CN115125223B - 一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用 - Google Patents

一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用，所述酶组合物包括用于片段化核酸的核酸内切酶和用于修复粘性末端的DNA聚合酶，还包括用于消化原始样本或反应过程中产生的单链，核酸内切酶、DNA聚合酶和核酸外切酶集中在一个反应体系中，在一定的浓度范围内相互配合，实现了对核酸样本的高效片段化切割，同时避免了额外单链的产生，构建的文库进行二代测序，获得的测序数据颠倒嵌合假阳性突变率低，解决了现有片段化酶法文库构建方法的测序数据单核苷酸位点变异或基因嵌合突变率假阳性背景高的问题，在文库构建领域具有重要意义。

Description

一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用
本申请是2021年2月9日提出的，名称为“一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用”的发明专利申请No.202110181154.5的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用，尤其涉及一种用于核酸片段化的酶组合物及其在文库构建中的应用。
背景技术
自人类基因组计划完成以来，测序技术得到了快速的发展。近年来，以二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)为主的高通量测序成本大幅下降，高通量测序市场迅速增长。随着高通量测序技术逐渐标准化和规范化，该技术已广泛应用于常规临床实践，应用领域包括无创产前检测(NIPT)、胚胎植入前遗传学筛查(PGS)、胚胎植入前遗传学诊断(PGD)、疾病筛查、肿瘤和药物基因组检测、病原微生物检测等。
目前，肿瘤NGS检测主要对体细胞突变来源的肿瘤进行分析(即肿瘤伴随诊断)，如非小细胞肺癌、结直肠癌等。通过NGS分析肿瘤中的突变基因，为肿瘤的靶向治疗提供依据，同时也为肿瘤分子分型、预后评价、耐药性分析和复发监测等提供有效信息。肿瘤NGS检测还用于筛查生殖细胞变异引起的遗传性肿瘤综合征，如遗传性乳腺癌，通过对具有肿瘤家族背景史的趋向者进行检测，有利于将肿瘤防治措施前移至预防阶段。肿瘤NGS检测还广泛应用于液体活检领域，大量研究证实，肿瘤患者的外周血中含有游离肿瘤DNA(ctDNA)，ctDNA取材方便，是潜在的肿瘤个体化诊断、预后和复发风险评估标志物。国内外先后发布了非小细胞癌ctDNA检测指南，为临床开展ctDNA的NGS检测提供了依据，为肿瘤分子分型和个体化治疗提供了精细化指导。此外，NGS技术还在病原微生物鉴定、法医鉴定和HLA配型等多个领域具有潜在的应用优势，可以同时检测多个样本，成为了强有力的分子诊断工具。
将NGS技术应用于临床肿瘤检测涉及多个流程，主要包括样品制备(核酸提取)、文库构建、上机测序以及数据过滤比对分析四个环节。人类全基因组碱基数约为3G，对临床诊断数据进行分析判定体细胞突变、融合突变类型等，通常需要上千甚至上万乘的覆盖度，使得全基因组测序成本非常高，因此，在文库构建后通常需要进行全部外显子捕获或目标区域捕获。全基因组测序通过对基因组上所有的基因进行测序分析，找到大量的SNV、CNV、Indel、SV(结构变异)、Fusion等基因变异信息，有利于全面解析癌症发生发展的分子机制。而外显组捕获测序主要针对基因组外显子区域的SNV(单核苷酸变异)进行数据分析，分析Indel(插入缺失)、CNV(拷贝数变异)、Fusion等基因变异类型和癌症的相关性。目标捕获测序则对一些功能富集的基因或研究人员感兴趣的基因组的部分区域进行捕获，分析基因变异对癌症的影响。
从NGS技术应用于临床肿瘤检测的整个流程来看，文库构建是最重要的环节之一。将NGS应用于临床诊断领域不仅对文库的构建时间、经济成本以及操作便捷性提出了新的要求，而且对文库下机数据的真实性、SNV、CNV、Indel等指标的检出灵敏度也提出了更高的要求。目前许多第三方检测机构承诺采用NGS进行肿瘤诊断、72小时内出具诊断报告，意味着72小时内需完成样本制备、DNA预文库构建、靶向富集、上机测序、数据分析和临床诊断报告出具等步骤，对实验操作时间和操作便捷性均有非常高的要求，因此越来越多的检测机构在预文库构建环节采用片段化酶法来代替传统的机械打断法。
目前市场上已经有多个商业机构，比如NEB、KAPA、Enzymatics推出了片段化酶法DNA文库构建试剂盒。相较于传统的机械打断法，片段化酶法在操作便捷性和时间成本上具有显著优势，但其下机数据的假阳性率比机械打断法高出一个甚至几个数量级。尤其对于小区域的靶向捕获，当测序深度达到几千甚至上万乘时，假阳性背景问题被进一步放大。已有文献报道KAPA和Enymatics的片段化酶法建库试剂盒构建的文库的颠倒嵌合假阳性背景非常高，而SNV等体细胞突变假阳性背景与颠倒嵌合假阳性背景呈正相关。主要是由于片段化酶法构建DNA文库过程中产生的单链非特异性互补配对，再通过聚合酶延伸补平粘性末端导致。由于FFPE样本本身存在损伤、降解以及提取过程存在高温脱腊环节，造成FFPE样本中的单链DNA占比更高，因此颠倒嵌合假阳性背景在FFPE样本上的表现尤为显著。这种假阳性背景具有较强的序列特征，都表现为一条测序read一部分比对到Watson链，而另一部分比对到了基因组临近位置的Crick链，从而造成了颠倒嵌合，此种reads在已发表的文献中被称为SSARreads(Strand-SplitArtifact Reads)。由于分析比对软件固有的比对算法，这部分比对到基因组临近位置Crick链的这序列又会被判定为SNP突变，从而造成SNP假阳性背景过高。这些由片段化酶建库试剂引入的假阳突变背景均具有序列特征，在生信分析比对时可以通过过滤来去除，但仍然增加了将真实突变遗漏的风险，因此解决这一问题的根本在于DNA文库构建试剂而非生信分析环节。文库构建环节接近的根本思路为降低文库构建过程中单链产生的概率，并且将样本中原先存在的单链DNA进行消除。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用，采用所述酶组合物进行核酸片段化不仅操作简便、成本低廉，而且获得的片段化核酸样本颠倒嵌合假阳性率低，在构建测序文库中具有重要的应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于核酸片段化的酶组合物，所述酶组合物包括核酸内切酶和DNA聚合酶。
