CN110241178B - 一种单细胞转录组测序高通量快速文库制备方法及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种寡核苷酸、单细胞转录组文库制备方法。本发明所述寡核苷酸，5’端至3’端依次为单端接头序列、细胞标签序列、poly(T)、随机N序列，可以并行检测近百个单细胞中polyA(+)和polyA(‑)RNAs。本发明所述单细胞转录组文库制备方法以所述寡核苷酸作为反转录引物合成cDNA；纯化后产物3’端加ployA后合成dsDNA，PCR扩增后通过单端包埋转座酶复合体一步法文库构建后上机测序。本发明提供一种从多个单细胞中制备全转录组cDNA文库的方法，采用未纯化产物直接一步法建库，操作简便更适用于高通量单细胞转录组检测需求。

Description

一种单细胞转录组测序高通量快速文库制备方法及检测试 剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单细胞转录组高通量快速文库制备方法及试剂盒，适用于全转录组文库构建。

背景技术

转录组是指在某一特定阶段由细胞转录出来的全部RNA，包括mRNA和非编码RNA，其中部分非编码RNA没有poly(A)尾，比如长非编码核糖核酸(1ong-noncoding RNA，lncRNA)，环形核糖核酸(circular RNA)等，它们对细胞基因表达存在重要的调控作用。

近几年单细胞转录组测序技术发展迅速，目前高通量单细胞转录组测序技术仅可检测含有poly(A)尾的mRNA，未见有同时检测mRNA和不含poly(A)尾非编码RNA的技术方法。并且现有高通量单细胞mRNA检测技术方法存在以下局限：1)现有模板置换的PCR扩增法和IVT(In Vitro Transcription)线性扩增方法，存在模板置换效率低、线性扩增效率低的问题，都不符合较低丰度非编码RNA的检测需求；2)已有技术方法因反转录引物oligod(T)上含有细胞标签信息，目前仅用于mRNA转录本3’端表达分析。

文库制备是单细胞转录组测序技术流程的关键部分，不同于传统的超声、酶切片段化文库构建方法，使用转座酶的建库方法可以在打断的同时在片段化DNA两端加上接头，将繁琐的DNA片段化、末端修复和连接反应等步骤变为了一步简单的酶促反应，这种方法极大的减少了起始模板量和样品处理时间。尽管如此，在转座酶建库前需要对扩增产物进行纯化，此操作增加了高通量检测流程的复杂度和产物间污染的风险。

发明内容

有鉴于此，针对以上问题本发明提供一种高效、简便的单细胞转录组高通量快速文库制备方法及检测试剂盒。基于3’加polyA结合单端转座酶建库技术原理，通过特殊寡核苷酸引物组合设计，可同时检测mRNA和非编码RNA，包括不含poly(A)尾非编码RNA，并且检测不限于转录本3’端。本发明中采用未纯化扩增产物，进行一步法单端转座酶建库，解决了高通量文库构建方法复杂、兼容性差等问题，符合单细胞转录组测序技术高通量发展技术需求。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种寡核苷酸，所述寡核苷酸的5’端至3’端依次为单端接头序列、细胞标签序列、poly(T)、随机N序列。

作为优选，单端接头序列可为P5端或P7端。在一些具体实施方案中，所述单端接头序列为P5接头序列，其具体序列为tcgtcggcagcgtcagatgt。

作为优选，所述poly(T)由4-30个T碱基组成。在一些具体实施方案中，所述poly(T)由24个T碱基组成。

作为优选，所述随机N由4-20个随机碱基组成。在一些具体实施方案中，所述随机N优选由6-9个随机碱基组成。

作为优选，所述细胞标签序列由5-20个可标识细胞的特定碱基序列组成。在一些具体实施方案中，所述细胞标签序列由6个可标识细胞的特定碱基序列组成。

本发明还提供了一种单细胞转录组文库制备方法，包括如下步骤：

1)分离单细胞、裂解，以上述寡核苷酸作为反转录引物，反转录合成cDNA；

2)将各单细胞的cDNA产物全部混合后进行纯化，纯化产物3’端加ploy(A)后合成dsDNA；

3)dsDNA进行PCR扩增；

4)dsDNA扩增产物与单端转座酶复合体、P5和P7测序引物组混合，采用一步法文库构建，纯化后上机测序。

在一些实施方案中，步骤2)所述cDNA产物纯化前还包括去除游离引物的步骤。在一些实施例中，所述去除游离引物的步骤具体为加入ExoSAP-IT，37℃反应30min，消化未反应的引物。

