CN117025724A - Rna链特异性建库试剂盒及建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种RNA链特异性建库试剂盒，其包含第一链cDNA合成组分，其特征在于所述第一链cDNA合成组分至少包括逆转录酶，所述逆转录酶的依赖DNA模板的DNA聚合酶活性在野生型逆转录酶依赖DNA模板的DNA聚合酶活性的30％以下，所述第一链cDNA合成组分中不含放线菌素D。还公开了MMLV逆转录酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的MMLV逆转录酶突变体，其DNA为模板的DNA聚合酶活性失活。用其制备的RNA链特异性建库试剂盒，在合成第一链cDNA时不需要再额外添加放线菌素D，可以显著的增加试剂盒的稳定性、安全性、方便性。
Description
技术领域
本发明专利涉及RNA链特异性建库试剂盒及建库方法，属于生物技术领域。
背景技术
随着第二代测序技术的快速发展，越来越多的科学家在利用第二代测序技术来解析各种生物学问题。第二代测序可以进行全基因组层面的重测序，分析基因组层面的差异；也可以进行转录组层面的测序，解析细胞或者特定的组织在某个发育阶段的基因表达谱。转录组测序又分为链特异性建库和非链特异性建库。链特异性建库又称ssRNA-seqlibrary，可以区分转录本来自于正义链还是反义链，这样可以更好的帮助科研者区分转录本，确认基因表达的信息，更好的解释科学问题。
目前可以实现链特异性的建库的策略有三点必须同时满足才能完成链特建库。第一个是在逆转录的过程中，添加一定比例的放线菌素D，抑制逆转录酶的DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)，保证在第一链cDNA的合成过程中，逆转录酶只有以RNA为模板的DNA聚合酶活性，只能产生第一链cDNA，无其他副产物产生，但是放线菌素D是有很多缺点的，比如对光非常敏感，容易出现见光降解，需要避光保存，造成试剂不稳定性、试剂使用简便性降低；比如有毒，虽然使用浓度较低，但是对生产等也存在一定风险；比如会逐渐吸附在塑料和玻璃的表面，这会造成操作时间过长，放线菌素D失效明显，因此有些产品甚至建议使用者现用现配。第二个是在第二链cDNA合成中添加dUTP，使合成的第二链cDNA中是含有dUTP的DNA链。第三个是利用UDGase，在PCR前将含有dUTP的第二链cDNA消化掉，保证只有第一链cDNA进入文库扩增。
因此，对于增加链特异性建库试剂盒的稳定性、安全性、方便性，亟需对实现链特异性的第一点进行改进，本发明就是通过对逆转录酶进行改造，使其失活其DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)，将放线菌素D直接舍弃，让试剂盒生产更安全、使试剂盒更稳定，让使用者更方便、更安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种RNA链特异性建库试剂盒，其中所使用的逆转录酶的DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)降低，甚至失活，实现了舍弃放线菌素D。
本发明采用的技术方案为：一种RNA链特异性建库试剂盒，至少包含逆转录酶和第一链cDNA合成组分，所述逆转录酶依赖DNA模板的DNA聚合酶活性在野生型逆转录酶依赖DNA模板的DNA聚合酶活性的30％以下，所述第一链cDNA合成组分中不含放线菌素D。降低或缺失逆转录酶的依赖DNA模板的DNA聚合酶活性可以通过酶突变、功能域除去、抗体封闭等方式实现。
优选的，所述逆转录酶缺失依赖DNA模板的DNA聚合酶活性。
优选的，所述试剂盒还包含第一链cDNA合成组分，所述第一链cDNA合成组分包括5-25U/μL逆转录酶，1-2U/μL RNase抑制剂，150-250mM pH 7-9的Tris-HCl，200-400mMKCl，10-20mM DTT，2.5-15mM dNTPs。
优选的，第一链cDNA合成组分包括25U/μL逆转录酶，2U/μL RNase抑制剂，250mMpH8.3的Tris-HCl，300mM KCl，20mM DTT，2.5mM dNTPs。
优选的，还包括片段化反应组分、第二链cDNA的合成及末端修复加A组分、接头连接组分、接头连接组分、文库扩增组分。
优选的，所述第二链cDNA的合成及末端修复加A组分包括0.5～1.5U/μL DNAPolymerase I,Large(Klenow)Fragment，0.2～1U/μL核糖核酸酶H，0.2～1U/μL T4 DNA聚合酶，0.05～1U/μL Taq DNA聚合酶，0.2～1U/μLT4多聚核苷酸激酶，50～250mM pH7-9的Tris-HCl，20～100mM MgCl2，120～500mM NaCl，0.8～15mM dNTPs，0.8～15mM dUTP，2～100mM ATP。
优选的，所述第二链cDNA的合成及末端修复加A组分包括1.5U/μL DNAPolymerase I,Large(Klenow)Fragment，0.25U/μL核糖核酸酶H，0.2U/μL T4 DNA聚合酶，1U/μL Taq DNA聚合酶，1U/μL T4多聚核苷酸激酶，100mM pH 8.0的Tris-HCl，20mM MgCl2，100mM NaCl，0.8mM dNTPs，2mM ATP，0.8mM dUTP。
优选的，所述接头连接组分包括50～500U/μL的T4 DNA Ligase，50～350mM pH7-9的Tris-HCl，10～100mM MgCl2，2～10mM ATP，3～10％v/v的PEG8000。
优选的，所述接头连接组分包括500U/μL的Novel T4DNA Ligase，350mMpH8.0的Tris-HCl，16mM MgCl2，2.8mM ATP，10％v/v的PEG8000。
优选的，RNA链特异性建库试剂盒的逆转录酶为MMLV逆转录酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述RNA链特异性建库试剂盒可以采用板式试剂盒。
本发明还公开了一种双模式转录组快速建库试剂盒，包含上述的RNA链特异性建库试剂盒中的各组分。
双模式转录组快速建库试剂盒的组分可以采用CN115011669A公开的组分，除了逆转录酶的依赖DNA模板的DNA聚合酶活性降低，以及第一链cDNA合成组分中不含放线菌素D。
本发明还公开了一种板式试剂盒，包括上述的RNA链特异性建库试剂盒中的各组分。
优选的，其包括如下组分：所述片段化反应组分、所述第一链cDNA合成组分、第二链cDNA的合成及末端修复加A组分、所述接头连接组分、所述文库扩增组分；各组分分别排布在同一反应板中的不同反应孔中。
本发明还公开了一种自动化测序产品，包括上述的板式试剂盒。
本发明还公开了一种MMLV逆转录酶突变体，在野生型逆转录酶MMLV的基础上，具有6个氨基酸位点的突变：K152E、L333P、T382A、G504S、D524A、T662A，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。
本发明还公开了上述的MMLV逆转录酶突变体的编码基因。
优选的，其DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还公开了上述的MMLV逆转录酶突变体的表达载体。
本发明还公开了表达上述的MMLV逆转录酶突变体的宿主菌。
本发明还公开了上述的MMLV逆转录酶突变体在逆转录反应中的应用。
本发明还公开了一种RNA链特异性建库方法，采用依赖DNA模板的DNA聚合酶活性在野生型逆转录酶依赖DNA模板的DNA聚合酶活性的30％以下的逆转录酶，且合成第一链cDNA时不使用放线菌素D。
优选的，其步骤包括：
(1)将mRNA进行片段化处理；
(2)以片段化的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成第一链cDNA；
(3)合成第二链cDNA；
(4)cDNA连接接头，纯化连接产物；
(5)对cDNA与接头的连接产物进行文库扩增，获得RNA链特异性文库。
优选的，所述逆转录酶为上述的MMLV逆转录酶突变体。RNA链特异性建库试剂盒还可以包括片段化反应组分及文库扩增组分，片段化反应组分及文库扩增组分可以采用翌圣生物的Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒中相应的片段化反应组分及文库扩增组分。
本发明具有如下有益效果：
本发明的MMLV逆转录酶突变体，其DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)失活。用其制备的RNA链特异性建库试剂盒，在合成第一链cDNA时不需要再额外添加放线菌素D，可以显著的增加试剂盒的稳定性、安全性、方便性。
附图说明
图1为本发明的RNA链特异性建库试剂盒板式形式。
图2为本发明的不同逆转录酶的链特建库文库峰图分析。
图3为本发明的新型的逆转录酶在RNA链特异性建库中的文库峰图分析。
图4为本发明的板式链特异性建库试剂盒和12310建库试剂盒的建库文库峰图分析。
图5为本发明的一种板式RNA链特异性建库试剂盒的自动化装液形式。
图6为本发明的板式链特异性建库试剂盒自动化建库A1-A12文库峰图分析。
图7为本发明的板式链特异性建库试剂盒自动化建库B1-B12文库峰图分析。
图8为板式RNA链特异性建库试剂盒的稳定性建库文库峰图分析。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
实施例1：不同逆转录酶的DNA对链特异性建库的影响
本实施例是利用Universal Reference RNAs(安捷伦，货号：740000)进行如下所示的RNA链特建库流程分析。本发明使用的部分建库组分是翌圣生物的UltimaDual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒的组分。本实施案例的RNA投入量为10ng，测试的逆转录酶有NEB的/>UltraTMIIDirectional RNA Library Prep Kit for/>的NEB Next First StrandSynthesis Enzyme Mix，诺唯赞的VAHTS Universal V8RNA-seq Library Prep Kit forIllumina(货号：NR605-01)1st Strand Enzyme Mix 3，InvitrogenTM的SuperScriptTM II反转录酶(货号：18064022)、SuperScriptTM III逆转录酶(货号：18080044)、SuperScriptTMIV逆转录酶(货号：18090200)，凯杰的M-MuLV Reverse Transcriptase(货号：P7040L)。
1)mRNA的抓取
根据翌圣生物的mRNA Isolation Master Kit mRNA纯化试剂盒(货号：12603)说明书，进行8个10ng Universal Reference RNAs的mRNA抓取。
2)mRNA的片段化
使用翌圣生物的Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒的打断反应缓冲液，进行94℃7min的片段化。
3)第一链cDNA的合成
使用1st cDNA合成反应缓冲液：250mM pH 8.3的Tris-HCl，300mM KCl，20mM DTT，2.5mM dNTPs，及凯杰的RNAse Inhibitor(货号：Y9240L)40U/反应进行第一链cDNA的合成。
表1不同逆转录酶的1st cDNA合成反应体系
根据表1配好第一链cDNA合成反应体系，进行第一链cDNA的反应程序：25℃10min；42℃15min；70℃15min；4℃Hold。
4)第二链cDNA的合成
使用翌圣生物的Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒的2nd Reaction Module 2(dUTP)的组分进行含有dUTP的第二链cDNA的合成。
5)接头连接，连接产物的纯化
使用翌圣生物的Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒的Ligation Reaction Module的组分，RNA 384CDIPrimer for/>(货号：12414)的PE Adapter对合成好的cDNA进行接头连接。完成连接后，使用翌圣Hieff/>DNA Selection Beads分选磁珠(完美替代AMPure XPBeads)(货号：12601)进行0.45x磁珠纯化，然后使用80％乙醇进行2次清洗，最后使用22μL的无菌水进行洗脱。
6)文库扩增后纯化
使用翌圣生物的Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒的2×Super/>II High-Fidelity Mix的组分，/>RNA 384CDIPrimer for/>(货号：12414)的RP 501及RP 701到RP707扩增引物，对合成的cDNA接头连接产物进行文库扩增，扩增循环数16个循环，然后使用翌圣/>DNA Selection Beads分选磁珠(完美替代AMPure XPBeads)(货号：12601)进行0.9x磁珠纯化，然后使用80％乙醇进行2次清洗，最后使用30μL的无菌水进行洗脱，然后使用Qubit进行文库定量，文库产量结果如下表2，文库峰图如图2，泳道1-8依次代表表2中实验编号1-8中各个反应所得文库的琼脂糖电泳结果。
表2不同逆转录酶的链特建库产量
使用不同的逆转录酶进行链特建库，发现使用不含放线菌素D的第一链cDNA合成反应缓冲液后，各种逆转录酶建库后产量相差较大，但是文库峰型基本一致。因此，我们进行等质量混库后送测序，分析测序数据。
7)第二代测序分析
对不同的逆转录酶进行10ng总RNA的mRNA链特异性建库的文库进行测序分析发现。如表3，可以看到，不同的逆转录酶反转录的第一链cDNA建好的文库，常规测序的下机质检指标差异不大；比对到基因组的比例基本都在98％左右，基因检出数目在18000左右，转录本检出数目在45000以上，外显子检出的占比在93％以上；但是对于链特异性建库的重要指标反义链的占比却相差较大，加放线菌素D的试剂盒12310实验编号1的链特异性能到96％以上，其他各个厂家的逆转录酶的链特异性存在差异，这可能与各个酶的DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)有关，具体：在不加放线菌素D的第一链cDNA反应缓冲液中的都存在不同比例的DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)，活性最高的是InvitrogenTMSuperScriptTM IV逆转录酶(货号：18090200)，有接近40％的第一链cDNA在反转录中形成了第二链cDNA，其次是诺唯赞的VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit forIllumina(货号：NR605-01)1st Strand Enzyme Mix 3，有接近30％的第一链cDNA在反转录中形成了第二链cDNA，再次是InvitrogenTM SuperScriptTM III逆转录酶(货号：18080044)，有接近11％的第一链cDNA在反转录中形成了第二链cDNA，翌圣的1st StrandEnzyme Mix(货号：12309)、InvitrogenTM SuperScriptTM II逆转录酶、NEBNext FirstStrand Synthesis Enzyme Mix、凯杰M-MuLV Reverse Transcriptase有接近7～8％的第一链cDNA在反转录中形成了第二链cDNA。
从这个实施案例可以给出的启示是：对不同的逆转录酶进行不同的突变改造可以对逆转录酶的这个DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)造成显著的影响，如果该活性降低甚至失活，就有可能完全不用再添加放线菌素D来提高链特异性建库的指标。因此，基于这个线索，我们开始对逆转录酶进行改造，筛选完全失活或者具有极低的DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)的逆转录酶，用第一链cDNA合成反应液(250mM pH 8.3的Tris-HCl，300mM KCl，20mM DTT，2.5mM dNTPs)筛选逆转录酶。
表3不同逆转录酶的链特建库后的测序数据
实施例2：新型逆转录酶的获得
基于实施例1，我们分析到可以通过改进逆转录酶的DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)活性，来达到不添加放线菌素D，做到逆转录酶只有以RNA为模板的DNA聚合酶活性。因此翌圣生物翌圣ZymeEditor平台基于已发表的各种逆转录酶的突变体及文献，寻找抑制DNA为模板的DNA聚合酶活性(负链转移)活性的突变体，确认在鼠白血病病毒的逆转录酶MMLV野生型进行了6个位点的定点突变：K152E、L333P、T382A、G504S、D524A、T662A，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成了上述逆转录酶突变体的编码DNA，其序列如SEQ ID No：2所示。将新型逆转录酶的编码基因SEQ ID No：2序列用常规方法进行蛋白表达纯化，得到新型逆转录酶。
DDDP(MMLV逆转录酶突变体依赖DNA的DNA聚合酶活性)检测。
本发明突变型逆转录酶酶活测定采用焦磷酸定量法，以野生型MMLV逆转录酶为参照。
测定MMLV逆转录酶DDDP活性的原理是以单链环DNA为模板，经MMLV逆转录酶扩增后，产生DNA的同时伴随着焦磷酸的产生。采用焦磷酸试剂盒对产物进行定量时，产生的荧光值与焦磷酸成正比，即所测得的荧光值与DDDP活性成正比。
焦磷酸检测试剂盒购自AAT Bioquest，MMLV逆转录酶DDDP活性的测试具体实施方式如下：
(1)将MMLV逆转录酶根据蛋白质浓度稀释成若干浓度梯度；
(2)根据表4配制引物退火体系。
表4引物退火体系
| 组分 | 用量 |
| 5x RT Buffer | 4μL |
| dNTPs(2.5mM each)(YEASEN) | 2μL |
| PhiX174DNA模板 | 0.5μL |
| Primer(10μM) | 1 |
| DEPC-H2O(YEASEN) | To 18μL |
在95℃孵育30s，置于冰上静置2min。
然后在上述退火反应体系加入待测酶2μL，振荡混匀，在37℃反2min，结束后立即置于冰上终止反应。
焦磷酸检测：在96孔酶标板中加入48μL DEPC水，2μL混匀的酶反应液，50μL焦磷酸工作液，酶标仪震荡混匀后，25℃孵育20min后，用酶标仪测量荧光值，根据荧光值计算突变型逆转录酶活力。新型逆转录酶的DDDP活力结果如表5。
表5突变型MMLV逆转录酶的DDDP活力结果
| 逆转录酶编号 | DDDP(U/μL) | DDDP(U/μg) | 比例％ |
| WT(野生型) | 394.74 | 91.27 | 100.00 |
| 新型逆转录酶 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
从表5可以看出，本发明的新型逆转录酶的DDDP活力能降至野生型的30％及以下，甚至检测不出DDDP活性。
实施例3：新型逆转录酶在RNA链特异性建库中的应用
本实施例是利用Universal Reference RNAs(安捷伦，货号：740000)进行如下所示的RNA链特建库流程分析。使用的部分建库组分是翌圣生物的Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒的组分。本实施案例的RNA投入量为1ug、10ng。具体建库流程参照实施案例1的1,5号实验组。12310试剂盒以及新型逆转录酶每个反应的逆转录酶使用量均为200U。
表6中实验编号1,2&5,6号实验组是使用翌圣Ultima Dual-modeRNALibrary Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)；实验编号3,4&7,8除1st cDNA合成反应缓冲液(250mM pH 8.3的Tris-HCl，300mM KCl，20mM DTT，2.5mM dNTPs)不含放线菌素D之外，合成反应缓冲液组分与实验编号1,2&5,6号实验组相同。逆转录酶使用的是新型逆转录酶及凯杰的RNAse Inhibitor(货号：Y9240L)进行第一链cDNA的合成。
结合表6，对新型逆转录酶的建库产量及测序数据分析发现，建库产量相当、文库峰型如图3所示基本一致，泳道1-8依次代表表2中实验编号1-8中各个反应所得文库的琼脂糖电泳结果。测序数据的下机质控合格、基本一致，但是在10ng投入量上，链特异性建库质控指标反义链占比相比使用12310试剂盒的5,6号要高2～3％。综上所述，使用新型逆转录酶确实可以实现不使用放线菌D做到10ng～1μg一致的反义链占比，可以达到98％以上。
表6新型逆转录酶在RNA链特异性建库中的建库产量及测序数据
实施例4：板式RNA链特异性建库试剂盒
分别配置以下组分：
组分A：片段化反应组分，采用12310试剂盒中的片段化反应组分；
组分B：第一链cDNA合成组分，具体为5-25U/μL所述逆转录酶，1-2U/μL RNase抑制剂，150-250mM pH 7-9的Tris-HCl，200-400mM KCl，10-20mM DTT，2.5-15mM dNTPs；
组分C：第二链cDNA的合成及末端修复加A组分，具体为0.5～1.5U/μlDNAPolymerase I,Large(Klenow)Fragment，0.2～1U/μl核糖核酸酶H，0.2～1U/μl T4 DNA聚合酶，0.05～1U/μl Taq DNA聚合酶，0.2～1U/μl T4多聚核苷酸激酶，5～250mM pH7-9的Tris-HCl，20～100mM MgCl2，120～500mM NaCl，0.8～15mM dNTPs，0.8～15mM dUTP，2～100mM ATP；
组分D：接头连接组分，具体为50～500U/μl的T4 DNALigase，50～350mM pH7-9的Tris-HCl，10～100mM MgCl2，2～10mM ATP，3～10％v/v的PEG8000。
组分E：文库扩增组分，采用12310试剂盒中的2×SuperII High-FidelityMix的组分。
将配置好的各个组分按照反应样本数量加到同一反应板中。
图1为96T反应的板式RNA链特异性建库试剂盒示意图，板式RNA链特异建库试剂盒是按照图1所示进行分装保存的。其中A组分-E组分分别满足96个反应样本数量；具体A1-H1为12T的A组分；依次类推其他组分。
图5为在建库试剂盒的基础上，进一步添加了自动化测序所需的其他反应组分，例如进行第6列加通用接头或者通用扩增引物，本实施案例加入的是RNA 384CDIPrimer for/>(货号：12414)的PE Adapter，第7，8，9列加入的是使用翌圣DNA Selection Beads分选磁珠(完美替代AMPure XPBeads)(货号：12601)，分选磁珠的列数可根据需求加入，不限于3列。这种排版可以和自动化完美搭配，不需要再转板，且可以节约客户的排版，节省时间，也可做到不同的自动化平台基本都可以直接使用。
具体的一体化的反应板可以选择常见的不同排布方式的反应板，例如8联排PCR反应板，96孔反应板，当样本数量较多，各组分的预配量较大时，可选择深孔板，以满足反应需求。
实施例5：板式RNA链特异性建库试剂盒和12310试剂盒的对比测试
本实施案例是利用Universal Reference RNAs(安捷伦，货号：740000)进行如下所示的板式RNA链特异性建库和12310试剂盒流程分析。使用翌圣生物的UltimaDual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒。本实施案例的RNA投入量为1ug、10ng。
1)mRNA的抓取
使用翌圣生物的Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒的打断反应缓冲液，进行94℃7min的片段化。
2)mRNA的片段化
使用翌圣生物的Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒的打断反应缓冲液，进行94℃7min的片段化。
3)第一链cDNA的合成
板式链特异性建库试剂盒的第一链cDNA合成组分2.0(B组分)包含：25U/μL新型的逆转录酶，2U/μL RNase抑制剂，250mM pH 8.3的Tris-HCl，300mM KCl，20mM DTT，2.5mMdNTPs。根据表7配置第一链cDNA合成反应体系。
表7试剂盒12310和板式链特异性建库的第一链cDNA合成反应体系
反应条件是：25℃10min，42℃15min，70℃15min，4℃保存。
使用两个试剂盒12310，板式链特异性建库试剂盒完成第一链cDNA的合成。
4)第二链cDNA的合成(含有dUTP第二链cDNA的合成)
板式链特异性建库试剂盒的第二链cDNA合成组份2.0(C组份)包含：1.5U/μl DNAPolymerase I,Large(Klenow)Fragment，0.25U/μl核糖核酸酶H，0.2U/μl T4 DNA聚合酶，1U/μlTaq DNA聚合酶，1U/μl T4多聚核苷酸激酶，100mM pH 8.0的Tris-HCl，20mM MgCl2，100mM NaCl，0.8mM dNTPs，2mM ATP，0.8mM dUTP。根据表8配置第二链cDNA合成反应体系。
表8试剂盒12310和板式链特异性建库的第二链cDNA合成反应体系
反应条件是：16℃30min，72℃15min，保存于4℃。
使用两个试剂盒12310，板式链特异性建库试剂盒完成第二链含有dUTP的cDNA的合成。
5)接头连接，连接产物的纯化
接头连接组分2.0(D组分)包含：500U/μL的Novel T4DNA Ligase，350mMpH8.0的Tris-HCl，16mM MgCl2，2.8mM ATP，10％ PEG8000(v/v)。根据表9配置第cDNA接头连接体系。
表9试剂盒12310和板式链特异性建库的cDNA接头连接反应体系
反应条件：20℃15min；4℃Hold。
使用两个试剂盒12310，板式链特异性建库试剂盒完成连接后，使用翌圣DNA Selection Beads分选磁珠(完美替代AMPure XPBeads)(货号：12601)进行0.45x磁珠纯化，然后使用80％乙醇进行2次清洗，最后使用22μL的无菌水进行洗脱。
6)文库扩增后纯化
使用翌圣生物的Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)(货号：12310)建库试剂盒的2×Super/>II High-Fidelity Mix的组分，/>RNA 384CDIPrimer for/>(货号：12414)的RP 501及RP 701到RP707扩增引物，对合cDNA接头连接产物进行文库扩增，总投入量1μg RNA时，扩增循环数为10个循环，总投入量10ng RNA时，扩增循环数为16个循环。然后使用翌圣/>DNASelection Beads分选磁珠(完美替代AMPure XPBeads)(货号：12601)进行0.9x磁珠纯化，然后使用80％乙醇进行2次清洗，最后使用30μL的无菌水进行洗脱，然后使用Qubit进行文库定量，文库产量结果如下表10，文库峰图如图4。
表10试剂盒12310和板式链特异性建库的产量分析
使用两个试剂盒12310，板式链特异性建库试剂盒完成1μg、10ng的总RNA的mRNA建库建库，实验编号1&2,5&6是使用全套的12310完成建库，实验编号3&4,7&8是使用板式链特异性建库试剂盒建库。根据表10，可以看到不同投入量，板式链特异性建库试剂盒相比12310产量要略高。因此，我们对上述8个样本进行第二代测序，分析一下测序数据上的差异。
7)第二代测序分析
对不同的试剂盒进行的1μg、10ng总RNA的mRNA链特异性建库的文库进行测序分析发现。如表11，可以看到，不同投入量不同试剂盒建库后，等质量的文库混库后送样测序，原始下机数据相差不大，原始数据的下机质控Q20、Q30差异不大；比对到基因组的占比，1μg的总RNA的mRNA建库占比达到98％以上，10ng的总RNA的mRNA建库，板式链特异性建库试剂盒要比12310高1％左右；外显子的占比板式链特异性建库试剂盒要比12310在不同投入量上要略高；链特异性建库的关键质检指标反义链的占比在1μg上相当，都可以达到98.5％以上，在10ng上板式链特异性建库试剂盒要比12310要高，而且板式链特异性建库试剂盒在不同投入量上存在一致的链特异性。根据上述案例，板式链特异性建库试剂盒在建库性能上是能达到12310的建库产量及测序数据指标，能满足案例1提的假想。
表11试剂盒12310和板式链特异性建库的不同投入量的文库测序数据
实施例6：板式RNA链特异建库试剂盒的自动化建库测试
本实施案例是利用Universal Reference RNAs(安捷伦，货号：740000)、293细胞系总RNA进行如下所示的板式RNA链特异建库的自动化测试。板式RNA链特异建库试剂盒是按照图1所示进行分装保存的。自动化仪使用的MGISP-960高通量自动化样本制备系统。根据翌圣的自动化建库流程操作指导进行自动化建库。因本实施例的板式试剂的排版只占用1-5列(依次对应图5中的A组分到E组分)，6-12列为空孔，所以我们在自动化前准备试剂的时候可以根据图5进行第6列加通用接头或者通用扩增引物，本实施案例加入的是Hieff
RNA 384CDIPrimer for/>(货号：12414)的PE Adapter(对应图5中的Primer Mix)，第7、8、9列加入的是使用翌圣/>DNA Selection Beads分选磁珠(完美替代AMPure XPBeads)(货号：12601)(对应图5中的三列DNA纯化磁珠)。这种排版可以和自动化完美搭配，不需要再转板，且可以节约客户的排版，节省时间，也可做到不同的自动化平台基本都可以直接使用。
本实施案例的板式链特异建库试剂盒进行了2排自动化测试，A1-A12(mRNA的抓取步骤中的样本标记号中的12个编号)进行1μg Universal Reference RNAs的mRNA建库，B1-B12(mRNA的抓取步骤中的样本标记号中的12个编号)进行1μg 293总RNA的mRNA建库。将A1-A12的样本添加到板式链特异建库试剂盒的A行中，按照建库反应步骤依次进行反应；将B1-B12的样本添加到板式链特异建库试剂盒的B行中，按照建库反应步骤依次进行反应。
表12是A1-A12是Universal Reference RNAs的建库产量及测序分析，表13是B1-B12的293RNA的建库产量及测序数据分析。通过图6、7对A1-A12到B1-B12文库峰型的分析发现，板式链特异性建库试剂盒重复性很好；表12、13对A1-A12到B1-B12文库产量分析发现，每个孔位的建库产量相当，下机数据的质控都差不多，包括外显子占比、比对到基因组的比例、尤其是链特异性建库指标反义链的占比都相当。通过上述案例可以说明我们的板式的链特异性建库试剂盒是适用于自动化建库。
表12板式RNA链特异建库试剂盒的自动化A1-A12建库产量及测序数据分析
表13板式RNA链特异建库试剂盒的自动化B1-B12建库产量及测序数据分析
实施例7：板式RNA链特异性建库试剂盒的稳定性测试
本实施例是利用Universal Reference RNAs(安捷伦，货号：740000)进行如下所示的RNA链特建库的稳定性测试。对于板式RNA链特异性建库试剂盒按照图1所示的形式，分装。进行4℃1周、2周、3周、4周，25℃2天、4天、6天、10天、14天放置后的按照实施案例4的板式RNA建库流程，进行1μg建库及测序分析。
结果如表14所示，可以看出，4℃处理1～4周，25℃处理2～14天，建库产量相比对照-20℃保存，产量变化不大，在±10％的误差以内；文库峰型如图8所示，基本一致；下机数据质检差异不大，比对到基因组的占比相当，基因检出数目及外显子占比也相差不大，链特异性建库测序指标反义链的占比也都维持在98％以上，稳定性较好。
表14板式RNA链特建库试剂盒的稳定性建库产量及测序数据
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Claims (17)
1.一种RNA链特异性建库试剂盒，其包含第一链cDNA合成组分，其特征在于所述第一链cDNA合成组分至少包括逆转录酶，所述逆转录酶的依赖DNA模板的DNA聚合酶活性在野生型逆转录酶依赖DNA模板的DNA聚合酶活性的30％以下，所述第一链cDNA合成组分中不含放线菌素D。
2.根据权利要求1所述的RNA链特异性建库试剂盒，其特征在于所述逆转录酶缺失依赖DNA模板的DNA聚合酶活性。
3.根据权利要求1所述的RNA链特异性建库试剂盒，其特征在于所述第一链cDNA合成组分包括5-25U/μL所述逆转录酶，1-2U/μL RNase抑制剂，150-250mM pH 7-9的Tris-HCl，200-400mM KCl，10-20mM DTT，2.5-15mM dNTPs。
4.根据权利要求1所述的RNA链特异性建库试剂盒，其特征在于还包括片段化反应组分、第二链cDNA的合成及末端修复加A组分、接头连接组分、文库扩增组分。
5.根据权利要求4所述的RNA链特异性建库试剂盒，其特征在于所述第二链cDNA的合成及末端修复加A组分包括0.5～1.5U/μL DNA Polymerase I,Large(Klenow)Fragment，0.2～1U/μL核糖核酸酶H，0.2～1U/μL T4 DNA聚合酶，0.05～1U/μL Taq DNA聚合酶，0.2～1U/μLT4多聚核苷酸激酶，5～250mM pH7-9的Tris-HCl，20～100mM MgCl2，120～500mM NaCl，0.8～15mM dNTPs，0.8～15mM dUTP，2～100mM ATP。
6.根据权利要求4所述的RNA链特异性建库试剂盒，其特征在于所述接头连接组分包括50～500U/μL的T4 DNA Ligase，50～350mM pH7-9的Tris-HCl，10～100mM MgCl2，2～10mMATP，3～10％v/v的PEG8000。
7.根据权利要求1所述的RNA链特异性建库试剂盒，其特征在于所述逆转录酶为MMLV逆转录酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
8.一种双模式转录组快速建库试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项所述的RNA链特异性建库试剂盒中的各组分。
9.一种板式试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-8中任一项所述的RNA链特异性建库试剂盒中的各组分。
10.根据权利要求9所述的板式试剂盒，其特征在于，其包括如下组分：所述片段化反应组分、所述第一链cDNA合成组分、第二链cDNA的合成及末端修复加A组分、所述接头连接组分、所述文库扩增组分；各组分分别排布在同一反应板中的不同反应孔中。
11.一种自动化测序产品，其特征在于，其包括权利要求9或10所述的板式试剂盒。
12.一种MMLV逆转录酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
13.权利要求12所述的MMLV逆转录酶突变体的编码基因。
14.权利要求12所述的MMLV逆转录酶突变体在逆转录反应中的应用。
15.一种RNA链特异性建库方法，其特征在于采用依赖DNA模板的DNA聚合酶活性在野生型逆转录酶依赖DNA模板的DNA聚合酶活性的30％以下的逆转录酶，且合成第一链cDNA时不使用放线菌素D。
16.根据权利要求15所述的RNA链特异性建库方法，其特征在于其步骤包括：
(1)将mRNA进行片段化处理；
(2)以片段化的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成第一链cDNA；
(3)合成第二链cDNA；
(4)cDNA连接接头，纯化连接产物；
(5)对cDNA与接头的连接产物进行文库扩增，获得RNA链特异性文库。
17.根据权利要求15或16所述的RNA链特异性建库方法，其特征在于所述逆转录酶为MMLV逆转录酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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