本发明中，酶组合物包括用于片段化核酸的核酸内切酶和用于修复粘性末端的DNA聚合酶，核酸内切酶和DNA聚合酶在一定的浓度范围内相互配合，实现了对核酸样本的高效片段化切割，同时避免了额外单链的产生，显著降低了颠倒嵌合假阳性突变率。
优选地，本发明采用核酸内切酶对核酸进行片段化，所述核酸内切酶包括热敏感性DNA酶、T7核酸内切酶、盐活性核酸内切酶SAN、核酸内切酶Vvn、核酸内切酶DNaseI或热稳定双链特异性DNA核酸酶中的任意一种或至少两种的组合。
在一些实施方案中，所述核酸内切酶包括对单链DNA和双链DNA均具有切割活性的核酸内切酶、或仅对双链DNA具有切割活性的核酸内切酶，例如可以是来源于北极虾(Pandalus borealis)的热敏感性DNA酶(thermolabile DNase)、来源于T7噬菌体的T7核酸内切酶(EndonucleaseI)、盐活性核酸内切酶SAN、来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn、来源于牛胰的核酸内切酶DNaseI或来源于短尾派蟹(Brachyura)的热稳定双链特异性DNA核酸酶(thermostable duplex-specific nuclease)中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述热敏感性DNA酶在所述酶组合物中的用量为0.0001～2U/μL，优选为0.0005～1U/μL。
优选地，所述T7核酸内切酶在所述酶组合物中的用量为0.001～2U/μL，优选为0.005～0.05U/μL。
优选地，所述盐活性核酸内切酶SAN在所述酶组合物中的用量为(1～3)×10-4U/μL。
优选地，所述核酸内切酶Vvn在所述酶组合物中的用量为1ng/μL～1μg/μL，优选为1～10ng/μL。
优选地，所述核酸内切酶DNaseI在所述酶组合物中的用量为0.0001～2U/μL，优选为0.0005～1U/μL。
优选地，所述热稳定双链特异性DNA核酸酶在所述酶组合物中的用量为0.0001～2U/μL，优选为0.0005～1U/μL。
本发明中，通过优化核酸内切酶在酶组合物中的种类、浓度、用量等参数来控制核酸片段化速率，与DNA聚合酶协同配合，避免了颠倒嵌合假阳性突变的产生。
优选地，本发明采用DNA聚合酶修复片段化核酸的粘性末端、并避免产生额外的单链，所述DNA聚合酶包括低温DNA聚合酶，所述低温DNA聚合酶包括T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、DNA聚合酶I或DNA聚合酶I大片段Klenow中的任意一种或至少两种的组合。
在一些实施方案中，所述低温DNA聚合酶例如可以是来源于T4噬菌体的T4 DNA聚合酶、来源于T7噬菌体的T7 DNA聚合酶、来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I或来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述低温DNA聚合酶在所述酶组合物中的用量为0.5～100U/μL，优选为1～10U/μL，进一步优选为1～5U/μL。
本发明中，通过优化DNA聚合酶在酶组合物中的种类、浓度、用量等参数来控制末端修复速率并避免产生额外的单链，与核酸内切酶相互配合，降低了片段化样本的颠倒嵌合假阳性突变率。
优选地，所述酶组合物还包括核酸外切酶，用于消化原始样本或反应过程中产生的单链，核酸内切酶、DNA聚合酶和核酸外切酶集中在一个反应体系中，在一定的浓度范围内相互配合，实现了对核酸样本的高效片段化切割，同时避免了额外单链的产生，显著降低了颠倒嵌合假阳性突变率。
优选地，本发明采用核酸外切酶消化原始样本或反应过程中产生的单链，包括核酸外切酶I、核酸外切酶S1、核酸外切酶T或绿豆核酸酶中的任意一种或至少两种的组合。
在一些实施方案中，所述核酸外切酶例如可以是来源于嗜冷海洋菌(psychrophilic marine bacterium)的核酸外切酶I(Exonuclease I)、来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的核酸外切酶S1(Nuclease S1)、来源于T7噬菌体的核酸外切酶T(Exonuclease T)或来源于绿豆芽(Mung bean sprouts)的绿豆核酸酶(MungBeanNuclease)中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述核酸外切酶在所述酶组合物中的用量为0.01～50U/μL，优选为0.01～3U/μL。
本发明中，通过优化核酸外切酶在酶组合物中的种类、浓度、用量等参数来去除原始样本中或片段化过程中产生的单链，与核酸内切酶和DNA聚合酶协同作用，降低了片段化样本的颠倒嵌合假阳性突变率。
在一些实施方案中，所述酶组合物还包括耐热DNA聚合酶，所述耐热DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，在已切割核酸的3’端进行加A尾反应，以便后续基于TA连接原理进行接头连接反应。
本发明中，术语“耐热DNA聚合酶”可以是Taq DNA聚合酶，在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90％，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60％，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40％，术语“低温DNA聚合酶”是相对于“耐热DNA聚合酶”而言，不具有耐热活性的DNA聚合酶。
优选地，所述Taq DNA聚合酶在所述酶组合物中的用量为0.1～5U/μL，优选为0.1～0.2U/μL，进一步优选为0.2U/μL。
在一些实施方案中，所述酶组合物还包括多聚核苷酸激酶，所述多聚核苷酸激酶包括T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)，对已切割的核酸进行5’磷酸化。
