CN107794575A

CN107794575A - 用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法和试剂盒

Info

Publication number: CN107794575A
Application number: CN201710962325.1A
Authority: CN
Inventors: 马倩倩; 钟宏彬; 梁浩; 唐玉婧; 安莹
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd; BGI Genomics Co Ltd
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2017-10-16
Publication date: 2018-03-13

Abstract

本申请公开了一种用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法和试剂盒。本申请用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法，包括对打断的DNA大片段进行ExoVII酶处理；然后依序进行第一次DNA损伤修复、末端修复处理和加接头处理、外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；然后，采用核酸电泳和片段回收系统对双酶切处理的产物进行片段分选；对片段分选产物进行第二次DNA损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库。本申请的DNA大片段文库构建方法，整个建库过程无需使用Pacbio建库试剂盒，大大降低了建库成本，为第三代测序和Pacbio核酸测序平台的推广应用奠定了物质基础。

Description

用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法和试剂盒

技术领域

本申请涉及核酸测序领域，特别是涉及一种用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法，以及特别用于该建库方法的试剂盒。

背景技术

Pacbio平台，即Pacbio核酸测序平台，采用的是第三代测序技术，也就是单分子实时测序(Single Molecule Real-Time)。Pacbio平台的测序基于两个关键技术，第一，Pacific Biosciences公司发明的一种直径只有几十纳米的纳米孔(zero-modewaveguides，缩写ZMW)，在该纳米孔内只能容许单分子核酸在DNA聚合酶作用下进行反应，检测纳米孔中合成过程的A、T、C、G这四种荧光标记的脱氧核苷酸，即可实现核酸测序；acific Biosciences公司提供的SMRT cell chip中，一条strip可以放8个SMRT cell，每个SMRT cell中有15万个ZMW。第二，利用共聚焦显微镜实时、快速地对集成在SMRT cell上的无数的纳米孔同时进行记录。

Pacbio核酸测序平台，其平均读长可达10-15k，且测序不受AT和CG含量的影响，能够对高GC含量或低GC含量的区域进行测序，相比二代测序有较大优势。但Pacbio核酸测序平台仍存在一些不足，例如由于技术垄断，Pacbio核酸测序平台的建库成本和测序成本较高，导致其应用范围受到较大限制。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法，以及特别针对该方法研制的试剂盒。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法，包括对打断的DNA大片段进行ExoVII酶处理；

对ExoVII酶处理产物进行第一次DNA损伤修复；

对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；

对加接头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；其中，双酶切处理的目的是，去除线状DNA及有损伤的环状DNA；

采用核酸电泳和片段回收系统对外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理的产物进行片段分选；优选的，本申请采用Blue Pippin全自动核酸电泳和片段回收系统和BluePippinReagent kit进行片段分选；

对核酸电泳和片段回收系统的片段分选产物进行第二次DNA损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库。

优选的，本申请的DNA大片段文库构建方法中第一次DNA损伤修复和第二次DNA损伤修复都采用购自NEB公司的DNA损伤修复试剂盒。

需要说明的是，本申请的DNA大片段文库构建方法，整个过程，包括ExoVII酶处理、第一次DNA损伤修复、末端修复处理、加接头处理、外切酶ExoIII和ExoVII处理、片段分选和第二次DNA损伤修复，都无需采用任何Pacbio建库试剂，例如末端修复处理和加接头处理采用常规建库的末端修复和加接头试剂即可，DNA损伤修复可以采用购自NEB公司的DNA损伤修复试剂盒。虽然，本申请的建库方法没有使用Pacbio建库试剂，建库流程也与之不同；但是，本申请创造性的采用ExoVII酶切、ExoIII和ExoVII双酶切，以及两次DNA损伤修复等处理，并采用核酸电泳和片段回收系统进行特定长度的片段分选，使得最终获得的DNA大片段文库能够适用于Pacbio平台。本申请的DNA大片段文库构建方法，成本大大降低，相比于Pacbio建库试剂3000元/文库的成本，本申请的建库方法只需要约230元/文库。并且，Pacbio建库试剂只能整盒购买，存在部分试剂不足、部分试剂又多余等，试剂不配套的情况，每文库的试剂成本至少为官方报价的2倍；而本申请的建库方法，其中采用的各试剂可灵活订购，避免了试剂浪费。

