CN108149326A - 一种高通量文库构建试剂盒及其应用 - Google Patents

一种高通量文库构建试剂盒及其应用 Download PDF

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CN108149326A
CN108149326A CN201810170706.0A CN201810170706A CN108149326A CN 108149326 A CN108149326 A CN 108149326A CN 201810170706 A CN201810170706 A CN 201810170706A CN 108149326 A CN108149326 A CN 108149326A
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王金龙
吕灵双
石太平
刘如银
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
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    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

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Abstract

本发明公开了一种高通量文库构建试剂盒及其应用。利用本发明的文库构建试剂盒构建文库的具体流程如下：首先使用内切酶将待测样本的基因组DNA进行平末端修复，将末端补平；然后将修复后片段的3'端用连接酶加上一个腺嘌呤A，再用TA连接方法加上接头，最后进行PCR扩增，富集连接好接头的DNA片段，达到上机测序所需的浓度及片段区间。本发明相比于国内外市场上其他建库试剂盒，DNA片段与接头的连接效率更高，解决了文库构建中的接头自连的残留问题，且连接后在保证固定浓度的同时，杂质去除地更为干净，最主要的是节约了大量成本，在高通量测序中的DNA文库构建方面具有良好市场前景。

Description

一种高通量文库构建试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量文库构建试剂盒及其应用。
背景技术
自从DNA的双螺旋结构被人们解析开始，人们在探究健康与疾病的基因组的复杂性与差异性上做出了巨大的努力。为了支持人类基因组计划的顺利进行，人们在仪器和试剂上做出了巨大的改进。该计划的完成使得人们强烈的意识到人们需要更多更好的技术与数据分析能力来回答随之而来的一系列生物学问题。然而，通量的限制以及居高不下的测序成本成为了人们进一步了解基因组的障碍。2000年之后推出的高通量测序平台很好地解决了这个问题，人类基因组测序的成本因此直接下降50000倍，并且由此产生了一个新的名词：下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)。在过去的十年中，NGS技术不停的在进步——测序的数据量增加了100-1000倍。这些技术上的进展使得人们甚至可以在一条read上读出整条基因组序列。根据VeritasGenomics的数据，人类基因组测序的成本也已经下降到1000美元/人。不仅如此，该技术已经广泛在临床诊断上得到应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于DNA文库构建的试剂盒。
本发明提供的用于DNA文库构建的试剂盒包括如下试剂：PNK缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTP溶液、克列诺酶、T4多聚核苷酸激酶、Blue缓冲液、三磷酸脱氧腺苷、大肠杆菌DNA聚合酶I、快速连接缓冲液、T4 DNA连接酶和PCR扩增缓冲液。
上述试剂盒中，所述PNK缓冲液为PNK Buffer，其具体为10×PNK Buffer；
所述T4 DNA聚合酶为T4 DNA Polymerase，其浓度具体为3U/μl；
所述dNTP溶液为dNTP Solution Set，其浓度具体为10mM。
所述克列诺酶为Klenow Fragment，其浓度具体为5U/μl；
所述T4多聚核苷酸激酶为T4 PNK，其浓度具体为10U/μl；
所述Blue缓冲液为Blue Buffer，其具体为10×Blue Buffer；
所述三磷酸脱氧腺苷为dATP，其浓度具体为1mM；
所述大肠杆菌DNA聚合酶I为Klenow 3'-5'exo-，其浓度具体为50U/μl；
所述快速连接缓冲液为Rapid Ligation Buffer，其具体为2×Rapid LigationBuffer；
所述T4 DNA连接酶为T4 DNA Ligase，其浓度具体为600U/μl；
所述PCR扩增缓冲液为HiFi Mix，其具体为2×HiFi Mix。
本发明的试剂盒还包括接头溶液和通用引物溶液；
所述接头溶液中包括接头1、接头2、接头3、接头4、接头5、接头6、接头7、接头8、接头9、接头10和接头11；所述接头溶液中各个接头的摩尔比相同；
所述接头1为序列1所示的单链DNA；所述接头2为序列2所示的单链DNA；所述接头3为序列3所示的单链DNA；所述接头4为序列4所示的单链DNA；所述接头5为序列5所示的单链DNA；所述接头6为序列6所示的单链DNA；所述接头7为序列7所示的单链DNA；所述接头8为序列8所示的单链DNA；所述接头9为序列9所示的单链DNA；所述接头10为序列10所示的单链DNA；所述接头11为序列11所示的单链DNA；