优选地，所述T4多聚核苷酸激酶在所述酶组合物中的用量为0.1～5U/μL，优选为0.5～1U/μL，进一步优选为0.5U/μL。
在一些实施方案中，所述酶组合物包括核酸内切酶、来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶；
其中，所述核酸内切酶包括来源于北极虾(Pandalus borealis)的热敏感性DNA酶(thermolabile DNase)、来源于T7噬菌体的T7核酸内切酶(EndonucleaseI)、盐活性核酸内切酶SAN、来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn、来源于牛胰的核酸内切酶DNaseI或来源于短尾派蟹(Brachyura)的热稳定双链特异性DNA核酸酶(thermostable duplex-specificnuclease)中的任意一种或至少两种的组合，优选为T7核酸内切酶和核酸内切酶Vvn的组合。
优选地，所述热敏感性DNA酶在所述酶组合物中的浓度为(1～5)×10-3U/μL，例如可以是1×10-3U/μL、3×10-3U/μL或5×10-3U/μL。
优选地，所述T7核酸内切酶在所述酶组合物中的浓度为0.005～0.05U/μL，例如可以是0.005U/μL、0.01U/μL或0.05U/μL。
优选地，所述盐活性核酸内切酶SAN在所述酶组合物中的浓度为(1～3)×10-4U/μL，例如可以是1×10-4U/μL、2×10-4U/μL或3×10-4U/μL。
优选地，所述核酸内切酶Vvn在所述酶组合物中的浓度为1～10ng/μL，例如可以是1ng/μL、2ng/μL、5ng/μL或10ng/μL。
优选地，所述核酸内切酶DNaseI在所述酶组合物中的浓度为(1～2)×10-3U/μL，例如可以是1×10-3U/μL、1.5×10-3U/μL或2×10-3U/μL。
优选地，所述热稳定双链特异性DNA核酸酶在所述酶组合物中的浓度为(5～7)×10-3U/μL，例如可以是5×10-3U/μL、6×10-3U/μL或7×10-3U/μL。
优选地，所述DNA聚合酶I大片段Klenow在所述酶组合物中的浓度为3～5U/μL，例如可以是3U/μL、4U/μL或5U/μL，优选为3U/μL。
优选地，所述Taq DNA聚合酶在所述酶组合物中的浓度为0.1～0.2U/μL，例如可以是0.1U/μL或0.2U/μL，优选为0.2U/μL。
优选地，所述T4多聚核苷酸激酶在所述酶组合物中的浓度为0.5～1U/μL，例如可以是0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL或1U/μL，优选为0.5U/μL。
本发明中，采用(1～5)×10-3U/μL热敏感性DNA酶、0.005～0.05U/μL T7核酸内切酶、(1～3)×10-4U/μL盐活性核酸内切酶SAN、1～10ng/μL核酸内切酶Vvn、(1～2)×10-3U/μL核酸内切酶DNaseI或(5～7)×10-3U/μL热稳定双链特异性DNA核酸酶中的任意一种，与3U/μL DNA聚合酶I大片段Klenow、0.2U/μLTaq DNA聚合酶和0.5U/μLT4多聚核苷酸激酶组成酶组合物进行核酸片段化，构建测序文库后进行二代测序，得到的测序读长的SSARreads(％)比例小于0.4，最低可达到0.0878，颠倒嵌合假阳性突变数不高于510。
在一些实施方案中，所述酶组合物包括来源于T7噬菌体的T7核酸内切酶(EndonucleaseI)、来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn、低温DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶；
其中，所述低温DNA聚合酶包括来源于T4噬菌体的T4 DNA聚合酶、来源于T7噬菌体的T7 DNA聚合酶、来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I或DNA聚合酶I大片段Klenow中的任意一种，优选为DNA聚合酶I大片段Klenow。
优选地，所述T7核酸内切酶在所述酶组合物中的浓度为0.005～0.05U/μL，例如可以是0.005U/μL、0.01U/μL、0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL或0.05U/μL，优选为0.05U/μL。
优选地，所述核酸内切酶Vvn在所述酶组合物中的浓度为1～10ng/μL，例如可以是1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、4ng/μL、5ng/μL、6ng/μL、7ng/μL、8ng/μL、9ng/μL或10ng/μL，优选为10ng/μL。
优选地，所述T4 DNA聚合酶在所述酶组合物中的浓度为1～5U/μL，例如可以是1U/μL、2U/μL、3U/μL、4U/μL或5U/μL。
优选地，所述T7 DNA聚合酶在所述酶组合物中的浓度为1～5U/μL，例如可以是1U/μL、2U/μL、3U/μL、4U/μL或5U/μL。
优选地，所述DNA聚合酶I在所述酶组合物中的浓度为1～5U/μL，例如可以是1U/μL、2U/μL、3U/μL、4U/μL或5U/μL。
优选地，所述DNA聚合酶I大片段Klenow在所述酶组合物中的浓度为1～5U/μL，例如可以是1U/μL、2U/μL、3U/μL、4U/μL或5U/μL。
优选地，所述Taq DNA聚合酶在所述酶组合物中的浓度为0.1～0.2U/μL，例如可以是0.1U/μL或0.2U/μL，优选为0.2U/μL。
优选地，所述T4多聚核苷酸激酶在所述酶组合物中的浓度为0.5～1U/μL，例如可以是0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL或1U/μL，优选为0.5U/μL。
本发明中，采用1～5U/μL T4 DNA聚合酶、1～5U/μL T7 DNA聚合酶、1～5U/μL DNA聚合酶I或1～5U/μL Klenow中的任意一种，与0.005～0.05U/μL T7核酸内切酶(EndonucleaseI)、1～10ng/μL核酸内切酶Vvn、0.2U/μL Taq DNA聚合酶和0.5U/μLT4多聚核苷酸激酶组成酶组合物进行核酸片段化，构建测序文库后进行二代测序，得到的测序读长的SSAR reads(％)比例低于9，最低仅0.0846，颠倒嵌合假阳性突变数不高于1864。