在一些实施方案中，步骤2)所述cDNA 3’端加ploy(A)反应加入dATP，dATP加入终浓度范围为0.1μM-0.5μM，最适终浓度为0.3μM。

在一些实施方案中，步骤3)所述PCR扩增的反应程序为95℃3min；95℃30sec，67℃1min，72℃6min，10-30个循环。

进一步的，本发明所述单细胞转录组文库制备方法使用未纯化扩增产物进行建库反应。

进一步的，本发明所述单细胞转录组文库制备方法使用单端包埋转座酶复合体建库。

在一些实施方案中，所述单端包埋转座酶复合体建库具体为：未纯化dsDNA扩增产物与单端包埋转座酶复合体、P5和P7测序引物组孵育，以实现随机片段化、插入接头序列、缺口补平延伸、文库扩增一步法文库构建。

所述单端包埋转座酶复合体包括转座酶和退火接头序列，其中所述退火接头序列与上述寡核苷酸中的单端接头序列分别属于不同测序接头端。如所述寡核苷酸中的单端接头序列为P5端，则所述单端包埋转座酶复合体中的退火接头序列为P7端。在一些具体实施例中，退火接头序列为：5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3’。

在一些具体实施方案中，所述P5和P7测序引物组中，P7端上游引物序列为：5’-caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxxxgtctcgtgggctcgg-3’，其中xxxxxxxx为index序列；P5端下游引物序列为：5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccga-3’。

在一些实施方案中，所述一步法扩增的反应程序为55℃，10min；72℃3min，98℃2min；98℃15s，60℃30s，72℃1min，5-15cycles；72℃5min。

作为优选，所述一步法扩增反应的反应体系还包括片段化buffer、PCR MasterMix。

本发明还提供了一种单细胞转录组检测试剂盒，包括上述的寡核苷酸。

本发明的有益效果：

1)本发明提供一种寡核苷酸，寡核苷酸中的随机序列可以结合mRNA转录本的多个位置，提高cDNA产物的覆盖度，解决现有技术方法仅可检测mRNA转录组本3’端的技术缺陷。

2)针对现有高通量单细胞转录组测序技术中存在的无法对转录组中不带poly(A)尾的RNA进行测序，本发明提供一种单细胞转录组高通量文库制备方法，可以同时检测近百个单细胞中的mRNA和非编码RNA，包括不含ploy(A)尾的lncRNA和circRNA。

3)本发明单细胞转录组高通量文库制备方法，基于cDNA产物3’加ploy(A)的PCR扩增方法，逆转录效率及扩增效率均高于现有模板置换的PCR扩增法和IVT(In VitroTranscription)线性扩增方法，更适用于较低丰度非编码RNA检测。

4)本发明单细胞转录组高通量文库制备方法，直接使用单细胞转录组产物建库，无需纯化，并且转座酶片段化、片段化产物PCR富集两个反应步骤在单管中一步完成，避免了单细胞间产物污染，更利于高通量、简单快速文库制备。

5)使用本发明转录组高通量文库制备方法，测序结果质控与mcSCRB-seq(Johannes et al.,2018)报道质控结果相比较：其中外显子区域mapping率高出17.47％，内含子区域mapping率二者接近，基因间区域mapping率本发明降低12.72％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示单细胞转录组文库质控结果图；

图2示单细胞测序数据Reads mapping率图；

图3示单细胞测序数据Exonic区mapping率图；

图4示单细胞测序数据Intronic区mapping图；

图5示单细胞测序数据Intergenic区mapping图；

图6示单细胞转录组数据中lncRNA检测结果图；

图7示单细胞转录组数据中circRNA检测结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种单细胞转录组文库制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在具体实施方案中，本发明所述单细胞转录组文库制备方法包括如下步骤：

