CN117844884A - 一种cfDNA末端修复及建库的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种cfDNA末端修复及建库的方法。本发明提出了一种cfDNA末端修复方法，末端修复反应体系采用包含Hemo KlenTaq和T4Polynucleotide Kinase的末端修复酶组合试剂，以及包含dmCTP等组分在内的10×末端修复缓冲液试剂。所述cfDNA末端修复的方法可以在修复cfDNA末端的同时保留cfDNA锯齿状末端序列。本发明加入带有甲基化修饰的胞嘧啶(dmCTP)，代替普通胞嘧啶，对cfDNA锯齿状末端序列进行保留。末端修复酶组合物(Hemo KlenTaq和T4Polynucleotide Kinase)共同处理cfDNA，以产生通过dmCTP进行保留cfDNA锯齿状末端序列的末端平齐化且3’端加A的cfDNA。因此，通过后续数据分析能够获得cfDNA锯齿状末端序列的遗传信息。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种cfDNA末端修复及建库的方法。
背景技术
血浆游离DNA(circulating cell free DNA,cfDNA)是一种存在于血浆中的游离的、不与细胞核融合的DNA片段。cfDNA可以用于非侵入性的液体活检，用于癌症早期筛查、疾病监测和治疗效果评估。此外，cfDNA也被用于产前诊断、器官移植监测等领域。目前研究学者发现血浆cfDNA携带单链DNA末端，即锯齿状末端。研究发现88％的血浆cfDNA分子均携带锯齿状末端，cfDNA锯齿状末端的产生与DNA核酸酶活性有关。cfDNA锯齿状末端代表了cfDNA的固有特性，是疾病中一种新生物学标志物。
专利公告号为CN111378632B的文献提供了一种cfDNA末端修复酶组合物，由酶Ⅰ(Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment，Exo-)和酶Ⅱ(T4Polynucleotide Kinase，简称T4PNK)组成，可以使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A，并使cfDNA 5’端发生磷酸化修饰。
但此种cfDNA末端修复法并未保留cfDNA锯齿状末端序列结构，导致这部分数据信息缺失。并且Klenow Fragment，Exo-具有3’-5’外切酶活性和聚合酶活性，会导致cfDNA在末端修复补平时会在3’端额外添加一个或多个核苷酸，进而引起信息分析差异。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种cfDNA末端修复方法，末端修复反应体系采用包含Hemo KlenTaq和T4 Polynucleotide Kinase的末端修复酶组合试剂，以及包含dmCTP等组分在内的10×末端修复缓冲液试剂，可以在修复cfDNA末端的同时保留cfDNA锯齿状末端序列。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种保留cfDNA锯齿状末端的末端修复方法，包括如下步骤：
S1.配置10×末端修复缓冲液试剂和末端修复酶组合试剂；
所述10×末端修复缓冲液试剂包含dmCTP，所述末端修复酶组合试剂包含HemoKlenTaq和T4 Polynucleotide Kinase；
S2.配置末端修复反应体系，所述末端修复反应体系包含所述10×末端修复缓冲液试剂、所述末端修复酶组合试剂和cfDNA，混匀再置于PCR仪上进行末端修复反应；
所述末端修复反应同时完成了三项操作：保留cfDNA锯齿状末端序列的末端平齐化，在cfDNA的3’端添加dA，以及在cfDNA的5’端修饰磷酸基团，从而获得具有粘性末端A且保留cfDNA锯齿状末端序列的cfDNA片段。
Hemo KlenTaq是截短后的Taq DNA聚合酶，它缺失了N端的280个氨基酸。HemoKlenTaq还有其它突变，这些突变使它能够耐受全血中存在的抑制剂。此酶能够扩增人和小鼠全血样品中的DNA而无需事先提纯。在大多数抗凝剂存在下Hemo KlenTaq依然表现良好，包括肝素、柠檬酸和EDTA。
Hemo KlenTaq不具有5’→3’外切酶活性和3’→5’外切酶活性，在保留cfDNA锯齿状末端序列的基础上经过末端平齐化的cfDNA 3’端添加碱基A，以获得具有粘性末端A的cfDNA片段。本发明寻找到Hemo KlenTaq，T4Polynucleotide Kinase二者同时具备活性的反应条件，即缓冲液条件和反应温度控制，可以将末端修复和加dA在一步完成。
