CN111763664B

CN111763664B - 一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用

Info

Publication number: CN111763664B
Application number: CN202010599034.2A
Authority: CN
Inventors: 曹林; 聂俊伟; 瞿志鹏; 张力军; 韩锦雄; 江明扬; 邱翠
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co Ltd; Jiangsu Health Coase Medical Science And Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co Ltd; Jiangsu Health Coase Medical Science And Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-06-28
Also published as: EP4130256A1; EP4130256A4; CN111763664A; WO2022001149A1; US20230193252A1

Abstract

本发明提供了一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用，所述酶反应液包括酶组合物和反应缓冲液；所述酶组合物包括核酸内切酶、DNA聚合酶和多聚核苷酸激酶；所述反应缓冲液包括金属盐、底物和缓冲介质水溶液。本发明通过优化酶反应液的配方，通过一步反应实现对核酸样本的切割、末端修复和加A尾处理，在适宜的缓冲体系中，酶切反应速率和末端修复反应速率达到平衡，在样本起始量为100pg‑1μg、处理时间相同的情况下，获得了长度分布一致的测序文库。

Description

一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用。

背景技术

随着高通量测序成本的大幅下降，高通量测序市场迅速增长。其中，DNA测序约占据整个高通量测序市场的一半，因此人们对于流程简便、快速、高通量的DNA建库技术的需求越来越迫切。DNA建库流程中第一步也是最关键的一步在于将大片段DNA分子无偏向性地片段化为特定长度的小片段DNA，目前主流的DNA片段化方式为超声机械打断。然而超声机械打断仪往往价格昂贵，许多工业、科研、医疗实验室无法配备此仪器；超声机械片段化DNA的操作繁琐、耗时长，需要实时取样检测样品的片段化效果；并且超声机械打断的样品数量少、单次处理样本的投入量少，无法满足工业、医疗领域对大通量处理样品的需求。片段化酶可以很好地解决上述问题，基于酶法的DNA样品处理方法可在热循环仪中完成，操作流程简便、快速；片段化酶能够对DNA分子进行非特异性的随机切割，因此有望替代传统的超声机械法将大片段DNA分子无偏向性地片段化为特定长度的小片段DNA分子，从而应用于高通量测序中的DNA文库构建。

目前已有的基于酶法的DNA片段化技术包括：1)使用Vvn在双链DNA分子上随机产生缺刻、同时利用T7核酸内切酶在缺刻位点将另一条DNA分子切开；2)使用DNaseI在Mn²⁺或Mg²⁺存在的情况下将双链DNA断裂；3)将多种识别特定碱基序列的限制性核酸内切酶(比如MspI、AluI、CviQI、MseI、MlucI、HaeIII等)混合，进行对DNA分子的切割。

当前，构建DNA文库的样本起始投入量从100pg～1μg不等，存在5个数量级的差异，而市面上的商业化试剂盒在起始量兼容性方面均不足以满足市场需求。一方面商业化的试剂盒的兼容下限均在100pg以上，另一方面不同的起始量需要使用不同的反应时间。在实际的实验过程中，从不同的样本中获得的核酸量是不同的，不可避免地会使用不同起始量的样本进行文库构建。因此，针对不同的样本起始量，需要调整反应时间，不仅增加了实验的繁琐程度和对仪器的需求量，而且也限制了文库构建方法在大通量样本方面的应用。

CN108998434A公开了片段化酶打断缓冲液及提高片段化酶打断效率的方法，所述片段化酶打断缓冲液包括适于片段化酶发挥作用的缓冲液组分和终浓度为10％以下的PEG8000，以及终浓度为10-25mM的Mg²⁺，通过在反应缓冲液体系中添加不同比例的PEG及Mg² ⁺来调节DNA片段化的效率及片段大小，得到可满足BGISEQ-500平台PE100和PE150双端测序文库要求的打断缓冲液，但是仍然不能兼容起始量为100pg～1μg的样本。

因此，有必要对现有的文库构建试剂盒进行改进。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用，所述酶反应液通过优化酶组合物的种类和用量，并与反应缓冲液中的金属离子和缓冲介质相互配合，平衡了文库构建过程中的酶切反应速率和末端修复反应速率，实现了在样本起始量不同、处理时间相同的情况下，获得长度一致的测序文库的技术效果，具有广泛的适用性和便捷的操作性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于构建测序文库的酶反应液，所述酶反应液包括酶组合物和反应缓冲液；