1、单细胞分离及裂解

培养细胞及临床样本来源细胞，梯度稀释后在显微镜下，采用口吸管分离单细胞至含有细胞裂解液的低吸附孔板中。

2、单细胞转录组扩增

以本发明所述寡核苷酸作为反转录引物，反转录合成第一链cDNA链，然后含有细胞标签的反转录cDNA产物全部混合后进行磁珠纯化，纯化产物经3’端加ployA后合成第二链dsDNA，dsDNA产物直接进行PCR扩增。

3、单细胞转录组扩增产物文库构建

取单细胞转录组扩增产物使用单端包埋(P7端)转座酶进行单管一步法文库构建，文库产物进行磁珠纯化。

4、文库定量质控

采用Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析仪通过微流体技术对文库进行质控，单细胞转录组测序的文库片段分布在250-1000bp范围内，主带在350-400bp之间，且无100bp以下小片段污染为质控合格。

5、文库混合及测序

将文库质控合格的样本按照Qubit测定的浓度等物质的量混合，混合文库须标签不同，文库浓度相差不超过2个数量级使用Illumina X10测序平台测序，测序策略为PE150bp。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，选择人肺癌A549细胞为实验材料，使用晶芯^TM单细胞转录组测序试剂盒进行转录组扩增，所用到的试剂及材料均由该试剂盒提供，包括单细胞裂解、反转录、3’加polyA、PCR扩增。单端包埋转座酶试剂购自Vazyme公司，其余为商品化试剂。

实施例1、

(1)单细胞裂解液配制

按照以下表1配制单细胞裂解液，吹吸混匀后3000rpm离心瞬甩，冰上分装1.0μL至低吸附96孔PCR板中。

表1单细胞裂解液

试剂组分	体积
		Lysis buffer Mix	90.24μL
Enzyme mix	5.76μL
		总体积	96.00μL

(2)单细胞挑取及裂解

取新鲜培养的A549细胞，在常温下离心收集，弃培养液加PBS重悬，在倒置显微镜下使用口吸管进行单细胞的选取分离，并将分离得到的单细胞加入到步骤(1)96孔板中，冰上操作。离心瞬甩收集液体至管底，可继续操作或冻存于-80℃保存1个月。

(3)加入反转录引物

在步骤(2)96孔板中加入细胞1-细胞96反转录引物0.5μL，引物序列中5’端至3’端依次为转座酶P5端接头序列、细胞标签、poly(T)、随机N序列。离心瞬甩后70℃反应90s,迅速置于冰上。引物序列如下表2。

表2引物序列

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(4)反转录合成cDNA

按照下表3冰上配制反转录酶Mix，冰上分装0.5μL至步骤(2)96孔PCR板中。3000rpm离心瞬甩后，42℃反应60min，70℃反应灭活15min后置于冰上。

表3反转录酶Mix

试剂组分	体积
		TIANSeq M-MLV	33.60μL
RNase Inhibitor	6.72μL
		T4 gene32 protein	7.68μL
总体积	48.00μL

