CN111088250B - 一种mRNA捕获序列、捕获载体的合成方法、高通量单细胞测序文库制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种mRNA捕获序列,包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列,通过引入稀有酶切位点序列,为后续测序接头连接提供了粘性末端,使cDNA双链两端接上两个不同的测序接头。本发明还提供了一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法及一种高通量单细胞测序文库制备方法。本发明提供的捕获载体通过在基底材料上原位合成引入稀有酶切位点序列的mRNA捕获序列,采用本发明提供的捕获载体来进行单细胞测序文库的制备,提高单细胞捕获效率以及寡核苷酸标签的标记效率,简化构建文库的流程,并且制得的cDNA双链两端接上两个不同的测序接头,保证一个哑铃型测序文库只组装一条引物及DNA聚合酶,三者的一一对应是保证单分子实时测序的前提。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种mRNA捕获序列、捕获载体的合成方法、高通量单细胞测序文库制备方法。
背景技术
肿瘤是严重影响人类健康的重大疾病之一,肿瘤细胞从基因型到表型上存在极大的差异(肿瘤的高度异质性),而这种高度异质性与肿瘤的恶性程度、耐药性、复发转移等都密切相关,是造成肿瘤早期诊断困难、临床诊治复杂、耐药复发和预后差的根源之一。全面解析肿瘤异质性是实现肿瘤精准治疗的关键。
近年来新兴的单细胞测序技术为解析肿瘤异质性、鉴别不同功能亚群提供了可能。单细胞测序能够获得每个细胞的基因组变异图谱及转录组表达图谱,通过单个细胞的图谱精确划分克隆归属,实现对异质性克隆群体的全面解析。现有单细胞测序技术主要是单细胞捕获、编码技术与二代测序技术的组合,形成了相对成熟的单细胞转录组测序技术。Peter Van Galen等人在Cell发表文献,通过单细胞转录本与三代测序技术相结合,首次实现对白血病患者肿瘤群体(以基因组变异为金标准)中转录组异质性的解析,发现肿瘤群体存在于表达谱不同的多种谱系中,明确了基因组异质性与转录组异质性相互独立又相互影响的关系,也表明在单细胞转录组水平进一步明确细胞的基因组变异的重要性。
单细胞测序的流程主要包括单细胞捕获、单细胞编码、测序文库制备和上机测序等环节。现有的单细胞测序技术,单细胞捕获通常通过将单细胞与携带有单细胞捕获序列的磁珠同时放入微液滴或微孔中,这样的操作必须保证一个微单元内有且只有一个单细胞和一个编码磁珠,然而现有技术单细胞和磁珠在微单元内的分布遵循泊松分布,能够满足需求的微单元数量小于10%,微单元利用率低,限制了该方法的单细胞处理通量。现有单细胞捕获也可以通过将捕获序列偶联在微孔上,再将单细胞放入微孔内,现有技术通过将预先合成的寡核苷酸序列,通过点样的方式加入目标微孔中,依次接枝偶联。因为每个微孔内的序列都不相同,在进行高通量分析时,需要的寡核苷酸序列库和点样接枝的工作量极为庞大,现有技术难以实现万级以上微孔的修饰工作,因此检测通量受到极大限制。此外,现有的单细胞测序技术通常两端连接同样的测序接头,很难实现在cDNA双链模板两端连接两个不同的测序接头。因此,如何提高单细胞测序技术中单细胞捕获的准确性和通量、如何使cDNA双链模板两端连接两个不同的测序接头为本领域面临的一技术难题。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的一个目的是提供一种mRNA捕获序列,引入稀有酶切位点序列,为后续测序接头连接提供了粘性末端,进而使cDNA双链两端接上两个不同的测序接头,可以保证一个哑铃型测序文库只组装一条引物及DNA聚合酶,三者的一一对应是保证单分子实时测序的前提。
本发明的第一个目的是提供一种mRNA捕获序列,所述mRNA捕获序列为一条寡聚核苷酸,包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列。
优选地,所述mRNA捕获序列的结构为通用引物-稀有酶切位点-细胞标签-随机分子标签-PolyT序列,序列长度为38~180bp;其中,
所述通用引物序列用以引发cDNA双链PCR,实现cDNA链的复制,序列长度3~20bp;