所述酶组合物包括核酸内切酶、DNA聚合酶和多聚核苷酸激酶；

所述反应缓冲液包括金属盐、底物和缓冲介质水溶液。

本发明的酶组合物包括用于进行切割的核酸内切酶、用于进行末端修复和3’加A尾的DNA聚合酶、以及用于进行5’磷酸化的多聚核苷酸激酶，所述酶组合物集中在一个反应体系中，通过一步反应实现对核酸样本的切割、末端修复和加A尾处理，反应缓冲液中既包含切割反应所需的离子缓冲液，又包含末端修复所需的离子缓冲液，而且还含有各类反应所需的底物分子dNTPs、dATP和ATP，各种组分在一定的浓度范围内相互配合，平衡酶切反应速率和末端修复反应速率，实现了在样本起始量为100pg-1μg、处理时间相同的情况下，获得长度一致的测序文库的技术效果。

本发明采用核酸内切酶对核酸样本进行切割，所述核酸内切酶例如可以是核酸内切酶dsDNase、T7核酸内切酶、盐活性核酸内切酶SAN、核酸内切酶Vvn或核酸内切酶DNaseI中的任意一种或至少两种的组合。

在一些实施方案中，所述核酸内切酶例如可以是来源于虾的核酸内切酶dsDNase、来源于T7噬菌体的核酸内切酶T7 Endonuclease、盐活性核酸内切酶SAN、来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn或来源于牛胰的核酸内切酶DNaseI中的任意一种或至少两种的组合。

在一些实施方案中，所述核酸内切酶在所述酶反应液中的终浓度为0.003～0.05U/μL，例如可以是0.003U/μL、0.004U/μL、0.005U/μL、0.006U/μL、0.007U/μL、0.008U/μL、0.009U/μL、0.01U/μL、0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL或0.05U/μL，优选为0.004～0.03U/μL，进一步优选为0.005～0.01U/μL。

在一些实施方案中，当所述核酸内切酶为Vvn时，所述核酸内切酶Vvn在所述酶反应液中的终浓度为0.1～0.5ng/μL，例如可以是0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.3ng/μL、0.4ng/μL或0.5ng/μL。

本发明针对不同种类的核酸内切酶，通过优化核酸内切酶在反应体系中的浓度、控制核酸内切酶的用量，从而调节核酸内切酶对核酸的切割速率。

本发明采用DNA聚合酶对已切割的核酸进行末端修复或在已切割核酸的3’端进行加A尾反应，所述DNA聚合酶包括低温DNA聚合酶和/或耐热DNA聚合酶，所述低温DNA聚合酶例如可以是来源于T4噬菌体的DNA聚合酶、来源于T7噬菌体的DNA聚合酶、来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I或来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow中的任意一种或至少两种的组合，对已切割的核酸进行末端修复，所述耐热DNA聚合酶例如可以是Taq DNA聚合酶，在已切割核酸的3’端进行加A尾反应，以便后续基于TA连接原理进行接头连接反应。

本发明中，术语“耐热DNA聚合酶”可以是Taq DNA聚合酶，在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90％，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60％，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40％，术语“低温DNA聚合酶”是相对于“耐热DNA聚合酶”而言，不具有耐热活性的DNA聚合酶。

在一些实施方案中，所述耐热DNA聚合酶在所述酶反应液中的终浓度为0.01～0.05U/μL，例如可以是0.01U/μL、0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL或0.05U/μL，优选为0.02～0.04U/μL。

在一些实施方案中，所述低温DNA聚合酶在所述酶反应液中的终浓度为0.03～1.2U/μL，例如可以是0.03U/μL、0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL、0.1U/μL、0.2U/μL、0.3U/μL、0.4U/μL、0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL、1.0U/μL、1.1U/μL或1.2U/μL，优选为0.04～1.1U/μL，进一步优选为0.05～1.0U/μL，再优选为0.06～0.9U/μL。

本发明针对不同种类的DNA聚合酶，通过优化DNA聚合酶在反应体系中的浓度、控制DNA聚合酶的用量，从而调节DNA聚合酶对已切割的核酸的末端修复速率。

本发明的酶反应液中还包括多聚核苷酸激酶，例如可以是T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)，对已切割的核酸进行5’磷酸化，所述多聚核苷酸激酶在所述酶反应液中的终浓度为0.05～0.2U/μL，例如可以是0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL、0.1U/μL或0.2U/μL。

在一些实施方案中，所述酶组合物还包括辅助蛋白。

本发明采用辅助蛋白来调控核酸内切酶的切割速率和DNA聚合酶的末端修复速率，所述辅助蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)和/或单链结合蛋白，优选地，所述单链结合蛋白包括来源于大肠杆菌的单链结合蛋白E.coli SSB和/或来源于T4噬菌体的单链结合蛋白T4GP32。