所述通用引物溶液包括引物1和引物2；所述引物1和所述引物2的摩尔比相同；
所述引物1为序列12所示的单链DNA；所述引物2为序列13所示的单链DNA。
本发明的试剂盒还包括AMPure XP beads。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述试剂盒在DNA文库构建中的应用。
本发明还有一个目的是提供一种构建DNA文库的方法。
本发明提供的构建DNA文库的方法包括如下步骤：
1)将待测DNA片段进行末端修复，得到末端修复产物；
所述末端修复的反应体系包括如下试剂：PNK缓冲液、dNTP溶液、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶和克列诺酶；
2)将所述末端修复产物进行加A尾，得到加尾产物；
所述加A尾的反应体系包括如下试剂：Blue缓冲液、三磷酸脱氧腺苷和大肠杆菌DNA聚合酶I；
3)将所述加尾产物连接接头，得到连接接头产物；
所述连接接头的反应体系包括如下试剂：快速连接缓冲液、T4 DNA连接酶和接头溶液；
4)将所述连接接头产物进行PCR扩增，得到PCR产物，即为所述DNA文库；
所述PCR扩增的反应体系包括PCR扩增缓冲液和通用引物溶液。
上述方法中，所述PNK缓冲液为PNK Buffer，其具体为10×PNK Buffer；
所述T4 DNA聚合酶为T4 DNA Polymerase，其浓度具体为3U/μl；
所述dNTP溶液为dNTP Solution Set，其浓度具体为10mM。
所述克列诺酶为Klenow Fragment，其浓度具体为5U/μl；
所述T4多聚核苷酸激酶为T4 PNK，其浓度具体为10U/μl；
所述Blue缓冲液为Blue Buffer，其具体为10×Blue Buffer；
所述三磷酸脱氧腺苷为dATP，其浓度具体为1mM；
所述大肠杆菌DNA聚合酶I为Klenow 3'-5'exo-，其浓度具体为50U/μl；
所述快速连接缓冲液为Rapid Ligation Buffer；其具体为2×Rapid LigationBuffer；
所述T4 DNA连接酶为T4 DNA Ligase，其浓度具体为600U/μl；
所述PCR扩增缓冲液为HiFi Mix，其具体为2×HiFi Mix。
上述方法中，所述接头溶液中包括接头1、接头2、接头3、接头4、接头5、接头6、接头7、接头8、接头9、接头10和接头11；所述接头溶液中各个接头的摩尔比相同；
所述接头1为序列1所示的单链DNA；所述接头2为序列2所示的单链DNA；所述接头3为序列3所示的单链DNA；所述接头4为序列4所示的单链DNA；所述接头5为序列5所示的单链DNA；所述接头6为序列6所示的单链DNA；所述接头7为序列7所示的单链DNA；所述接头8为序列8所示的单链DNA；所述接头9为序列9所示的单链DNA；所述接头10为序列10所示的单链DNA；所述接头11为序列11所示的单链DNA；
所述通用引物溶液包括引物1和引物2；所述引物1和所述引物2的摩尔比相同；
所述引物1为序列12所示的单链DNA；所述引物2为序列13所示的单链DNA。
上述方法中，所述末端修复的反应体系包括如下试剂：5μl 10×PNK Buffer、1μldNTP Solution Set、1μl T4 DNA Polymerase、1μl T4 PNK和1μl Klenow Fragment；
所述加A尾的反应体系包括如下试剂：2.5μl 10×Blue Buffer、2.5μl dATP和0.5μlKlenow 3'-5'exo-；
所述连接接头的反应体系包括如下试剂：25μl 2×Rapid Ligation Buffer、1μlT4 DNA Ligase和0.7μl接头溶液；
所述PCR扩增的反应体系包括如下试剂：25μl 2×HiFi Mix和2μl通用引物溶液。
在本发明中，所述末端修复的反应体系由如下试剂组成：3ng DNA、5μl 10×PNKBuffer、1μl dNTP Solution Set、1μl T4 DNA Polymerase、1μl T4PNK和1μl KlenowFragment，NF-water补足体系至50μl；
所述加A尾的反应体系由如下试剂组成：19.5μl纯化后的末端修复产物、2.5μl10×Blue Buffer、2.5μl dATP和0.5μl Klenow 3'-5'exo-；
所述连接接头的反应体系由如下试剂组成：25μl加尾产物、25μl 2×RapidLigation Buffer、1μl T4 DNA Ligase和0.7μl接头溶液；
所述PCR扩增的反应体系由如下试剂组成：23μl纯化后的连接接头产物、25μl 2×HiFi Mix和2μl通用引物溶液。
上述方法中，所述步骤1)和步骤2)之间、步骤3)和步骤4)之间、步骤4)之后均还包括纯化的步骤；所述纯化的方法可为磁珠纯化；所述磁珠纯化具体采用AMPure XP beads。
上述方法中，所述步骤1)和步骤2)之间的磁珠纯化方法包括如下步骤：将末端修复产物与75μl AMPure XP beads混匀，室温孵育5min；
所述步骤3)和步骤4)之间的磁珠纯化方法包括如下步骤：将加尾产物与40μlAMPure XP beads混匀，室温孵育5min；