在一些实施方案中，所述酶组合物包括来源于T7噬菌体的T7核酸内切酶、来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn、来源于T4噬菌体的T4 DNA聚合酶、核酸外切酶、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶；
其中，所述核酸外切酶包括来源于嗜冷海洋菌(psychrophilic marinebacterium)的核酸外切酶I(Exonuclease I)、来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的核酸外切酶S1(Nuclease S1)、来源于T7噬菌体的核酸外切酶T(Exonuclease T)或来源于绿豆芽(Mungbean sprouts)的绿豆核酸酶(Mung BeanNuclease)中的任意一种。
优选地，所述T7核酸内切酶在所述酶组合物中的浓度为0.005～0.05U/μL，例如可以是0.005U/μL、0.01U/μL、0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL或0.05U/μL，优选为0.05U/μL。
优选地，所述核酸内切酶Vvn在所述酶组合物中的浓度为1～10ng/μL，例如可以是1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、4ng/μL、5ng/μL、6ng/μL、7ng/μL、8ng/μL、9ng/μL或10ng/μL，优选为10ng/μL。
优选地，所述T4 DNA聚合酶在所述酶组合物中的浓度为3～5U/μL，例如可以是3U/μL、4U/μL或5U/μL，优选为3U/μL。
优选地，所述核酸外切酶I在所述酶组合物中的浓度为0.03～1U/μL，例如可以是0.03U/μL、0.1U/μL、0.3U/μL或1U/μL。
优选地，所述核酸外切酶S1在所述酶组合物中的浓度为0.02～2U/μL，例如可以是0.02U/μL、0.1U/μL、0.5U/μL或2U/μL。
优选地，所述核酸外切酶T在所述酶组合物中的浓度为0.03～1U/μL，例如可以是0.03U/μL、0.1U/μL、0.3U/μL或1U/μL。
优选地，所述绿豆核酸酶在所述酶组合物中的浓度为0.02～2U/μL，例如可以是0.02U/μL、0.1U/μL、0.5U/μL或2U/μL，优选为0.1～2U/μL。
优选地，所述Taq DNA聚合酶在所述酶组合物中的浓度为0.1～0.2U/μL，例如可以是0.1U/μL或0.2U/μL，优选为0.2U/μL。
优选地，所述T4多聚核苷酸激酶在所述酶组合物中的浓度为0.5～1U/μL，例如可以是0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL或1U/μL，优选为0.5U/μL。
本发明中，采用0.05U/μLT7核酸内切酶、10ng/μL核酸内切酶Vvn、3U/μLT4 DNA聚合酶、0.2U/μLTaq DNA聚合酶和0.5U/μLT4多聚核苷酸激酶，与0.03～1U/μL核酸外切酶I、0.02～2U/μL核酸外切酶S1、0.03～1U/μL核酸外切酶T或0.02～2U/μL绿豆核酸酶组合形成酶组合物进行核酸片段化，构建测序文库后进行二代测序，得到的测序读长的SSAR reads(％)比例低于17，最低仅0.2398，颠倒嵌合假阳性突变数不高于3636。
在一些实施方案中，所述酶组合物包括来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn、来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶。
优选地，所述来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn在所述酶组合物中的浓度为5～10ng/μL，例如是5ng/μL、6ng/μL、7ng/μL、8ng/μL、9ng/μL或10ng/μL。
优选地，所述来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow在所述酶组合物中的浓度为1～5U/μL，例如是1U/μL、2U/μL、3U/μL、4U/μL或5U/μL。
优选地，所述Taq DNA聚合酶在所述酶组合物中的浓度为0.1～0.2U/μL，例如是0.1U/μL或0.2U/μL，优选为0.2U/μL。
优选地，所述T4多聚核苷酸激酶在所述酶组合物中的浓度为0.5～1U/μL，例如是0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL或1U/μL，优选为0.5U/μL。
在一些实施方案中，所述酶组合物包括来源于牛胰的核酸内切酶DNaseI、来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶。
优选地，所述来源于牛胰的核酸内切酶DNaseI在所述酶组合物中的浓度为0.001U/μL。
优选地，所述来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow在所述酶组合物中的浓度为1～5U/μL，例如是1U/μL、2U/μL、3U/μL、4U/μL或5U/μL。
优选地，所述Taq DNA聚合酶在所述酶组合物中的浓度为0.1～0.2U/μL，例如是0.1U/μL或0.2U/μL，优选为0.2U/μL。
优选地，所述T4多聚核苷酸激酶在所述酶组合物中的浓度为0.5～1U/μL，例如是0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL或1U/μL，优选为0.5U/μL。