所述稀有酶切位点用以由限制性内切酶特异性识别并剪切,序列长度为10~30bp,所述限制性内切酶包括但不限于AgeI、ApoI、BamHI、BbsI、BclI、BmtI、BsaI、BsiWI、BsrGI、BstEII、BstZ17I、DraIII、EagI、EcoRI、EcoRV、HindIII、KpnI、MfeI、MluI、NcoI、NheI、NotI、NruI、NsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SalI、SbfI、ScaI、SpeI、SphI、SspI、StyI;
所述细胞标签用以编码单细胞,序列长度5~50bp,以使同一细胞来源的mRNA编码相同细胞标签序列,不同细胞来源的mRNA编码不同细胞标签序列;
所述随机分子标签用以编码mRNA,序列长度10~30bp,以使每一条mRNA携带不同的分子标签序列;
PolyT序列由胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的重复序列组成,序列长度10~50bp,用以捕获携带PolyA的mRNA。
本发明的第二个目的是提供一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法,包括以下步骤:
步骤一,选择含有若干微反应单元的基底材料,通过化学修饰方法在所述微反应单元内形成若干用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团;
步骤二,以步骤一所形成用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团为起始点,在每一所述微反应单元内原位合成若干如权利要求1或2所述的mRNA捕获序列,制得用于mRNA捕获的捕获载体。
优选地,所述基底材料包括但不限于微孔阵列、微球、磁珠、凝胶微球、树脂填料。
优选地,所述基底材料为微孔阵列,所述微孔阵列包括1~100万个微孔数量,所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。
优选地,所述微孔结构横截面为圆形,纵截面包括但不限于长方形、正方形、正“T”字形、倒梯形;
和/或,所述微孔底部设有滤膜。
优选地,所述用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团包括但不限于氨基、羟基、巯基、羧基。
优选地,所述的原位化学合成如权利要求1或2所述的mRNA捕获序列的方法,包括但不限于光化学合成法、喷墨打印法。
本发明的第三个目的是提供一种高通量单细胞测序文库制备方法,包括以下步骤:
S1、利用如权利要求3所述的合成方法制得的用于mRNA捕获的捕获载体的微反应单元捕获单细胞;
S2、单细胞进行裂解,释放mRNA,所述微反应单元内的mRNA捕获序列中的PoLYT与mRNA上的PolyA特异性结合,逆转录合成cDNA;
S3、置换缓冲液,加入携带复制引物的微球,进行PCR扩增反应,形成完整的cDNA双链模板,其中,所述复制引物与所述微反应单元内的mRNA捕获序列上的通用引物序列相同;
S4、回收微球并合并,清洗置换缓冲液,在cDNA双链模板末端接第一粘性末端;
S5、清洗并置换缓冲液;
S6、酶切将cDNA双链模板的第二粘性末端暴露;
S7、在S5步骤或本步骤中利用DNA连接酶连接第一测序接头;利用DNA连接酶连接第二测序接头,形成哑铃型测序文库,纯化文库;
S8、测序引物和测序酶与哑铃型测序文库组装;
S9、将组装好的文库填入纳米孔芯片中,并且锚定在纳米孔底部,上机测序。
优选地,所述第一粘性末端与所述第二粘性末端不同,所述第一测序接头与所述第二测序接头不同;所述微球的尺寸1~50微米;所述的PCR过程循环数为1~100。
优选地,所述微球为磁性微球,所述微球的尺寸10~30微米;所述微球的所述的PCR过程循环数为1~10。
优选地,所述第一测序接头、第二测序接头均为发卡型寡聚核苷酸;其中,
所述第一测序接头包括第一互补序列和第三粘性末端序列,所述第三粘性末端序列与cDNA双链模板末端的第一粘性末端互补;
所述第二测序接头包括第二互补序列和第四粘性末端序列,所述第四粘性末端序列与cDNA双链模板末端的第二粘性末端互补;
所述第一测序接头或所述第二测序接头包括测序引物互补序列。
相比现有技术,本发明的有益效果在于:
本发明提出了一种单细胞全长转录组测序文库制备方法,利用长读长三代测序技术,完整的获取单细胞mRNA上携带的转录组信息和基因突变信息,为异质性克隆群体的全面解析提供可靠工具。从单细胞测序文库制备的全流程进行了技术创新。在单细胞捕获与编码方面,本发明提出了一种基于微孔阵列芯片的单细胞捕获及原位编码方法。在一优选方案中,微孔阵列芯片具备不少于10万个的独立微反应单元,并且每个微单元内原位合成了能够编码并引发mRNA逆转录的核苷酸序列,保证了高通量。本发明在现有技术基础上,优化了微孔结构,以提高单细胞捕获效率;改进了编码核苷酸序列组成,引入稀有酶切位点序列,为后续测序接头连接提供了粘性末端。在测序文库制备过程中,引入携带引物的微球,将逆转录的cDNA序列转移至微球上,便于后续反应及纯化;通过酶切暴露粘性末端,结合平末端连接或加尾的方式制造粘性末端,分步的粘性末端形成方式可以实现异质性测序接头的连接,便于测序引物和酶的特异性组装,实现哑铃型测序文库、测序引物、测序酶的一一对应,保证单分子层面的测序。在测序方法方面,采用第三代长读长的单分子实时测序技术,无需对cDNA打断,保留了完整的转录组信息和转录组携带的基因突变信息。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以一些实施例来详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本申请的一部分,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明一实施例中单细胞测序文库制备流程;
图2为本发明另一实施例中单细胞测序文库制备流程;
图3为本发明一实施例中用于单细胞捕获的微孔阵列的结构示意图;
图4为本发明一实施例中微孔结构示意图;
图5为本发明另一实施例中微孔结构示意图;
图6为本发明又一实施例中微孔结构示意图;
图7为本发明再一实施例中微孔结构示意图;
图8为本发明mRNA捕获序列与捕获载体的微反应单元的连接关系示意图;
图9为本发明一实施例中第一测序接头的结构示意图;
图10为本发明一实施例中单细胞测序文库制备工艺流程图。
图中:101、第一微孔;102、第二微孔;103、第三微孔;104、第四微孔;200、滤膜。
具体实施方式
为了可以更充分地理解本文描述的发明,阐述以下实施例。应当理解这些实施例仅用于说明性目的并且不应被理解为以任何方式限制本发明。
实施例1
本发明提供一种mRNA捕获序列,所述mRNA捕获序列为一条寡聚核苷酸,包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列。
进一步地,所述mRNA捕获序列的结构为通用引物-稀有酶切位点-细胞标签-随机分子标签-PolyT序列,即所述mRNA捕获序列由以下顺序的部分组成:通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列,序列长度为38~180bp,优选为57~100bp;其中,
所述通用引物序列用以引发cDNA双链PCR,实现cDNA链的复制,序列长度10~30bp,优选为15~25bp;
所述稀有酶切位点可以由限制性内切酶特异性识别并剪切,所述限制性内切酶包括但不限于Acc65I、AccI、AciI、AclI、AcuI、AflII、AhdI、AluI、AlwNI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AvaI、AvaII、AvrII、BaeGI、BaeI、BamHI、BbsI、BbvI、BciVI、BclI、BcoDI、BfuAI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BpmI、BpuEI、BsaAI、BsaHI、BsaWI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsiEI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmI、BsoBI、Bsp1286I、BspCNI、BspEI、BspHI、BspQI、BsrBI、BsrDI、BsrGI、BsrI、BssHII、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtsCI、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DrdI、EagI、EarI、Eco53kI、EcoNI、EcoO109I、EcoP15I、EcoRI、EcoRV、Esp3I、Fnu4HI、FseI、FspI、HaeIII、HhaI、HincII、HinfI、HinP1I、HpaII、HphI、Hpy166II、HpyAV、HpyCH4IV、HpyCH4V、KpnI、MboI、MluCI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