CN110117574B - 一种基于多重pcr富集循环肿瘤dna的方法和试剂盒 - Google Patents
一种基于多重pcr富集循环肿瘤dna的方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110117574B CN110117574B CN201910402310.9A CN201910402310A CN110117574B CN 110117574 B CN110117574 B CN 110117574B CN 201910402310 A CN201910402310 A CN 201910402310A CN 110117574 B CN110117574 B CN 110117574B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- pcr
- sequence
- enzyme
- sequencing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法和试剂盒,所述的方法包含:步骤(1),设计若干PCR引物对,PCR引物包含:一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、及一段引物连接序列;所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接;步骤(2),取含有循环肿瘤DNA的模板,并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应,获得第一次PCR反应产物;步骤(3),在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶,以消化残留的PCR引物;步骤(4),将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中,进行第二次PCR反应,以获得测序文库。本发明具有降低样本损失的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法和试剂盒。
背景技术
随着人类基因组完成图完成,人类进入后基因组时代。在后基因组时代,首先要求利用人类基因组DNA序列信息来研究基因及其变异,以检测变异带来的功能改变。
通常肿瘤的发生涉及多个基因的发生发展,针对单一基因变化的研究就显示出很大的局限性,只有全面检测多个基因的碱基突变,才能有效监控MRD,用药指导,治疗疗效和术后治疗等。
近年来,针对ctDNA(循环肿瘤DNA,Circulation tumor DNA),即“液体活检”在临床中的应用,开展了广泛的研究,覆盖肿瘤全程管理的方方面面:如肿瘤筛查、分子诊断、转移或复发监测、实时监测疗效、探寻新的靶点和耐药机制等。ctDNA指坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤DNA片段,其带有肿瘤特异性突变或表观遗传学改变。cfDNA(游离DNA,circulating-free cell DNA)是指存在于血浆或血清的细胞外DNA。ctDNA包含在cfDNA中,是肿瘤患者cfDNA中的一部分。
研究结果显示,ctDNA检测可早于72%的影像学诊断的肿瘤复发,中位提前时间为5.2个月。证明ctDNA检测的灵敏度及特异性较高,且显著早于影像学可诊断的微小复发灶,可用于MRD的早期诊断,并以此指导这部分患者的早期干预和个体化的辅助治疗。
NGS测序技术(Next-generation sequencing technology)作为一种新兴生物技术,虽然各国学者已经看到了它的重要应用价值,但是由于其高假阳性率,错配率,高成本,低重复率等缺陷,使该技术的迅速发展和广泛应用受到了一定的限制。
ctDNA检测技术中,根据富集策略的不同,基于NGS的技术目前可分为靶向扩增子测序及目标序列捕获测序。靶向扩增子测序是针对目的基因设计几十甚至上百对PCR引物,利用多重PCR扩增富集靶标序列。目标序列捕获测序是针对目的基因设计探针,通过捕获杂交的方法富集。捕获法的缺点是时间长,操作复杂,而扩增子法的优势是操作简单,时间短,可以快速检测,更早的检出结果。
PCR过程中,对于不同的反应体系,延伸反应产物保真需要的退火温度是不同的,在高变化的退火温度范围内,Tag酶等低保真DNA聚合酶引入的错误率和假阳性率高,
近年发现的Pfu高保真DNA聚合酶具有严格的模板依赖性和3’-5’外切酶活性(校正活性),能依据模板用3’-5’校正酶活性将引物3’端多个不匹配碱基校正成与模板匹配而扩增出非目的性产物,并在较宽的退火温度范围内仍适用。所以单用Pfu高保真DNA聚合酶介导的引物延伸反应同样会出现非特异性条带。
Ion Torrent测序平台由于有成本低,检测周期短等优点,被广泛应用于检测平台中,但是由于Ion Torrent平台的测序原理,决定了测序中会引入一些错误,特别是短片段缺失的错误。在检测循环游离DNA样本时,由于检测的样本中ctDNA样本的含量低,检测的结果和PCR过程中引入的错误和测序平台引入的错误混杂在一起,无法有效区分开检测错误,导致检测结果为假阴性或者假阳性。