在一些实施方案中，所述酶组合物包括来源于T7噬菌体的T7核酸内切酶(Endonuclease I)、来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn、来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow或来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I的至少一种DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶。
优选地，所述T7核酸内切酶在所述酶组合物中的浓度为0.005～0.05U/μL，例如是0.005U/μL、0.01U/μL或0.05U/μL。
优选地，所述核酸内切酶Vvn在所述酶组合物中的浓度为1～10ng/μL，例如是1ng/μL、2ng/μL、5ng/μL或10ng/μL。
优选地，所述来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow或来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I在所述酶组合物中的浓度为1～5U/μL，例如是1U/μL、2U/μL、3U/μL、4U/μL或5U/μL。
优选地，所述Taq DNA聚合酶在所述酶组合物中的浓度为0.1～0.2U/μL，例如是0.1U/μL或0.2U/μL，优选为0.2U/μL。
优选地，所述T4多聚核苷酸激酶在所述酶组合物中的浓度为0.5～1U/μL，例如是0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL或1U/μL，优选为0.5U/μL。
在一些实施方案中，所述酶组合物可进一步包含核酸外切酶，所述核酸外切酶选自核酸外切酶SI或绿豆核酸酶中的任意一种或两种的组合。
在一些实施方案中，所述酶组合物包括来源于T7噬菌体的T7核酸内切酶(Endonuclease I)、来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn、来源于T4噬菌体的T4 DNA聚合酶、来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的核酸外切酶S1(Nuclease S1)和来源于绿豆芽(Mung bean sprouts)的绿豆核酸酶的至少一种核酸外切酶、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶。
优选地，所述核酸外切酶SI在所述酶组合物中的浓度为0.02～0.5U/μL，例如是0.02U/μL、0.1U/μL、0.3U/μL或0.5U/μL。
优选地，所述绿豆核酸酶在所述酶组合物中的浓度为0.02～2U/μL，例如是0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL、0.1U/μL、0.3U/μL、0.5U/μL、0.7U/μL、0.9U/μL、1U/μL或2U/μL。
第二方面，本发明提供了一种用于构建测序文库的酶反应液，所述酶反应液包括第一方面所述的酶组合物。
优选地，所述酶反应液还包括缓冲液。
第三方面，本发明提供了一种测序文库的构建方法，所述方法包括：
将靶核酸加入第二方面所述的酶反应液中，孵育，进行靶核酸的片段化、末端修复、5’磷酸化和3’加A尾。
优选地，所述孵育的条件为35～40℃保持10～20min，60～70℃保持20～40min。
优选地，所述方法还包括将孵育产物与测序接头进行连接反应，将连接产物进行PCR，得到测序文库的步骤。
本发明中，采用包括核酸内切酶、DNA聚合酶、任选的核酸外切酶的酶组合物进行核酸片段化，不同种类酶在一定的浓度范围内协同配合，在不额外产生单链的前提下、实现了高效片段化核酸样本的效果，片段化样本经T4多聚核苷酸激酶和Taq DNA聚合酶处理进行5’磷酸化和3’加dA尾后，连接测序接头构建测序文库用于二代测序，获得的测序读长颠倒嵌合假阳性率低，避免了产生单核苷酸位点变异(SNV)或基因嵌合突变(Fusion)，实现了快速、准确、低成本构建测序文库的效果。
第四方面，本发明提供了一种用于构建测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的酶组合物和/或第二方面所述的酶反应液。
优选地，所述试剂盒还包括测序接头、连接反应试剂或PCR试剂中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的酶组合物中，核酸内切酶对核酸进行片段化切割，DNA聚合酶对片段化核酸进行末端修复并避免额外产生单链，两者相互配合实现了对核酸样本的高效片段化切割；
(2)本发明的酶组合物中进一步含有核酸外切酶，去除了原始样本中或反应过程中产生的单链，与核酸内切酶和DNA聚合酶在合适的种类、浓度条件下协同配合，在避免产生单链的前提下、实现了对核酸样本的高效片段化切割；
(3)本发明的酶组合物处理的片段化样本进行5’磷酸化和3’加dA尾后，连接测序接头构建测序文库用于二代测序，获得的测序读长颠倒嵌合假阳性率低，避免了产生单核苷酸位点变异(SNV)或基因嵌合突变(Fusion)，提高了有效数据的比例，为临床数据的真实性提供了保障；
(4)本发明的基于片段化酶法的文库构建方法快速、准确、操作简便、成本低、成功率高，在文库构建领域具有重要的应用前景。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步的说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1酶组合物的配制
本实施例分别配制以下10μL酶组合物：
(1)热敏感性DNA酶0.01U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(2)热敏感性DNA酶0.03U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(3)热敏感性DNA酶0.05U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(4)SAN 0.001U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(5)SAN 0.002U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(6)SAN 0.003U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(7)Vvn 20ng、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(8)Vvn 50ng、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(9)Vvn 100ng、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(10)核酸内切酶DNaseI 0.01U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4PNK 5U；
