CN108251504A

CN108251504A - 一种超快速构建基因组dna测序文库的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN108251504A
Application number: CN201810046262.XA
Authority: CN
Inventors: 曹振
Original assignee: Yi San Biotechnology (shanghai) Co Ltd
Current assignee: Yi San Biotechnology (shanghai) Co Ltd
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2018-07-06

Abstract

本发明涉及一种超快速构建基因组DNA测序文库的方法，以及基于此方法设计的快速建库试剂盒产品。通过将DNA酶切法片段化、末端修复、加dA尾和加接头等步骤合并在一个反应管中进行，大幅度节约了建库的时间。构建好的文库通过高通量测序分析，显示其具有良好的比对率和较低的偏好性。

Description

一种超快速构建基因组DNA测序文库的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种超快速构建基因组DNA测序文库的方法和试剂盒。

背景技术

随着高通量测序技术的普及，各种生物科学领域的研究或者临床检测领域都涉及到测序文库的构建及高通量测序服务。常规的测序文库制备涉及样本DNA的片段化、末端补平、5’末端磷酸化、3’末端加dA尾、接头连接和PCR扩增等多种步骤，而且步骤之间还需要多次的核酸纯化，既耗时又容易造成样本损失。目前有部分商业化试剂盒，如KAPABiosystems、NEB等公司提供的产品，将末端修复和加dA尾的建库步骤进行合并，达到节约时间、降低损耗的目的。但针对一些每日需要处理大量建库样本及初次接触建库的工作人员来说，传统的建库方法还是太过繁琐。特别是DNA的片段化，一般需使用专门的超声片段化仪来完成，耗材成本较大。

如上所述，为满足日益旺盛的高通测序需求，市场急需一款可将DNA片段化、修复和加dA尾步骤合并的测序文库构建产品，以改善目前建库耗时长、步骤繁琐的缺点。

发明内容

本发明旨在提供一种快速、便捷的基因组DNA文库构建方法，以提高大规模建库的效率及降低建库的操作难度。

为实现上述目的，本发明提供一种超快速构建基因组DNA测序文库的方法，包括以下步骤：步骤一、对样本DNA进行酶切法片段化，得到片段化DNA；步骤二、对步骤二得到的片段化DNA直接进行末端修复和加dA尾，得到末端修复和加dA尾的DNA；步骤三、将步骤二得到的末端修复和加dA尾的DNA与接头进行连接，得到带有barcode的接头连接产物；步骤四、对带有barcode的接头连接产物进行PCR扩增，得到基因组DNA测序文库。

进一步地，步骤一中进行酶切法片段化的酶为多种识别四个碱基的限制性内切酶的组合；限制性内切酶的酶切产物的末端具有5’突出的结构。

进一步地，限制性内切酶对甲基化不敏感。这有利于避免由于真核生物的DNA有甲基化修饰时，出现所选用的限制性内切酶不能切割甲基化修饰的位点的问题。

进一步地，限制性内切酶的组合选自MspI、AluI、CviQI、MseI、MlucI、HaeIII中的多种。这里的多种指两种及两种以上，包括上述可选的全部限制性内切酶。

进一步地，步骤一的反应条件是37℃，5-10分钟。反应后无需纯化。

进一步地，步骤二采用Taq DNA聚合酶对片段化DNA进行末端修复和加dA尾。只使用Taq DNA聚合酶即可完成对片段化DNA的末端修复和加dA尾，无需额外使用其他酶。上述末端修复和加dA尾步骤可通过Taq DNA聚合酶一步完成，是由于上述片段化DNA具有5’突出末端，可利用Taq DNA聚合酶的5’-3’的碱基延伸活性将3’端补齐，又可利用Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性进行3’端的dA尾添加。