所述步骤4)之后的磁珠纯化方法包括如下步骤：将PCR产物与40μl AMPure XPbeads混匀，室温孵育5min。
上述方法中，所述末端修复的反应条件为20℃反应30min；
所述加A尾的反应条件为37℃反应30min；
所述连接接头的反应条件为20℃反应15min；
所述PCR扩增的反应程序如下：94度2min；94度15s，65度30s，72度60s，14个循环；72度10min；4度hold。
本发明提供了一种文库构建试剂盒及其制备方法，利用本发明的文库构建试剂盒构建文库的具体流程如下：首先将待测样本的基因组DNA进行平末端修复，将末端补平；然后将修复后片段的3'端用连接酶加上一个腺嘌呤A，再用TA连接方法加上接头，最后进行PCR扩增，富集连接好接头的DNA片段，达到上机测序所需的浓度及片段区间。本发明相比于国内外市场上其他建库试剂盒，DNA片段与接头的连接效率更高，解决了文库构建中的接头自连的残留问题，且连接后在保证固定浓度的同时，杂质去除地更为干净，最主要的是节约了大量成本，在高通量测序中的DNA文库构建方面具有良好市场前景。
附图说明
图1为本发明的安捷伦2100生物分析仪的文库片段检测图。
图2为文库浓度检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
原料名称
下述实施例中的NEXTfiexTMDNA-Seq Kit文库构建试剂盒是BIOO Scientific的产品；NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina文库构建试剂盒是康为世纪生物科技有限公司的产品。
实施例1、文库构建试剂盒的制备
1、文库构建试剂盒的制备原料
制备本发明的文库建库试剂盒的原料如表1所示，具体如下：10×PNK Buffer、T4DNA Polymerase、dNTP Solution Set、Klenow Fragment、T4PNK、10×Blue Buffer、dATP、Klenow 3'-5'exo-、5×Rapid Ligation Buffer、T4 DNA Ligase、Adapte、2×HiFiMix和Primer Mix。上述原料的购买处如表2所示。
表1、文库构建试剂盒中的试剂
表2、文库构建试剂中各试剂的稀释浓度及用量
2、文库构建试剂盒的制备
使用ddH2O将步骤1中的文库构建试剂盒的制备原料按照表2所示稀释浓度进行稀释，得到本发明的文库构建试剂盒，其包括如下试剂：10×PNK Buffer、T4 DNAPolymerase、dNTP Solution Set、Klenow Fragment、T4PNK、10×Blue Buffer、dATP、Klenow 3'-5'exo-、2×Rapid Ligation Buffer、T4 DNA Ligase、Adapter、2×HiFiMix和Primer Mix，试剂盒中的各个试剂浓度及用量如表2所示。
实施例2、文库构建试剂盒在文库构建中的应用
一、供试DNA样本
本发明用于文库构建的DNA样本为孕妇的血液循环中的胎儿游离DNA(cff-DNA)。
二、文库构建
1、末端修复
(1)末端补平
建库起始量为3ng，根据相应的DNA浓度，计算DNA取样量，并用NF-water补足体系至41μl，置于PCR反应管中；然后再加入表3所示的末端试剂，反应体系总体积为50μl；涡旋混匀10次；20℃反应30min，得到末端修复DNA。
表3、末端修复试剂
(2)磁珠纯化
将步骤(1)中的末端修复DNA进行磁珠纯化，得到纯化后产物。具体步骤如下：
(2-1)向体系中加入75μl充分混匀的AMPure XP beads，轻轻吹打均匀，室温孵育5min；
(2-2)然后室温放置磁力架至少5min，使磁珠充分吸附在磁力架上；
(2-3)吸弃上清；
(2-4)然后向置于磁力架上的反应管中加入200μl 80％乙醇；
(2-5)室温孵育30s，吸弃上清；
(2-6)重复步骤(2-4)和(2-5)；
(2-7)室温静置5min以晾干磁珠；
(2-8)每管加入21.5μl RSB(Resuspension Buffer)，充分混匀磁珠；
(2-9)室温孵育5min，然后磁力架静置5min(上清清亮)；
(2-10)吸取19.5μl上清至一新的PCR管。
2、加“A”尾
向步骤1(2-10)中的纯化后产物中加入表4所示的试剂，将末端修复DNA的5’端加A尾；涡旋混匀；37℃反应30min，得到加A尾产物。
表4、5’端连接“A”试剂
3、连接接头
(1)连接反应
在步骤2中的加A尾产物中加入表5所示的试剂；涡旋混匀；20℃反应15min，得到连接接头产物。
表5、加Adapter试剂
备注：表5中Adapter为标签接头，不同DNA样本在连接接头时候，一端会连接通用引物，通用引物序列是相同，但是Adapter标签接头序列不同，DNA样本通过不同的Adapter标签进行区分，用于测序后数据的分类与分析。
Adapter由Adapter 1、Adapter 2、Adapter3、Adapter4、Adapter5、Adapter6、Adapter7、Adapter8、Adapter9、Adapter10和Adapter 11组成，均为人工合成，具体序列如下：
Adapter1：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列1)；
Adapter2：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列2)；
Adapter3：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列3)；
Adapter4：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列4)；
Adapter5：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列5)；
Adapter6：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列6)；
Adapter7：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列7)；
Adapter8：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列8)；
Adapter9：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列9)；
Adapter10：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATCAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列10)；
Adapter11：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(序列11)。
上述各接头在连接反应体系中的终浓度均为17.5μM。
(2)磁珠纯化
将步骤(1)中的连接接头产物进行磁珠纯化，得到纯化后产物。具体步骤如下：
(2-1)向体系中加入40μl充分混匀的AMPure XP beads，轻轻吹打均匀，室温孵育5min；
(2-2)然后室温放置磁力架至少5min，使磁珠充分吸附在磁力架上；
(2-3)吸弃上清；
(2-4)然后向置于磁力架上的反应管中加入200μl 80％乙醇；
(2-5)室温孵育30s，吸弃上清；
(2-6)重复步骤(2-4)和(2-5)；
(2-7)室温静置5min以晾干磁珠；
(2-8)每管加入25.5μl RSB(Resuspension Buffer)，充分混匀磁珠；
(2-9)室温孵育5min，然后磁力架静置5min(上清清亮)；
(2-10)吸取23μl上清至一新的PCR管。
4、富集DNA片段
(1)PCR扩增
在步骤3中的纯化后产物中加入表6所示试剂；涡旋混匀；然后进行如下反应程序：94度2min；94度15s，65度30s，72度60s，14个循环；72度10min；4度hold；得到PCR产物。
表6、富集DNA片段试剂
Primer Mix中的引物由通用Primer1和通用Primer2组成，均为人工合成，具体序列如下：
Primer1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(序列12)；
Primer2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(序列13)。
(2)磁珠纯化
将步骤(1)中的PCR产物进行磁珠纯化，得到纯化后的文库。具体步骤如下：
(2-1)向体系中加入40μl充分混匀的AMPure XP beads，轻轻吹打均匀，室温孵育5min；
(2-2)然后室温放置磁力架至少5min，使磁珠充分吸附在磁力架上；
(2-3)吸弃上清；
(2-4)然后向置于磁力架上的反应管中加入200μl 80％乙醇；
(2-5)室温孵育30s，吸弃上清；
(2-6)重复步骤(2-4)和(2-5)；
(2-7)室温静置5min以晾干磁珠；
(2-8)每管加入22.5μl RSB(Resuspension Buffer)，充分混匀磁珠；
(2-9)室温孵育5min，然后磁力架静置5min(上清清亮)；
(2-10)吸取21μl上清至准备好的新的EP管作为文库管，即为构建的DNA文库。
三、文库质控
将步骤二纯化后的DNA文库分别使用安捷伦2100检测仪及Life Invitrogen3.0荧光定量仪进行文库质检。
安捷伦2100进行文库质检具体步骤如下(以下操作所用试剂均为<安捷伦HighSensitivity DNA Reagents>)：
1、准备凝胶染料混合液Gel-Dye Mix
(1)取出Agilent High Sensitivity DNA Reagents试剂盒中的DNA浓缩染料(蓝色)和DNA凝胶(红色)，室温下平衡试剂30min。
(2)涡旋DNA浓缩染料(蓝色)，然后用移液器吸取25μl染料，添加到一管DNA凝胶中(红色)。
(3)充分涡旋混合液，离心。转移到过滤柱中。
(4)加载凝胶染料混合液Gel-Dye Mix。
(5)取一块新的DNA芯片，放在芯片注胶平台上。
(6)吸取9μl凝胶染料混合液加到标记有G的孔内。
(7)确保注射器柱塞定位在1ml然后关闭芯片注胶平台。
(8)按压柱塞，直到被夹子卡住。
(9)等待计时60s，然后松开夹子。
(10)等待5s，然后拉回柱塞到1ml的位置。
(11)打开芯片注胶平台，吸取9μl凝胶染料混合液加到其他标记有G的孔内。
2、加载标记物Markers
吸取5μl Marker(绿色)加到12个样品孔内和Ladder孔内，不要让任何孔空着。
3、加Ladder和加样
(1)吸取1μl DNA Ladder(黄色)到标记有梯子的孔内。
(2)其他12个样品孔内，需要使用的孔内添加1μl样品，不需要使用的孔内，添加1μl去离子水。