(11)核酸内切酶DNaseI 0.015U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4PNK 5U；
(12)核酸内切酶DNaseI 0.02U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4PNK 5U；
(13)热稳定双链特异性DNA核酸酶0.05U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(14)热稳定双链特异性DNA核酸酶0.06U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(15)热稳定双链特异性DNA核酸酶0.07U、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(16)T7核酸内切酶0.05U、Vvn 10ng、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(17)T7核酸内切酶0.05U、Vvn 50ng、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(18)T7核酸内切酶0.05U、Vvn 100ng、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(19)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶10U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(20)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(21)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶50U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(22)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T7 DNA聚合酶10U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(23)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T7 DNA聚合酶30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(24)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T7 DNA聚合酶50U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(25)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、DNA聚合酶I10U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(26)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、DNA聚合酶I 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(27)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、DNA聚合酶I 50U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK5U；
(28)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、Klenow 10U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(29)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、Klenow 30U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(30)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、Klenow 50U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(31)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶I 0.3U、TaqDNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(32)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶I1U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(33)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶I 3U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(34)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶I10U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(35)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶S10.2 U、TaqDNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(36)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶S11 U、TaqDNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(37)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶S15 U、TaqDNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(38)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶S120 U、TaqDNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(39)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶T 0.3U、TaqDNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(40)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶T1U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(41)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶T 3U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(42)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、核酸外切酶T10U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(43)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、绿豆核酸酶0.2U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(44)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、绿豆核酸酶1U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(45)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、绿豆核酸酶5U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U；
(46)T7核酸内切酶0.5U、Vvn 100ng、T4 DNA聚合酶30U、绿豆核酸酶20U、Taq DNA聚合酶2U、T4 PNK 5U。
采用的蛋白酶供应信息见表1。
表1
创伤弧菌核酸酶Vvn的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
Ala Pro Pro Ser Thr Phe SerAlaAla Lys Gln Gln AlaAla Lys Ile Tyr GlnAspHis Pro Ile Thr Phe Tyr Cys Gly Cys Asp Ile Glu Trp Gln Gly Lys Lys GlyIle ProAsn Leu Glu Thr Cys Gly Tyr Gln ValArg Lys Ser Gln ThrArg Ala SerArgIle GluTrp Glu His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His His Arg Gln Cys TrpGln Lys GlyGly Arg Lys Asn Cys Ser Lys Asn Asp Gln Gln Phe Arg Leu Met GluAla Asp LeuHis Asn Leu Ser Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn GlyAsp Arg SerAsn PheAsn Phe SerGln TrpAsn GlyValAsp GlyVal SerTyr GlyArg Cys Glu Met Gln ValAsnPhe LysGlnArg Lys Val Met Pro Gln Thr Glu LeuArg Gly Ser Ile AlaArg Thr TyrLeu TyrMet Ser Gln Glu Tyr Gly Phe Gln Leu Thr Lys Gln Gln Gln Leu Met GlnAla TrpAsn Lys Ser Tyr Pro Val Asp Glu Trp Glu Cys Ser Arg Asp Asp Arg IleAla Lys IleGln GlyAsn HisAsnPro Phe Val Gln Gln Ser Cys Gln Thr Gln。
实施例2DNA模板的片段化和末端修复
本实施例以293gDNA为模板，起始投入量为100ng，采用实施例1的不同酶组合物和Vayzme#ND617Universal plus DNA Library Prep Kit for Illumina中的FEABuffer对gDNA进行片段化、末端修复、3’加A尾和5’磷酸化，并在随后的实施例中采用Vayzme#ND617/>Universal plus DNA Library Prep Kit for Illumina中的Rapid DNA Ligation Buffer2和Rapid DNA Ligase进行测序接头连接，采用Vazyme#N401DNA Clean Beads对接头连接产物和PCR扩增产物进行纯化，采用Vayzme#N616HiFi Amplification Mix中的VAHTS HiFi Amplification Mix和PCR PrimerMix 3for Illumina对纯化的连接产物进行扩增富集，其中用于连接反应的接头(Adaptor)为/>DNAAdapters for Illumina(Vazyme#N805-N806)。