在一些实施方案中，所述辅助蛋白在所述酶反应液中的终浓度为0.05～1μg/μL，例如可以是0.05μg/μL、0.06μg/μL、0.07μg/μL、0.08μg/μL、0.09μg/μL、0.1μg/μL、0.2μg/μL、0.3μg/μL、0.4μg/μL、0.5μg/μL、0.6μg/μL、0.7μg/μL、0.8μg/μL、0.9μg/μL或1μg/μL，优选为0.05～0.5μg/μL，进一步优选为0.1～0.4μg/μL。

本发明针对不同种类的辅助蛋白，通过优化辅助蛋白在反应体系中的浓度、控制辅助蛋白的用量，从而调节核酸内切酶的切割速率和DNA聚合酶的末端修复速率。

在一些实施方案中，所述金属阳离子包括Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺或Ca²⁺中的任意一种或至少两种的组合，所述含有Mg²⁺的盐可以是MgCl₂和/或Mg₂SO₄，所述含有Mn²⁺的盐可以是MnCl₂，所述含有Na⁺的盐可以是NaCl，所述含有Ca²⁺的盐可以是CaCl₂。

本发明通过调节酶反应液中的金属阳离子种类、浓度，金属阳离子与缓冲介质共同调节反应体系处于适宜的酸碱环境中，控制核酸内切酶和DNA聚合酶的酶活性，从而平衡酶切反应速率和末端修复反应速率。

在一些实施方案中，所述Mg²⁺在所述酶反应液中的终浓度为0～20mM，例如可以是1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM，优选为2～18mM，进一步优选为3～17mM，再优选为4～16mM或5～15mM。

在一些实施方案中，所述Mn²⁺在所述酶反应液中的终浓度为0.05～1mM，例如可以是0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1mM，优选为0.07～0.8mM，进一步优选为0.09～0.6mM，再优选为0.1～0.5mM。

在一些实施方案中，所述Na⁺在所述酶反应液中的终浓度为0～50mM，例如可以是1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM，优选为0～30mM，进一步优选为5～30mM，再优选为5～20mM或5～15mM。

在一些实施方案中，所述Ca²⁺在所述酶反应液中的终浓度为0～10mM，例如可以是1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM，优选为0～8mM、0～5mM、0～3mM、1～10mM、1～5mM、1～3mM、2～10mM或2～5mM。

在一些实施方案中，所述底物包括dNTPs、dATP或ATP中的任意一种或至少两种的组合。

在一些实施方案中，所述dNTPs在所述酶反应液中的终浓度为0.05～0.5mM，例如可以是0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM，优选为0.05～0.4mM、0.05～0.3mM、0.05～0.2mM、0.05～0.1mM、0.07～0.5mM、0.07～0.4mM、0.07～0.3mM、0.07～0.2mM、0.07～0.1mM、0.09～0.5mM、0.09～0.4mM、0.09～0.3mM、0.09～0.2mM或0.09～0.1mM。

本发明中，将dNTPs的浓度限定在一定的范围内，有利于调节DNA聚合酶的末端修复速率。

在一些实施方案中，所述dATP在所述酶反应液中的终浓度为0.1～2mM，例如可以是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM，优选为0.1～1.5mM、0.1～1mM、0.3～2mM、0.3～1.5mM、0.3～1mM、0.5～2mM、0.5～1.5mM、0.5～1mM或0.5～0.8mM。

在一些实施方案中，所述ATP在所述酶反应液中的终浓度为1～10mM，例如可以是1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM，优选为1～9mM、1～8mM、1～7mM、1～6mM、1～5mM、3～10mM、3～9mM、3～8mM、3～7mM或3～6mM。

在一些实施方案中，所述缓冲介质包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和/或三羟甲基氨基甲烷(TRIS)。

在一些实施方案中，所述缓冲介质在所述酶反应液中的终浓度为10～50mM，例如可以是10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM，优选为10～40mM、10～30mM、15～50mM、15～45mM、15～40mM或15～30mM。

在一些实施方案中，所述酶反应液的pH为7.0～8.5，例如可以是7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，优选为7.5～8.1。

在一些实施方案中，所述酶组合物包含T4 PNK、BSA、T4 GP32、Vvn、T7核酸内切酶、Taq DNA聚合酶和Klenow。

在一些实施方案中，所述酶组合物包含T4 PNK、BSA、E.coli SSB、dsDNase、TaqDNA聚合酶和Klenow。

在一些实施方案中，所述酶组合物包含T4 PNK、BSA、T4 GP32、SAN、Taq DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I。

在一些实施方案中，所述酶组合物包含T4 PNK、BSA、T4 GP32、DNaseI、Taq DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶。

在一些实施方案中，所述反应缓冲液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、MgCl₂、CaCl₂、NaCl、MnCl₂、dNTPs、dATP和ATP。

在一些实施方案中，所述反应缓冲液包含或三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MgCl₂、CaCl₂、NaCl、MnCl₂、dNTPs、dATP和ATP。

