得单细胞悬液，投入500万单细胞，其余步骤同实施例3操作，经过实验操作离心耗损，最后回收得到约200万细胞用于文库构建。文库送Illumina Hiseq X ten平台进行质量检测与测序，使用PE150测序策略，返回原始数据进行筛分比对得到基因表达谱，使用R分析基因表达与亚群得到数据质控与细胞所属亚群可视化t-SNE，根据实际测序深度过滤得到高质量数据细胞，筛选得到前80万单细胞数据。单细胞水平分群如图9所示，说明该方法对大规模高通量单细胞转录组有较高的灵敏度和细胞亚型高分辨能力。

实施例7

取成体蝾螈，取其16主要组织(心脏，肝脏，肾脏，大脑，眼睛，前肢，后肢，皮肤，尾巴，肠，泄殖腔，胃，外鳃，肺，膀胱，性腺)进行裂解液消化获得单细胞核悬液，投入100万单细胞核，其余步骤同实施例5操作，经过实验操作离心耗损，最后回收得到约50万细胞用于文库构建。文库送Illumina Hiseq X ten平台进行质量检测与测序，使用PE100测序策略，返回原始数据进行筛分比对得到基因组开放性区域富集图谱，使用R分析开放基因组与亚群得到数据质控与细胞所属亚群可视化t-SNE，根据实际测序深度过滤得到高质量数据细胞，筛选得到前10万单细胞核数据。单细胞水平分群如图10所示，说明该方法对大规模高通量单细胞染色质开放程度有较高的灵敏度和细胞亚型高分辨能力。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种基于寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞测序方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(41)

<223> n is a, t, c or g.

<220>

<221> misc_feature

<222> (64)..(64)

<223> v is a, c or g.

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(65)

<223> n is a, t, c or g.

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtnnnnnnn nnnnnnnnnn nttttttttt tttttttttt 60

tttvn 65

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(33)

<223> n is a, t, c or g.

<400> 2

actctgcgtt gataccactg cttnnnnnnn nnnagatcgg aagagcgtcg tgtagggaaa 60

gagtgt 66

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(39)

<223> n is a, t, c or g.

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnnnna cactctttcc ctacacgacg 60

ctcttccgat ct 72

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatgatacgg cgaccaccga ga 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caagcagaag acggcatacg ag 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctgtctctta tacacatct 19

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(33)

<223> n is a, t, c or g.

<400> 9

aagcagtggt atcaacgcag agtnnnnnnn nnnagatgtg tataagagac ag 52

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

Claims (7)

1.一种基于寡核苷酸链杂交标记的高通量单细胞测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对细胞进行固定处理，或者先从细胞中提取细胞核，再对细胞核进行固定处理；

（2）将固定后的细胞或细胞核均匀分装到多孔板中，对于细胞在每个孔中加入一种反转录寡核苷酸序列并进行反转录；对于细胞核在每个孔中加入一种带寡核苷酸细胞标签序列的转座酶包埋复合物进行转座反应，

其中，每孔加入的一种反转录寡核苷酸序列带有：

杂交序列1；

分子标签，用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA；

各孔间序列不同的细胞标签1；

多聚T尾，用于与细胞中带有poly-A序列的mRNA互补配对；

每孔加入的一种带寡核苷酸细胞标签序列的转座酶包埋复合物中寡核苷酸细胞标签序列带有：

杂交序列1；

各孔间序列不同的细胞标签1；

包埋固定序列，用于与Tn5转座酶结合，所述包埋固定序列为双链结构，其中一条链与细胞标签1连接；

带寡核苷酸细胞标签序列的转座酶包埋复合物中一个转座酶复合物携带两个基因片段，两个基因片段均为所述寡核苷酸细胞标签序列，或者一个基因片段为所述寡核苷酸细胞标签序列，另一个基因片段为通用型序列，通用型序列包括：

文库扩增接头2，作为文库扩增时的引物结合区域，

包埋固定序列，用于与Tn5转座酶结合，所述包埋固定序列为双链结构，其中至少一条链与文库扩增接头2连接；

（3）将步骤（2）反转录后的细胞或者转座反应后的细胞核收集混合，然后再次均匀分装到多孔板中，并在每个孔中加入一种杂交寡核苷酸序列进行杂交，其中，每孔加入的一种杂交寡核苷酸序列带有：

杂交序列2，与杂交序列1为互补序列，用于与杂交序列1进行互补杂交；

各孔间序列不同的细胞标签2；

文库扩增接头1，用于作为文库扩增时引物结合的序列；

（4）杂交后，再向每孔中加入封闭寡核苷酸序列进行封闭，封闭寡核苷酸序列与杂交寡核苷酸序列中的杂交序列2为互补序列，对未与杂交序列1互补杂交的多余游离杂交序列2进行封闭；

（5）将步骤（4）封闭后的细胞或细胞核收集混合，然后再次均匀分装到多孔板中，并合成完整DNA双链，合成完整DNA双链时一步聚合连接所有缺口和双链，随后进行细胞或细胞核的解交联及裂解；

其中，对于反转录结果，缺口在第二链cDNA合成时由合成二链的cDNA聚合酶及连接酶补齐；对于转座酶反应结果，缺口由合成完整DNA双链的聚合酶及连接酶补齐；

（6）然后在每个孔中加入文库扩增引物对进行文库扩增构建测序文库，所述文库扩增引物对包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物上分别带有用来结合测序仪芯片上测序引物进行测序的文库两侧接头，

其中，上游引物或下游引物的其中一条上带有：

各孔间序列不同的细胞标签3；

通过细胞标签1、细胞标签2和细胞标签3标识测序文库中每条序列的细胞来源，

所述细胞标签1、细胞标签2和细胞标签3均包括序列为随机合成的特异性片段，且每一种特异性片段分别存放，用于在使用时实现各孔间序列不同，

步骤（2）、步骤（3）和步骤（5）分装到多孔板中时，所分孔的数量均不少于96孔。

2.根据权利要求1所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，步骤（3）中，杂交寡核苷酸序列使用与文库扩增接头1序列互补配对的杂交互补退火序列进行封闭保护。

3.根据权利要求1所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述分子标签包括序列为随机合成的特异性片段，且不同序列之间混合存放。

4.根据权利要求3所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，反转录寡核苷酸序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTNNNNNNNNnnnnnnnnnnTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，N表示A/T/C/G中的任一种，8N序列为随机合成的分子标签；n表示A/T/C/G中的任一种，10n序列为随机合成的细胞标签1；3’端V表示A/C/G中的任一种，V为随机合成；

杂交寡核苷酸序列为：5’-ACTCTGCGTTGATACCACTGCTTnnnnnnnnnnAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’，n表示A/T/C/G中的任一种，10n序列为随机合成的细胞标签2。

5.根据权利要求1所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，步骤（2）中分装到多孔板中时，所分孔的数量均不少于384孔；步骤（3）分装到多孔板中时，所分孔的数量均不少于768孔；步骤（5）分装到多孔板中时，所分孔的数量均不少于96孔。

6.根据权利要求1所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，步骤（1）中，待测序的细胞中含有2种或2种以上的细胞。

7.根据权利要求1所述的高通量单细胞测序方法，其特征在于，寡核苷酸细胞标签序列中一条链为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTnnnnnnnnnnAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，n表示A/T/C/G中的任一种，10n序列为随机合成的细胞标签1；另一条链为单独的包埋固定序列；

通用型序列为中一条链为5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；另一条链为单独的包埋固定序列；

其中，单独的包埋固定序列为：5'-[pho]CTGTCTCTTATACACATCT-3'，[pho]代表磷酸化修饰。

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