加入带有甲基化修饰的胞嘧啶(dmCTP)，代替普通胞嘧啶，与末端修复酶组合物处理cfDNA以产生通过dmCTP进行末端平齐化且3’端加A的cfDNA，因此通过后续数据分析能够获得cfDNA锯齿状末端序列的遗传信息。
优选地，所述Hemo KlenTaq与所述T4 Polynucleotide Kinase的体积比为1:(0.1-1)。
优选地，每50μL所述末端修复反应体系中，所述dmCTP浓度4-5mM。
优选地，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含dGTP、dTTP和dATP，(dmCTP+dGTP+dTTP)和dATP的摩尔比为(3-5)：(10-15)。
末端平齐化所需的四种脱氧核糖核苷三磷酸很少，末端平齐化后通过HemoKlenTaq为DNA双链的3’端添加碱基A，所以反应体系中dATP浓度对于cfDNA 3’端加A效率影响较大。
优选地，每50μL所述末端修复反应体系中，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含：0.9-1.1M Tris-HCl、0.1-0.2M MgCl2、0.01-0.15M DTT、0.1-0.2M KCl和10-30mMATP。
优选地，每50μL所述末端修复反应体系中，所述末端修复酶组合试剂包含：2-4μLHemo KlenTaq、1-2μL T4 Polynucleotide Kinase、90-100mM Tris-HCl和体积浓度45-50％的甘油。
优选地，每50μL所述末端修复反应体系中，所述cfDNA的加入量至少为1ng。
本发明优化了反应体系进行甲基化建库，使用先建库后转化的实验方案可以避免转化效率低下、文库污染等问题，提高建库效率和准确性。另外，仅需要1ng的cfDNA就可以建立高质量的文库，可以在样本量极少的情况下进行研究，节省了实验成本和时间。
优选地，反应条件包括：所述末端修复反应体系pH值为7.0～8.5，将所述末端修复反应体系先进行80-85℃的热盖处理，再在35-40℃反应15-30min，然后在60-70℃反应15-30min。
本发明还提供了一种基于上述任一种cfDNA末端修复方法的对血浆或精浆样本进行cfDNA末端修复的应用。
在以上技术方案的基础上，本发明还提供一种cfDNA建库方法，包括如下步骤：
步骤A.使用上述任一项所述的末端修复方法进行cfDNA末端修复；
步骤B.在末端修复体系中直接加入Illumina Adaptor、T4 DNA Ligase及T4DNALigase Buffer，进行接头连接；
步骤C.接头连接产物进行磁珠纯化，去除反应体系中的酶、盐离子及残余接头；
步骤D.进行cfDNA甲基化处理，回收甲基化的cfDNA；
步骤E.进行PCR扩增并将扩增产物纯化回收，得到cfDNA测序文库。
因需要通过dmCTP进行末端修复，以保证对cfDNA锯齿状末端序列进行保留，因此，需要先进行末端修复与接头连接，再进行甲基化转化实验，所以需要在末端修复后，通过不受甲基化转化影响的接头进行接头连接。并且在末端修复后，无需将产物纯化就可以进行接头连接，减少产物损失。
本发明还提供所述的cfDNA建库方法在对血浆或精浆样本的cfDNA进行测序中的应用。
本发明相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明通过dmCTP进行末端修复，带有甲基化修饰的胞嘧啶(dmCTP)，代替普通胞嘧啶(dmCTP)，以保证对cfDNA锯齿状末端序列进行保留。采用的末端修复酶组合试剂中的Hemo KlenTaq不具有5’→3’外切酶活性和3’→5’外切酶活性，可以保留锯齿状末端、末端平齐化并3’端添加碱基A，以获得具有粘性末端A的cfDNA片段。本发明末端修复反应的同时保留了cfDNA锯齿状末端序列，因此，通过后续数据分析能够获得cfDNA锯齿状末端序列的遗传信息。
(2)本发明减少了所需使用的cfDNA末端修复酶的种类，另外也仅需要1ng的cfDNA就可以建立高质量的cfDNA的测序文库，可以在样本量极少的情况下进行研究，节省了有限的样本资源，降低了实验成本。
(3)本发明采用先建库后甲基化转化的实验方案，可以避免转化效率低下、文库污染等问题，提高建库效率和准确性。通过不受甲基化转化影响的接头进行接头连接，并且在末端修复后，无需将产物纯化就可以进行接头连接，减少产物损失。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1的Q-seq质检图；