在一些实施方案中，所述酶反应液还包含甘油。

在一些实施方案中，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MgCl₂、CaCl₂、NaCl、MnCl₂、dNTPs、dATP、ATP、T4 PNK、BSA、T4 GP32、DNaseI、Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和甘油。

在一些实施方案中，所述酶反应液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、MgCl₂、CaCl₂、NaCl、MnCl₂、dNTPs、dATP、ATP、T4 PNK、BSA、T4 GP32、DNaseI、Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和甘油。

在一些实施方案中，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MgCl₂、CaCl₂、NaCl、MnCl₂、dNTPs、dATP、ATP、T4 PNK、BSA、T4 GP32、SAN、Taq DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I和甘油。

在一些实施方案中，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷(TRIS)30mM、MgCl₂15mM、CaCl₂ 3mM、NaCl 10mM、MnCl₂ 0.1mM、dNTPs 0.1mM、dATP 0.6mM、ATP 5mM、T4PNK0.1U/μL、BSA 0.3μg/μL、T4 GP32 0.1μg/μL、DNaseI 0.006U/μL、Taq DNA聚合酶0.03U/μL、T4 DNA聚合酶0.9U/μL和甘油。

在一些实施方案中，所述酶反应液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)20mM、MgCl₂15mM、CaCl₂ 3mM、NaCl 10mM、MnCl₂ 0.5mM、dNTPs 0.1mM、dATP 0.6mM、ATP 5mM、T4 PNK0.1U/μL、BSA 0.3μg/μL、T4 GP32 0.1μg/μL、DNaseI 0.006U/μL、Taq DNA聚合酶0.03U/μL、T4 DNA聚合酶0.9U/μL和甘油。

在一些实施方案中，所述酶反应液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)20mM、MgCl₂5mM、CaCl₂ 3mM、NaCl 10mM、MnCl₂ 0.1mM、dNTPs 0.1mM、dATP 0.6mM、ATP 5mM、T4 PNK0.1U/μL、BSA 0.3μg/μL、T4 GP32 0.1μg/μL、DNaseI 0.006U/μL、Taq DNA聚合酶0.03U/μL、T4 DNA聚合酶0.9U/μL和甘油。

在一些实施方案中，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷(TRIS)30mM、MgCl₂15mM、CaCl₂ 3mM、NaCl 10mM、MnCl₂ 0.5mM、dNTPs 0.1mM、dATP 0.6mM、ATP 5mM、T4PNK0.1U/μL、BSA 0.3μg/μL、T4 GP32 0.1μg/μL、SAN 0.006U/μL、Taq DNA聚合酶0.03U/μL、大肠杆菌DNA聚合酶I 0.06U/μL和甘油。

本发明中，反应体系中的金属离子种类、浓度和缓冲介质的种类、浓度在一定范围内相互配合，维持酶反应液的pH值处于较稳定和适宜的状态，影响核酸内切酶和DNA聚合酶的活性，保证酶切反应速率和末端修复反应速率相一致，使构建的测序文库的长度适用于二代测序平台。

第二方面，本发明提供了一种测序文库的构建方法，所述方法包括：

将靶核酸加入第一方面所述的酶反应液中，孵育，进行靶核酸的片段化、末端修复、5’磷酸化和3’加A尾；

将孵育产物与测序接头进行连接反应；

将连接产物进行PCR，得到测序文库。

优选地，所述靶核酸的添加量为100pg～1μg，例如可以是100pg、1ng、10ng、100ng或1μg。

优选地，所述孵育的条件为35～40℃保持10～20min，60～70℃保持20～40min，优选为37℃保持15min，65℃保持30min。

第三方面，本发明提供了一种用于构建测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的酶反应液。

优选地，所述试剂盒还包括测序接头、连接反应试剂或PCR试剂中的任意一种或至少两种的组合。

本领域技术人员可以理解的是，本发明的酶反应液中的反应缓冲液和酶组合物可各自以独立的包装存在，反应缓冲液和酶组合物混合后终浓度与本发明一致或基本一致，亦在本发明的保护范围内。

第四方面，本发明提供了一种测序文库，所述测序文库采用第二方面所述的方法或第三面所述的试剂盒构建；

所述测序文件的长度为300～500bp。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明将核酸样本片段化、末端修复、3’加dA尾和5’磷酸化修饰整合为一步反应，酶组合物包括用于进行切割的核酸内切酶、用于进行末端修复和3’加A尾的DNA聚合酶、以及用于进行5’磷酸化的多聚核苷酸激酶，与反应缓冲液在一定的浓度范围内相互配合，控制酶切反应速率和末端修复反应速率，实现了在样本起始量为100pg-1μg、处理时间相同的情况下，获得长度一致的测序文库的技术效果，提高了文库构建的成功率；