优选的，本申请的建库方法中，ExoVII酶处理、第一次DNA损伤修复、末端修复处理、加接头处理、外切酶ExoIII和ExoVII处理、片段分选、第二次DNA损伤修复，在每个处理之后都包括核酸纯化步骤，然后再进入下一个处理。同样的，在第二次DNA损伤修复后经过核酸纯化即得到适用于Pacbio平台的DNA大片段文库。

优选的，核酸纯化步骤采用磁珠纯化。

磁珠纯化是目前使用比较广，且很成熟的核酸纯化技术，因此，本申请优选采用磁珠纯化对各步骤处理后的产物进行纯化；可以理解，除了磁珠纯化以外，还可以根据具体试验条件采用其它的纯化方法，在此不做具体限定。需要说明的是，核酸纯化的主要目的是去除上一步骤处理的试剂，避免其对下一处理步骤造成影响。

优选的，加接头处理中，接头序列为Seq ID No.1所示序列，

Seq ID No.1：5’-atctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatt-3’。

需要说明的是，Seq ID No.1所示序列是根据测序平台使用需求而自行设计合成的序列。

优选的，ExoVII酶处理之前，还包括对核酸样品进行DNA打断处理，DNA打断处理具体包括，将核酸样品放入g-Tube管，在Eppendorf MiniSpinplus离心机上3000-4000rpm离心2min，待上端液体全部转移至下端后，将g-Tube管倒置，3000-4000rpm离心2min，待液体全部转移至管盖后，用移液器将管盖中液体全部转移至新的离心管中，即获得打断的DNA大片段。

需要说明的是，本申请采用离心的形式对核酸进行打断，以获得DNA大片段，可以理解，核酸打断还可以采用其它方式，在此不做具体限定。另外，3000-4000rpm的离心速度跟根据样品完整性及建库片段大小而调整的；可以理解，如果核酸样品本身比较完整，或者需要的建库片段较小，则可以采用更高的离心速度，反之则采用较低的离心速度。

本申请的另一面公开了一种用于Pacbio平台DNA大片段文库构建的试剂盒，该试剂盒中包括至少五组试剂，

第一组试剂为ExoVII酶处理试剂，由ExoVII酶和ExoVII酶切反应缓冲液组成；

第二组试剂为DNA损伤修复试剂，包括DNA损伤修复酶及其反应缓冲液；

第三组试剂为末端修复处理试剂，包括DNA聚合酶及其反应缓冲液；

第四组试剂为加接头处理试剂，包括T4DNA连接酶、接头核酸片段、连接酶反应缓冲液；

第五组试剂为双酶切处理试剂，由ExoIII酶和双酶切缓冲液组成。

需要说明的是，本申请的试剂盒是特别针对本申请的建库方法而研制的；采用本申请的试剂盒，可以很方便的进行适用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建。并且，本申请的试剂盒相对于Pacbio建库试剂盒而言，一方面，本申请的试剂盒成本更低，只需要约230元/文库；另一方面，本申请的试剂盒中各试剂可以单独订购，使用更灵活方便。

优选的，第二组试剂中还包括氧化型辅酶NAD⁺酶。

优选的，第三组试剂中还包括多核苷酸激酶PNK和Klenow Fragment，第三组试剂中的反应缓冲液为PNK Buffer。

优选的，试剂盒中还包括dNTPs溶液。

可以理解，dNTPs溶液可以采用常规的，其它方式购买的dNTPs溶液，本申请为了使用方便，也将其配置到试剂盒中。

优选的，试剂盒中还包括第六组试剂，第六组试剂为磁珠纯化试剂，包括磁珠溶液、清洗溶液、洗脱液和磁力架。

需要说明的是，其中清洗溶液即washing buffer，本申请的一种优选方案中采用70％的乙醇作为清洗溶液；洗脱液是指将核酸从磁珠上洗脱下来并溶解的溶液，通常可以采用一般试剂盒的EB缓冲液，或者自行配置TE缓冲液，又或者采用灭菌的ddH₂O。

本申请的有益效果在于：

本申请的Pacbio平台DNA大片段文库构建方法，整个建库过程采用自行配置的试剂，无需使用Pacbio建库试剂盒，大大降低了建库成本，为第三代测序和Pacbio核酸测序平台的推广应用奠定了物质基础。同时，每一步反应后均有纯化步骤，去除DNA样本中杂质，提高了DNA的纯度，也保障了每一步反应的充分进行。