本实施例还采用商业化片段化酶建库试剂盒5×WGS Fragmentation Mix(Enzymatics)和KAPAHyperPlus Kit(KAPA)进行预文库构建，操作步骤按照说明书进行。
靶DNA的片段化、末端修复、5’磷酸化和3’加dA尾反应体系如表2所示，其中，酶组合物的配方采用实施例1的组合(1)～(46)中的其中一种，反应条件为37℃孵育15min、65℃孵育30min，得到的片段化产物进行测序文库构建。
表2片段化反应体系
组分 用量
FEABuffer 5μL
靶DNA 100ng
酶组合物 10μL
灭菌ddH2O 补齐至35μL
实施例3构建测序文库
本实施例对实施例2制备的片段化产物进行接头连接反应、PCR扩增反应和纯化，构建测序文库，接头连接反应体系如表3所示，配制好的体系在20℃下孵育15min，进行接头连接；使用60μLVAHTS DNA Clean Beads对连接产物进行纯化，洗脱体积为20/22.5μL；
将纯化产物进行PCR扩增，体系如表4所示，条件如表5所示，使用45μLVAHTS DNACleanBeads对扩增产物进行纯化，洗脱体积为20/22.5μL。
表3接头连接反应体系
组分 体积
片段化、末端修复、加dA尾产物 50μL
连接反应缓冲液(RapidDNALigationBuffer) 25μL
DNA连接酶(RapidDNALigase) 5μL
接头(DNAAdaptor) 5μL
灭菌ddH2O 15μL
表4PCR体系
组分 体积
接头连接纯化产物 20μL
PCR扩增用酶及其缓冲液(VAHTSHiFiAmplificationMix) 25μL
引物(PCRPrimerMix3forIllumina) 5μL
表5PCR反应程序
预文库构建完成后投入500ng文库，12个文库混合在一起进行杂交捕获，使用艾吉泰康的NCC肿瘤诊断(T074)进行panel捕获，捕获后的文库扩增7个循环。捕获文库采用Illumina Hiseq-X10进行测序，测序模式为PE150。
对测序数据进行分析，使用cutadapt 2.8从原始数据中过滤去除接头和低质量读长(Reads)，得到高质量读长(Clean Reads)，每个样本取相同Clean Reads数据量，使用bwa0.7.17与hg19参考基因组进行比对；针对长度大于等于12nt的Soft Clip片段，使用ChimeraMiner进行重新比对，统计与匹配的片段比对到不同方向的链至少有3nt重叠、且距离不超过5000的测序序列，作为颠倒嵌合读长(Invert chimerareads)。颠倒嵌合读长对(Invert chimera reads pair)占高质量读长对(Clean reads pair)的比例作为该样本含颠倒嵌合读长(Invert chimera reads)的比例，以Invert chimera reads比例作为评价样本中颠倒嵌合背景值的标准。
结果如表6所示，其中1～18为同一批样本，19～30为同一批样本，31～46为同一批样本，当样本为非变性293gDNA时，8、9、10、16、17、18、25～30、35～37、43～46条件下SSAR比例低，颠倒嵌合假阳性突变数低；变性293gDNA存在非常多单链，所以下机数据中的SSAR比例以及SNV检出都会高于不变性的293gDNA，35～38、43～46条件下添加了核酸外切酶能够消除单链，因此SSAR比例降低。
表6
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综上所述，本发明的酶组合物中各组分在合适的种类、浓度条件下协同配合，实现了对核酸样本的高效片段化切割、并避免额外产生单链，构建的测序文库用于二代测序，获得的测序读长颠倒嵌合假阳性率低，避免了产生单核苷酸位点变异(SNV)或基因嵌合突变(Fusion)，在文库构建领域具有重要意义。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于核酸化的酶组合物，其特征在于，所述酶组合物包括核酸内切酶Vvn10ng/μL、T7核酸内切酶0.05U/μL、T4DNA聚合酶3U/μL，TaqDNA聚合酶0.2U/μL和T4多聚核苷酸激酶0.5U/μL。
2.根据权利要求1所述的用于核酸片段化的酶组合物，还包括核酸外切酶0.02～2U/μL，所述核酸外切酶选自核酸外切酶S1或绿豆核酸酶。
3.根据权利要求2所述的用于核酸片段化的酶组合物，其特征在于，所述核酸外切酶的浓度选自0.02U/μL、0.1U/μL、0.5U/μL或2U/μL。
4.一种用于构建测序文库的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包括权利要求1-3任一项所述的酶组合物。
5.根据权利要求4所述的用于构建测序文库的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液还包括缓冲液。
6.一种构建测序文库的方法，其特征在于，所述方法包括：将靶核酸加入如权利要求4所述的酶反应液中，孵育，进行靶核酸的片段化、末端修复、5’磷酸化和3’加A尾。
7.根据权利要求6所述的构建测序文库的方法，其特征在于，所述孵育的条件是35-40℃反应10-20min，60-70℃反应20-40min。
8.根据权利要求6所述的测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法还包括将孵育产物与测序接头进行连接反应，将连接产物进行PCR，得到测序文库的步骤。
9.一种用于构建测序文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的酶组合物或权利要求4所述的酶反应液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括测序接头、连接反应试剂或PCR试剂中的任意一种或至少两种的组合。
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