图2为实施例2的Q-seq质检图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种cfDNA末端修复方法，包括如下步骤：
S1.配置10×末端修复缓冲液试剂和末端修复酶组合试剂；
所述10×末端修复缓冲液试剂包含dmCTP，所述末端修复酶组合试剂包含HemoKlenTaq和T4 Polynucleotide Kinase；
S2.配置末端修复反应体系，所述末端修复反应体系包含所述10×末端修复缓冲液试剂、所述末端修复酶组合试剂和cfDNA，混匀再置于PCR仪上进行末端修复反应；
所述Hemo KlenTaq与所述T4 Polynucleotide Kinase的体积比优选为1:(0.1-1)，更优选为1:0.5。
每50μL所述末端修复反应体系中，所述dmCTP浓度优选为4-5mM，更优选为4mM。
所述10×末端修复缓冲液试剂还包含dGTP、dTTP和dATP，所述dmCTP、dGTP、dTTP和dATP的摩尔比优选为为：1：1：1：(10-15)，更优选为1:1:1:11。
优选地，每50μL所述末端修复反应体系中，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含：0.9-1.1M Tris-HCl、0.1-0.2M MgCl2、0.01-0.15M DTT、0.1-0.2M KCl和10-30mMATP，进一步优选为：1M Tris-HCl、0.2M MgCl2、0.15M DTT、0.2MKCl和30mMATP。
优选地，每50μL所述末端修复反应体系中，所述末端修复酶组合试剂包含：2-4μLHemo KlenTaq、1-2μL T4 Polynucleotide Kinase、90-100mM Tris-HCl和体积浓度45-50％的甘油，进一步优选为：2μL Hemo KlenTaq、1μL T4Polynucleotide Kinase、100mMTris-HCl和体积浓度50％的甘油。
优选地，每50μL所述末端修复反应体系中，所述cfDNA的加入量至少为1ng。
优选地，末端修复反应条件包括：所述末端修复反应体系pH值为7.0～8.5，更优选为pH 8.0，将所述末端修复反应体系先进行80-85℃的热盖处理，再在35-40℃反应15-30min，然后在60-70℃反应15-30min，进一步优选为先进行85℃的热盖处理，再在37℃反应20min，然后在68℃反应30min。
实施例1
血浆样品Jag-seq建库，包括以下步骤：
A、末端修复
每50μL反应体系中，10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
表1
每50μL反应体系中，末端修复酶组合试剂的组分和含量如下：
表2
| 组分 | 含量 |
| Hemo KlenTaq | 2μL |
| T4 Polynucleotide Kinase | 1μL |
| Tris-Hcl(pH8.0) | 100mM |
| 甘油 | 50％v/v |
末端修复包括如下步骤：
S1.取1ng cfDNA于PCR管中，在PCR管中配制如下末端修复反应混合液：
表3
| 组分 | 体积 |
| 10×末端修复缓冲液试剂 | 5μL |
| 末端修复酶组合试剂 | 5μL |
| cfDNA(1ng) | xμL |
| Nuclease-free Water | 40-xμL |
| Total | 50μL |
S2.震荡混匀5s，瞬时离心将反应液收集至管底；
S3.将含有上一步反应混合液的PCR管置于PCR仪上，如下条件反应：
表4
B、接头连接，包括如下步骤：
S1.向上一步PCR管中加入以下连接反应混合液；
表5
| 组分 | 体积 |
| T4 DNA Ligase Buffer | 8μL |
| T4 DNA Ligase | 3μL |
| NEBNext EM-seq Adaptor | 2μL |
| Nuclease-free Water | 17μL |
| Total | 80μL |
S2.震荡混匀10s，请保证混匀充分，瞬时离心将反应液收集至管底；
S3.将含有上一步反应液的PCR管置于PCR仪上，按照下表的条件进行反应：
表6
| 温度 | 时间 |
| 热盖 | 37℃ |
| 25℃ | 30min |
| 4℃ | Hold |
C、连接接头产物纯化
使用Vazyme的VAHTS DNA纯化磁珠(N411)进行DNA片段的纯化回收。包括如下步骤：
S1.提前30min取出VAHTS DNA纯化磁珠置于室温，使用前充分震荡混匀；