优选地，步骤二的反应条件是72℃，20分钟。反应后无需纯化。

进一步地，步骤一和步骤二合并为一步在同一个反应体系中完成；该反应体系为缓冲液、多种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、所述样本DNA、dNTP和水。其中，缓冲液为10×cutsmart缓冲液，多种限制性内切酶为MspI、MlucI、AluI、CviQI等体积混合液，水为ddH₂O。优选地，该反应体系于37℃反应5-10分钟，72℃反应20分钟。

进一步地，步骤三中采用的DNA连接试剂为T4DNA连接酶和连接促进剂；连接促进剂由聚乙二醇6000(PEG 6000)、牛血清白蛋白(BSA)和曲拉通X-100(Triton X-100)所组成。优选地，步骤三的反应条件是20℃，15分钟；反应后进行磁珠纯化或分选。

步骤三将步骤二得到的末端修复和加dA尾的DNA与接头进行连接，连接完成后进行磁珠纯化或片段分选，去除多余的接头。所述接头为带有barcode的接头。

进一步地，在步骤四进行PCR扩增后，将PCR产物再经过磁珠纯化，得到基因组DNA测序文库。优选地，磁珠纯化为双轮磁珠分选。

本发明还涉及一种超快速构建基因组DNA测序文库的试剂盒，包括识别四个碱基的限制性内切酶混合液、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、连接促进剂、dNTP、ATP、接头、高保真DNA聚合酶、二硫苏糖醇。

进一步地，限制性内切酶混合液为MspI、AluI、CviQI、MseI、MlucI、HaeIII中的多种酶的组合。

进一步地，连接促进剂由由聚乙二醇6000(PEG 6000)、牛血清白蛋白(BSA)和曲拉通X-100(Triton X-100)所组成。

进一步地，采用如上所述的超快速构建基因组DNA测序文库的方法进行高通量测序文库的构建。

本发明具有以下技术特点：

1)酶切法片段化：本方法和试剂盒均集成了DNA片段化模块(多种限制性内切酶的组合，或者叫限制性内切酶混合液)，无需超声破碎DNA，降低成本，且操作方便。

2)末端修复效率：本方法和试剂盒选用的片段化酶为多种限制性内切酶的组合，其酶切产物具有5’突出末端，可直接使用Taq DNA聚合酶进行末端补齐及3’端dA尾添加，极大地提高了末端修复的效率。

3)接头连接效率：本方法和试剂盒选用多种小分子物质作为连接促进剂，如PEG6000、BSA和Triton X-100，经过系统地优化后极大地提高了接头连接效率。

4)单管法：常规DNA建库试剂盒，需要在末端修复、加dA尾、接头连接、PCR扩增等每一步之后进行磁珠纯化，从而使得整个试验过程有多个液体转移、开闭管盖的步骤，存在交叉污染的风险。本发明从DNA片段化至接头连接都在一个反应管中进行，中间没有纯化步骤，减少了样本转移过程出错的可能。

5)快速：由于PCR扩增前的步骤减少到两步(包括步骤一和步骤二合并成的一步，以及步骤三)，同时在一管完成，比起常规方法需要4～5个小时完成的文库构建工作，本方法可以在1.5小时内完成，大大缩短了整个试验过程。

附图说明

图1是100ng和500ng小牛胸腺DNA进行酶切法片段化后得到的片段化DNA的电泳图。

图2是10ng三种不同GC含量细菌(蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌和嗜盐杆菌)基因组DNA建库后使用Agilent 2100DNA 1000 Chip质控结果。其中，蜡状芽孢杆菌，GC含量为34％；大肠杆菌，GC含量为51％；嗜盐杆菌，GC含量为65％；FU(fluorescence units)表示荧光单位。

图3-5分别是10ng蜡状芽孢杆菌基因组DNA、10ng大肠杆菌基因组DNA和10ng嗜盐杆菌基因组DNA经建库后进行高通量测序，测序结果使用Bowtie 2将Reads进行比对并使用Picard's Collect GC Bias Metrics计算GC覆盖度的结果。其中，预期的标准化覆盖度1.0以灰色的水平线表示；不同GC％中100bp区域的数量以条形图显示；空心圈组成的线表示标准化后的文库覆盖度。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于优化酶切法基因组DNA片段化条件