(2)本发明的酶反应液使基于酶法的DNA片段化与文库构建方法得到了进一步简化，具有更加广泛的适用性和更加便捷的操作性。

附图说明

图1为使用组合1的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图2为使用组合2的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图3为使用组合3的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图4为使用组合4的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图5为使用组合5的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图6为使用组合6的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图7为使用组合7的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图8为使用组合8的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图9为使用组合9的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图10为使用组合10的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图11为使用组合11的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图12为使用组合12的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图13为使用组合13的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图14为使用组合14的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图15为使用组合15的酶反应液构建的测序文库的长度分布；

图16为使用组合16的酶反应液构建的测序文库的长度分布。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1酶反应液的配制

本实施例首先配制酶反应液，包括两个部分：如表1所示的反应缓冲液和如表2所示的酶组合物，将表1的反应缓冲液和表2的酶组合物进行交叉组合，得到如表3所示的不同配方的酶反应液，蛋白酶的厂家及货号见表4，创伤弧菌核酸酶Vvn的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

表1 反应缓冲液

表2 酶组合物

表3 酶反应液

组合编号	反应缓冲液+酶组合物
		组合1	反应缓冲液A+酶组合物1
组合2	反应缓冲液A+酶组合物2
		组合3	反应缓冲液A+酶组合物3
组合4	反应缓冲液A+酶组合物4
		组合5	反应缓冲液B+酶组合物1
组合6	反应缓冲液B+酶组合物2
		组合7	反应缓冲液B+酶组合物3
组合8	反应缓冲液B+酶组合物4
		组合9	反应缓冲液C+酶组合物1
组合10	反应缓冲液C+酶组合物2
		组合11	反应缓冲液C+酶组合物3
组合12	反应缓冲液C+酶组合物4
		组合13	反应缓冲液D+酶组合物1
组合14	反应缓冲液D+酶组合物2
		组合15	反应缓冲液D+酶组合物3
组合16	反应缓冲液D+酶组合物4

表4 蛋白/酶厂家及货号

创伤弧菌核酸酶Vvn的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

Ala Pro Pro Ser Thr Phe Ser Ala Ala Lys Gln Gln Ala Ala Lys Ile TyrGln Asp His Pro Ile Thr Phe Tyr Cys Gly Cys Asp Ile Glu Trp Gln Gly Lys LysGly Ile Pro Asn Leu Glu Thr Cys Gly Tyr Gln Val Arg Lys Ser Gln Thr Arg AlaSer Arg Ile Glu Trp Glu His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His His Arg GlnCys Trp Gln Lys Gly Gly Arg Lys Asn Cys Ser Lys Asn Asp Gln Gln Phe Arg LeuMet Glu Ala Asp Leu His Asn Leu Ser Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn Gly Asp ArgSer Asn Phe Asn Phe Ser Gln Trp Asn Gly Val Asp Gly Val Ser Tyr Gly Arg CysGlu Met Gln Val Asn Phe Lys Gln Arg Lys Val Met Pro Gln Thr Glu Leu Arg GlySer Ile Ala Arg Thr Tyr Leu Tyr Met Ser Gln Glu Tyr Gly Phe Gln Leu Thr LysGln Gln Gln Leu Met Gln Ala Trp Asn Lys Ser Tyr Pro Val Asp Glu Trp Glu CysSer Arg Asp Asp Arg Ile Ala Lys Ile Gln Gly Asn His Asn Pro Phe Val Gln GlnSer Cys Gln Thr Gln。

实施例2DNA模板的片段化和末端修复

本实施例以鲑鱼精gDNA为模板，起始投入量分别为100pg、1ng、10ng、100ng和1μg，采用实施例1的不同酶反应液对gDNA进行切割、末端修复、3’加A尾和5’磷酸化，并在随后的实施例中使用Vayzme#ND607

Universal DNA Library Prep Kit for

V3中的Rapid DNA Ligation Buffer和Rapid DNA Ligase进行接头连接反应，使用Vazyme#N401

DNA Clean Beads对接头连接产物和PCR扩增产物进行纯化，使用Vayzme#ND607

Universal DNA Library Prep Kit for

V3中的VAHTS HiFiAmplification Mix和PCR Primer Mix 3for Illumina对纯化的连接产物进行扩增富集，其中用于连接反应的接头(Adaptor)为

DNA Adapters for

(Vazyme#N801)。

靶DNA的片段化、末端修复、5’磷酸化和3’加dA尾反应体系如表5所示，其中，酶组合物的配方采用实施例1的组合1～16中的其中一种，靶DNA的投入量XμL分别对应100pg、1ng、10ng、100ng和1μg，反应条件为37℃孵育15min、65℃孵育30min，得到的片段化产物进行测序文库构建。