附图说明

图1是本申请实施例中茶树DNA打断纯化后的FA检测图；

图2是本申请实施例中辣椒DNA打断纯化后的FA检测图；

图3是本申请实施例中茶树DNA加接头和双酶切后的FA检测图；

图4是本申请实施例中辣椒DNA加接头和双酶切后的FA检测图；

图5是本申请实施例中茶树DNA经BluePippin分选和第二次DNA损伤修复后的FA检测图；

图6是本申请实施例中辣椒DNA经BluePippin分选和第二次DNA损伤修复后的FA检测图；

图7是本申请实施例中茶树DNA建库后的FA检测图；

图8是本申请实施例中辣椒DNA建库后的FA检测图。

具体实施方式

Pacbio核酸测序平台采用单分子实时测序，是号称第三代测序技术的新测序技术，具有超长的读长，并且测序不受AT和CG含量影响，能够直接测量甲基化等优点。但是，Pacbio平台最大的不足在于，建库成本高。一方面，Pacbio建库试剂盒需要3000元/文库的建库成本；另一方面，Pacbio建库试剂盒只能整盒购买，存在部分试剂不足、部分试剂多余等，试剂不配套的情况，使得每文库的试剂成本至少为官方报价的2倍。建库成本大大制约了Pacbio平台广泛应用。为此，本申请通过对Pacbio平台的长期使用和研究，特别研发了一种新的用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法，并研发了配套的试剂盒，以替换Pacbio建库试剂盒；将建库成本由3000元/文库，降低至约230元/文库，成本大幅度降低，使得更多的研究者可以使用先进的Pacbio平台和第三代测序技术。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、主要试剂和材料

1.试剂

本例的主要试剂包括，购自BeckMan公司的Agencourt AMPure XP磁珠纯化试剂盒，购自NEB公司的ExoVII酶、5×Reaction Buffer、Damage Repair Mix、Damage RepairBuffer、dNTPs、10×NAD⁺、PNK Buffer、DNA Polymerase、PNK、Klenow Fragment、T4DNALigase、Ligase Buffer、ExoIII、Cutsmart Buffer。

2.接头

本例针对Pacbio平台设计了接头序列，如Seq ID No.1所示序列，

Seq ID No.1：5’-atctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatt-3’。

接头由上海生工合成。

3.DNA样品

本例采用了两份DNA样品用于文库构建，两份DNA样品分别来源于商业项目辣椒和茶树。

二、DNA大片段文库构建

本例分别对两份DNA样品进行文库构建，本例的文库构建方法具体如下：

1.打断DNA样品及纯化

1.1打断DNA样品

1)取8μg DNA样品补水至150μL，放入g-Tube管在Eppendorf MiniSpinplus离心机上3500rpm离心2min，若有部分液体残留轻弹g-Tube管重复上述操作。

2)待上端液体全部转移至下端后，将g-Tube管倒置，3500rpm离心2min，若有部分液体残留，轻弹g-Tube管，待液体全部转移至管盖后，用移液器将管盖中液体全部转移至新的1.5ml离心管中。

1.2磁珠纯化及定量

1)将磁珠从4℃冰箱中取出，室温平衡30min。

2)使用前振荡混匀，向样品管中加入1.8倍体积的磁珠，轻轻混匀后室温下静置10min。

3)瞬时离心3s后，将离心管放到磁力架上至液体澄清，约2-5min。

4)用移液器小心的去除上清。

5)保持离心管在磁力架上，加入500μL 70％的乙醇，加完盖上离心管盖，将磁力架上下颠倒混匀3次，去上清。

6)重复步骤5)。

7)将离心管开盖置于干浴仪，37℃干燥5-10min直到磁珠干裂。

8)加入30μL分装水，用枪吹打混匀使磁珠充分溶解，室温静置5min。

9)将离心管放到磁力架上至液体澄清，2-3min。

10)将28μL洗脱下来的DNA转入到新的标注了的1.5mL离心管中。

11)取1μL纯化的样品稀释5倍，稀释样品中，取1μL用于Qubit定量，其余样品送检FA，送检FA，即采用Fragment analyzer仪器，对样品进行片段分析。