本发明中的酶切法片段化部分是此发明的核心组分，此片段化酶由几种精心挑选的限制性内切酶组成。在本实施例中，我们选择了MspI、MlucI、AluI、CviQI这四种限制性内切酶，这些酶的切割位点分别为C^CGG、^AATT、AG^CT、G^TAC，其酶切产物的末端具有5’突出结构。该种末端结构便于直接使用Taq DNA聚合酶来完成末端修复和加dA的目标，且酶切后的片段损伤较小，可提高整个文库建库的出库量。

本实施例以小牛胸腺DNA为模板进行，使用上述四种限制性内切酶组合进行酶切片段化，并设置酶切时间梯度，具体操作如下：

现将商业化购买的四种限制性内切酶MspI、MlucI、AluI、CviQI进行等体积混合，混合液命名为片段化酶混合液(Fragment enzyme mix)，并按照表1的DNA酶切片段化体系配制酶切反应体系：

表1.DNA酶切片段化体系

将混合好的体系置于热循环仪中，不开热盖，37℃分别处理5、10、20、30分钟。反应结束后，添加5μl 0.5M的EDTA，可终止酶切反应，并使用2％胶浓度的琼脂糖凝胶电泳来观察酶切结果。

通过电泳结果(图1)，可以清晰地看到小牛胸腺DNA在不同的酶切时间作用下，呈现梯度的条带大小分布。根据一般建库需求，可选择酶切30分钟，使片段大小位于100-500bp之间，但如果酶切的起始DNA量更少的话，所需的酶切时间可能更短，这需要后期进行优化实验。

实施例2

本实施例用于说明本发明可用于快速基因组DNA文库构建

1)使用OMEGA公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒，抽提蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌和嗜盐杆菌三种细菌的基因组DNA。其中，蜡状芽孢杆菌购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，货号为1.10559；大肠杆菌购买自北京全式金生物科技有限公司，货号为CD601；嗜盐杆菌购买自ATCC，货号为ATCC-29341。

2)使用Qubit定量上述DNA后，各取10ng用于建库。

3)按表2配制DNA片段化、末端修复和加dA尾反应体系，然后于37℃反应10分钟，72℃反应20分钟。

表2.一步法DNA片段化、末端修复和加dA尾反应体系

4)按表3配制接头连接体系，然后于20℃反应15分钟。

表3.接头连接体系

5)接头连接产物使用1.0×Hieff NGS^TM DNA分选磁珠(1.0×Hieff NGS^TM DNASelection Beads)进行纯化，去除多余接头，产物用21μl无菌超纯水洗脱，取20μl用于后续实验。

6)按表4配制接头PCR扩增体系，并按表5推荐的反应程序进行10个循环的PCR，对已连接接头的文库进行扩增。接头的结构是：所有的接头两端序列都一样，只有中间的barcode序列不同，故连接了接头的文库，可以使用同一对引物进行扩增。所用的引物如下：

文库扩增引物1：

5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’(如SEQ ID NO.1所示)

文库扩增引物2：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(如SEQ ID NO.2所示)

表4.文库扩增体系

表5.文库扩增反应程序

7)文库扩增产物使用Hieff NGS^TM DNA分选磁珠(Hieff NGS^TM DNA SelectionBeads)进行双轮分选。第一轮加入35μl Hieff NGS^TM DNA分选磁珠，进行分选，无需洗脱，直接进入第二轮。第二轮加入10μl Hieff NGS^TM DNA分选磁珠，进行分选。最后用21μl无菌超纯水洗脱，取20μl用于文库产量测定。使用Qubit测得蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌和嗜盐杆菌基因组DNA文库的产量分别为986ng、1021ng和1045ng。使用Agilent 2100核酸分析仪检测三种文库(图2)，结果显示文库构建良好，分布均匀、无接头残留。