表5 片段化反应体系

组分	用量
		反应缓冲液	5μL
酶组合物	10μL
		靶DNA	XμL
灭菌ddH<sub>2</sub>O	补齐至50μL

实施例3构建测序文库

本实施例对实施例2制备的片段化产物进行接头连接反应、PCR扩增反应和纯化，构建测序文库，接头连接反应体系如表6所示，配制好的体系在20℃下孵育15min，进行接头连接；使用60μL VAHTS DNA Clean Beads对连接产物进行纯化，洗脱体积为20/22.5μL；

将纯化产物进行PCR扩增，体系如表7所示，条件如表8所示，使用45μL VAHTS DNAClean Beads对扩增产物进行纯化，洗脱体积为20/22.5μL。

表6 接头连接反应体系

组分	体积
		片段化纯化产物	50μL
连接反应缓冲液(Rapid DNA Ligation Buffer)	25μL
		DNA连接酶(Rapid DNA Ligase)	5μL
接头(DNA Adaptor)	5μL
		灭菌ddH<sub>2</sub>O	15μL

表7 PCR体系

组分	体积
		接头连接纯化产物	20μL
PCR扩增用酶及其缓冲液(VAHTS HiFi Amplification Mix)	25μL
		引物(PCR Primer Mix 3for Illumina)	5μL

表8 PCR反应程序

不同起始DNA投入量对应的接头稀释倍数和扩增循环数如表9所示。

表9 不同起始DNA投入量对应的接头稀释倍数和扩增循环数

gDNA投入量	接头稀释倍数	扩增循环数
			100pg	200倍	14
1ng	100倍	12
			10ng	10倍	8
100ng	原液	3
			1μg	原液	2

采用Agilent 2100 DNA1000芯片检测DNA文库的长度分布，结果如图1～图16，可以看出，各组酶反应液均可以在相同的处理时间内实现对不同投入量的DNA的有效切割、末端修复、5’磷酸化修饰和3’加dA尾。

其中，如图16所示，组合16的酶反应液的效果最优，能够完全兼容100pg～1μg的起始DNA投入量，文库片段长度的分布范围一致性好，主要在400～500bp范围内，说明当酶组合物为0.3U DNaseI、45U T4 DNA聚合酶、1.5U Taq DNA聚合酶、5U T4 PNK、15μg BSA和5μgT4 GP32时，与反应缓冲液(300mM Tris、150mM MgCl₂、30mM CaCl₂、100mM NaCl、1mM MnCl₂、1mM dNTPs、6mM dATP和50mM ATP)相互配合，可以完美平衡酶切反应速率和末端修复反应速率，制备得到片段长度一致的测序文库；

如图8、图11和图4所示，组合8、组合11和组合4的酶反应液的效果也较好，对起始投入量为100pg～1μg的DNA兼容性较好，制备得到片段长度大体一致，说明当酶组合物为0.004～0.008U/μL核酸内切酶、0.05～0.9U/μL低温DNA聚合酶、0.01～0.05U/μL Taq DNA聚合酶、0.05～0.3U/μL T4 PNK和0.2～0.6μg/μL辅助蛋白时，与反应缓冲液10～40mM缓冲介质、5～20mM Mg²⁺、0.1～0.6mM Mn²⁺、5～25mM Na⁺、1～5mM Ca²⁺、0.05～0.5mM dNTPs、0.1～1mM dATP和1～5mM ATP相互配合，调控酶切反应速率和末端修复反应速率，使制备得到的测序文库的片段长度较一致。

从图1可以看出，组合1的酶反应液适宜的起始投入量为100pg～10ng，起始投入量进一步增加会影响片段长度；从图2可以看出，组合2的酶反应液适宜的起始投入量为100ng～1μg；从图3可以看出，组合3的酶反应液适宜的起始投入量为1ng～10ng；从图5可以看出，组合5的酶反应液适宜的起始投入量为100pg～100ng；从图6可以看出，组合6的酶反应液适宜的起始投入量为10ng～100ng；从图7可以看出，组合7的酶反应液适宜的起始投入量为100pg～10ng；从图9可以看出，组合9的酶反应液适宜的起始投入量为100pg～10ng；从图10可以看出，组合10的酶反应液适宜的起始投入量为100pg～10ng；从图12可以看出，组合12的酶反应液适宜的起始投入量为1ng～100ng；从图13可以看出，组合13的酶反应液适宜的起始投入量为1ng～100ng；从图15可以看出，组合15的酶反应液适宜的起始投入量为10ng～100ng。

综上所述，本发明通过优化酶反应液的配方，酶组合物和反应缓冲液相互配合，优化了文库构建过程中的酶切反应速率和末端修复反应速率，实现了在样本起始量不同、处理时间相同的情况下，获得长度一致的测序文库的技术效果，具有广泛的适用性和便捷的操作性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏康科斯医疗科技有限公司；南京诺唯赞生物科技股份有限公司