另外检测ctDNA样本时,因为样本中肿瘤分子含量少,检测需要很高的灵敏度,建库过程中,需要损失的肿瘤分子越少越好。但是目前的大多数检测过程,中间都会带有磁珠纯化的步骤,而每一次的纯化步骤,必然会导致样本损失,导致检测的灵敏度降低。
为了更好的利用ctDNA优化患者的全程管理,一种能快速检测ctDNA的方法或试剂,以及同时具有高敏感性和特异性的液体活检平台不可或缺。通过动态定量监测癌症患者ctDNA中的分子突变数,可预测患者的治疗疗效和预后,将液体活检推向一个新的高度。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法,这种方法的样本损失量小,检测灵敏度和检测特异性高。
为了达到上述目的,本发明提供的一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法,其包含以下步骤:
步骤(1),设计若干PCR引物对,PCR引物上带有U碱基,所述的PCR引物对包含正向引物和反向引物,所述的正向引物和反向引物均包含:一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、及一段引物连接序列;所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接;
步骤(2),取含有循环肿瘤DNA的模板,并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应,获得第一次PCR反应产物;
步骤(3),在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶,以消化残留的PCR引物;所述的组合酶包含:用于将所述的第一次PCR反应产物中的U碱基切除并降解单链DNA片段的第一类酶、以及用于将所述第一次PCR反应产物中的双链DNA上的U修复为T的第二类酶;
步骤(4),将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中,进行第二次PCR反应,以获得测序文库。
较佳地,所述的PCR引物上的U碱基的个数为1个或者1个以上。
较佳地,所述的第一类酶包含UDG酶、AP endonuclease酶和核酸外切酶I,所述的第二类酶包含T4多聚核苷酸激酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。
较佳地,步骤(1)中,所述的正向引物和反向引物还均包含:一段UMI分子标签序列。
较佳地,步骤(1)中,所述的UMI分子标签序列为UNNNACTNNNTGAU。
较佳地,所述的通用测序接头包含:一段通用测序引物序列、一段带有唯一标识的样本标签序列、一段接头连接序列;所述的接头连接序列用于与所述的引物连接序列互补结合。
本发明还提供了基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法的另一方案,其包含以下步骤:
步骤(1),设计若干PCR引物对,该PCR引物对小于30对,所述的PCR引物对包含正向引物和反向引物,所述的正向引物和反向引物均包含:一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、及一段引物连接序列;所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接;
步骤(2),取含有循环肿瘤DNA的模板,并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应,获得第一次PCR反应产物;
步骤(3),在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶,以消化残留的PCR引物;所述的组合酶包含:用于消化单链引物、形成发卡结构的引物或者引物二聚体的第三类酶;
步骤(4),将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中,进行第二次PCR反应,以获得测序文库。
步骤(4),将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中,进行第二次PCR反应,以获得测序文库。
较佳地,所述的第三类酶包含核酸外切酶I、核酸外切酶VII、EndoIV、Klenow大片段、T4DNA聚合酶及T7核酸内切酶I。
本发明还提供了一种循环肿瘤DNA富集试剂盒,所述的试剂盒包含:上述的带有U碱基的PCR引物、所述的第一类酶、所述的第二类酶及所述的通用测序接头。
本发明还提供了另一种循环肿瘤DNA富集试剂盒,所述的试剂盒包含:上述的带有U碱基的PCR引物、所述的第一类酶、所述的第二类酶及通用测序接头;该试剂盒还包含:不带U碱基的PCR引物、所述的第三类酶、所述的第四类酶。当PCR引物对小于30对或者大于30对时,可以采用不同的方案对循环肿瘤DNA进行富集,有利于节约成本。
本发明与现有技术相比,具有如下有益效果:
1.本方法是对常用的多重PCR方法的一次重要改进,它的特点是整个流程在同一EP管中完成,中间步骤不需要纯化或者换管操作,可以降低ctDNA的损失,提高检测灵敏度,并且操作简单,减少个人的操作差异引入的误差。