(3)将芯片水平的放在芯片涡旋振荡器上，2400rpm涡旋1min(计时器计时)。
(4)5min之内芯片必须放在Agilent 2100上，按照软件提示进行DNA电泳操作。
4、上机
(1)双击桌面上Agilent 2100的软件图标，进入系统。
(2)在实验开始之前，先将清洗电极用的Cleaner Chip注满超纯水，放在芯片平台上，盖上仪器的盖子，清洗15s左右，打开仪器盖子，取出Cleaner Chip。将之前加完样本的芯片放在仪器芯片平台上，盖上仪器的盖子，按照软件提示点击软件上的Start按钮，进行DNA电泳操作。
Qubite3.0核酸检测仪进行文库质检的具体步骤如下：
1、试剂配置
(1)取出Qubit Reagent(HS)1μl加入199μl Qubit Buffer，振荡混均，备用。
(2)吸取1μl文库样本，加入到上步备用配置液中，振荡混均。
2、上机检测
将上步混合有配置液的样本盖紧盖子，放在Qubit3.0检测仪器上，点击开始检测。
安捷伦2100文库质检结果如图1所示。从图中看出：使用本发明的文库构建试剂盒构建得到的DNA文库经安捷伦2100生物分析仪质检分析，检测片段大小均无明显差别(检测目的片段区间为：280-300bp)，在峰图的120bp位置左右均无接头峰，证明无接头自连情况。在峰图50-280bp区间无其他杂峰，说明本发明所应用的技术体系纯化结果很理想，杂质去除地很干净。
Qubite3.0核酸检测仪检测的文库浓度结果如表7所示。经过Life Invitrogen3.0荧光定量仪检测，文库浓度均为合格值(检测浓度≥2ng/μl)。同一样本建平行文库的出库浓度值比较均一，显示片段大小也趋于一致。
表7、Qubit质检结果
样本名称 样本类型 建库起始量(ng) Adapter 文库浓度(ng/μl)
19 游离DNA 3 1 4.70
21 游离DNA 3 2 7.72
23 游离DNA 3 3 6.88
以上结果表明：本发明的文库构建试剂盒使用效果比较稳定，可有效去除dNTP、引物、引物二聚体、接头、盐离子和其他杂质。本发明的文库构建试剂盒不仅仅是连接效率高，且在原料的使用量上与国内外市场上试剂盒相比也是有特别大的优势，从而可以很大的降低建库成本。
实施例3、本发明的试剂盒与其他试剂盒的性能比较
一、供试样本
以10例孕妇的血液循环中的胎儿游离DNA(cff-DNA)为供试样本。
二、使用不同的文库构建试剂盒构建文库
以步骤一的cff-DNA为供试样本，分别使用NEXTfiexTMDNA-Seq Kit文库构建试剂盒(记作Bioo试剂盒)、NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina文库构建试剂盒(记作康为世纪试剂盒)与实施例1中的本发明的文库构建试剂盒进行文库构建。NEXTfiexTMDNA-Seq Kit文库构建试剂盒和NGS Fast DNA Library Prep Set forIllumina文库构建试剂盒的构建方法参见试剂盒中说明书，本发明的文库构建试剂盒的构建方法参见实施例2中的方法。
三、本发明的试剂盒与其他试剂盒的性能比较
使用Life Invitrogen 3.0荧光定量仪(核酸、蛋白定量仪)分别对步骤二中的不同试剂盒构建得到的文库浓度进行检测。使用安捷伦2100生物分析仪分别对步骤二中的不同试剂盒构建得到的文库片段进行检测。
检测结果如图2和表8所示。经过Qubit3.0对文库检测结果说明：与本发明的试剂盒相比，Bioo试剂盒在片段扩增及连接效率上存在着明显的不稳定性；而康为世纪试剂盒在稳定性上与本发明的试剂盒没有较大出入，但是在连接效率上相较于本发明的试剂盒却有相应的损失。
综上所述，不管是在片段的连接效率上，还是在扩增富集上，本发明的试剂盒均有很大的优势。
表8、本发明的试剂盒与其他试剂盒的性能比较
序列表
<110>北京创新乐土生物科技有限公司
<120>一种高通量文库构建试剂盒及其应用
<160>13
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt caccgatgta tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>2
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cactgaccaa tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>3
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacacagtga tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>4
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacgccaata tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>5
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt caccagatca tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>6