<120> 一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用

<130> 20200624

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 212

<212> PRT

<213> 创伤弧菌

<400> 1

Ala Pro Pro Ser Thr Phe Ser Ala Ala Lys Gln Gln Ala Ala Lys Ile

1 5 10 15

Tyr Gln Asp His Pro Ile Thr Phe Tyr Cys Gly Cys Asp Ile Glu Trp

20 25 30

Gln Gly Lys Lys Gly Ile Pro Asn Leu Glu Thr Cys Gly Tyr Gln Val

35 40 45

Arg Lys Ser Gln Thr Arg Ala Ser Arg Ile Glu Trp Glu His Val Val

50 55 60

Pro Ala Trp Gln Phe Gly His His Arg Gln Cys Trp Gln Lys Gly Gly

65 70 75 80

Arg Lys Asn Cys Ser Lys Asn Asp Gln Gln Phe Arg Leu Met Glu Ala

85 90 95

Asp Leu His Asn Leu Ser Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn Gly Asp Arg

100 105 110

Ser Asn Phe Asn Phe Ser Gln Trp Asn Gly Val Asp Gly Val Ser Tyr

115 120 125

Gly Arg Cys Glu Met Gln Val Asn Phe Lys Gln Arg Lys Val Met Pro

130 135 140

Gln Thr Glu Leu Arg Gly Ser Ile Ala Arg Thr Tyr Leu Tyr Met Ser

145 150 155 160

Gln Glu Tyr Gly Phe Gln Leu Thr Lys Gln Gln Gln Leu Met Gln Ala

165 170 175

Trp Asn Lys Ser Tyr Pro Val Asp Glu Trp Glu Cys Ser Arg Asp Asp

180 185 190

Arg Ile Ala Lys Ile Gln Gly Asn His Asn Pro Phe Val Gln Gln Ser

195 200 205

Cys Gln Thr Gln

210

Claims

1.一种用于构建测序文库的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包括酶组合物和反应缓冲液；

所述酶组合物包括核酸内切酶、DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和辅助蛋白；

所述反应缓冲液包括金属盐、底物和缓冲介质水溶液；

所述核酸内切酶包括DNaseI或SAN；

所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，还包括T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I；

所述多聚核苷酸激酶包括T4多聚核苷酸激酶；

所述辅助蛋白包括牛血清白蛋白和T4噬菌体单链结合蛋白；

所述金属盐包括金属阳离子，所述金属阳离子包括Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺和Ca²⁺；

所述底物包括dNTPs、dATP和ATP；

所述缓冲介质包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸或三羟甲基氨基甲烷；

所述DNaseI在所述酶反应液中的终浓度为0.005~0.01 U/μL；

所述SAN在所述酶反应液中的终浓度为0.005~0.01 U/μL；

所述Taq DNA聚合酶在所述酶反应液中的终浓度为0.01~0.05 U/μL；

所述T4 DNA聚合酶在所述酶反应液中的终浓度为0.05~1.0 U/μL；

所述大肠杆菌DNA聚合酶I在所述酶反应液中的终浓度为0.05~1.0 U/μL；

所述T4多聚核苷酸激酶在所述酶反应液中的终浓度为0.05~0.3 U/μL；

所述牛血清白蛋白在所述酶反应液中的终浓度为0.1~0.4 μg/μL；

所述T4噬菌体单链结合蛋白在所述酶反应液中的终浓度为0.05~0.5 μg/μL；

所述Mg²⁺在所述酶反应液中的终浓度为2~18 mM；

所述Mn²⁺在所述酶反应液中的终浓度为0.07~0.8 mM；

所述Na⁺在所述酶反应液中的终浓度为5~25 mM；

所述Ca²⁺在所述酶反应液中的终浓度为1~5 mM；

所述dNTPs在所述酶反应液中的终浓度为0.05~0.5 mM；

所述dATP在所述酶反应液中的终浓度为0.1~1 mM；

所述ATP在所述酶反应液中的终浓度为3~10 mM；

所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸在所述酶反应液中的终浓度为10~40 mM；

所述三羟甲基氨基甲烷在所述酶反应液中的终浓度为10~40 mM。

2.根据权利要求1所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷、MgCl₂、CaCl₂、NaCl、MnCl₂、dNTPs、dATP、ATP、T4 PNK、BSA、T4 GP32、DNaseI、Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和甘油。