2.本发明在扩增产物中引入了UMI序列,该UMI序列可以唯一标记样本中每一个模板片段,可以将样本精确定量到拷贝数,还能降低检测流程中的背景噪音,提高检测灵敏度最低可到0.01%的水平,由于显著降低了测序带来的背景噪音和PCR过程中带来的错误,同时能追踪每一个突变的模板来源,可以用于精确的,高灵敏地检测低拷贝的突变,提高了检测灵敏度,特异性和可靠性。
3.本发明能有效消除反应过程中残留的引物,减少测序中引物嵌合体的序列,增加测序的有效测序的序列数。
4.适用于不同的NGS测序平台进行多基因、多位点的检测,只需更改通用测序引物序列,就可以切换到其他测序平台
5.DNA分子两端的通用测序接头中引入了双index,可以明显消除测序过程中带入的index-Hopping(样本标签序列错误分配)问题,降低假阳性,增加检测结果的准确性。
6.本发明操作简单、高效、经济、实用,可以用于其他领域的DNA/RNA的检测中。
附图说明
图1为采用本发明的方法对循环肿瘤DNA进行检测的流程示意图。
图2为消除残留引物的方法一的原理示意图。
图3为消除残留引物的方法二的原理示意图。
图4为将双链DNA上的U修复为T的原理示意图。
图5a为通过不带U碱基的引物及未经PDER1消化获得的文库的检测结果图。
图5b为通过不带U碱基的引物及经PDER1消化获得的文库的检测结果图。
图5c为通过带U碱基的引物及未经PDER2消化获得的文库的检测结果图。
图5d为通过带U碱基的引物及经PDER2消化获得的文库的检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
本发明采用靶向扩增子测序方法对ctDNA进行检测,利用多重PCR扩增富集靶标序列。本发明适用于Ion Torrent或Illumina NGS等测序平台,可以用于检测游离肿瘤DNA,特别是低拷贝数突变的游离肿瘤DNA。
请参阅图1,本发明主要包括3步过程:第一步,PCR扩增基因目标区域,获得目标区域的同时,连接上UMI分子标签序列;第二步是消化掉第一步PCR残留的引物;第三步是通过PCR扩增的方式,加上通用测序接头,并对目标区域进行指数放大。
本发明的基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法,具体包含以下步骤:
步骤(1),设计若干PCR引物对,该PCR引物对包含正向引物和反向引物,所述的正向引物和反向引物分别包含:一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列,一段引物连接序列;所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接。
所述的正向引物和反向引物还包含:一段UMI分子标签序列。
步骤(2),抽提得到含有循环肿瘤DNA的模板,并将所述模板和步骤(1)设计的PCR引物一起进行第一次PCR反应,获得第一次PCR反应产物。
步骤(3),在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶,以消化残留的PCR引物。
步骤(4),将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中,进行第二次PCR反应,以获得测序文库。
请继续参阅图1,本发明的具体原理为:
一、上述步骤(1)中,所述的正向引物和反向引物的5’端到3’端依次为:引物连接序列、UMI分子标签序列、用于扩增目的片段的扩增引物序列。扩增引物序列可按照常规方法设计,例如,根据Primer3程序设计出Tm值在60~64℃的扩增引物序列。UMI分子标签序列是一段随机序列,能够用于区分原始DNA突变碱基与文库扩增错误产生的突变碱基。PCR引物合成时,UMI分子标签序列随机合成。
一些实施例中,UMI分子标签序列选择TNNNACTNNNTGAT或UNNNACTNNNTGAU,N表示ATCG四种碱基中的任意一种。
由于NGS测序平台的测序原理的原因,在测序中会引入一些错误,特别是IonTorrent平台会存在短片段缺失的错误,Illumina会引入单碱基突变错误。在检测循环游离DNA样本时,由于检测的样本中ctDNA分子的含量低,检测的结果和PCR过程中引入的错误和测序平台引入的错误混杂在一起,无法有效区分开检测错误,导致检测结果为假阴性或者假阳性。本发明通过一种复合的引物设计结构,可以在扩增产物上带上UMI分子标签序列,相同的UMI标签可以标识同一个来源的DNA分子,利用UMI序列可以减小背景噪音,提高检测灵敏度和检测特异性,从而提供一个高特异,高灵敏的检测方案。
二、上述步骤(2)中,第一次PCR反应可在Tag酶体系中进行扩增,扩增3个循环(UMI分子标签序列用于区分每个模板分子来源,PCR扩增三个循环,确保每一个模板分子都能带上一个唯一的标签)。
三、上述步骤(3)中,消除残留引物的目的是提供一个没有样本损失的方法。循环游离DNA样本因为样本中肿瘤分子含量少,检测需要很高的灵敏度和特异性,才能不会漏检。这就要求在检测过程中,需要损失的肿瘤分子越少越好。但是目前的大多数检测过程,中间都会带有纯化的步骤,而每一次的纯化步骤,必然会导致样本损失,导致检测的灵敏度和特异性降低。
