CN111518870A - 一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法 - Google Patents

一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去除核糖体RNA的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体RNA的方法；该反转录引物池的序列如SEQ ID NO：1～21所示；该试剂盒包含上述反转录引物池，本发明利用真核生物共有的rRNA序列，设计不同密度覆盖的反转录引物，根据具体需要去除的RNA中本身的rRNA序列的差异，进行特异性的反转录，从而得到与目标RNA完全反向互补的cDNA序列，再通过后续的RNase H和DNase I特异性消化杂合链的rRNA和cDNA，最终去除核糖体RNA；该方法能够搭配建库试剂盒，最终得到浓度足够高的转录组文库，从而有效实现转录组测序在基础研究、临床诊断和药物研发等领域的广泛应用。

Description

一种去除核糖体RNA的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体 RNA的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种去除核糖体RNA构建转录组测序文库的反转录引物池、试剂盒，以及去除核糖体RNA的方法。
背景技术
随着现代科学技术的发展，生命科学的研究已经进入了组学时代。基因和基因组测序技术已经成为现代生命科学研究，特别是基因组学研究中不可或缺的手段。近年来新一代基因组测序技术突飞猛进的发展带来了基因组学研究的空前繁荣。新一代测序技术已经在生命科学各个领域及农学、医学、环境保护、法医等领域中得到广泛的应用。随着新一代高通量测序技术的快速发展，转录组测序已经成为研究转录组与基因表达的重要手段。转录组是指单个生物物种的个体，或者该个体的特定组织或特定细胞类型，在特定的环境条件下，或者实验处理条件下所产生的所有转录本的集合。各种类型的转录本都可以通过新一代测序技术进行高通量定量检测，这项技术被称为转录组测序。转录组测序技术可以用作转录本的结构及其变异、基因表达水平、非编码区域功能和低丰度全新转录本发现等各方面的研究上。通过对转录组的研究，人们能够从生物的整体水平上研究基因结构及其基因功能。转录组测序已被广泛应用于遗传学、农学和医学基础研究、医疗诊断和药物研发等领域中。
核糖体RNA(rRNA)构成细胞RNA含量的绝大部分，其占细胞内RNA 含量的约80％～95％。高丰度的rRNA使样本中其他相关的目标分子的分析复杂化，如转录组测序(RNA-seq)分析、微阵列的基因表达分析等；尤其在目标分子含量较少的研究中，rRNA成为巨大的背景污染。因此，通常在构建RNA文库(例如构建转录组文库时)，需要对总RNA进行mRNA(比例约为10％)纯化处理。
转录组测序能全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的几乎所有转录本序列信息，是研究基因表达调控的主要手段。转录组测序中样品是来源于细胞和组织中经分离的总RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA、 LncRNA和小RNA等。对于转录组分析中的目标RNA(mRNA和LncRNA)， rRNA的数据属于冗余信息，在转录组测序中的RNA文库构建中，首先会进行rRNA的去除，再进行常规的RNA建库。
现有的用于去除rRNA，进行转录组文库构建的试剂盒，主流的试剂盒使用RNA探针结合链霉亲和素磁珠方法去除rRNA，如Illumina的
Figure BDA0002379718220000021
Stranded Total RNA LT-(with Ribo-Zero TM Human/Mouse/Rat)，或者以DNA 为探针结合RNase H和DNase I酶消化的方法去除rRNA，如NEB的NEBNext rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)试剂盒。以上两种原理的试剂盒的探针均为外源性合成，价格昂贵，而且只能基于1～2个物种进行设计，其他种属的物种未能保证其去除效率，而且总RNA起始量为100ng～1ug，对于总RNA起始量为1ng～100ng的样品，暂未有能有效去除其rRNA、进行转录组文库构建的试剂盒。这一限制可能导致试剂盒标注物种以外的其他真核物种，或者血浆、血清和Exosome等样品来源的转录组测序文库构建中存在严重的rRNA残留、数据冗余，从而影响后续的mRNA或LncRNA的检出与分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的反转录引物池。
本发明的第二个目的是提供一种构建转录组测序文库的试剂盒。
本发明的第三个目的是提供一种构建转录组测序文库时，用于去除核糖体RNA的方法。
本发明的第四个目的是提供上述方法在构建转录组测序文库中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的反转录引物池，该反转录引物池的序列如SEQ ID NO：1～21所示。
本发明是利用真核生物共有的rRNA序列，设计不同密度覆盖的反转录引物，形成引物池，该引物池有效规避了不同物种甚至亚种之间，核糖体RNA 序列有插入和/或缺失片段，带来的与已有探针只能局部反向互补的弊端，能够特异性的生成与样品核糖体RNA完全反向互补的序列，从而实现有效去除核糖体RNA的目的。
本发明反转录引物池中包括21种引物，在用于去除核糖体RNA时，可以形成不同组合，例如，可以从这21种引物中分别选取5种、8种或者12 种引物形成引物组，用于反转录，从而去除核糖体RNA，也可以是将这21 种引物形成引物组，用于反转录，从而去除核糖体RNA(具体引物组合实例如表2)。
本领域技术人员应能理解，除了上述反转录引物池，在上述反转录引物池的序列上增长或者缩短，位置左移或者右移，或其他不同位置不同长度的组合均在本发明的保护范围内。
进一步地，含有上述去除核糖体RNA的反转录引物池的，用于构建转录组测序文库的试剂盒也在本发明的保护范围内。
该在本发明保护范围内的试剂盒，加入的外源性核酸数量少(本发明的试剂盒没有探针等外源性核酸)，引物池除了具备上述的优点外，还能契合不同物种(甚至亚种样品来源的RNA样品)，因此拓宽了本发明试剂盒的应用范围，为更多的真核物种，甚至是指定位置的基因组序列的物种转录组文库中，缺乏对应的去除核糖体RNA的试剂盒，弥补了空白，实现了真核物种的转录组研究缺乏有效试剂的问题。
优选地，上述试剂盒还含有RNase H、DNase I；这里RNase H、DNase I分别用于特异性消除通过反转录引物池，以样品总RNA为模板获得的与目标RNA完全反向互补的cDNA序列(cDNA-rRNA杂合链)中rRNA和 cDNA。
更优选地，试剂盒中RNase H的用量为3U～6U，DNase I的用量为 2.5U～10U，此时rRNA的去除效率较高。
优选地，上述试剂盒中，反转录引物池中每条引物的浓度范围为5μ M～100μM，此时rRNA的去除效率较高。
更优选地，反转录引物池中每条引物的浓度范围为10μM时，rRNA 的去除效果最好。
优选地，试剂盒中，反转录引物池中每条引物的浓度均相同，从而保证每条引物等同的反转录效率。
一种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的方法，包括以下步骤：
(1)针对目的rRNA设计得到反转录的引物池；
(2)提取样品的总RNA，加入引物池进行反转录，得cDNA-rRNA 杂合链；
(3)加入RNase H消除cDNA-rRNA杂合链的rRNA，再加入DNase I消除cDNA-rRNA杂合链的cDNA；
(4)回收剩余的RNA产物。
这里，步骤(2)、(3)所述cDNA-rRNA杂合链为经过反转录得到的 rRNA的cDNA和rRNA结合的杂合链。
这里，步骤(4)剩余的RNA产物包括去除rRNA后的mRNA和lncRNA 等其他RNA。
在本发明中，利用真核生物共有的rRNA序列，设计不同密度覆盖的反转录引物，根据具体需要去除的RNA中本身的rRNA序列的差异，进行特异性的反转录，从而得到与目标RNA完全反向互补的cDNA序列，再通过后续的RNase H特异性消化cDNA-rRNA杂合链的rRNA，DNase I特异性消化 cDNA-rRNA杂合链的cDNA，最终实现核糖体RNA的去除。
优选地，上述方法中，步骤(1)是在rRNA对应的基因组上以产物大小为500bp/条～5000bp/条的设计密度设计得到反转录的引物池，该引物池的序列如SEQ ID NO：1～21所示。
更优选地，当以产物大小为1000bp/条的设计密度设计得到的反转录引物池，进行核糖体RNA去除时，rRNA去除率最高，此时该反转录引物池的序列如表2所示，具体为SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO： 6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14～16、SEQID NO： 20～21。
优选地，上述方法中，步骤(3)中RNase H的用量为3U～6U，DNase I的用量为2.5U～10U。
更优选地，RNase H的用量为6U，DNase I的用量为5U。
优选地，上述方法中，步骤(2)样品总RNA的起始量为1ng～5μg。
更优选地，样品总RNA的起始量为1ng～100ng。
优选地，上述方法中，步骤(2)样品总RNA的完整度RIN值为2～ 10。
更优选地，样品总RNA的完整度RIN值>7；具体地，可以是7～10。
本发明所指的核糖体RNA来自真核生物，优选人源性、小鼠和大鼠源性的totalRNA。
上述去除核糖体RNA的方法在构建转录组测序文库中的应用。
本发明所描述的构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA(真核生物)的方法，能够通过搭配各大主流的建库试剂盒，包括NEB和Illumina 公司的建库试剂盒，均能实现高效的核糖体RNA去除，最终得到浓度足够高的转录组文库，完成上机测序和后续的转录组测序相关的应用，有效实现转录组测序在基础研究、临床诊断和药物研发等领域的广泛应用。
优选地，上述应用包括以下步骤：
(1)去除样品总RNA中的核糖体RNA，得到剩余RNA产物；
(2)对获得的剩余RNA产物进行转录组的文库构建。
更优选地，步骤(2)选用本领域常规的转录组文库构建方法即可，可以利用市面上各大主流的建库试剂盒完成。
经不同样本RNA总起始量的测试、不同的物种和样品种类来源、与不同主流建库试剂盒试剂搭配使用，以及上机测序的数据，均表明本发明设计的核糖体RNA去除方法能够达到预期的转录组文库建库和测序的性能要求，不仅能在转录组文库质量上和文库浓度上与行业内标准媲美，所构建的转录组文库也能满足基因检测的测序要求，具有广泛应用于各种物种来源的转录组测序的前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明反转录引物池设计密度为1000bp(即以产物大小为1000bp/条的设计密度设计得到的反转录引物池，下文同)，反转录引物池的每条引物的浓度为10μM时，去除了人细胞中80％以上的rRNA；检测到了超过20000 个基因；检测到了超过51000个转录本。
本发明反转录引物池设计密度为1000bp，反转录引物池的每条引物的浓度为10μM，RNase H用量为6U，DNase I用量为5U时，去除了人细胞中90％以上的rRNA；检测到了超过27000个基因；检测到了超过66000个转录本。
本发明RNA起始量为1～5000ng，RT primer pool的浓度为10μM，RNase H用量为6U，DNase I用量为5U时，去除了人细胞中90％以上的rRNA；检测到了超过22000个基因；检测到了超过60000个转录本。
同时，本发明还具有以下优点：
(1)由于不同物种，甚至是同一个种属的不同亚种，核糖体RNA的序列均有所差异，存在少量的插入和缺失序列，凡是基于探针结合(RNA或者 DNA探针)均不可能设计适用于全部物种甚至全部亚种核糖体RNA使用的序列。本发明的创新和优势之处，就是利用通用的反转录引物池，先使用反转录得到对应物种或者亚种自身的反向互补的cDNA-rRNA，再利用RNase H 消除cDNA-rRNA杂合链中的rRNA，继而使用DNase I消除生成的 cDNA-rRNA杂合链中的cDNA，最终实现特异性的去除核糖体RNA，并且能够适用于有插入或者缺失序列的真核生物各个物种的RNA，完成后续转录组建库的核糖体RNA去除前处理。
(2)本发明所述方法是基于反转录，去除反转录得到的rRNA的cDNA 与模板rRNA项目结合的杂合链，再进行常规的转录组文库构建，可以实现起始量为10ng甚至1ng的总RNA中核糖体RNA的去除。而现有试剂盒，其捕获原理都引入了RNA或者DNA的探针，比如Illumina品牌的试剂盒，是基于RNA的探针和链酶亲和素的磁珠杂交去除的原理，一般只能做到总 RNA起始量为100ng水平的核糖体RNA的去除。同时，现有试剂盒的成本相对较高，因为需要同时制备含有Biotin的批次稳定的RNA探针，同时也要有链酶亲和素的磁珠。与其相比，本发明使用化学合成的方法制备所选的RT primer的序列，批次稳定性高和成本较低，而且无需链酶亲和素磁珠捕获抓取，在相近甚至更好的效果下，大大节省成本。
(3)本发明的方法还降低了污染风险，Illumina或NEB的试剂盒，在建库初期，引入了核酸探针干扰物，必须通过后续的有效去除方可不干扰到原来样品的信息，无论是Illumina去磁珠方式去除探针，或者是NEB用酶消化的原理去除探针，残留的探针都有可能干扰样品原来的信息。而去除的过程，特别是酶去除，又有可能引入了新的偏好性，不能较好的还原样品原来的信息，甚至造成原来样品的损失。相比之下，本发明的方法，在加入少量的反转录引物，把rRNA先反转录为cDNA，再两步去除，大大降低了外来核酸干扰风险。
(4)由于本发明使用的方法是特异性的反转录引物结合后，特异性的扩增对应物种的rRNA，并且利用双酶进行酶解消除，因此不受物种间rRNA序列局部差异的影响，其能应用于真核源性的其他物种的核糖体RNA去除，实现了不同物种来源的RNA都使用同一套反转录引物进行实验的目的。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到(表1)。
表1
Figure BDA0002379718220000061
Figure BDA0002379718220000071
实施例1
一、反转录引物设计以及rRNA去除实验
1、细胞培养
使用GIBCO的DMEM和10％的FBS血清，37℃、5％CO2培养条件下对 293T细胞进行培养，正常培养2天后，细胞密度在60～80％(4万～5万个) 左右。
2、总RNA提取
按照Qiagen的QIAamp RNA RNeasy Mini Kit说明书指示进行总RNA的提取，以1μg的total RNA起始进行后续反应。
3、反转录引物混合成反转录引物池
反转录引物设计与合成，在rRNA的前体RNA 45S序列(序列号：NR_046235.1)上按照产物500bp/条、1000bp/条、2000bp/条和5000bp/条的设计密度设计反转录引物，混合反转录引物为RT Primer pool(简称为反转录引物池)，每条反转录引物用灭菌水稀释至10μM。
1000bp/条设计密度(记为RT-1000bp组)，对应表2中1Kbp/条项的所有划勾的共12条反转录引物混合而成的pool，每条反转录引物均与前体RNA 45S序列上的一段区域互补。反转录引物pool中任意两种反转录引物的浓度是相等的(10μM)。反转录引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
表2：反转录引物列表(49-mer)，其中，√标识对应组使用此序列。
Figure BDA0002379718220000081
Figure BDA0002379718220000091
(1)反转录反应
使用Omega第一链反转试剂盒，如表3配制RT反应体系，分别配制A、B两种组分，A、B组分总体积为10ul。
表3：RT反应体系
序号 试剂 A组分 B组分
1 5X RT Buffer 2ul 1ul
2 10mM dNTP Mix \ 0.5ul
3 Inhibitor \ 1.5ul
4 RTase \ 1.5ul
5 RT primer pool 2ul \
6 Total RNA 1ug \
7 H<sub>2</sub>O \ 根据情况加
(2)RT反应程序：
RT反应程序如表4，先将A组分放置于Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler PCR仪中反应，等程序刚进行到步骤3时，将反应程序暂停，并加入 42℃预热好的B组分，并用移液器将A、B组分混匀，然后稍离心以除去气泡，再接着进行剩余反应步骤，完成整个反应程序。
表4：RT反应程序
步骤 RT反应程序
1 90.0℃，5s
2 降低升温速率至0.1C/s
3 42.0℃，5min
4 降低升温速率至0.1C/s
5 45.0℃，30min
6 降低升温速率至0.1C/s
7 50.0℃，5min
8 70.0℃，10min
9 降低升温速率至0.1C/s
10 4.0℃，10min；结束反应
4、RNase H处理
在上一步的RT反应产物中，直接加入0.2ul的RNase H酶(TAKARA，60U/ul)，然后轻轻混匀反应液，稍离心后放置于Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler PCR仪中37℃反应30min，紧接着再70℃反应10min，以除去RNase H 酶的活性。
表5：RNase H处理反应程序
步骤 RNase H处理反应程序
1 37℃，30min
2 70℃，10min
3 4℃结束反应
5、DNase I处理
(1)反应体系总体积：20ul，具体如表6。
表6：DNase I处理反应体系
序号 试剂 体积
1 RNase H处理后产物 10.2ul
2 10X DNase I Buffer 2ul
3 DNase I(5U/ul) 0.2ul
4 H<sub>2</sub>O 7.6ul
(2)DNase I处理反应程序(表7)：
根据表6配制20ul反应体系，然后轻轻混匀反应液，稍离心后放置于 Bio-RadC1000 Touch Thermal Cycler PCR仪中37℃反应30min，紧接着再 80℃反应10min，以除去DNase I酶的活性。
表7：DNase I处理反应程序
步骤 DNase I处理反应程序
1 37℃，30min
2 80℃，10min
3 4℃结束反应
6、rRNA去除产物乙醇沉淀
包括以下步骤：(1)、取1.5ml新EP管，加入DNase I处理后的rRNA Depletion产物，用无RNA酶灭菌水补至180ul；(2)、加入18ul 3M NaAc，温和涡旋；(3)、加入2ul 10mg/ml糖原(或4ul 5mg/ml糖原)，温和涡旋； (4)、加入600ul-20℃预冷的无水乙醇，温和涡旋；(5)、放置-20℃冰箱过夜或8个小时以上；(6)、14000转离心30min，去上清；(7)、加入800ul-20℃预冷的70％乙醇；(8)、14000转离心5min，去上清；(9)、重复步骤(8)一次、(10)、尽量去干净上清液，室温干燥5min，加入10ul 无RNA酶灭菌水溶解RNA沉淀。
二、转录组测序文库构建
利用步骤6的方法得到rRNA去除后的回收RNA，用NEBNext RNA超快速文库制备试剂盒-Illumina进行文库构建，主要步骤为：1、RNA片段化 (片段化后平均片段长度为200bp)；2、一链反转录；3、二链反转录；4、双链cDNA末端修复及纯化；5、3’末端加A及纯化；6、测序接头连接及纯化；7、PCR扩增及纯化，得到了转录组测序文库。其中具体步骤按照超快速文库制备试剂盒说明书指示进行。
1、转录组测序文库质检：使用Agilent 4200TapeStation和Qubit 2.0进行文库质检。
2、转录组文库上机检测
通过质检的文库进行上机检测。使用Pair End Flow Cell，按照HiSeq 2500 UserGuide的指示进行HiSeq 2500上机操作，并运行Pair End(2×150)标准测序程序。测序程序运行完毕后，对所得数据进行生物信息学分析。其中rRNA 残留率计算公式为：与数据库比对得到的rRNA片段数/过滤合格片段数。数据库为RNA central(http://rnacentral.org/)。
3、结果分析
测序分析结果(如表8)显示，经过rRNA去除的文库rRNA的残留量均在25％以下，而阴性对照组在90％以上(阴性对照未进行rRNA去除处理)，表明本方法能高效去除rRNA。同时，本方法检测到的基因数和转录本数提升，提升了测序效率。另外，以每隔1000bp设计反转录引物的RT primer pool的 rRNA残留量最少，仅为9.98％，能够分析得到的基因数和转录本数最多，分别为26722个和64721个。以每隔1000bp设计的反转录引物性能最佳。
表8
Figure BDA0002379718220000111
Figure BDA0002379718220000121
注：比对片段：把过滤合格片段与对应总RNA来源的物种的核糖体RNA序列进行比对，比对上的序列划分为rRNA残留片段，其他序列再与对应物种的转录组(mRNA+LncRNA等)数据库比对即得。
表中，检测总片段数是实际检测到的总片段数，定为100％；过滤合格片段百分数为过滤合格片段数与检测总片段数的比值*100％；rRNA残留片段百分数为rRNA残留片段数与过滤合格片段数的比值 *100％；比对片段百分数为比对片段数与非核糖体部分的过滤合格片段的比值*100％，其中非核糖体部分的过滤合格片段为过滤合格片段数与rRNA残留片段数的差值。
最后检测到的基因数和转录本数都是通过比对后注释得到的个数，他们越多代表同等数据量量级下得到的测序深度更深。
实施例2反转录引物的浓度探索
1、细胞培养：具体方法同实施例1。
2、总RNA提取：具体方法同实施例1，total RNA的起始量为1μg。
3、反转录引物混合
反转录引物以1000bp/条的设计密度设计反转录，混合反转录引物为RT Primerpool，每条反转录引物用灭菌水稀释至5μM、10μM、50μM和100μM。对应表1中1000bp/条项的所有划勾的共12条反转录引物混合而成的pool，每条反转录引物均与前体RNA 45S序列上的一段区域互补。反转录引物pool 中任意两种反转录引物的浓度是相等的。反转录引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
4、反转录反应：具体方法同实施例1。
5、RNase H处理：具体方法同实施例1。
6、DNase I处理：具体方法同实施例1。
7、rRNA去除产物乙醇沉淀：具体方法同实施例1。
8、转录组测序文库构建：具体方法同实施例1。
9、结果分析：测序分析结果(表9)显示进行rRNA去除的文库rRNA 的残留量均在25％以下；最后，以10μM反转录引物用量的rRNA残留量最少，仅占8.92％，且能够分析得到的基因数和转录本数组多，分别为27382 个和67328个，以10μM的反转录引物性能最佳。
表9
Figure BDA0002379718220000122
Figure BDA0002379718220000131
注：比对片段：把过滤合格片段与对应总RNA来源的物种的核糖体RNA序列进行比对，比对上的序列划分为rRNA残留片段，其他序列再与对应物种的转录组(mRNA+LncRNA等)数据库比对即得。
表中，检测总片段数是实际检测到的总片段数，定为100％；过滤合格片段百分数为过滤合格片段数与检测总片段数的比值*100％；rRNA残留片段百分数为rRNA残留片段数与过滤合格片段数的比值 *100％；比对片段百分数为比对片段数与非核糖体部分的过滤合格片段的比值*100％，其中非核糖体部分的过滤合格片段为过滤合格片段数与rRNA残留片段数的差值。
最后检测到的基因数和转录本数都是通过比对后注释得到的个数，他们越多代表同等数据量量级下得到的测序深度更深。
实施例3 RNase H和DNase I用量探索
1、细胞培养：具体方法同实施例1。
2、总RNA提取：具体方法同实施例1，total RNA的起始量为1μg。
3、反转录引物混合
反转录引物以1000bp/条的设计密度设计反转录，混合反转录引物为RT Primerpool，每条反转录引物用灭菌水稀释至10μM。对应表1中1000bp/条项的所有划勾的共12条反转录引物混合而成的pool，每条反转录引物均与前体RNA 45S序列上的一段区域互补。反转录引物pool中任意两种反转录引物的浓度是相等的。反转录引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
4、反转录反应：具体方法同实施例1。
5、RNase H处理：具体方法同实施例1。
6、DNase I处理：具体方法同实施例1。
不同之处为：RNase H和DNase I的酶用量，分别以3U：2.5U、3U：5U、 6U：5U、6U：10U和12U：10U的用量进行实验。
7、rRNA去除产物乙醇沉淀：具体方法同实施例1。
8、转录组测序文库构建：具体方法同实施例1。
9、结果分析：测序分析结果(表10)显示进行rRNA去除的文库rRNA 的残留量均在25％以下；最后，以6U的RNase H搭配5U的DNase I的rRNA 残留量最少，仅占8.76％，且能够分析得到的基因数和转录本数组多，分别为27439个和66462个；以6U的RNase H搭配5U的DNase I的实验条件性能最佳。
表10
Figure BDA0002379718220000141
注：比对片段：把过滤合格片段与对应总RNA来源的物种的核糖体RNA序列进行比对，比对上的序列划分为rRNA残留片段，其他序列再与对应物种的转录组(mRNA+LncRNA等)数据库比对即得。
表中，检测总片段数是实际检测到的总片段数，定为100％；过滤合格片段百分数为过滤合格片段数与检测总片段数的比值*100％；rRNA残留片段百分数为rRNA残留片段数与过滤合格片段数的比值 *100％；比对片段百分数为比对片段数与非核糖体部分的过滤合格片段的比值*100％，其中非核糖体部分的过滤合格片段为过滤合格片段数与rRNA残留片段数的差值。
最后检测到的基因数和转录本数都是通过比对后注释得到的个数，他们越多代表同等数据量量级下得到的测序深度更深。
实施例4样品起始量的探索
1、细胞培养：具体方法同实施例1。
2、总RNA提取：具体方法同实施例1，不同之处为：分别使用1ng、10ng、 50ng、100ng、500ng、1μg和5μg的total RNA起始进行后续反应。
3、反转录引物混合
反转录引物以1000bp/条的设计密度设计反转录，混合反转录引物为RT Primerpool，每条反转录引物用灭菌水稀释至10μM。对应表1中1000bp/条项的所有划勾的共12条反转录引物混合而成的pool，每条反转录引物均与前体RNA 45S序列上的一段区域互补。反转录引物pool中任意两种反转录引物的浓度是相等的。反转录引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
4、反转录反应：具体方法同实施例1。
5、RNase H处理：具体方法同实施例1。
6、DNase I处理：具体方法同实施例1。
7、rRNA去除产物乙醇沉淀：具体方法同实施例1。
8、转录组测序文库构建：具体方法同实施例1。
9、结果分析：测序分析结果(表11)显示，经过rRNA去除的文库rRNA 的残留量均在10％以下，而阴性对照组在85％以上(阴性对照未进行rRNA 去除处理)，表明本方法能高效去除rRNA。同时，本方法检测到的基因数和转录本数提升，提升了测序效率。本方法能应用于不同起始的total RNA起始的核糖体去除，1ng、10ng、50ng、100ng、500ng、1μg和5μg范围都能够达到很好的去除效果。
表11
Figure BDA0002379718220000151
注：比对片段：把过滤合格片段与对应总RNA来源的物种的核糖体RNA序列进行比对，比对上的序列划分为rRNA残留片段，其他序列再与对应物种的转录组(mRNA+LncRNA等)数据库比对即得。
表中，检测总片段数是实际检测到的总片段数，定为100％；过滤合格片段百分数为过滤合格片段数与检测总片段数的比值*100％；rRNA残留片段百分数为rRNA残留片段数与过滤合格片段数的比值 *100％；比对片段百分数为比对片段数与非核糖体部分的过滤合格片段的比值*100％，其中非核糖体部分的过滤合格片段为过滤合格片段数与rRNA残留片段数的差值。
最后检测到的基因数和转录本数都是通过比对后注释得到的个数，他们越多代表同等数据量量级下得到的测序深度更深。
实施例5与市面上主流金标准试剂盒对比
1、细胞培养：具体方法同实施例1。
2、总RNA提取：具体方法同实施例1，不同之处为：分别使用10ng、 100ng和1μg的total RNA起始进行后续反应。
3、反转录引物混合
反转录引物以1000bp/条的设计密度设计反转录，混合反转录引物为RT Primerpool，每条反转录引物用灭菌水稀释至10μM。对应表1中1000bp/条项的所有划勾的共12条反转录引物混合而成的pool，每条反转录引物均与前体RNA 45S序列上的一段区域互补。反转录引物pool中任意两种反转录引物的浓度是相等的。反转录引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
4、反转录反应：具体方法同实施例1。
5、RNase H处理：具体方法同实施例1。
6、DNase I处理：具体方法同实施例1。
7、rRNA去除产物乙醇沉淀：具体方法同实施例1。
8、转录组测序文库构建
具体方法同实施例一，不同之处为：同时以10ng、100ng和1μg的total RNA起始进行Illumina的
Figure BDA0002379718220000162
Stranded Total RNA LT-(with Ribo-Zero TM Human/Mouse/Rat)和NEB的NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)试剂盒建库，详细步骤按照对应试剂盒操作说明进行。
9、结果分析：表12中，AlfaSeq为本发明使用的实验条件及试剂，Illumina 为使用Illumina的
Figure BDA0002379718220000161
Stranded Total RNA LT-(with Ribo-Zero TM Human/Mouse/Rat)试剂盒进行实验，NEB为使用NEB的NEBNext rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)试剂盒进行实验。测序分析结果显示，经过rRNA去除的文库rRNA的残留量均在10％以下，而阴性对照组在80％以上(阴性对照未进行rRNA去除处理)，表明本方法能高效去除rRNA。同时，本方法检测到的基因数和转录本数提升，提升了测序效率。与市场上主流的试剂盒Illumina和NEB比较，本发明的方法均有更佳的去除效果，能应用于不同起始的total RNA起始的核糖体去除，10ng、100ng和1μg范围都能够达到很好的去除效果。
表12
Figure BDA0002379718220000171
注：比对片段：把过滤合格片段与对应总RNA来源的物种的核糖体RNA序列进行比对，比对上的序列划分为rRNA残留片段，其他序列再与对应物种的转录组(mRNA+LncRNA等)数据库比对即得。
表中，检测总片段数是实际检测到的总片段数，定为100％；过滤合格片段百分数为过滤合格片段数与检测总片段数的比值*100％；rRNA残留片段百分数为rRNA残留片段数与过滤合格片段数的比值 *100％；比对片段百分数为比对片段数与非核糖体部分的过滤合格片段的比值*100％，其中非核糖体部分的过滤合格片段为过滤合格片段数与rRNA残留片段数的差值。
最后检测到的基因数和转录本数都是通过比对后注释得到的个数，他们越多代表同等数据量量级下得到的测序深度更深。
实施例6不同物种样品起始
1、细胞培养：具体方法同实施例1。
不同之处为：分别培养人源细胞293T、小鼠源细胞C2C12和大鼠源细胞 C6。
2、总RNA提取：具体方法同实施例1，不同之处为：分别以100ng的人源性，小鼠源性和大鼠源性total RNA起始进行后续实验。
3、反转录引物混合
反转录引物以1000bp/条的设计密度设计反转录，混合反转录引物为RT Primerpool，每条反转录引物用灭菌水稀释至10μM。对应表1中1000bp/条项的所有划勾的共12条反转录引物混合而成的pool，每条反转录引物均与前体RNA 45S序列上的一段区域互补。反转录引物pool中任意两种反转录引物的浓度是相等的。反转录引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
4、反转录反应：具体方法同实施例1。
5、RNase H处理：具体方法同实施例1，使用6U的RNase H进行后续反应。
6、DNase I处理：具体方法同实施例1，使用5U的DNase I进行后续反应。
7、rRNA去除产物乙醇沉淀：具体方法同实施例1。
8、转录组测序文库构建：具体方法同实施例1。
9、结果分析：测序分析结果(表13)显示，经过rRNA去除的文库rRNA 的残留量均在10％以下，表明本方法能高效去除rRNA。应用于不同物种起始的total RNA起始的核糖体去除，人源性、小鼠源性和大鼠源性范围都能够达到很好的去除效果。由于本发明使用的方法是特异性的反转录引物结合后，特异性的扩增对应物种的rRNA，并且利用双酶进行酶解消除，因此不受物种间rRNA序列局部差异的影响，原理上能应用于真核源性的其他物种的核糖体去除。
表13
Figure BDA0002379718220000191
注：比对片段：把过滤合格片段与对应总RNA来源的物种的核糖体RNA序列进行比对，比对上的序列划分为rRNA残留片段，其他序列再与对应物种的转录组(mRNA+LncRNA等)数据库比对即得。
表中，检测总片段数是实际检测到的总片段数，定为100％；过滤合格片段百分数为过滤合格片段数与检测总片段数的比值*100％；rRNA残留片段百分数为rRNA残留片段数与过滤合格片段数的比值 *100％；比对片段百分数为比对片段数与非核糖体部分的过滤合格片段的比值*100％，其中非核糖体部分的过滤合格片段为过滤合格片段数与rRNA残留片段数的差值。
最后检测到的基因数和转录本数都是通过比对后注释得到的个数，他们越多代表同等数据量量级下得到的测序深度更深。
实施例7不同RNA完整度的核糖体RNA去除
1、细胞培养：具体方法同实施例1。
2、总RNA提取：具体方法同实施例1,total RNA的起始量为100ng。
不同之处为：分别以100ng的人源性total RNA起始进行后续实验。通过对RNA进行热损伤，制备不同total RNA完整程度的样品，分别取RIN值为 2、5、7和10的total RNA进行后续的实验。
3、反转录引物混合
反转录引物以1000bp/条的设计密度设计反转录，混合反转录引物为RT Primerpool，每条反转录引物用灭菌水稀释至10μM。对应表1中1000bp/条项的所有划勾的共12条反转录引物混合而成的pool，每条反转录引物均与前体RNA 45S序列上的一段区域互补。反转录引物pool中任意两种反转录引物的浓度是相等的。反转录引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
4、反转录反应：具体方法同实施例1。
5、RNase H处理：具体方法同实施例1，使用6U的RNase H进行后续反应。
6、DNase I处理：具体方法同实施例1，使用5U的DNase I进行后续反应。
7、rRNA去除产物乙醇沉淀：具体方法同实施例1。
8、转录组测序文库构建：具体方法同实施例1。
9、结果分析：测序分析结果(表14)显示，经过rRNA去除的文库rRNA 的残留量均在10％以下，表明本方法能高效去除rRNA。应用于不同RNA完整程度的total RNA起始的核糖体，都能够达到很好的去除效果。本发明的方法能够满足于不同RNA质量的样品起始进行核糖体去除。
表14
Figure BDA0002379718220000201
注：RIN值是NGS测序质控行业内常用的Agilent仪器的一个表征RNA完整度的指标。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 广东美格基因科技有限公司
<120> 一种去除核糖体RNA的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体RNA的方法
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cacatcatca gtagggtaaa actaacctgt ctcacgacgg tctaaaccc 49
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
tggcgccaga agcgagagcc cctcgggctc gcccccccgc ctcaccggg 49
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ccgaggcgag gcgcgcgcgg aaccgcggcc ccgggggcgg acccggcgg 49
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gccccgaccc ttctcccccc gccgcgcccc cacgcggcgc tcccccggg 49
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
tccgggatcg gtcgcgttac cgcactggac gcctcgcggc gcccatctc 49
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gccgccctcc gacgcacacc acacgcgcgc gcgcgcgcgc cgcccccgc 49
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ccaggtcgga cgaccgattt gcacgtcagg accgctacgg acctccacc 49
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
agtccgcccc gccccccgac ccgcgcgcgg cacccccccc gtcgccggg 49
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
acccccggcc ccgcccgccc acccccgcac ccgccggagc ccgccccct 49
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
actaatatgc ttaaattcag cgggtcgcca cgtctgatct gaggtcgcg 49
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
cgttatcgga attaaccaga caaatcgctc caccaactaa gaacggcca 49
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
caaaatagaa ccgcggtcct attccattat tcctagctgc ggtatccag 49
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
acgttcgaat gggtcgtcgc cgccacgggg ggcgtgcgat cggcccgag 49
<210> 14
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
gacatgcatg gcttaatctt tgagacaagc atatgctact ggcaggatc 49
<210> 15
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
tccgagatca gacgagatcg ggcgcgttca gggtggtatg gccgtagac 49
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
tcgcagctag ctgcgttctt catcgacgca cgagccgagt gatccaccg 49
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
gttgaggttt agggctaagc atagtggggt atctaatccc agtttgggt 49
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
aaaccctgtt cttgggtggg tgtgggtata atactaagtt gagatgata 49
<210> 19
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
cgggcaggtc aatttcactg gttaaaagta agagacagct gaaccctcg 49
<210> 20
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
tttcttaatt ggtggctgct tttaggccta ctatgggtgt taaattttt 49
<210> 21
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
ctaaggttgt ctggtagtaa ggtggagtgg gtttggggct aggtttagc 49

Claims (10)

1.一种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的反转录引物池，其特征在于，该反转录引物池的序列如SEQ ID NO：1～21所示。
2.一种构建转录组测序文库的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的去除核糖体RNA的反转录引物池。
3.根据权利要求2所述的构建转录组测序文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有RNase H、DNaseI。
4.根据权利要求3所述的构建转录组测序文库的试剂盒，其特征在于，所述反转录引物池中每条引物的浓度范围为5μM～100μM。
5.一种构建转录组测序文库时，用于去除核糖体RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对目的rRNA设计得到反转录的引物池；
(2)提取样品的总RNA，加入引物池进行反转录，得cDNA-rRNA杂合链；
(3)加入RNase H消除cDNA-rRNA杂合链的rRNA，再加入DNase I消除cDNA-rRNA杂合链的cDNA；
(4)回收剩余的RNA产物。
6.根据权利要求5所述的构建转录组测序文库时，用于去除核糖体RNA的方法，其特征在于，步骤(1)是在rRNA对应的基因组上以产物大小为500bp/条～5000bp/条的设计密度设计得到反转录的引物池。
7.根据权利要求5所述的构建转录组测序文库时，用于去除核糖体RNA的方法，其特征在于，步骤(3)中RNase H的用量为3U～6U，DNase I的用量为2.5U～10U。
8.根据权利要求5所述的构建转录组测序文库时，用于去除核糖体RNA的方法，其特征在于，步骤(2)样品总RNA的起始量为1ng～5μg。
9.根据权利要求5所述的构建转录组测序文库时，用于去除核糖体RNA的方法，其特征在于，步骤(2)样品总RNA的完整度RIN值为2～10。
10.权利要求5至9任一项所述方法在构建转录组测序文库中的应用。
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