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt caccttgtaa tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>7
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacatcacga tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>8
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacttaggca tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>9
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>9
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacacttgaa tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>10
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>10
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacgatcaga tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>11
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>11
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cactagctta tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>12
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>12
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>13
caagcagaag acggcatacg agat 24

Claims (10)

1.一种用于DNA文库构建的试剂盒，其包括如下试剂：PNK缓冲液、T4DNA聚合酶、dNTP溶液、克列诺酶、T4多聚核苷酸激酶、Blue缓冲液、三磷酸脱氧腺苷、大肠杆菌DNA聚合酶I、快速连接缓冲液、T4DNA连接酶和PCR扩增缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述PNK缓冲液为10×PNK Buffer；
所述Blue缓冲液为10×Blue Buffer；
所述快速连接缓冲液为2×Rapid Ligation Buffer；
所述PCR扩增缓冲液为2×HiFi Mix。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括接头溶液和通用引物溶液；
所述接头溶液的浓度为25μM；
所述通用引物溶液的浓度为12.5μM；
所述T4DNA聚合酶的浓度为3U/μl；
所述dNTP溶液的浓度为10mM；
所述克列诺酶的浓度为5U/μl；
所述T4多聚核苷酸激酶的浓度为10U/μl；
所述三磷酸脱氧腺苷的浓度为1mM；
所述大肠杆菌DNA聚合酶I的浓度为50U/μl；
所述T4DNA连接酶的浓度为600U/μl。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括AMPure XPbeads。
5.权利要求1-4任一所述的试剂盒在DNA文库构建中的应用。
6.一种构建DNA文库的方法，包括如下步骤：
1)将待测DNA片段进行末端修复，得到末端修复产物；
所述末端修复的反应体系包括如下试剂：PNK缓冲液、dNTP溶液、T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶和克列诺酶；
2)将所述末端修复产物进行加A尾，得到加尾产物；
所述加A尾的反应体系包括如下试剂：Blue缓冲液、三磷酸脱氧腺苷和大肠杆菌DNA聚合酶I；
3)将所述加尾产物连接接头，得到连接接头产物；
所述连接接头的反应体系包括如下试剂：快速连接缓冲液、T4DNA连接酶和接头溶液；
4)将所述连接接头产物进行PCR扩增，得到PCR产物，即为所述DNA文库；
所述PCR扩增的反应体系包括PCR扩增缓冲液和通用引物溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述PNK缓冲液为10×PNK Buffer；
所述Blue缓冲液为10×Blue Buffer；
所述快速连接缓冲液为2×Rapid Ligation Buffer；
所述PCR扩增缓冲液为2×HiFi Mix；
或，
所述接头溶液的浓度为25μM；
所述通用引物溶液的浓度为12.5μM；
所述T4DNA聚合酶的浓度为3U/μl；
所述dNTP溶液的浓度为10mM；
所述克列诺酶的浓度为5U/μl；
所述T4多聚核苷酸激酶的浓度为10U/μl；
所述三磷酸脱氧腺苷的浓度为1mM；
所述大肠杆菌DNA聚合酶I的浓度为50U/μl；