本发明通过一种称为PDER(Primer DigestER)的技术(引物消化技术),中间过程中不用纯化,所有的步骤都是在同一管反应液中进行,不需要进行液体在不同EP管中移动,可以大大的减少模板DNA的损失,可以极大的提高检测的灵敏度和特异性。同时还带来了操作简便,用时少的优点。
PDER技术提供了2种消除残留引物的方法。该技术使用组合酶对残留引物进行消化。
(1)消除残留引物的方法一:
用于少于30对PCR引物的情况,该PCR引物为不带U碱基的引物,即引物中的部分T碱基不需要替换为U。
如图2所示,PCR扩增后残留的引物可能存在多种形式。图2的(A)、(B)、(C)即(D)表示残留的引物可能存在的4种形式。不同形式的引物可采用不同类型的酶进行消化。图2的(B)中,Mung Bean Nuclease为单链特异性核酸内切酶,当这种酶过量时可以降解双链DNA、RNA或者DNA-RNA杂交体。
一些实施例中,利用核酸外切酶I(Exo I)和核酸外切酶VII消除PCR扩增中的残留的单链引物,并利用具有3’→5’外切酶活性的EndoIV、Klenow大片段、T4DNA聚合酶,以及T7核酸内切酶I等酶对形成发卡结构的引物或者引物二聚体进行酶切。各种酶可等量加入反应体系中。
核酸外切酶I(Exonuclease I,Exo I)是单链特异性3'→5'核酸外切酶,从ssDNA(单链DNA)的3'-OH末端分解生成5'-单核苷酸。
核酸外切酶VII(Exo VII)来源于大肠杆菌,从5’→3’和3’→5’方向切割单链DNA。核酸外切酶I和核酸外切酶VII共用确保了单链引物的消化效率以及单链引物的完全消化。
EndoIV具有3’→5’外切酶活性,能够消除引物二聚体的5‘overhangs(突出部分)。
Klenow大片段(克伦诺片段,Klenow fragment)是大肠杆菌DNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性,但缺少完整酶的5’→3’外切酶活性。
T4DNA聚合酶是一种模板依赖的DNA聚合酶,可以在结合有引物的单链DNA模板上,从5'→3'方向催化DNA合成反应。T4DNA聚合酶具有3'→5'外切酶活性,但不具有5'→3'外切酶活性。
T7核酸内切酶I是一种结构选择性核酸内切酶,它可识别并切割不完全配对的DNA,可用于消化引物二聚体。
本方法所用的组合酶,在各种酶的共同作用下,基本可以消除第一步PCR反应残留的引物和引物二聚体,在不进行PCR纯化和换管的情况下,可以直接进行下一步PCR扩增。
(2)消除残留引物的方法二:
设计带有U碱基的PCR引物。当使用的多重PCR引物过多时,残留的引物过多,用方法一不能完全消除。方法二较方法一复杂,并且成本更高,因此建议在PCR引物多于30对的情况下采用。方法二通过设计一种带U的引物序列(合成引物时,将引物中适当位置的1个或1个以上的T合成为U),然后通过UDG酶、AP endonuclease酶、ExoI等酶的共同作用下,将未参加反应的引物切除U,从而把残留的引物分解成多个更短的片段,最后通过ExoI(核酸外切酶I)的消化下将单链DNA酶切掉。
UDG酶能催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶,常用于PCR产物的防污染。
AP endonuclease酶也称为AP核酸内切酶(Apurinic/apyrimidinicendonuclease,APE),是氧化还原和DNA碱基切除修复途径中的重要一员。识别其他糖苷酶产生的脱嘌呤、脱嘧啶(AP)位点然后切割,可以在碱基移除时构建的磷酸骨架上制造缺口。根据其制造缺口的位点,可分为四类。一型和二型在DNA磷酸基团3’和5’间制造碱基缺失位点并遗留3’-OH和5’-磷酸末端。三型和四型切割位置相同,但是造成3’-磷酸和5’-OH。
一些实施例中,由于UMI分子标签序列位于PCR引物的中部,因此UMI分子标签序列设计为UNNNACTNNNTGAU,其两端的碱基为U。如图3所示,图3的(A)、(B)和(C)为残留的引物形成的3种二聚体形式,每条引物带有两个U碱基。经UDG酶和AP endonuclease酶的共同作用下,U碱基被移除,残留的引物分解成多个更短的片段,最后通过ExoI(核酸外切酶I)的消化,单链的DNA被酶切掉。图3的(D)中,残留的引物为单链形式,通过UDG酶、APendonuclease酶、ExoI等酶的共同作用下,引物被降解。
如图4所示,由于DNA模板在第一次PCR反应后扩增的产物也带有U,在UDG酶和APendonuclease酶的作用下,也会把双链DNA产物的U剪切掉。此时可利用模板的双链互补特性,通过加入T4多聚核苷酸激酶,DNA聚合酶和DNA连接酶,可以将双链DNA上的U修复为T。
T4多聚核苷酸激酶是一种多聚核苷酸5’羟基激酶,可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3’磷酸基团的单核苷酸的5’羟基转移。用于DNA连接酶作用底物的DNA分子必须首先进行5'端磷酸化才可用于连接反应。T4多聚核苷酸激酶可对三型和四型AP endonuclease酶造成的5’-OH进行5'端磷酸化。