S2.吸取88μLVAHTSDNA纯化磁珠至80μL连接产物中，用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5min；
S3.瞬时离心，将PCR管置于磁力架，静置2min至液体澄清，移液器吸取并弃掉上清；
S4.保持PCR管固定于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，保持PCR管固定于磁力架上，等待30s后彻底弃去乙醇。
S5.重复步骤S4一次，最后一次尽量吸干管底液体，有少量残留在管壁时可将PCR管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器把管底液体吸干。
S6.保持PCR管固定于磁力架上，打开PCR管管盖，室温干燥3-5min，直至磁珠无反光、无开裂；
S7.将PCR管从磁力架上取下，加入21μLTE Buffer进行DNA洗脱，移液器吹打混匀并室温下孵育5min；
S8.瞬时离心，将PCR管置于磁力架上，静置5min至液体澄清，将20μL上清液转移到新的PCR管中，进行下一步反应或者-20℃保存。
D、甲基化处理
使用ZYMO的EZ DNAMethylation-GoldKit(D5005)进行DNA甲基化处理。包括如下步骤：
S1.将130μL的CT Conversion Reagent加入到20μL的纯化产物中。通过轻弹试管或上下移液来混合样品，然后将液体离心到试管的底部。
S2.将含有上一步反应液的PCR管置于PCR仪上，按照下表的条件进行反应：
表7
| 温度 | 时间 |
| 热盖 | 37℃ |
| 25℃ | 30min |
| 4℃ | Hold |
S3.将600μL的M-Binding Buffer添加到Zymo-SpinTM IC Column中，并将该管放入提供的Collection Tube中。
S4.将样品(从S2开始)装入含有M-Binding Buffer的Zymo-SpinTM IC Column中。关闭盖子，颠倒混匀多次。
S5.10000x g离心30s，去除Collection Tube中液体。
S6.在收集柱中加入100μL的M-Wash Buffer，10000x g离心30s，去除CollectionTube中液体。
S7.在收集柱中加入200μL的M-Desulphonation Buffer，在室温(20-30℃)下静置17min。孵育结束后，10000x g离心30s，去除Collection Tube中液体。
S8.在收集柱中加入200μL的M-Wash Buffer。10000x g离心30s，去除CollectionTube中液体。再加入200μL的M-Wash Buffer，10000x g离心30s，去除Collection Tube中液体。
S9.将收集柱置入1.5mL的EP管中。直接向收集柱中加入25μL的M-ElutionBuffer。10000x g离心30s洗脱DNA。
E、PCR扩增，包括如下步骤：
S1.按照下表配制PCR反应混合液；
表8
| 组分 | 体积 |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix | 25μL |
| Index primer | 2μL |
| DNA产物 | 23μL |
| Total | 50μL |
S2.震荡混匀5s，瞬时离心将反应液收集至管底；
S3.将上述PCR管置于PCR仪上，按照下表的条件进行反应：
表9
F、产物纯化
使用Vazyme的VAHTS DNA纯化磁珠(N411)进行PCR产物的纯化回收。包括如下步骤：
S1.提前30min取出VAHTS DNA纯化磁珠置于室温，使用前充分震荡混匀；
S2.吸取75μL VAHTS DNA纯化磁珠至50μLPCR产物中，用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5min；
S3.瞬时离心，将PCR管置于磁力架，静置2min至液体澄清，移液器吸取并弃掉上清；
S4.保持PCR管固定于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，保持PCR管固定于磁力架上，等待30s后彻底弃去乙醇。
S5.重复步骤S4一次，最后一次尽量吸干管底液体，有少量残留在管壁时可将PCR管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器把管底液体吸干。
S6.保持PCR管固定于磁力架上，打开PCR管管盖，室温干燥3-5min，直至磁珠无反光、无开裂；
S7.将PCR管从磁力架上取下，加入22μL TE Buffer进行DNA洗脱，移液器吹打混匀并室温下孵育5min；