3.根据权利要求2所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷10~40 mM、MgCl₂ 2~18 mM、CaCl₂ 1~5 mM、NaCl 5~25 mM、MnCl₂ 0.07~0.8 mM、dNTPs 0.05~0.5 mM、dATP 0.1~1 mM、ATP 3~10 mM、T4 PNK 0.05~0.3 U/μL、BSA 0.1~0.4 μg/μL、T4GP32 0.05~0.5 μg/μL、DNaseI 0.005~0.01 U/μL、Taq DNA聚合酶0.01~0.05 U/μL、T4 DNA聚合酶0.05~1.0 U/μL和甘油。

4.根据权利要求3所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷30 mM、MgCl₂ 15 mM、CaCl₂ 3 mM、NaCl 10 mM、MnCl₂ 0.1 mM、dNTPs 0.1 mM、dATP 0.6 mM、ATP 5 mM、T4 PNK 0.1 U/μL、BSA 0.3 μg/μL、T4 GP32 0.1 μg/μL、DNaseI 0.006 U/μL、Taq DNA聚合酶0.03 U/μL、T4 DNA聚合酶0.9 U/μL和甘油。

5.根据权利要求1所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、MgCl₂、CaCl₂、NaCl、MnCl₂、dNTPs、dATP、ATP、T4 PNK、BSA、T4 GP32、DNaseI、Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和甘油。

6.根据权利要求5所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸10~40 mM、MgCl₂ 2~18 mM、CaCl₂ 1~5 mM、NaCl 5~25 mM、MnCl₂ 0.07~0.8 mM、dNTPs0.05~0.5 mM、dATP 0.1~1 mM、ATP 3~10 mM、T4 PNK 0.05~0.3 U/μL、BSA 0.1~0.4 μg/μL、T4 GP32 0.05~0.5 μg/μL、DNaseI 0.005~0.01 U/μL、Taq DNA聚合酶0.01~0.05 U/μL、T4DNA聚合酶0.05~1.0 U/μL和甘油。

7.根据权利要求6所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 mM、MgCl₂ 5 mM、CaCl₂ 3 mM、NaCl 10 mM、MnCl₂ 0.1 mM、dNTPs 0.1 mM、dATP 0.6mM、ATP 5 mM、T4 PNK 0.1 U/μL、BSA 0.3 μg/μL、T4 GP32 0.1 μg/μL、DNaseI 0.006 U/μL、Taq DNA聚合酶0.03 U/μL、T4 DNA聚合酶0.9 U/μL和甘油。

8.根据权利要求6所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 mM、MgCl₂ 15 mM、CaCl₂ 3 mM、NaCl 10 mM、MnCl₂ 0.5 mM、dNTPs 0.1 mM、dATP 0.6mM、ATP 5 mM、T4 PNK 0.1 U/μL、BSA 0.3 μg/μL、T4 GP32 0.1 μg/μL、DNaseI 0.006 U/μL、Taq DNA聚合酶0.03 U/μL、T4 DNA聚合酶0.9 U/μL和甘油。

9.根据权利要求1所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷、MgCl₂、CaCl₂、NaCl、MnCl₂、dNTPs、dATP、ATP、T4 PNK、BSA、T4 GP32、SAN、Taq DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I和甘油。

10.根据权利要求9所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷10~40 mM、MgCl₂ 2~18 mM、CaCl₂ 1~5 mM、NaCl 5~25 mM、MnCl₂ 0.07~0.8 mM、dNTPs0.05~0.5 mM、dATP 0.1~1 mM、ATP 3~10 mM、T4 PNK 0.05~0.3 U/μL、BSA 0.1~0.4 μg/μL、T4 GP32 0.05~0.5 μg/μL、SAN 0.005~0.01 U/μL、Taq DNA聚合酶0.01~0.05 U/μL、大肠杆菌DNA聚合酶I 0.05~1.0 U/μL和甘油。

11.根据权利要求10所述的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包含三羟甲基氨基甲烷30 mM、MgCl₂ 15 mM、CaCl₂ 3 mM、NaCl 10 mM、MnCl₂ 0.5 mM、dNTPs 0.1 mM、dATP 0.6mM、ATP 5 mM、T4 PNK 0.1 U/μL、BSA 0.3 μg/μL、T4 GP32 0.1 μg/μL、SAN 0.006 U/μL、Taq DNA聚合酶0.03 U/μL、大肠杆菌DNA聚合酶I 0.06 U/μL和甘油。

12.一种测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

将靶核酸加入权利要求1-11任一项所述的酶反应液中，孵育，进行靶核酸的片段化、末端修复、5’磷酸化和3’加A尾；

将孵育产物与测序接头进行连接反应；

将连接产物进行PCR，得到测序文库。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述靶核酸的添加量为100 pg~1 μg。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述孵育的条件为35~40℃保持10~20min，60~70℃保持20~40 min。

15.一种用于构建测序文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-11任一项所述的酶反应液。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序接头、连接反应试剂或PCR试剂中的任意一种或至少两种的组合。