利用上述的PDER技术对引物消化后,残留的引物会以易降解的短片段或者NMP(核苷酸)的形式存在PCR反应液中,不会影响下一步PCR反应。另外PDER技术选用的酶可以在PCR扩增缓冲液中正常工作,不需要另外添加反应缓冲液。
四、请参阅图1,上述步骤(4)中,所述的通用测序接头包含:一段测序平台特异的通用测序引物序列(图1中的通用测序引物1或通用测序引物2),一段带有唯一标识的样本标签序列(图1中的index1或index2),一段特定的接头连接序列。本发明设计的接头连接序列包含正向连接序列和反向连接序列。
一些实施例中,接头连接序列的正向连接序列设计为:TCTGTACGGTGACAAGGCG;反向接头序列设计为TGACAAGGCGTAGTCACGG。
所述的通用测序引物序列可以采用如:Illumina测序平台的P5、P7,和IonTorrent测序平台的A、P1。所述的样本标签序列(index)是不同样本的区分依据。所述的接头连接序列能够与步骤(1)中的相匹配的引物连接序列互补结合。消化完多余引物的第一次PCR反应的产物,再加入通用测序接头反应完后就是带有通用测序引物的文库,该文库可以在相应的测序平台上进行测序。
本发明可以兼容Illumina和Ion Torrent测序平台。Illumina和Ion Torrent测序平台是目前主流的测序平台,由于测序仪昂贵,不是每个实验室都能配置主流的测序仪。所以一个兼容不同测序平台的方法,可以便利检测机构和检测人员。本发明通过设计的接头序列结构,只需要将相应的通用测序引物序列设置为对应的测序平台的通用测序引物,就可以在相应的平台上进行测序检测。
本发明的方法可以充分利用样本正负双链模板:
目前一些带UMI的扩增子法方案中,只能检测DNA双链中的正链或者负链,另外一条模板链会损失掉。这对本来就微量的检测样本来说,就是一种浪费。本发明的方法中,可以设计2对通用测序接头(正链DNA和负链DNA各连接1对),以充分利用模板中的正、负双链DNA,没有损失模板的信息。
本发明还提供一个双接头方案(DNA单链的两端分别连接index1和index2)来消除测序和检测过程中样本间的交叉污染:
Illumina测序平台已知有index hopping(index错误分配)问题,测序数据间会发生样本测序数据交叉问题,引入假阳性结果。检测过程中,也会有微量的样本交叉污染问题。通过双index接头技术,可以有效减少index hopping问题,同时也可以将样本间的交叉污染产生的数据,在数据处理过程中去掉,从而达到消除假阳性问题。本发明在通用测序接头设计中引入双index,可以起到消除假阳性问题。
本发明根据上述方法提供两种试剂盒。
第一种试剂盒包含:上述的带有U碱基的PCR引物、上述的第一类酶、上述的第二类酶及所述的通用测序接头。这种试剂盒不限定所使用的PCR引物对的数量。
第二种试剂盒包含第一种试剂盒里的成分,但是另外提供适用于消化不带有U碱基的PCR引物的组合酶。采用不带有U碱基的PCR引物,成本相对较低,但PCR引物对数量超过30时,消化后残留的引物可能过多。当每次实验的PCR引物对数量不同时,在试剂盒提供的两种不同的引物消化方案中选择合适的一种进行实验,有利于节约成本。
实施例1
利用本发明的方法检测血液样本中ctDNA肿瘤突变。
具体步骤如下:
一、测试模板准备。
培养的SK细胞系和HCC1975(含EGFR:p.L858R突变)细胞系,分别按照酚氯仿方法进行DNA抽提,然后用NEB公司的片段化酶进行DNA打断。再将HCC1975样本的DNA按照1%的比率掺入到SK样本中。通过ddPCR进行EGFR:p.L858R突变频率的定量,从而得到含有EGFR:p.L858R突变,并且知道突变频率的样本。
二、引物设计。本实施例设计了2种PCR引物
引物I:不带U碱基的PCR引物。
引物II:带U碱基的PCR引物。
设计的引物长度是60~70bp,形成的引物二聚体序列在70~100之间,设计的通用测序接头序列长度在70~80bp之间,PCR引物加上用测序接头后,形成的片段范围在160~190bp,由于设计的预期目的片段大小在250~280bp左右,所以不在预期范围的片段也可判定为引物二聚体。
三、文库构建。
(1)将抽提好的cfDNA样本和设计的引物,和DNA聚合酶以及buffer混合,进行PCR扩增,一共扩增4管。
(2)扩增完后的4管产物,根据引物是否带U碱基,以及是否加入PDER相关酶,可分成四类:
a.不带U碱基的引物,加入PDER技术方法一中的组合酶(PDER1)消化残留引物;组合酶中含有:核酸外切酶I、核酸外切酶VII、EndoIV、Klenow大片段、T4DNA聚合酶,以及T7核酸内切酶;
b.不带U碱基的引物,不加入组合酶;
c.带U碱基的引物,加入PDER技术方法二中的组合酶(PDER2)消化残留引物,组合酶中含有:UDG酶、AP endonuclease酶、核酸外切酶I、T4多聚核苷酸激酶、DNA聚合酶和DNA连接酶;
d.带U碱基的引物,不加入组合酶。
(3)加完组合酶后,放置到PCR以上,37℃30min进行消化,消化完后用98℃2分钟对酶进行灭活。
(4)消化完的产物加入通用测序接头进行PCR扩增。
(5)扩增得到的PCR产物,进行磁珠纯化得到纯化后的产物。