S8.瞬时离心，将PCR管置于磁力架上，静置5min至液体澄清，将20μL上清液转移到新的PCR管中，进行文库检测，Q-seq质检图结果如图1所示，Q-seq质检有明显峰形，文库浓度值为14.5ng/μL。
实施例2
精浆样品Jag-seq建库，步骤和实施例1相同，进行文库检测，Q-seq质检图结果如图2所示，Q-seq质检有较好的峰形，文库浓度值为14.3ng/μL。表明本发明提供的cfDNA末端修复的方法也可以应用于精浆样品的cfDNA Jag-seq建库。
实施例3
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，末端修复酶组合试剂的组分和含量如下：
表10
其他均和实施例1相同。进行文库检测，文库浓度值为0.015ng/μL。
实施例4
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，末端修复酶组合试剂的组分和含量如下：
表11
| 组分 | 含量 |
| Hemo KlenTaq | 2μL |
| T4 Polynucleotide Kinase | 0 |
| Tris-Hcl(pH8.5) | 100mM |
| 甘油 | 50％v/v |
其他均和实施例1相同，进行文库检测，文库浓度值为0.153ng/μL。
实施例5
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，末端修复酶组合试剂的组分和含量如下：
表12
| 组分 | 含量 |
| Hemo KlenTaq | 0 |
| T4 Polynucleotide Kinase | 1μL |
| Tris-Hcl(pH8.5) | 100mM |
| 甘油 | 50％v/v |
其他均和实施例1相同。进行文库检测，文库浓度值为0.051ng/μL。
实施例3-5表明Hemo KlenTaq与T4 polynucleotide kinase酶组分缺少任一种酶组分都会极大降低文库浓度，会对实验结果产生影响，原因在于缺少任一种酶组分，会导致无法进行正常的cfDNA修复反应，没有经过末端修复的cfDNA可能会导致接头连接的效率降低，因为末端的不一致性可能会影响连接酶的结合和连接效率。
实施例6
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为使用dCTP替换dmCTP，具体为每50μL反应体系中，10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
表13
| 组分 | 含量 |
| Tris-Hcl(pH8.0) | 1M |
| MgCl2 | 0.2M |
| DTT | 0.15M |
| KCl | 0.2M |
| ATP | 30mM |
| dATP | 44mM |
| dGTP | 4mM |
| dTTP | 4mM |
| dCTP | 4mM |
其他均和实施例1相同。本实施例进行甲基化分析时无法检测到特殊标记dmCTP，因此无法进行锯齿状末端信息获取。
实施例7
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，末端修复酶组合试剂的组分和含量如下：
表14
| 组分 | 含量 |
| Hemo KlenTaq | 2μL |
| T4 Polynucleotide Kinase | 0.2μL |
| Tris-Hcl(pH8.5) | 100mM |
| 甘油 | 50％v/v |
其他均和实施例1相同。
实施例8
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，末端修复酶组合试剂的组分和含量如下：
表15
| 组分 | 含量 |
| Hemo KlenTaq | 4μL |
| T4 Polynucleotide Kinase | 4μL |
| Tris-Hcl(pH8.5) | 100mM |
| 甘油 | 50％v/v |
其他均和实施例1相同。
实施例1、实施例7和实施例8的文库检测结果如下：
表16
| 名称 | 比例 | 文库浓度(ng/μL) |
| Hemo KlenTaq:T4 polynucleotide kinase | 1:0.5 | 14.5 |
| Hemo KlenTaq:T4 polynucleotide kinase | 1:0.1 | 0.205 |
| Hemo KlenTaq:T4 polynucleotide kinase | 1:1 | 15 |