结果显示，本例的两份DNA样品，经打断处理和纯化后，茶树样品和辣椒Qubit定量结果分别为205ng/μL、197ng/μL，茶树和辣椒的FA检测图分别为图1和图2。图1的结果显示，茶树DNA打断纯化后的样品主峰主要包括36848bp，样品的片段大小主要集中在3000bp-55000bp内，与预期相符；图2的结果显示，辣椒DNA打断纯化后的样品主峰主要包括16265bp，样品的片段大小主要集中在3000bp-50000bp内，与预期相符。

2ExoVII酶处理及纯化

2.1ExoVII酶处理

每管样品中加入10μL Reaction Buffer及1μL ExoVII酶，补充水至50μL，充分混匀，短暂离心后，放入Thermomixer中，37℃温浴15min，4℃1min。完成ExoVII酶处理。

2.2磁珠纯化

加入1.8倍体积的磁珠，约90μL进行磁珠纯化。磁珠纯化的步骤参考1.2，最后采用86μL EB回溶。

3第一次DNA损伤修复及磁珠纯化

3.1损伤修复

DNA损伤修复的反应体系为100μL，包括：ExoVII酶处理后磁珠纯化回收的DNA样品84μL、Damage Repair Buffer 10μL、10mM的dNTPs 1μL、NAD⁺1μL、DamageRepair Mix 4μL。其中，Damage Repair Buffer、dNTPs和DamageRepair Mix可以预配制为16μL的Mix。反应体系充分混匀，短暂离心后，放入Thermomixer中，37℃温浴60min，4℃1min。

3.2磁珠纯化

加入1.8倍体积磁珠，约180μL对第一次DNA损伤修复的产物进行磁珠纯化，纯化步骤见1.2，最后使用77μL EB回溶。

4末端修复及磁珠纯化

4.1末端修复

末端修复的反应体系为100μL，包括：第一次DNA损伤修复的磁珠纯化产物75μL，和25μL Mix。其中，25μL Mix包括：PNK Buffer 10μL、10mM的dNTPs4μL、DNA Polymerase 5μL、PNK 5μL、Klenow Fragment 1μL。反应体系充分混匀，短暂离心后，放入Thermomixer中，37℃温浴30min，完成末端修复。

4.2磁珠纯化

加入1.8倍体积磁珠，约180μL对末端修复的产物进行磁珠纯化，纯化步骤见1.2，最后使用36μL EB回溶。

5末端连接“Adapter”及纯化

5.1加Adapter

1)预先从-20℃保存的试剂盒中，取出Ligation buffer、Adapter和ATP，于室温解冻，并充分震荡混匀并离心备用；

2)配制加接头反应体系50μL，包括：末端修复的磁珠纯化产物34μL、10mM的Adapter 10μL、Ligation buffer 5μL、T4DNA Ligase 1μL。反应体系充分混匀，短暂离心后，放入Thermomixer中，16℃温浴12-16h，本例具体是放置过夜，约15h，然后65℃温浴10min，冷却至4℃。

5.2磁珠纯化

加入1.8倍体积磁珠，约90μL对加接头的产物进行磁珠纯化，纯化步骤见1.2，最后使用36μL EB回溶。

6净化模板

6.1加外切酶消化

本例采用ExoIII和ExoVII双酶切处理净化模板，去除其中没有连接的接头和短小片段。双酶切反应体系为40μL，包括：加接头的磁珠纯化产物34μL、Cutsmart Buffer 4μL、ExoIII酶1μL、ExoVII酶1μL。反应体系充分混匀，短暂离心后，放入Thermomixer中，37℃温浴1h，冷却至4℃。

6.2磁珠纯化及定量

加入1.8倍体积磁珠，约90μL对双酶切产物进行磁珠纯化，纯化步骤见1.2，最后使用32μL EB回溶。

本例取1μL双酶切的磁珠纯化产物进行5倍稀释，取稀释液1μL检测Qubit，其余稀释液送检FA，对样品进行片段分析。

结果显示，本例的两份DNA样品，经加接头和双酶切净化后，茶树样品和辣椒Qubit定量结果分别为60.9ng/μL、50.2ng/μL；茶树和辣椒的FA检测图分别为图3和图4。图3的结果显示，茶树DNA加接头和双酶切后的样品主峰主要包括27563bp，样品的片段大小主要集中在6000bp-50000bp内，与预期相符；图4的结果显示，辣椒DNA加接头和双酶切后的样品主峰主要包括14710bp，样品的片段大小主要集中在3000bp-50000bp内，与预期相符。