(5)去除游离引物

在步骤(4)96孔PCR板中加入1.0μL ExoSAP-IT，37℃反应30min，80℃反应灭活15min后置于冰上。

(6)cDNA产物纯化

取步骤(5)中各孔反应产物至新的低吸附1.5mL离心管中，加入等体积Ampure XPbeads纯化，取6.0μL纯化产物移至低吸附0.2mL离心管中。

(7)3’加polyA

在低吸附0.2mL离心管中依次加入下表4试剂，3000rpm离心瞬甩后，37℃反应15min，70℃反应灭活15min后置于冰上。

表4加polyA反应试剂

试剂组分	体积
		Tt Buffer Mix	4.50μL
Tt Enzyme Mix	0.50μL
		总体积	6.00μL

(8)合成dsDNA

在步骤(7)0.2mL离心管中依次加入下表5试剂，3000rpm离心瞬甩后，95℃反应3min，50℃反应2min，72℃反应10min。

表5第二链反应试剂

(9)PCR扩增

在步骤(8)0.2mL离心管中加入2.0μL PCR primer，混匀后3000rpm离心瞬甩。在PCR仪上按照表6程序进行反应。

表6 PCR程序

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(10)文库构建

取步骤(9)PCR产物5.0μL至0.2mL离心管中，使用一步法进行文库构建，参照以下表7加入试剂。混匀后1000rpm离心瞬甩后，在PCR仪上反应程序为：55℃，10min；72℃3min，98℃2min；98℃15s，60℃30s，72℃1min，12cycles；72℃5min；12℃forever。

表7文库构建试剂

试剂组分	体积
		PCR产物	5.00μL
5×Tagment Buffer	4.00μL
		TTE Mix	1.00μL
2×PCR Master Mix	5.00μL
		测序引物组P7上游引物	2.50μL
测序引物组P5下游引物	2.50μL
		总体积	20.00μL

(11)文库质控

使用等体积Ampure XP beads纯化，经80％乙醇清洗磁珠，使用Nuclease-freewater洗脱。经Qubit定量后，稀释至1ng/μL采用Agilent 2100Bioanalyzer生物分析仪对文库进行质控，结果见图1。

图1结果显示产物片段分布在250-1000bp范围内，主带在350-400bp之间，且无100bp以下小片段污染为质控合格。

(12)上机测序

采用Illumina X10测序平台测序，测序策略为PE150bp。

(13)数据质控

1)96个单细胞测序数据Mapping率分布曲线如下图2，96个细胞建库成功率为100％，且各个单细胞细胞测序数据mapping率分布较均一。

2)96个单细胞测序数据QC质控数据见图3-图5，各单细胞Exonic mapping rate中位值为73.40％(67.47％-78.07％)，intronic mapping rate中位值为12.78％(8.89％-18.00％)，intergenic mapping rate中位值为13.67％(10.75％-18.28％)。

3)96个单细胞转录组数据中lncRNA、circRNA检测结果见图6、图7，各单细胞lncRNA检测数量中位值为240个(97个-479个)，circRNA检测数量中位值为2个(0个-9个)，已有研究表明单细胞circRNA表达呈现高度异质性。

Claims (6)

1.一种单细胞转录组测序高通量快速文库制备方法，包括如下步骤：

1)分离单细胞、裂解，以寡核苷酸作为反转录引物，反转录合成cDNA；所述寡核苷酸的5’端至3’端依次为单端接头序列、细胞标签序列、polyT、随机N序列；所述单端接头序列为P5端或P7端；所述细胞标签序列由4-15个可标识细胞的特定碱基序列组成；所述polyT由4-30个T碱基组成；所述随机N由4-20个随机碱基组成；

2)将各单细胞的cDNA产物全部混合后进行纯化，纯化产物3’端加polyA后合成dsDNA；

3)dsDNA进行PCR扩增；

4)dsDNA扩增产物与单端包埋转座酶复合体、P5和P7测序引物组混合，采用一步法文库构建，纯化后上机测序。

2.根据权利要求1所述的文库制备方法，步骤2)中cDNA产物3’端加polyA反应加入dATP，dATP加入终浓度范围为0.1μM-0.5μM。

3.根据权利要求1所述的文库制备方法，步骤3)所述PCR扩增的反应程序为95℃3min；95℃30sec，67℃1min，72℃6min，10-30个循环。

4.根据权利要求1所述的文库制备方法，步骤4)所述单端包埋转座酶复合体包括转座酶和退火接头序列，所述退火接头序列与所述寡核苷酸中的单端接头序列分别属于不同测序接头端。

5.根据权利要求1所述的文库制备方法，步骤4)所述一步法文库构建程序为55℃，10min；72℃3min，98℃2min；98℃15s，60℃30s，72℃1min，5-15cycles；72℃5min；12℃。

6.根据权利要求1所述的文库制备方法，步骤4)所述一步法文库构建的反应体系还包括片段化buffer、PCR Master Mix。

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