(6)纯化好的产物进行Agilent2100文库质检和qPCR定量。
(7)最终合格的文库产物上机测序(Ion Proton DA8600)。
四、结果分析
1.不带U碱基的引物的检测结果。
请参阅图5a,未经过PDER1消化的文库,最终能得到的文库片段基本在160~190bp范围内,基本是引物二聚体。请参阅图5b,经过PDER1消化的文库,最终能得到的文库片段基本在250~280bp范围内,是期望拿到的文库片段大小,并且在160~190bp范围的引物二聚体,都已被消化干净。
2.带U碱基的引物的检测结果。
请参阅图5c,未经过PDER2消化的文库,最终能得到的文库片段基本在160~190bp范围内,基本是引物二聚体。请参阅图5d,经过PDER2消化的文库,最终能得到的文库片段基本在250~280bp范围,是期望拿到的文库片段大小,并且在160~190bp范围的引物二聚体,都被消化干净。
3.将HCC1975样本的DNA倍比稀释后掺入到SK样本中,并利用带U碱基的引物及相应的组合酶,以检测本发明的方法的灵敏度,设2个平行。对测序得到的结果根据测序平台的分析流程,进行分析。结果如表1所示。
由于测序结果带有UMI序列,通过UMI序列可以有效的去除测序结果的PCR过程引入的错误,测序过程中引入的错误。从最终的测序结果上看,本发明所提供的方法能检测低至0.01%的突变。
表1测序结果
综上所述,本发明能精确检测循环游离DNA中的ctDNA分子,减少样本损失,同时能消除PCR过程中引入的错误和测序仪引入的错误,得以构建一个高效,高精度,高通量的特异基因热点突变的多重PCR检测技术平台。本发明可以用来制备兼容Illumina/IonTorrent测序平台的循环游离肿瘤DNA富集文库,以用于检测基因的热点突变,短片段插入缺失,融合等类型的变异。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍,但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后,对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此,本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 常州桐树生物科技有限公司
<120> 一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法和试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tnnnactnnn tgat 14
<210> 2
<211> 14
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
unnnactnnn tgau 14
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgtacggt gacaaggcg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgacaaggcg tagtcacgg 19
Claims (6)
1.一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法,该方法用于非诊断目的,其特征在于,包含以下步骤:
步骤(1),设计若干PCR引物对,PCR引物上带有U碱基,所述的PCR引物对包含正向引物和反向引物,所述的正向引物和反向引物均包含:一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、一段引物连接序列、及一段序列为UNNNACTNNNTGAU的UMI分子标签;所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接;
步骤(2),取含有循环肿瘤DNA的模板,并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应,获得第一次PCR反应产物;
步骤(3),在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶,以消化残留的PCR引物;所述的组合酶包含:用于将所述的第一次PCR反应产物中的U碱基切除并降解单链DNA片段的第一类酶、以及用于将所述第一次PCR反应产物中的双链DNA上的U修复为T的第二类酶;所述的第一类酶包含UDG酶、AP endonuclease酶和核酸外切酶I,所述的第二类酶包含T4多聚核苷酸激酶、DNA聚合酶和DNA连接酶;
步骤(4),将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中,进行第二次PCR反应,以获得测序文库。
2.根据权利要求1所述的基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法,其特征在于,所述的PCR引物上的U碱基的个数为1个或者1个以上。