7BluePippin片段分选

1)根据FA送检结果，选取适当的起始片段分选长度。本例具体选取10000bp-50000bp的片段分选长度，对加接头并经过双酶切净化的两个DNA样品进行片段分选。

2)将保存于4℃的BluePippin Reagent kit(Marker S1)放室温平衡30min。

3)取未开封的BluePippin胶板，观察每个泳道内胶有无萎缩断裂，若有异常，做好备注，重新取用新胶。

4)观察回收孔外围有无气泡，用手轻弹胶板回收孔周围，排净其周围气泡，避免对回收造成影响。

5)撕开回收孔上方封口膜。

6)用移液器吸净回收孔内液体，添加新鲜的electrophoresis buffer 40μL，注意添加过程避免气泡产生。

7)加完electrophoresis buffer后，在回收孔上方封上封口膜。

8)去掉加样孔上方的封口膜，若加样孔中液体不满，用electrophoresis buffer补满，放入光路校准后的BluePippin中，进行Test，BluePippin具体操作请参照《BluePippin标准操作流程指导书》。

9)Test完毕后，往之前需要做BluePippin的样品管中，加入10μLloadingsolution，共40Μl体系，轻弹混匀，短离2s；DNA marker(S1)，震荡混匀，短离2s，待用。

10)在胶板上标注好各Lane需加入的文库名或marker，吸取加样孔中electrophoresis buffer 40μL，并依次加入到加样孔中，进行BluePippin分选。

11)程序运行完毕后，静置30min后，将回收孔中液体全部转移至新的标记好后的1.5mL LoBind管中，孔内正常液体体积应在35-65μL之间，若体积过多，做好备注并及时反馈。

12)本例取40μL片段分选产物，向其中加入40μL 0.1％Tween solution，静置20min后，全部转移至对应的LoBind管中，共80μL体系。

13)用于1.8倍体积的磁珠，约144μL对步骤12)的产物进行纯化，纯化步骤见1.2，最终回溶于86μL EB。

8损伤修复及磁珠纯化

8.1第二次DNA损伤修复

DNA损伤修复的反应体系为100μL，包括：BluePippin分选的磁珠纯化产物84μL、Damage Repair Buffer 10μL、10mM的dNTPs 1μL、NAD⁺1μL、DamageRepair Mix 4μL。反应体系充分混匀，短暂离心后，放入Thermomixer中，37℃温浴60min，4℃1min。

8.2磁珠纯化

加入1.8倍体积磁珠，约180μL对第二次DNA损伤修复的产物进行磁珠纯化，纯化步骤见1.2，最后回溶于12μL EB，即获得DNA大片段文库。

取1μL文库稀释5倍，取稀释的文库1μL用于检测Qubit，剩余的稀释文库送检FA，对样品进行片段分析。

结果显示，本例的两份DNA样品，经BluePippin分选和第二次DNA损伤修复后，茶树样品和辣椒样品Qubit定量结果分别为71.4ng/μL、67.3ng/μL；茶树和辣椒的FA检测图分别为图5和图6。图5的结果显示，茶树DNA经BluePippin分选和第二次DNA损伤修复后的样品主峰主要包括24221bp，样品的片段大小主要集中在10000bp-50000bp内，与预期相符；图6的结果显示，辣椒DNA经BluePippin分选和第二次DNA损伤修复后的样品主峰主要包括13677bp，样品的片段大小也主要集中在10000bp-50000bp内，与预期相符。

在采用以上DNA大片段文库构建方法对两份DNA样品进行文库构建的基础上，作为对比，本例进一步采用了市购的Pacbio建库试剂盒分别对两份相同的DNA样品进行了文库构建。即本例总计构建了四个DNA大片段文库，用于后续的测序和数据分析。