MwoI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、PacI、PaeR7I、PflFI、PflMI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、SacI、SacII、SalI、SapI、SbfI、SfiI、SfoI、SmaI、SpeI、StuI、StyD4I、StyI、SwaI、TaqI-v2、TfiI、TseI、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XhoI、XmaI、XmnI;优选为AgeI、ApoI、BamHI、BbsI、BclI、BmtI、BsaI、BsiWI、BsrGI、BstEII、BstZ17I、DraIII、EagI、EcoRI、EcoRV、HindIII、KpnI、MfeI、MluI、NcoI、NheI、NotI、NruI、NsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SalI、SbfI、ScaI、SpeI、SphI、SspI、StyI;序列长度为10~30bp,优选为5~10bp;
所述细胞标签用以编码单细胞,以使同一细胞来源的mRNA编码相同细胞标签序列,不同细胞来源的mRNA编码不同细胞标签序列;序列长度5~50bp,优选为10~25bp;
所述随机分子标签用以编码mRNA,以使每一条mRNA携带不同的分子标签序列,序列长度10~30bp,优选为12~20bp;
PolyT序列由胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的重复序列组成,用以捕获携带PolyA的mRNA,序列长度10~50bp,优选为15~20bp。
实施例2
如图8所示,本发明还提供了一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法,包括以下步骤:
步骤一,选择含有若干微反应单元的基底材料,通过化学修饰方法在所述微反应单元内形成用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团;
步骤二,以步骤一所形成用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团为起始点,在每一所述微反应单元内原位合成若干如上所述的mRNA捕获序列,制得用于mRNA捕获的捕获载体。
所述基底材料包括但不限于微孔阵列、微球、磁珠、凝胶微球、树脂填料。
所述基底材料为微孔阵列,如图3所示,图中CL1、CL2至CLn等均为所示微孔阵列上的微孔,即微反应单元,所述微孔阵列包括1~100万个微孔数量,微孔数量优选为大于等于10万个;其中,所述微孔阵列上的微孔即为微反应单元。所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。
如图4至图7所示,所述微孔结构横截面为圆形,纵截面包括但不限于长方形、正方形、正“T”字形、倒梯形;和/或,所述微孔底部设有滤膜200。图4中第一微孔101横截面为圆形,纵截面为长方形或正方形;图5中第二微孔101横截面为圆形,纵截面为正“T”字形;图6中第三微孔103横截面为圆形,纵截面为倒梯形;图7中第四微孔横截面为圆形,底部设有滤膜200。
所述微孔结构优选为第二微孔102,横截面为圆形,纵截面为正“T”字形;即所述微孔结构包括两个相连的圆柱形微孔组成,顶部的圆柱形微孔的直径大于底部的圆柱形微孔的直径,捕获单细胞效率高。其中,顶部圆柱形微孔直径为20~100微米,优选为30~60微米;底部圆柱形微孔直径为0.001~10微米,优选为0.1~5微米,深度为10~500微米,优选为20~100微米。
所述用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团包括但不限于氨基、羟基、巯基、羧基。
所述的原位化学合成如上所述的mRNA捕获序列的方法,包括但不限于光化学合成法、喷墨打印法,优选为喷墨打印法。
以下对具体合成步骤进以阐述,应当理解以下具体步骤仅用于说明性目的并且不应被理解为以任何方式限制本发明。
本发明提供的一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法,具体包括以下步骤:
步骤一,双抛硅片经过热氧化、旋涂光刻胶、光刻、深硅刻蚀、热氧化、抛光、清洗微机电加工工艺,制备形成一端直径30微米、深度60微米另一端直径5微米、深度10微米的Janus通孔微阵列,即所述微孔结构横截面为圆形,纵截面为正“T”字形;微孔(微反应单元)数量达10万个。利用食人鱼洗液(硫酸:双氧水=7:3)在70℃处理热氧化的硅片表面1小时,随后用3-氨丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液,在90℃下处理硅片表面1小时,清洗后在热板上100℃热烘2小时,即在若干所述微反应单元内形成若干用以接枝寡聚核苷酸的氨基官能团;
步骤二,利用喷墨打印在步骤一所得到的含有若干用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团的微反应单元内进行核苷酸固相合成。该喷墨打印机可以选择性的将每个微孔所需的反应试剂(包括合成核酸用的碱对及反应用试剂)点入对应微孔中,控制每个微反应单元中合成的mRNA捕获序列的核苷酸序列。
应当理解,mRNA捕获序列的核苷酸序列合成方法采用现有任意核苷酸合成方法。例如,mRNA捕获序列的核苷酸合成步骤如下:
1)将受二甲氧基三甲苯(DMT)保护的核苷亚磷酰胺与微反应单元中氨基官能团发生偶联反应进而被连接于所述微反应单元上,其中,一核苷亚磷酰胺含有如上所述的mRNA捕获序列的一碱基;
2)用三氯乙酸除去附着在所述微反应单元上的二甲氧基三甲苯(DMT),露出氨基官能团;
3)碘氧化将亚磷酸转化为磷酸盐,产生受氰乙基保护的磷酸盐骨架;
4)脱去DMT;
5)按如上述的mRNA捕获序列的对应序列碱基按照步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤4)依次接入所述微反应单元上,循环步骤至mRNA捕获序列合成完毕。
如图8所示,每一个微反应单元里经表面修饰后含有若干用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团,通过该表面官能团与mRNA捕获序列的通用引物P1序列进行偶联,通用引物P1连接在微反应单元中,再依次通过核苷酸合成方法依次接收稀有酶切位点CS1、细胞标签CL、随机分子标签UMI、PolyT序列接,即完成在微反应单元内原位合成mRNA捕获序列。每一个微反应单元中包括若干mRNA捕获序列,同一个微反应单元中的若干mRNA捕获序列的细胞标签序列相同,随机分子标签序列不同,如图8所示,同一个微反应单元中,若干mRNA捕获序列的细胞标签均为CS1,不同mRNA捕获序列的随机分子标签分别为UMI1、UMI2、UMI3等;不同微反应单元中的mRNA捕获序列的细胞标签序列不同,随机分子标签序列不同。保证不同微反应单元中的单细胞释放的mRNA携带不同的细胞标签序列,同一单细胞释放的mRNA携带相同的细胞标签序列。
实施例3
如图1、图2、图10所示,本发明还提供了一种高通量单细胞测序文库制备方法,包括以下步骤:
S1、利用如上所述的合成方法制得的用于mRNA捕获的捕获载体的微反应单元捕获单细胞;
S2、单细胞进行裂解,释放mRNA,所述微反应单元内的mRNA捕获序列中的PoLYT与mRNA上的PolyA特异性结合,逆转录合成cDNA;
S3、置换缓冲液,加入携带复制引物的微球,进行PCR扩增反应,形成完整的cDNA双链模板,其中,所述复制引物与所述微反应单元内的mRNA捕获序列上的通用引物序列相同;
S4、回收微球并合并,清洗置换缓冲液,在cDNA双链模板末端接第一粘性末端;
S5、清洗并置换缓冲液;
S6、酶切将cDNA双链模板的第二粘性末端暴露;
S7、在S5步骤或本步骤中利用DNA连接酶连接第一测序接头;利用DNA连接酶连接第二测序接头,形成哑铃型测序文库,纯化文库;
S8、测序引物和测序酶与哑铃型测序文库组装;
S9、将组装好的文库填入纳米孔芯片中,并且锚定在纳米孔底部,上机测序。
所述第一粘性末端与所述第二粘性末端不同,所述第一测序接头与所述第二测序接头不同;所述微球的尺寸1~50微米;所述的PCR过程循环数为1~100。
所述微球为磁性微球,所述微球的尺寸10~30微米;所述微球的所述的PCR过程循环数为1~10。
PCR(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制。
如图9所示,测序接头,是一条人工合成的寡核苷酸单链,在一定温度下退火互补形成。通常由粘性末端、互补颈和功能单链组成。粘性末端用于与cDNA的粘性末端进行互补连接。互补颈用于诱导退火形成环形结构。功能单链包含测序引物互补序列、酶识别序列或锚定序列。测序引物互补序列的功能是结合测序引物,测序引物互补序列存在于所述第一测序接头、所述第二测序接头二者之一上即可,酶识别序列的功能是特异性结合DNA聚合酶,锚定序列的功能是与修饰在纳米孔底部的序列互补,将哑铃型文库锚定在纳米孔底部。整个序列的长度10~100bp,优选20~80bp。