所述T4DNA连接酶的浓度为600U/μl。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述末端修复的反应体系包括如下试剂：5μl 10×PNK Buffer、1μl dNTP溶液、1μl T4DNA聚合酶、1μl T4多聚核苷酸激酶和1μl克列诺酶；
所述加A尾的反应体系包括如下试剂：2.5μl 10×Blue Buffer、2.5μl三磷酸脱氧腺苷和0.5μl大肠杆菌DNA聚合酶I；
所述连接接头的反应体系包括如下试剂：25μl 2×Rapid Ligation Buffer、1μl T4DNA连接酶和0.7μl接头溶液；
所述PCR扩增的反应体系包括如下试剂：25μl 2×HiFi Mix和2μl通用引物溶液。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)之间、步骤3)和步骤4)之间、步骤4)之后均还包括纯化的步骤；
或，所述纯化的方法为磁珠纯化；
或，所述磁珠纯化采用AMPure XP beads。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)之间的磁珠纯化方法包括如下步骤：将末端修复产物与75μl AMPure XP beads混匀，室温孵育5min；
或，所述步骤3)和步骤4)之间的磁珠纯化方法包括如下步骤：将加尾产物与40μlAMPure XP beads混匀，室温孵育5min；
或，所述步骤4)之后的磁珠纯化方法包括如下步骤：将PCR产物与40μl AMPure XPbeads混匀，室温孵育5min。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108929901A (zh) * 2018-07-27 2018-12-04 博奥生物集团有限公司 一种用于痕量dna的多重扩增建库方法及其专用试剂盒
CN109385469A (zh) * 2018-10-09 2019-02-26 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种高灵敏度双链循环肿瘤dna检测方法及试剂盒
CN111073952A (zh) * 2018-12-29 2020-04-28 浙江安诺优达生物科技有限公司 构建dna文库的方法及其应用
WO2022001149A1 (zh) * 2020-06-28 2022-01-06 江苏康科斯医疗科技有限公司 一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016082057A1 (zh) * 2014-11-25 2016-06-02 深圳华大基因研究院 游离dna测序文库的构建方法
CN105695448A (zh) * 2016-03-11 2016-06-22 浙江圣庭生物科技有限公司 一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用
CN106498038A (zh) * 2016-10-11 2017-03-15 哈尔滨博泰生物科技有限公司 一种快速进行dna末端修复和加接头的方法及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016082057A1 (zh) * 2014-11-25 2016-06-02 深圳华大基因研究院 游离dna测序文库的构建方法
CN107075732B (zh) * 2014-11-25 2020-08-04 深圳华大智造科技有限公司 游离dna测序文库的构建方法
CN105695448A (zh) * 2016-03-11 2016-06-22 浙江圣庭生物科技有限公司 一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用
CN106498038A (zh) * 2016-10-11 2017-03-15 哈尔滨博泰生物科技有限公司 一种快速进行dna末端修复和加接头的方法及应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108929901A (zh) * 2018-07-27 2018-12-04 博奥生物集团有限公司 一种用于痕量dna的多重扩增建库方法及其专用试剂盒
CN108929901B (zh) * 2018-07-27 2022-02-01 博奥生物集团有限公司 一种用于痕量dna的多重扩增建库方法及其专用试剂盒
CN109385469A (zh) * 2018-10-09 2019-02-26 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种高灵敏度双链循环肿瘤dna检测方法及试剂盒
CN111073952A (zh) * 2018-12-29 2020-04-28 浙江安诺优达生物科技有限公司 构建dna文库的方法及其应用
CN111073952B (zh) * 2018-12-29 2023-09-22 浙江安诺优达生物科技有限公司 构建dna文库的方法及其应用
WO2022001149A1 (zh) * 2020-06-28 2022-01-06 江苏康科斯医疗科技有限公司 一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用

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