同样的，从Pacbio建库试剂盒构建的DNA文库中，取1μL文库稀释5倍，取稀释的文库1μL用于检测Qubit，剩余的稀释文库送检FA，对样品进行片段分析。

结果显示，采用Pacbio建库试剂盒构建的两份DNA样品的文库，茶树样品和辣椒PB官方试剂盒构建文库的Qubit定量结果分别为76.5ng/μL，72.3ng/μL；茶树和辣椒的FA检测图分别为图7和图8。图7的结果显示，茶树DNA建库后的样品主峰主要包括21455bp，样品的片段大小仍然集中在10000bp-50000bp内，与预期相符；图8的结果显示，辣椒DNA建库后的样品主峰主要包括15000bp，样品的片段大小仍然主要集中在10000bp-50000bp内，与预期相符。

三、Pacbio平台测序和数据分析

本例的DNA大片段文库构建方法和Pacbio建库试剂盒，都成功构建了DNA 20k文库，建库成功率100％。本例进一步的，采用Pacbio Sequel测序仪，分别对四个文库进行测序，每个文库测序1个cell，获得4个cell的数据质量和产量，结果如表1所示。

表1四个文库的数据质量和产量统计结果

表1中，本例样本1为采用本例的DNA大片段文库构建方法构建的第一个DNA样品的测序文库，本例样本2为采用本例的DNA大片段文库构建方法构建的第二个DNA样品的测序文库；Pacbio样本1为采用Pacbio建库试剂盒构建的第一个DNA样品的测序文库，Pacbio样本2为采用Pacbio建库试剂盒构建的第二个DNA样品的测序文库。

表1的结果显示，本例样本平均读长与Pacbio样本平均读长基本一致均大于10k，数据量产出也基本无差异。最终结果评价显示，本例的DNA大片段文库构建方法所构建的DNA大片段文库，能够适用于Pacbio平台，可以替换现有的Pacbio建库试剂盒。

更为重要的是，本例的DNA大片段文库构建方法所采用的试剂或试剂盒，成本只需要约230元/文库，远低于Pacbio建库试剂盒3000元/文库的建库成本；并且，本例的DNA大片段文库构建方法所采用的各试剂可以灵活订购，避免了试剂量不匹配造成的资源浪费。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大基因股份有限公司

<120> 用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法和试剂盒

<130> 17I24733

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atctctctct tttcctcctc ctccgttgtt gttgttgaga gagatt 46

Claims

1.一种用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法，其特征在于：包括对打断的DNA大片段进行ExoVII酶处理；

对ExoVII酶处理产物进行第一次DNA损伤修复；

对加接头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；

采用核酸电泳和片段回收系统对外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理的产物进行片段分选；

2.根据权利要求1所述的DNA大片段文库构建方法，其特征在于：所述ExoVII酶处理、第一次DNA损伤修复、末端修复处理、加接头处理、双酶切处理、片段分选、第二次DNA损伤修复，每个处理之后都包括核酸纯化步骤，然后再进入下一个处理。

3.根据权利要求2所述的DNA大片段文库构建方法，其特征在于：所述核酸纯化步骤采用磁珠纯化。

4.根据权利要求1-3任一项所述的DNA大片段文库构建方法，其特征在于：所述加接头处理中，接头序列为Seq ID No.1所示序列，

Seq ID No.1：5’-atctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatt-3’。

5.根据权利要求1-3任一项所述的DNA大片段文库构建方法，其特征在于：所述ExoVII酶处理之前，还包括对核酸样品进行DNA打断处理，所述DNA打断处理具体包括，将核酸样品放入g-Tube管，在Eppendorf MiniSpinplus离心机上3000-4000rpm离心2min，待上端液体全部转移至下端后，将g-Tube管倒置，3000-4000rpm离心2min，待液体全部转移至管盖后，用移液器将管盖中液体全部转移至新的离心管中，即获得打断的DNA大片段。

6.一种用于Pacbio平台DNA大片段文库构建的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括至少五组试剂，

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述第二组试剂中还包括氧化型辅酶NAD⁺酶。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述第三组试剂中还包括多核苷酸激酶PNK和Klenow Fragment，第三组试剂中的反应缓冲液为PNK Buffer。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括dNTPs溶液。

10.根据权利要求6-9任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括第六组试剂，所述第六组试剂为磁珠纯化试剂，包括磁珠溶液、清洗溶液、洗脱液和磁力架。