所述第一测序接头、第二测序接头均为发卡型寡聚核苷酸;其中,
所述第一测序接头包括第一互补序列和第三粘性末端序列,所述第三粘性末端序列与cDNA双链模板末端的第一粘性末端互补;
所述第二测序接头包括第二互补序列和第四粘性末端序列,所述第四粘性末端序列与cDNA双链模板末端的第二粘性末端互补;
所述第一测序接头或所述第二测序接头包括测序引物互补序列。
所述单细胞裂解方式包括但不限于加热裂解、超声裂解、裂解液裂解,优选为裂解液裂解。
回收微球的方式包括但不限于磁场富集、缓冲液反向冲洗富集;优选为磁场富集。
以下以具体实施例阐述本发明提供的一种高通量单细胞测序文库制备方法,应当理解以下具体实施例仅用于说明性目的并且不应被理解为以任何方式限制本发明。
实施例4
高通量单细胞测序文库的制备
1)将组织、血液、体外培养等样本制备成单细胞悬液(浓度105个/mL),取1mL单细胞悬液滴加在微孔阵列(10万孔)上,使悬液自然沉降流经微孔,待悬液完全流过微孔,以将单细胞捕获在微孔内(即微反应单元);
2)加入30微升细胞裂解液(Single Cell-to-CTTM Kit,ThermoFisher)填充微孔,随后将微孔阵列芯片浸入FC-70密封油中,在室温下静置5分钟,取出芯片利用PBS淋洗3次,并滤干芯片;加入30微升逆转录试剂(Single Cell-to-CTTM Kit,ThermoFisher)进行逆转录合成cDNA;
3)随后将芯片浸入FC-70密封油中,25℃处理10分钟,42℃处理60分钟,85℃处理5分钟,然后冷却至室温,取出芯片利用PBS淋洗3次,并滤干芯片;加入携带复制引物的磁性微球和20微升PCR预混液(Gene Expression Master Mix,ThermoFisher),密封后进行热循环,50℃处理2分钟,95℃处理10分钟,60℃处理1分钟,95℃处理10秒,后两步热循环重复10次,最终冷却至室温,形成完整的cDNA双链模板;
5)在磁场下用PBS清洗磁珠3次;
6)加入限制性内切酶NotⅠ和缓冲液(NEBuffer 3.1),37℃反应10分钟,65℃反应20分钟,酶切将cDNA双链模板的第二粘性末端暴露;
7)利用磁场移除磁珠,并向反应管中再加入Rapid DNA Ligation Kit(快速DNA连接盒)(ThermoFisher)和第一测序接头、第二测序接头,室温反应5分钟,随后利用凝胶电泳纯化得到哑铃型测序文库;
8)在缓冲液中加入哑铃型测序文库、DNA聚合酶和测序引物,在室温下组装形成组装体;
9)将组装好的文库填入纳米孔芯片中,并且锚定在纳米孔底部,上机测序。
应当理解,如图2所示,本实施例中采用TDT加尾,即采用末端转移酶加尾(加入加dA尾试剂),在cDNA双链的3’端利用末端脱氧核苷酰转移酶进行同聚物加尾得第一粘性末端。
本实施例中,第一测序接头与第二测序接头同时添加,第一测序接头的第三粘性末端序列与与cDNA双链模板末端的第一粘性末端互补,进而将第一测序接头接入cDNA双链的一端;第二测序接头的第四粘性末端序列与与cDNA双链模板末端的第而粘性末端互补,进而将第二测序接头接入cDNA双链的另一端。应当理解,第一测序接头与第二测序接头可分步添加,即在cDNA双链得到第一粘性末端时,加入第一测序接头;在cDNA双链得到第二粘性末端时,加入第二测序接头,在此不再赘述。
实施例5
高通量单细胞测序文库的制备
1)将组织、血液、体外培养等样本制备成单细胞悬液(浓度106个/mL),取100微升单细胞悬液滴加在微孔阵列(100万孔)上,使悬液自然沉降流经微孔,待悬液完全流过微孔,以将单细胞捕获在微孔内(即微反应单元);
2)利用NEBNext单细胞/超低起始量RNA文库制备试剂盒对细胞进行裂解、mRNA释放、捕获和逆转录,逆转录合成cDNA;
3)取出芯片利用PBS淋洗3次,并滤干芯片;加入修饰引物的磁性微球NEBNext单细胞/超低起始量cDNA合成&扩增模块,密封后进行如下热循环:95℃处理10分钟,60℃处理2分钟,94℃处理30秒,后两步热循环重复20次,最终冷却至室温,形成完整的cDNA双链模板;
4)取出芯片利用磁场富集磁珠,PBS清洗三遍后转移至EP管中。加入预合成寡聚核苷酸序列和NEBNext快速连接模块,在37℃孵育10分钟,在cDNA双链模板末端接入第一粘性末端;
5)在磁场下用PBS离心清洗磁珠3次,向反应管中再加入Rapid DNA Ligation Kit(ThermoFisher)和第一测序接头,室温反应5分钟,在cDNA双链模板一末端接入第一粘性末端;
6)在磁场下用PBS离心清洗磁珠3次,加入限制性内切酶SalⅠ和缓冲液(NEBuffer3.1),37℃反应10分钟,65℃反应20分钟,酶切将cDNA双链模板的第二粘性末端暴露;
7)利用磁场移除磁珠,并向反应管中再加入Rapid DNA Ligation Kit(ThermoFisher)和第二测序接头,室温反应5分钟,随后利用凝胶电泳纯化得到哑铃型测序文库;
8)在缓冲液中加入哑铃型测序文库、DNA聚合酶和测序引物,在室温下组装形成组装体;
9)将组装好的文库填入纳米孔芯片中,并且锚定在纳米孔底部,上机测序。
本实施例中,如图1所示,采用平末端连接,合成两段寡核苷酸单链,可以互补形成平端和粘性末端,利用DNA连接酶,将cDNA双链的平末端和合成寡核苷酸互补链的平末端连接,使cDNA形成可以进行后续接头连接的第一粘性末端。
本实施例中,第一测序接头与第二测序接头分步添加,即在cDNA双链得到第一粘性末端时,加入第一测序接头;在cDNA双链得到第二粘性末端时,加入第二测序接头。应当理解,第一测序接头与第二测序接头可同时添加,在cDNA双链两端形成第一粘性末端与第二粘性末端后进行,在此不再赘述。
应当理解,在上述实施例中采用“第一”、“第二”、“第三”等描述,仅仅为便于描述各相同或相近似结构或物质而进行名称上的区别,并不做任何先后、大小、出现顺序等方面的限定。
本发明提供了一种mRNA捕获序列,为用于单细胞编码的寡核苷酸标签,由携带通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT的寡核苷酸序列组成。稀有酶切位点序列为该标签提供了两个优点:一是可以通过酶切将共价修饰在孔壁上的cDNA双链切下为游离,便于回收测序;二是可以保证cDNA双链具备两个不同的粘性末端,一个由平末端连接或末端转移酶接尾提供,另一个由酶切稀有位点提供,两个不同的粘性末端可以保证最后测序接头接不同的序列。不同测序接头的优点在于,可以保证一个哑铃型测序文库只组装一条引物及DNA聚合酶,三者的一一对应是保证单分子实时测序的前提。
本发明提供的一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法,在基底材料的微反应单元内原位合成如上所述的mRNA捕获序列。在一优选方案中,采用微孔阵列芯片原位合成mRNA捕获序列。能够提高单细胞捕获效率以及寡核苷酸标签的标记效率,简化构建文库的流程。
本发明提供的一种高通量单细胞测序文库制备方法,使用了如上所述的合成方法制得的用于mRNA捕获的捕获载体,提高单细胞捕获效率以及寡核苷酸标签的标记效率,保证了高通量。在单细胞测序建库大部分流程中采用固液界面反应,即mRNA捕获序列共价偶联在微孔或微球的界面上,其优势在于可以简化核酸纯化步骤,每一步反应后通过直接缓冲液淋洗过滤的方式,即可清除上一步反应对后续反应的抑制剂。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
Claims (10)
1.一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、利用用于mRNA捕获的捕获载体的微反应单元捕获单细胞;
S2、单细胞进行裂解,释放mRNA,所述微反应单元内的mRNA捕获序列中的PoLYT与mRNA上的PolyA特异性结合,逆转录合成cDNA;
S3、置换缓冲液,加入携带复制引物的微球,进行PCR扩增反应,形成完整的cDNA双链模板,其中,所述复制引物与所述微反应单元内的mRNA捕获序列上的通用引物序列相同;
S4、回收微球并合并,清洗置换缓冲液,在cDNA双链模板末端接第一粘性末端;
S5、清洗并置换缓冲液;
S6、酶切将cDNA双链模板的第二粘性末端暴露;
S7、在S5步骤或本步骤中利用DNA连接酶连接第一测序接头;利用DNA连接酶连接第二测序接头,形成哑铃型测序文库,纯化文库;
S8、测序引物和测序酶与哑铃型测序文库组装;
S9、将组装好的文库填入纳米孔芯片中,并且锚定在纳米孔底部,上机测序;
其中,用于mRNA捕获的捕获载体的微反应单元的合成包括以下步骤:
步骤一,选择含有若干微反应单元的基底材料,通过化学修饰方法在所述微反应单元内形成若干用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团;
步骤二,以步骤一所形成用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团为起始点,在每一所述微反应单元内原位合成若干mRNA捕获序列,制得用于mRNA捕获的捕获载体;所述mRNA捕获序列为一条寡聚核苷酸,包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列。
2.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,所述第一粘性末端与所述第二粘性末端不同,所述第一测序接头与所述第二测序接头不同;所述微球的尺寸1~50微米;所述的PCR过程循环数为1~100。
3.根据权利要求2所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,所述微球为磁性微球,所述微球的尺寸10~30微米;所述微球的所述的PCR过程循环数为1~10。
4.根据权利要求3所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,所述第一测序接头、第二测序接头均为发卡型寡聚核苷酸;其中,
所述第一测序接头包括第一互补序列和第三粘性末端序列,所述第三粘性末端序列与cDNA双链模板末端的第一粘性末端互补;
所述第二测序接头包括第二互补序列和第四粘性末端序列,所述第四粘性末端序列与cDNA双链模板末端的第二粘性末端互补;
所述第一测序接头或所述第二测序接头包括测序引物互补序列。
5.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,所述mRNA捕获序列的结构为通用引物-稀有酶切位点-细胞标签-随机分子标签-PolyT序列,序列长度为38~180bp;其中,
所述通用引物序列用以引发cDNA双链PCR,实现cDNA链的复制,序列长度3~20bp;
所述稀有酶切位点用以由限制性内切酶特异性识别并剪切,序列长度为10~30bp,所述限制性内切酶包括AgeI、ApoI、BamHI、BbsI、BclI、BmtI、BsaI、BsiWI、BsrGI、BstEII、BstZ17I、DraIII、EagI、EcoRI、EcoRV、HindIII、KpnI、MfeI、MluI、NcoI、NheI、NotI、NruI、NsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SalI、SbfI、ScaI、SpeI、SphI、SspI、StyI;
所述细胞标签用以编码单细胞,序列长度5~50bp,以使同一细胞来源的mRNA编码相同细胞标签序列,不同细胞来源的mRNA编码不同细胞标签序列;
所述随机分子标签用以编码mRNA,序列长度10~30bp,以使每一条mRNA携带不同的分子标签序列;
PolyT序列由胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的重复序列组成,序列长度10~50bp,用以捕获携带PolyA的mRNA。
6.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,所述基底材料包括微孔阵列、微球、磁珠、凝胶微球、树脂填料。
7.根据权利要求6所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,所述基底材料为微孔阵列,所述微孔阵列包括1~100万个微孔数量,所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。
8.根据权利要求7所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,所述微孔结构横截面为圆形,纵截面包括长方形、正方形、正“T”字形、倒梯形;
和/或,所述微孔底部设有滤膜。
9.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,所述用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团包括氨基、羟基、巯基、羧基。
10.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法,其特征在于,所述的原位化学合成mRNA捕获序列的方法,包括光化学合成法、喷墨打印法。
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