由此可知，在不改变其他条件的情况下，仅改变Hemo KlenTaq与T4polynucleotide kinase酶组分比例，会对实验结果产生影响。在一定程度下，增加T4polynucleotide kinase占比会使得文库浓度增加；但超过1：0.5后，增加T4polynucleotide kinase占比并不会引起文库浓度改变。因此，选择Hemo KlenTaq：T4polynucleotide kinase为1：0.5，最为合适。
实施例9
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
表17
| 组分 | 含量 |
| Tris-Hcl(pH8.0) | 1M |
| MgCl2 | 0.2M |
| DTT | 0.15M |
| KCl | 0.2M |
| ATP | 30mM |
| dATP | 55mM |
| dGTP | 5mM |
| dTTP | 5mM |
| dmCTP | 5mM |
其他均和实施例1相同。
实施例10
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
表18
其他均和实施例1相同。
实施例11
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
表19
| 组分 | 含量 |
| Tris-Hcl(pH8.0) | 1M |
| MgCl2 | 0.2M |
| DTT | 0.15M |
| KCl | 0.2M |
| ATP | 30mM |
| dATP | 24mM |
| dGTP | 4mM |
| dTTP | 4mM |
| dmCTP | 4mM |
其他均和实施例1相同。
实施例9-11的文库检测结果分析如下：
表20
| 名称 | 比例 | 文库浓度(ng/μL) |
| dmCTP+dTTP+dGTP：dATP | 1:2 | 2.11 |
| dmCTP+dTTP+dGTP：dATP | 1:3 | 13.4 |
| dmCTP+dTTP+dGTP：dATP | 3:11 | 14.7 |
在不改变其他条件的情况下，仅改变dmCTP+dTTP+dGTP：dATP组分比例，会对实验结果产生影响。在一定程度下，增加dATP的占比会使得使得文库浓度增加。
实施例12
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
表21
| 组分 | 含量 |
| Tris-Hcl(pH 8.0) | 1.1M |
| MgCl2 | 0.2M |
| DTT | 0.15M |
| KCl | 0.2M |
| ATP | 30mM |
| dATP | 44mM |
| dGTP | 4mM |
| dTTP | 4mM |
| dmCTP | 4mM |
其他均和实施例1相同。
实施例13
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
表21
| 组分 | 含量 |
| Tris-Hcl(pH8.0) | 0.9M |
| MgCl2 | 0.1M |
| DTT | 0.01M |
| KCl | 0.1M |
| ATP | 10mM |
| dATP | 44mM |
| dGTP | 4mM |
| dTTP | 4mM |
| dmCTP | 4mM |
其他均和实施例1相同。
实施例14
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为每50μL反应体系中，末端修复酶组合试剂的组分和含量如下：
表22
| 组分 | 含量 |
| Hemo KlenTaq | 2μL |
| T4 Polynucleotide Kinase | 1μL |
| Tris-Hcl(pH8.5) | 90mM |
| 甘油 | 45％v/v |
其他均和实施例1相同。
实施例12-14文库检测的文库浓度分别为14.6ng/μL、4.52ng/μL和12.56ng/μL，说明在不改变其他条件的情况下，仅改变Tris-HCl浓度，会对实验结果产生影响。在一定程度下，增加Tris-HCl浓度会使得使得文库浓度增加。
实施例15
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为cfDNA的用量为0.5ng。其他均和实施例1相同，检测文库，检测的文库浓度值为0.112ng/μL。
实施例16
血浆样品cfDNA末端修复，本实施例与实施例1的区别为cfDNA的用量为1.5ng。其他均和实施例1相同检测文库，检测的文库浓度值为19.57ng/μL。