3.根据权利要求1所述的基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法,其特征在于,所述的通用测序接头包含:一段通用测序引物序列、一段带有唯一标识的样本标签序列、一段接头连接序列;所述的接头连接序列用于与所述的引物连接序列互补结合。
4.一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法,该方法用于非诊断目的,其特征在于,包含以下步骤:
步骤(1),设计若干PCR引物对,该PCR引物对小于30对,所述的PCR引物对包含正向引物和反向引物,所述的正向引物和反向引物均包含:一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、及一段引物连接序列;
所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接;
步骤(2),取含有循环肿瘤DNA的模板,并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应,获得第一次PCR反应产物;
步骤(3),在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶,以消化残留的PCR引物;所述的组合酶包含:用于消化单链引物、形成发卡结构的引物或者引物二聚体的第三类酶;所述的第三类酶包含核酸外切酶I、核酸外切酶VII、EndoIV、Klenow大片段、T4 DNA聚合酶及T7核酸内切酶I;
步骤(4),将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中,进行第二次PCR反应,以获得测序文库。
5.一种循环肿瘤DNA富集试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒通过权利要求1所述的基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法对循环肿瘤DNA进行富集;所述的试剂盒包含:权利要求1-3中任意一项所述的PCR引物、所述的组合酶、及所述的通用测序接头。
6.一种循环肿瘤DNA富集试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包含:权利要求1-3中任意一项所述的PCR引物、所述的组合酶、及所述的通用测序接头;该试剂盒还包含:权利要求4所述的PCR引物、所述的组合酶、及所述的通用测序接头。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910402310.9A CN110117574B (zh) | 2019-05-15 | 2019-05-15 | 一种基于多重pcr富集循环肿瘤dna的方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910402310.9A CN110117574B (zh) | 2019-05-15 | 2019-05-15 | 一种基于多重pcr富集循环肿瘤dna的方法和试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110117574A CN110117574A (zh) | 2019-08-13 |
CN110117574B true CN110117574B (zh) | 2021-03-23 |
Family
ID=67522506
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910402310.9A Active CN110117574B (zh) | 2019-05-15 | 2019-05-15 | 一种基于多重pcr富集循环肿瘤dna的方法和试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110117574B (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111041131B (zh) * | 2020-03-16 | 2020-07-10 | 广东永诺医疗科技有限公司 | 基于微滴式数字pcr的eb病毒检测试剂盒 |
CN111379033A (zh) * | 2020-04-21 | 2020-07-07 | 深圳易倍科华生物科技有限公司 | 一种添加分子标签的多重pcr方法及建库仪器 |
CN111763664B (zh) * | 2020-06-28 | 2021-03-26 | 江苏康科斯医疗科技有限公司 | 一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用 |
CN113462749A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-10-01 | 广州东盛生物科技有限公司 | 一种高灵敏扩增子建库试剂盒以及建库方法和应用 |
CN114277114B (zh) * | 2021-12-30 | 2023-08-01 | 深圳海普洛斯医学检验实验室 | 一种扩增子测序添加唯一性标识符的方法及应用 |