8)将文库送至诺禾致源公司进行高通量测序，测序数据与参考基因组比对(mapping)结果如下表所示。测序数据同时进行生物信息学分析(图3-5)，结果显示其在各自的GC含量覆盖范围内，与参考基因组具有几乎一致的覆盖度，说明测序数据均一度较好。

表6.三种细菌基因组DNA高通量测序结果

本发明提供一种超快速构建基因组DNA测序文库的方法，包括以下步骤：步骤一、对样本DNA进行酶切法片段化，得到片段化DNA；步骤二、对步骤二得到的片段化DNA直接进行末端修复和加dA尾，得到末端修复和加dA尾的DNA；步骤三、将步骤二得到的末端修复和加dA尾的DNA与接头进行连接，得到带有barcode的接头连接产物；步骤四、对带有barcode的接头连接产物进行PCR扩增，得到基因组DNA测序文库。其中步骤一体现在实施例1中；步骤二到四体现在实施例2中。

从实施例1和2可以看出，本发明涉及的一种超快速构建基因组DNA测序文库的试剂盒，包括识别四个碱基的限制性内切酶混合液、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、连接促进剂、dNTP、ATP、接头、高保真DNA聚合酶、二硫苏糖醇。且采用该试剂盒进行如实施例1和2的方法可以实现超快速构建基因组DNA测序文库。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 翌圣生物科技（上海）有限公司

<120> 一种超快速构建基因组DNA测序文库的方法和试剂盒

<130> 01519-17001PIX

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagcagaag acggcatacg a 21

Claims

1.一种超快速构建基因组DNA测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、对样本DNA进行酶切法片段化，得到片段化DNA；

步骤二、对所述步骤二得到的片段化DNA直接进行末端修复和加dA尾，得到末端修复和加dA尾的DNA；

步骤三、将所述步骤二得到的末端修复和加dA尾的DNA与接头进行连接，得到带有barcode的接头连接产物；

步骤四、对带有barcode的接头连接产物进行PCR扩增，得到所述基因组DNA测序文库。

2.如权利要求1所述的超快速构建基因组DNA测序文库的方法，其特征在于，所述步骤一中进行酶切法片段化的酶为多种识别四个碱基的限制性内切酶的组合；所述限制性内切酶的酶切产物的末端具有5’突出的结构。

3.如权利要求2所述的超快速构建基因组DNA测序文库的方法，其特征在于，所述限制性内切酶的组合选自MspI、AluI、CviQI、MseI、MlucI、HaeIII中的多种。

4.如权利要求1所述的超快速构建基因组DNA测序文库的方法，其特征在于，所述步骤一的反应条件是37℃，5-10分钟。

5.如权利要求1所述的超快速构建基因组DNA测序文库的方法，其特征在于，所述步骤二采用Taq DNA聚合酶对所述片段化DNA进行末端修复和加dA尾。

6.如权利要求1所述的超快速构建基因组DNA测序文库的方法，其特征在于，所述步骤一和所述步骤二合并为一步在同一个反应体系中完成；所述反应体系为缓冲液、多种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、所述样本DNA、dNTP和水。

7.如权利要求1所述的超快速构建基因组DNA测序文库的方法，其特征在于，所述步骤三中采用的DNA连接试剂为T4 DNA连接酶和连接促进剂；所述连接促进剂由聚乙二醇6000、牛血清白蛋白和曲拉通X-100所组成。

8.一种超快速构建基因组DNA测序文库的试剂盒，其特征在于，包括识别四个碱基的限制性内切酶混合液、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、连接促进剂、dNTP、ATP、接头、高保真DNA聚合酶、二硫苏糖醇。

9.如权利要求8所述的超快速构建基因组DNA测序文库的试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶混合液为MspI、AluI、CviQI、MseI、MlucI、HaeIII中的多种酶的组合。

10.如权利要求8所述的超快速构建基因组DNA测序文库的试剂盒，其特征在于，所述连接促进剂由由聚乙二醇6000、牛血清白蛋白和曲拉通X-100所组成。