实施例15-16与实施例1对比可知，每50μL所述末端修复反应体系中cfDNA的加入量至少为1ng，若加入量不足1ng会对文库浓度产生影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1.配置10×末端修复缓冲液试剂和末端修复酶组合试剂；
所述10×末端修复缓冲液试剂包含dmCTP，所述末端修复酶组合试剂包含HemoKlenTaq和T4 Polynucleotide Kinase；
S2.配置末端修复反应体系，所述末端修复反应体系包含所述10×末端修复缓冲液试剂、所述末端修复酶组合试剂和cfDNA，混匀再置于PCR仪上进行末端修复反应；
所述末端修复反应同时完成了三项操作：保留cfDNA锯齿状末端序列的末端平齐化，在cfDNA的3’端添加dA，以及在cfDNA的5’端修饰磷酸基团，从而获得具有粘性末端A且保留cfDNA锯齿状末端序列的cfDNA片段。
2.如权利要求1所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：所述Hemo KlenTaq与所述T4 Polynucleotide Kinase的体积比为1:(0.1-1)。
3.如权利要求1所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：每50μL所述末端修复反应体系中，所述dmCTP浓度4-5mM。
4.如权利要求3所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：所述10×末端修复缓冲液试剂还包含dGTP、dTTP和dATP，(dmCTP+dGTP+dTTP)和dATP的摩尔比为(3-5):(10-15)。
5.如权利要求4所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：每50μL所述末端修复反应体系中，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含：0.9-1.1M Tris-HCl、0.1-0.2M MgCl2、0.01-0.15M DTT、0.1-0.2M KCl和10-30mM ATP。
6.如权利要求2所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：每50μL所述末端修复反应体系中，所述末端修复酶组合试剂包含：2-4μL Hemo KlenTaq、1-2μLT4 PolynucleotideKinase、90-100mM Tris-HCl和体积浓度45-50％的甘油。
7.如权利要求4所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：每50μL所述末端修复反应体系中，所述cfDNA的加入量至少为1ng。
8.如权利要求5所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：反应条件包括：所述末端修复反应体系pH值为7.0～8.5，将所述末端修复反应体系先进行80-85℃的热盖处理，再在35-40℃反应15-30min，然后在60-70℃反应15-30min。
9.如权利要求1-8中任一项所述的cfDNA末端修复方法在对血浆或精浆样本进行cfDNA末端修复的应用。
10.一种cfDNA建库方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤A.使用如权利要求1-8中任一项所述的cfDNA末端修复方法进行cfDNA末端修复；
步骤B.在末端修复体系中直接加入IlluminaAdaptor、T4 DNA Ligase及T4DNA LigaseBuffer，进行接头连接；
步骤C.接头连接产物进行磁珠纯化，去除反应体系中的酶、盐离子及残余接头；
步骤D.进行cfDNA甲基化处理，回收甲基化的cfDNA；
步骤E.进行PCR扩增并将扩增产物纯化回收，得到cfDNA测序文库。
Priority Applications (1)
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| CN202311663149.3A CN117844884A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 一种cfDNA末端修复及建库的方法 |
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