CN116790718B (zh) * | 2023-08-22 | 2024-05-14 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种多重扩增子文库的构建方法及其应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106906211B (zh) * | 2017-04-13 | 2020-11-20 | 苏州普瑞迈德医学检验所有限公司 | 一种分子接头及其应用 |
WO2019006392A1 (en) * | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Life Technologies Corporation | LIBRARY PREPARATION METHODS AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
CN108929901B (zh) * | 2018-07-27 | 2022-02-01 | 博奥生物集团有限公司 | 一种用于痕量dna的多重扩增建库方法及其专用试剂盒 |
-
2019
- 2019-05-15 CN CN201910402310.9A patent/CN110117574B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110117574A (zh) | 2019-08-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110117574B (zh) | 一种基于多重pcr富集循环肿瘤dna的方法和试剂盒 | |
US11697843B2 (en) | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing | |
US9745614B2 (en) | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors | |
CN106906211B (zh) | 一种分子接头及其应用 | |
CN102373288B (zh) | 一种对目标区域进行测序的方法及试剂盒 | |
KR101858344B1 (ko) | 바코드 서열을 포함하는 어댑터를 이용한 차세대 염기서열 분석 방법 | |
US20120003657A1 (en) | Targeted sequencing library preparation by genomic dna circularization | |
CN106554957B (zh) | 测序文库及其制备和应用 | |
US20200283839A1 (en) | Methods of attaching adapters to sample nucleic acids | |
JP2023081950A (ja) | ライブラリー調製方法ならびにそのための組成物および使用 | |
WO2017204572A1 (ko) | 분자 바코딩을 이용한 초병렬 시퀀싱을 위한 라이브러리 제조방법 및 그의 용도 | |
CN111801427A (zh) | 用于单分子的单链环状dna模板的产生 | |
CN112779320A (zh) | 多区域dna甲基化检测探针设计及其检测方法 | |
US20220002713A1 (en) | Method for constructing sequencing library | |
CN114277114B (zh) | 一种扩增子测序添加唯一性标识符的方法及应用 | |
US20230112730A1 (en) | Compositions and methods for oncology precision assays | |
CN114774553A (zh) | 一种利用高通量测序技术检测多基因位点突变的方法 | |
CN102586422A (zh) | 一种对6磷酸葡萄糖脱氢酶基因进行测序的方法及试剂盒 | |
US12091715B2 (en) | Methods and compositions for reducing base errors of massive parallel sequencing using triseq sequencing | |
US11447819B2 (en) | Methods for 3′ overhang repair | |
CN102533992A (zh) | 一种对苯丙氨酸羟化酶基因进行测序的方法及试剂盒 | |
CN102586421B (zh) | 一种检测易瑞沙适用性基因的方法及试剂盒 | |
WO2023225515A1 (en) | Compositions and methods for oncology assays | |
KR20240032630A (ko) | 핵산의 정확한 병렬 검출 및 정량화 방법 | |
JP2024501637A (ja) | 塩基配列決定用の核酸サンプルの調製 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |