CN107893260A - 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒 - Google Patents

高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN107893260A
CN107893260A CN201711206697.8A CN201711206697A CN107893260A CN 107893260 A CN107893260 A CN 107893260A CN 201711206697 A CN201711206697 A CN 201711206697A CN 107893260 A CN107893260 A CN 107893260A
Authority
CN
China
Prior art keywords
artificial sequence
rna
rrna
cguuaucaac uugaaaaagu
guuuuagagc uagaaauagc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711206697.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107893260B (zh
Inventor
张必良
克雷格·梅洛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Ribobio Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Ruikang Medical Laboratory Co ltd
Guangzhou Ribobio Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Ruikang Medical Laboratory Co ltd, Guangzhou Ribobio Co ltd filed Critical Guangzhou Ruikang Medical Laboratory Co ltd
Priority to CN201711206697.8A priority Critical patent/CN107893260B/zh
Publication of CN107893260A publication Critical patent/CN107893260A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107893260B publication Critical patent/CN107893260B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种构建转录组测序文库的方法，包括以下步骤：提供包括含有待去除的rRNA的DNA分子；针对待去除的rRNA的DNA序列设计得到的Crispr RNA pool；使DNA样本与Crispr RNA pool、Crispr蛋白接触，获得Crispr系统编辑后的样本，得到转录组测序文库，以及构建转录组测序文库的试剂盒。本发明所述方式和试剂盒能够高效去除如rRNA等大量冗余RNA，富集样本中其他分子，提高了起始转录组测序的数据质量和有效数据比例，降低了测序成本。

Description

高效去除核糖体RNA的构建转录组测序文库的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种高效去除核糖体RNA的构建转录组测序文库的方法及试剂盒。
背景技术
核糖体RNA(rRNA)构成细胞RNA含量的绝大部分，其占细胞内RNA 含量的约80％-95％。高丰度的rRNA使样本中其他相关的目标分子的分析复杂化，如转录组测序(RNA-seq)分析、微阵列的基因表达分析等；尤其在目标分子含量较少的研究中，rRNA成为巨大的背景污染。因此，通常在构建RNA文库(例如构建转录组文库时)，需要对总RNA进行mRNA(比例约为10％)纯化处理。
转录组测序能全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的几乎所有转录本序列信息，是研究基因表达调控的主要手段。转录组测序中样品是来源于细胞和组织中经分离的总RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA、LncRNA 和小RNA等。对于转录组分析中的目标RNA(mRNA和LncRNA)，rRNA的数据属于冗余信息，在转录组测序中的RNA文库构建中，首先会进行rRNA的去除，再进行常规的RNA建库。
现有的用于去除rRNA，进行转录组文库构建的试剂盒，对起始总RNA的要求为100ng-1μg，如Illumina的Stranded Total RNALT-(with Ribo-Zero TM Human/Mouse/Rat)和NEB的NEBNext rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat) 试剂盒。而对于总RNA起始量为1ng-100ng的样品，暂未有能有效去除其rRNA、进行转录组文库构建的试剂盒。这一限制可能导致血浆、血清和Exosome等样品来源的转录组测序文库构建中存在严重的rRNA残留、数据冗余，从而影响后续的mRNA或LncRNA的检出与分析。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高效去除核糖体RNA的构建转录组测序文库的方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种构建转录组测序文库的方法，包括以下步骤：
1)提取细胞总RNA，逆转录，进行cDNA文库构建,得到包括含有待去除的rRNA 序列信息的cDNA文库；
2)针对待去除的rRNA的cDNA文库设计得到Crispr RNA pool；
3)使cDNA文库样本与Crispr RNA pool、Crispr蛋白接触，获得Crispr系统编辑后的样本，得到去除了rRNA信息的cDNA文库。
4)对步骤3)获得的cDNA文库进行扩增。
在其中一个实施例中，以1-100ng起始量的细胞的RNA，进行cDNA文库构建；优选1-10ng起始量的细胞的RNA。
在其中一个实施例中，在rRNA对应的基因组上以50bp/条—500bp/条的设计密度设计Crispr RNA pool中的RNA，优选100-200bp/条的设计密度。所述rRNA 选自前体45SrRNA、28SrRNA、18SrRNA、12SrRNA、16SrRNA或其组合。
在其中一个实施例中，Crispr RNA pool是sgRNA pool。
在其中一个实施例中，所述sgRNA如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.133。
在其中一个实施例中，所述sgRNA包括有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.133中的所有序列号为奇数的序列。
在其中一个实施例中，包括如下步骤：步骤3)包括：配制去rRNA反应体系，进行反应，37℃温育反应0.5-2h，优选为1h。
在其中一个实施例中，所述Crispr蛋白为Cas9，所述Cas9的终浓度为 30nM-3μM，优选为300nM。
在其中一个实施例中，在反应体系中，所述Crispr RNA pool的总浓度为 2.5-3.5μM。
本发明的另一目的提供一种构建转录组测序文库的试剂盒。
一种构建转录组测序文库的试剂盒，包括如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.XXX 的sgRNA和Crispr蛋白，或SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.133中的所有序列号为奇数的序列所述Crispr蛋白为Cas9。
在本发明中，gRNA或sgRNA指向导RNA，其与Cas9蛋白组装为核糖核蛋白复合体，通过gRNA的靶序列与靶基因互补配对识别靶基因，在gRNA引导下Cas9蛋白剪切靶基因的双链DNA。
本申请所述的构建转录组测序文库的方法，通过高效去除如rRNA等大量冗余RNA(rRNA是NGS文库的一大部分)，富集样本中其他分子，提高了起始转录组测序的数据质量和有效数据比例，降低了测序成本(对高通量测序而言，有效数据比例每提高一倍，获得可靠结果所需的总测序量可降低一半)，提升了测序检测效率、灵敏度和分析效果。可用于微弱的RNA信号的提取、RNA文库的构建与测序的前处理等。该发明还可进一步延伸应用于去除高表达转录本的无效测序，能在转录组测序的基础上，挖掘出更多新的转录本和低丰度的转录本，有效实现RNA测序在基础研究、临床诊断和药物研发等领域的广泛应用。
本发明所述方法操作简单、兼容性好、rRNA残余量低，除可应用于常规起始量的总RNA的转录组测序，还可解决1ng-100ng低起始量的总RNA转录组测序中rRNA难以有效去除的问题；为血浆、血清和Exosome来源的转录组测序提供了解决的方案，尤其适用于珍贵样品，具有广泛地应用于各个物种来源的、低起始量的转录组测序的前景。
通过使用本发明的基因编辑方法去除rRNA后对样品进测序分析，rRNA残留率、检测到的基因和转录本个数相对现有技术均有一定提高。相较于现有金标准试剂盒，在RNA起始量为1-100ng时，rRNA残留率至少降低了42％-89％。在RNA起始量为1-10ng时，检测到的基因个数至少提高了74％-86％。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
在一些实施方案中，本发明RNA设计密度为200bp，蛋白与RNA pool的浓度为(1-100)：100时，去除了人细胞中80％以上的rRNA；检测到了超过22000 个基因；检测到了超过62000个转录本。
在一些实施方案中，本发明RNA设计密度为200bp，蛋白与RNA pool的浓度为1：10，反应时间为0.5-2h时，去除了人细胞中90％以上的rRNA；检测到了超过22000个基因；检测到了超过63000个转录本。
在一些实施方案中，本发明RNA起始量为1-100ng，RNA设计密度为200bp，蛋白与RNA pool的浓度为1：10，反应时间为1h时，去除了人细胞中95％以上的rRNA；检测到了超过22000个基因；检测到了超过66000个转录本。
在一些实施方案中，本发明RNA pool中包括10-150种sgRNA，具体可为 27-133种、67种。优选RNA pool中任意两种sgRNA的浓度是相等的。
本领域技术人员应能理解，本方法中的RNA pool除可为实施例中的sgRNA pool，也可为crRNA 和tracrRNA的组合pool，或其他RNA形式；本方法中的Crispr蛋白除可为实施例中的Cas9蛋白之外，也可包括其他蛋白，只要其符合Crispr编辑的原理。
本发明所述方法是基于扩增，去除冗余文库，再扩增的原理，灵敏度会提高，可以实现起始量为10ng甚至1ng的总RNA的核糖体RNA的去除。而现有试剂盒，其捕获原理都引入了RNA或者DNA的探针，比如Illumina品牌的试剂盒，是基于RNA的探针和链酶亲和素的磁珠杂交去除的原理，一般只能做到总RNA起始量为100ng水平的核糖体RNA的去除。同时，现有试剂盒的成本相对较高，因为需要同时制备含有Biotin的批次稳定的RNA探针，同时也要有链酶亲和素的磁珠。与其相比，我们使用化学合成的方法制备所选的gRNA的序列，批次稳定性高和成本较低，而且无需链酶亲和素磁珠捕获抓取，在相近甚至更好的效果下，成本大大节省。
第三，我们的方法还降低了污染风险，Illumina或NEB的试剂盒，在建库初期，引入了核酸探针干扰物，必须通过后续的有效去除方可不干扰到原来样品的信息。无论是Illumina去磁珠方式去除探针，或者是NEB用酶消化的原理去除探针，残留的探针都有可能干扰样品原来的信息。而去除的过程，特别是酶去除，又有可能引入了新的偏好性，不能较好的还原样品原来的信息，甚至造成原来样品的损失。相比之下我们的方法，在RNA已经扩增为DNA文库后，再引入向导RNA，由于向导RNA没有接头不会影响后续的文库组成，大大降低了外来核酸干扰风险。
实施例一：gRNA设计密度
一、建库
1、细胞培养
使用GIBCO的DMEM和10％的FBS血清，37℃和5％CO2培养条件下对 293T细胞进行培养，正常培养2天后，细胞密度在60-80％(4万-5万个)左右。
2、RNA抽提
按照Magen的RaPure Total RNA Kit说明书指示进行总RNA的抽提。
3、RNA建库：
以10ng起始量(细胞的RNA)，用NEBNext RNA超快速文库制备试剂盒- Illumina进行文库构建，主要步骤为：RNA片段化(片段化后平均片段长度为 200bp)；第一链cDNA合成；第二链cDNA合成及纯化；末端修复及纯化；3' 末端加A及纯化；adaptor连接及纯化；PCR扩增及纯化，得到了cDNA基因文库。
二、文库进行rRNA去除处理
1、gRNA 设计与合成
在rRNA的前体RNA 45S序列(NR_046235.1)上按照100bp/条、200bp/ 条和500bp/条的设计密度设计gRNA，混合gRNA为gRNA pool，每条gRNA 用灭菌水稀释至50μM。
200bp/条设计密度，对应表1中200bp/条项的所有划勾的共67条gRNA(全部奇数序列)混合而成的pool，每条gRNA均与前体RNA 45S序列上的一段区域互补。RNA pool中任意两种sgRNA的浓度是相等的。
表1：rRNA-gRNA序列表(102-mer)，其中，√表示对应组使用此序列。
gRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。
2、gRNA处理文库
(1)配制去rRNA反应体系，PCR仪中37℃温育1h。
(2)用AMPure XP Beads纯化回收反应体系中的DNA，得到去除了rRNA信息的转录组文库。
(3)PCR扩增
PCR反应体系
(4)文库质检
将PCR产物全部转到1.5ml EP管中，用AMPure XP Beads纯化反应体系中的DNA，并用Agilent 2200TapeStation和Qubit 2.0进行文库质检。片段平均长度200bp为质检通过的文库。
三、RNA文库上机检测
通过质检的文库进行上机检测。使用Pair End Flow Cell，按照HiSeq 2500 UserGuide的指示进行HiSeq 2500上机操作，并运行Pair End(2×100)标准测序程序。测序程序运行完毕后，对所得数据进行生物信息学分析。其中rRNA 残留率计算公式为：与数据库比对得到的rRNA片段数/过滤合格片段数。数据库为RNAcentral(http://rnacentral.org/)。
四、结果分析
测序分析结果显示，经过rRNA去除的文库rRNA的残留量均在15％以下，而阴性对照组在80％以上(阴性对照未进行rRNA去除处理)，表明本方法能高效去除rRNA。同时，本方法检测到的基因数和转录本数提升，提升了测序效率。另外，以每隔200bp设计一条gRNA(获得200bp密度)的gRNApool的rRNA 残留量最少，仅为3.46％，能够分析得到的基因数和转录本数最多，分别为26470 个和66887个。
实施例二：Cas9用量
一、RNA建库
具体方法同实施例一。
二、RNA文库进行rRNA去除处理
具体方法同实施例一。
其中，gRNApool的设计密度为200bp/条；Cas9工作浓度分别使用30nM、 300nM、3μM、30μM和300μM进行实验。
三、RNA文库上机检测
具体方法同实施例一。
四、结果分析
测序分析结果显示进行rRNA去除的文库rRNA的残留量均在30％以下；最后，以300nM Cas9用量的rRNA残留量最少，仅占3.46％，且能够分析得到的基因数和转录本数组多，分别为26470个和66887个。
实施例三：反应时间
一、RNA建库
具体方法同实施例一。
二、RNA文库进行rRNA去除处理
具体方法同实施例一。
其中gRNA pool的设计密度为200bp/条，Cas9工作浓度为300nM，分别使用5min、30min、1h、2h和5h不同的时间进行rRNA去除处理。
三、RNA文库上机检测
具体方法同实施例一。
四、结果分析
测序分析结果显示经过rRNA去除的文库rRNA的残留量均在20％以下；去rRNA反应时间为1h时，rRNA残留量最少，仅占3.46％，且能够分析得到的基因数和转录本数组多，分别为26470个和66887个。
实施例四：总RNA起始量
一、RNA建库
具体方法同实施例一。
其中，总RNA起始量为别为1ng、10ng、50ng、100ng、500ng、1μg和5μg。二、RNA文库进行rRNA去除处理
具体方法同实施例一。
其中gRNApool的设计密度为200bp/条，Cas9工作浓度为300nM，去rRNA 反应时间为1h。
三、RNA文库上机检测
具体方法同实施例一。
四、结果分析
测序分析结果显示，经rRNA去除的文库rRNA残留量均在10％以下；起始总RNA量为1ng-100ng时，去除效率能够达到5％以下。
实施例五与金标准试剂盒比较
一、试验方法
采用本申请的方法与Illumina的Stranded Total RNA LT-(withRibo-Zero TM Human/Mouse/Rat)和NEB的NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)进行rRNA去除处理的比对。总RNA起始量为1ng、10ng 和100ng。
本申请的方法参照实施例一。其中，gRNA pool的设计密度为200bp/条， Cas9工作浓度为300nM，1h的反应时间。试剂盒方法参照试剂盒说明书。二、结果分析
测序分析结果显示，在RNA起始量为1-100ng时，使用Illumina和NEB的试剂盒，经rRNA去除的文库的rRNA残留率在20％以下，而本方法的rRNA 残留率均低于10％。且相较前两种试剂盒，残留率至少降低了42％-89％。在RNA 起始量为1ng时，rRNA残留率至少降低了42％；在RNA起始量为10ng时，rRNA 残留率至少降低了70％；在RNA起始量为100ng时，rRNA残留率至少降低了 89％。
同时在RNA起始量为1-100ng时，本方法检测到的基因和转录本个数相对现有试剂盒也均有一定程度的提高。特别是在RNA起始量为1-10ng时，检测到的基因个数至少提高了74％-86％。在RNA起始量为1ng时，检测到的基因个数至少提高了74％；在RNA起始量为10ng时，检测到的基因个数至少提高了 86％。表明本方法在起始量为1-100ng时具有优势。
实施例六：样品物种
一、RNA建库
具体方法同实施例一。
其中培养细胞为293T(人)、C2C12(小鼠)和C6(大鼠)细胞。
二、RNA文库进行rRNA去除处理
具体方法同实施例一。
其中gRNA pool的设计密度为200bp/条，Cas9工作浓度为300nM，去rRNA 反应时间为1h。
三、RNA文库上机检测
具体方法同实施例一。
四、结果分析
测序分析结果显示，经rRNA去除的文库rRNA残留量均在5％以下，表明总RNA起始量为10ng时，不同物种细胞中的rRNA去除效率能够到5％以下，可应用于各个物种来源样品的rRNA去除。
所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市锐博生物科技有限公司
广州锐康医学检验所有限公司
<120> 高效去除核糖体RNA的构建转录组测序文库的方法及试剂盒
<160> 133
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cuaccgguga cccggcuagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 2
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgagagaac agcaggcccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 3
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
guccgggucu cugacccacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 4
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccagcggggu gggguugucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 5
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caacccccca cuccggggaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 6
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggggcucuuc gugaucgaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 7
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uccuucucgc uccgccccgc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 8
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggugcgugu gggaaggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 9
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agggcugucu gccgcgucag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 10
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcccgcaagu cgacaaccac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 11
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccccgagagg gcagcacgac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 12
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggaacgaca caccaccguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 13
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agacgcgccc cucccacgcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 14
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acccaccgcg aucgcucaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 15
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggcgcucugc cucggaagga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 16
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agguguuucc ucguaccgca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 17
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcgaucugag aggcgugccu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 18
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcuucccccu cgacgggguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 19
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
guucccagcg gguugggacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 20
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgucggcacc ggucacgacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 21
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaucacgagc gacgguggug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 22
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgggaccgcc cucgugucug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 23
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggcggggaag agggcacaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 24
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
accggcuuca cguccguugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 25
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gccacugauc ggcccggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 26
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaacccuccg ggaagcccac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 27
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gggggaggag acgguuccgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 28
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggggaucgcc gagggccggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 29
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcggggaagg ggacgccacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 30
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgacggggaa ggcgcgagaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 31
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cucuccccga cgccgacgcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 32
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcacgaacgc cuguccggca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 33
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cucgcccuuu ccccgggucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 34
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acacgccaca cgacggccaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 35
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cccucgaccg gaccggugcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 36
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cucgcucgcc gcccggacgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 37
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ucgggccguc cgccuccucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 38
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggcgcgacga agaagcgucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 39
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ccgucguccu ccucgcuugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 40
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cagguaggua agguagagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 41
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cgugcguacu cagacaugca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 42
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gcacgcaucc cccccgcgaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 43
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aaugggucgu cgccgccacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 44
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ggggaaucag gguucgauuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 45
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
auuuuucguc acuaccuccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 46
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aagucuggug ccagcagccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 47
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cguccccgcc ccuugccucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 48
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
uauuccuagc ugcgguaucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 49
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
auucuuggac cggcgcaaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 50
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gaauaacgcc gccgcaucgc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 51
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cuuugcaacc auacuccccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 52
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
auagcucuuu cucgauuccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 53
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
uuacgcgacc cccgagcggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 54
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
agcgugugcc uacccuacgc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 55
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cgcccgucgc uacuaccgau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 56
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
aggaaguaaa agucguaaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 57
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
uccguuaaug auccuuccgc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 58
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cgagcgaacg aacgggcacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 59
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ucguuggugu gcgcgugucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 60
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cccgccgaca cccacgucgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 61
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cggcggaggc gacgggaauc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 62
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cgacccucga gacgcccuag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 63
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gccggaacgc gcuagguacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 64
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gagucccguc gggaggggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 65
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
cgucgggugg gggcuuuacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 66
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gacaccaccc cacaggcgcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 67
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ccccccccgc ccaagaggag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 68
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ccuccucccg gugcgucguc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 69
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cgacacuucg aacgcacuug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 70
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
uugccgauca aucgcccccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 71
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
acgccgccgg gucugcgcuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 72
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cgcgcccggc ugagagagac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 73
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gcgguccggg uuccucccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 74
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gacgacgacg acgacgggca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 75
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ugccggcggg gagagagggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 76
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gccucggagg aggggcggcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 77
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cgggguucgc guguccccgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 78
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cccgucccga gcuuccgcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 79
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
uccggucguc ccgcuccggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 80
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gacgcuccgu cgggagacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 81
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
cggaggagaa gaaacuaacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 82
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
cguacggaag acccgcuccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 83
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
cgggugguaa acuccaucua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 84
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
accguuaaga gguaaacggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 85
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ggggggcggg aaagauccgc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 86
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
accguccccc gaccggcgac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 87
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ggaggaggag gacggacgga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 88
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gccggggggg cuguaacacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 89
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
cccucgcggg ggauuccccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 90
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
cccucgcggg ggauuccccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 91
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
uguccccagu gcgccccggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 92
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
guguuucaag acgggucggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 93
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
aggccucucc aguccgccga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 94
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ggagcacgag cgcacguguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 95
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
ugcaaaucgg ucguccgacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 96
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
accggauaaa acugcguggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 97
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
cguggaaugc gagugccuag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 98
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
ugcgggauga accgaacgcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 99
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gaaucaacua gcccugaaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 100
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
ucccguccac ucucgacugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 101
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gggaggaggg gaggaggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 102
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gcuacgccgc gacgaguagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 103
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gccgcaggug cagaucuugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 104
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
augggcgagc gccguuccga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 105
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
ucuccgccac uccggauucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 106
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
cucggggcga acccauucca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 107
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
ccgugccuug gaaagcgucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 108
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
uuggagaccu gcugcggaua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 109
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ggauccguaa cuucgggaua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 110
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
aggggggugc cccgggcgug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 111
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gagaaggguc ggggcggcag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 112
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
agcuggggcg auccacggga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 113
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ucgucgcgcg cgcguccgcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 114
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
uccuccucgg cgcgcggcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 115
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
acuuagaacu ggugcggacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 116
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
augaagcgcg gguaaacggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 117
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
cugugguuuc gcuggauagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 118
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
gcacggugaa gagacaugag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 119
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
ucagaguagu gguauuucac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 120
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
ccagaagcga gagccccucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 121
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
caccugcguu accguuugac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 122
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
gaauacagac cgugaaagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 123
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gcgacgucgc uaugaacgcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 124
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
uggauuguuc acccacuaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 125
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
guaauccugc ucaguacgag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 126
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
cccgcccagg cggaacgaua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 127
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
ggcgggggac cggcuauccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 128
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
ggacgaaggg cacuccgcac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 129
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
ucacgcaccg cacguucgug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 130
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
cggacaaacc cuugugucga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 131
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
cccaccacca cgcccgcggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 132
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
ccuccucccc guucaccgcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 133
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
ccaacccccg ggacggggac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

Claims (10)

1.一种构建转录组测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取细胞总RNA，进行cDNA文库构建,得到包括含有待去除的rRNA序列信息的cDNA文库；
2)针对待去除的rRNA的cDNA文库设计得到Crispr RNA pool；
3)使cDNA文库、与Crispr RNA pool、Crispr蛋白接触，通过Crispr系统编辑，得到去除了rRNA信息的cDNA文库；
4)对步骤3)获得的cDNA文库进行扩增。
2.根据权利要求1所述的构建转录组测序文库的方法，其特征在于，在rRNA对应的基因组上以50bp/条—500bp/条的设计密度设计Crispr RNA pool中的RNA，优选100-200bp/条的设计密度。
3.根据权利要求2所述的构建转录组测序文库的方法，其特征在于，Crispr RNA pool是sgRNA pool。
4.根据权利要求3所述的构建转录组测序文库的方法，其特征在于，所述sgRNA如SEQID NO.1-SEQ ID NO.133。
5.根据权利要求4所述的构建转录组测序文库的方法，其特征在于，所述sgRNA包括有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.133中的所有序列号为奇数的序列。
6.根据权利要求1所述的文库处理的方法，其特征在于，
以1-100ng起始量的细胞的RNA，进行cDNA文库构建；优选1-10ng起始量的细胞的RNA。
7.根据权利要求1-6所述的构建转录组测序文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤3)包括：配制去rRNA反应体系，进行反应，37℃温育反应0.5-2h，优选为1h。
8.根据权利要求7所述的构建转录组测序文库的方法，其特征在于，所述Crispr蛋白为Cas9，所述Cas9的终浓度为30nM-3μM，优选为300nM。
9.根据权利要求8所述的构建转录组测序文库的方法，其特征在于，在反应体系中，所述Crispr RNA pool的终浓度为2.5-3.5μM，优选3μM。
10.一种构建转录组测序文库的试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.133的sgRNA或SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.133中的所有序列号为奇数的序列。
CN201711206697.8A 2017-11-27 2017-11-27 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒 Active CN107893260B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711206697.8A CN107893260B (zh) 2017-11-27 2017-11-27 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711206697.8A CN107893260B (zh) 2017-11-27 2017-11-27 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107893260A true CN107893260A (zh) 2018-04-10
CN107893260B CN107893260B (zh) 2021-01-12

Family

ID=61806387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711206697.8A Active CN107893260B (zh) 2017-11-27 2017-11-27 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107893260B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109706149A (zh) * 2018-11-29 2019-05-03 华中农业大学 一种改进的16S-seq方法及其应用
CN111518870A (zh) * 2020-02-04 2020-08-11 广东美格基因科技有限公司 一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法
CN111534512A (zh) * 2019-09-11 2020-08-14 广东美格基因科技有限公司 一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法
CN112927756A (zh) * 2019-12-06 2021-06-08 深圳华大基因科技服务有限公司 鉴别转录组rRNA污染源的方法、装置和改善rRNA污染的方法
CN113046388A (zh) * 2021-01-19 2021-06-29 南京启真基因工程有限公司 用于构建双基因联合敲除的动脉粥样硬化猪核移植供体细胞的crispr系统及其应用
WO2021159741A1 (zh) * 2020-02-10 2021-08-19 南京启真基因工程有限公司 一种用于制备irs基因缺陷的糖尿病克隆猪核供体细胞的crispr系统及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104630206A (zh) * 2015-02-05 2015-05-20 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 转录组文库的构建方法
WO2016100955A2 (en) * 2014-12-20 2016-06-23 Identifygenomics, Llc Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using crispr/cas system proteins
WO2017091630A1 (en) * 2015-11-23 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016100955A2 (en) * 2014-12-20 2016-06-23 Identifygenomics, Llc Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using crispr/cas system proteins
CN104630206A (zh) * 2015-02-05 2015-05-20 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 转录组文库的构建方法
WO2017091630A1 (en) * 2015-11-23 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
W. GU ET AL.: "Depletion of Abundant Sequences by Hybridization (DASH): using Cas9 to remove unwanted high-abundance species in sequencing libraries and molecular counting applications", 《GENOME BIOLOGY 》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109706149A (zh) * 2018-11-29 2019-05-03 华中农业大学 一种改进的16S-seq方法及其应用
CN109706149B (zh) * 2018-11-29 2020-12-18 华中农业大学 一种改进的16S-seq方法及其应用
CN111534512A (zh) * 2019-09-11 2020-08-14 广东美格基因科技有限公司 一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法
CN112927756A (zh) * 2019-12-06 2021-06-08 深圳华大基因科技服务有限公司 鉴别转录组rRNA污染源的方法、装置和改善rRNA污染的方法
CN111518870A (zh) * 2020-02-04 2020-08-11 广东美格基因科技有限公司 一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法
WO2021159741A1 (zh) * 2020-02-10 2021-08-19 南京启真基因工程有限公司 一种用于制备irs基因缺陷的糖尿病克隆猪核供体细胞的crispr系统及其应用
CN113046388A (zh) * 2021-01-19 2021-06-29 南京启真基因工程有限公司 用于构建双基因联合敲除的动脉粥样硬化猪核移植供体细胞的crispr系统及其应用
CN113046388B (zh) * 2021-01-19 2023-04-25 南京启真基因工程有限公司 用于构建双基因联合敲除的动脉粥样硬化猪核移植供体细胞的crispr系统及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107893260B (zh) 2021-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107893260A (zh) 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒
CN106906211B (zh) 一种分子接头及其应用
EP2691544B1 (en) Method for verifying bioassay samples
CN108350500A (zh) 用于检测染色体异常的核酸和方法
CN108753954B (zh) 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途
CN107699957A (zh) 基于dna的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用
CN107893100A (zh) 一种单细胞mRNA逆转录与扩增的方法
CN106498036A (zh) 一种用于高通量测序检测的药物基因组snp变异文库的构建方法及其应用
CN105505755A (zh) 空间转录组建库测序方法及所用装置
CN108517567A (zh) 用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法
CN112359093A (zh) 血液中游离miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒
CN106834286B (zh) 一步法快速构建扩增子文库的引物组合
CN106497916A (zh) 一种用于高通量测序检测的nk细胞多基因变异文库的构建方法及其应用
CN110317864A (zh) 一种通过宏转录组测序来检测病原体的方法
CN109853047A (zh) 一种基因组dna测序文库快速构建方法及配套试剂盒
CN108728515A (zh) 一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法
CN113416769B (zh) 基于二代测序技术检测无对照样本的微卫星不稳定的方法、组合物和用途
CN111518870A (zh) 一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法
CN102559856B (zh) 去除测序文库中的载体片段的方法
CN109680040A (zh) 一种针对FFPE和cfDNA的DNA二代测序文库构建的试剂盒及其应用
CN108753922A (zh) 一种构建转录组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒
CN114317696A (zh) 一种试剂盒及其文库构建方法与污染检测方法
CN107904297B (zh) 用于微生物多样性研究的引物组、接头组和测序方法
CN108315320A (zh) 一种rna高通量测序文库的制备方法
Kielpinski et al. Reproducible analysis of sequencing-based RNA structure probing data with user-friendly tools

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zhang Biliang

Inventor before: Zhang Biliang

Inventor before: Craig Merlow

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Method and kit for efficiently removing ribosomal RNA and constructing transcriptome sequencing Library

Effective date of registration: 20211223

Granted publication date: 20210112

Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch

Pledgor: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd.

Registration number: Y2021980016275

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221207

Address after: 510530 No.7, tungda street, Science City, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province

Patentee after: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd.

Address before: 510663 C3-13, innovation building, 182 science Avenue, Guangzhou Development Zone, Guangzhou City, Guangdong Province

Patentee before: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd.

Patentee before: GUANGZHOU RUIKANG MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right
PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Date of cancellation: 20221209

Granted publication date: 20210112

Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch

Pledgor: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd.

Registration number: Y2021980016275

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Construction of Transcriptome Sequencing Library with Efficient Ribosome RNA Removal Method and Kit

Effective date of registration: 20230615

Granted publication date: 20210112

Pledgee: CITIC Bank Co.,Ltd. Guangzhou Branch

Pledgor: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980044095

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right