CN102559856B - 去除测序文库中的载体片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了去除测序文库中的载体片段的方法。本发明还提供了对基因组克隆文库进行测序的方法，所述方法包括利用基因组克隆文库构建测序文库，并且在对测序文库进行测序前去除测序文库中的载体片段。本发明还提供了可用于本发明的方法的试剂盒。

Description

去除测序文库中的载体片段的方法
发明领域
本发明属于分子生物学领域。特别地，本发明提供了去除测序文库中的载体片段的方法。本发明还提供了对基因组克隆文库进行测序的方法，所述方法包括利用基因组克隆文库构建测序文库，并且在对测序文库进行测序前去除测序文库中的载体片段。本发明还提供了可用于本发明的方法的试剂盒。
发明背景
De nove测序法也称从头测序法，其不需要任何基因序列信息即可对某个物种的基因组进行测序。在测序后，用生物信息学的分析方法对测序获得的序列进行拼接、组装，即可获得该物种的基因组序列图谱。
使用Illumina公司的DNA测序平台进行De nove测序的方法主要分为以下四个步骤：1，制备测序文库；2，用Cluster Station对样品进行扩增；3，对成簇后的样品进行测序；4，数据处理和拼接。根据测序的片段的大小，基于Illumina公司的DNA测序平台的测序文库制备分为小片段DNA的测序文库制备和大片段DNA的测序文库制备。
为了解决非单倍体基因组序列杂合度过高、De novo测序序列拼接组装难度大的问题，目前通常采用以Fosmid克隆文库为模板构建DNA小片段测序文库的方法。建立Fosmid克隆文库是指将某种生物的总DNA与Fosmid载体一起以重组的形式转移到宿主细胞中，然后通过细胞增殖形成多个克隆的整体。对于Fosmid载体，可插入的基因组DNA片段的合适的长度为大约40kb。构建Fosmid小片段测序文库是指将一定数量的Fosmid克隆混合到一起作为建库模板，然后采用以下步骤进行测序文库制备：1、打断DNA到一定的片段大小；2、进行末端修复，即，利用T4 DNA聚合酶和Klenow聚合酶使DNA片段全部变成平末端，并采用T4 PNK(也称为T4多核苷酸激酶)将DNA片段的5′端磷酸化；3、利用无3′到5′外切酶活性的Klenow聚合酶(也称为Klenow 3’-5’exo-)在已进行末端修复的DNA片段的3′端加上一个碱基“A”；4、用DNA连接酶将接头有方向性地加到DNA片段的两端，其中接头的核苷酸序列能与Solexa测序仪的flowcell上带有的寡核苷酸的序列互补；5、将加了接头的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收一定大小的DNA片段，以除去未加到DNA片段上的接头，以及其他不符合片段大小的DNA片段；6、富集所有两端都加上接头的目的片段，使用针对接头的核苷酸序列的引物，通过PCR扩增所有加了接头的DNA；7、纯化获得的PCR产物，从而建立测序文库。测序文库经Agilent Bioanalyzer 2100和Q-PCR检测确定浓度及片段大小合格后使用Solexa测序仪进行测序。
随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序的成本和时间大大降低，从而为研究新物种的全基因组序列提供了一个崭新的研究平台。然而，由于集中化商业性多物种基因组测序的大规模开展，使得我们迫切需要降低测序成本，减少测序流程，提高劳动效率，以便能够更好的将测序方法应用到分析、疾病诊断以及个性化(个体化)医疗等新领域。
发明内容
除非另有定义，否则本文中所使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。为了更好的理解本发明，特别提供了下列术语的定义。
如本文中所使用的，术语“杂交”是指相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。核酸杂交可以在DNA-DNA之间，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之间进行，只要它们之间存在互补序列，可以进行碱基配对。一般而言，杂交的双方是待测核酸分子和已知核酸分子。在杂交体系中已知的核酸分子称作探针(probe)。核酸杂交包括固-液相杂交和液相杂交。液相杂交是在溶液中进行的杂交反应，其是指待测核酸分子与已知核酸分子(探针)在溶液中退火形成杂交复合物。
通常，探针是经标记的，从而在杂交反应结束后，通过利用探针上的标记物，可以分离和检测杂交后的双链。可用于标记探针的标记物在本领域内是已知的，包括但不限于，放射性同位素或核素，生物素，吖啶翁酯(acridinium ester)，polyA等。根据使用的标记物，相应的核酸分离和检测方法在本领域内也是已知的，包括但不限于，羟基磷灰石(HAP)法和亲和吸附法。参见例如，Henegariu O等人，(1999).“Custom fluorescent-nucleotide synthesis as analternative method for nucleic acid labeling”，NatureBiotechnology 18：345-348；Ezaki T等人，1989.FluorometricDeoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridization inMicrodilution Wells as an Alternative to Membrane FilterHybridization in which Radioisotopes Are Used To DetermineGenetic Relatedness among Bacterial Strains.Int.J.ofSystemic Bacteriology 29(3)：224-229；和Herrington C等人，1998.PCR 3：PCR in situ hybridization：a practical approach，Volume 3.Oxford：Oxford University Press。
本发明至少部分基于下述原理：在对测序文库进行测序前，除去测序文库中用于构建基因组克隆文库的载体的片段可以避免浪费测序资源和产生不需要的测序数据，从而降低测序成本，提高测序效率。
例如，当使用Solexa DNA测序仪对由Fosmid克隆文库建立的测序文库进行测序时，由于在建库过程中对Fosmid克隆进行了打断处理，Fosmid载体也被打断成了许多1kb以下的小片段DNA，因而测序文库中包含有大量的Fosmid载体片段，因此，如果对整个测序文库进行测序，那么将产生大量的不需要的载体序列数据，并且这些不需要的序列数据还将影响后续的数据分析。相比之下，如果在使用SolexaDNA测序仪对测序文库进行测序前，将Fosmid载体片段将去除，那么将可以避免对Fosmid载体进行测序，减少不必要的数据读取及分析，从而显著降低测序成本，提高测序效率。
因此，在一个方面，本发明提供了除去测序文库中的载体片段的方法，其包括步骤：
1)制备经标记的探针，所述探针能够与所述载体或其片段杂交；
2)将所述探针与测序文库进行杂交反应，从而使探针与所述载体或其片段形成带标记的双链核酸；
3)利用特异性结合探针上的标记的分子实体，去除步骤2)中形成的带标记的双链核酸，从而除去测序文库中的载体片段。
在一个优选实施方案中，所述载体用于构建基因组克隆文库，并且优选是Fosmid载体。在又一个优选实施方案中，探针用生物素进行标记，并且特异性结合所述标记的分子实体是亲和素，优选链霉亲和素，例如链霉亲和素磁珠。在另一个优选实施方案中，将探针与测序文库进行液相杂交反应。
在一个优选实施方案中，通过下列步骤制备生物素标记的探针：
1)使用生物素化的dNTP对载体进行PCR扩增，并纯化回收PCR产物；
2)将PCR产物片段化并回收纯化，从而获得生物素标记的探针。
在一个优选实施方案中，使用Covaris将PCR产物片段化。在另一个优选实施方案中，将PCR产物片段化为大约200bp-500bp的片段，例如大约300bp的片段。
在一个优选实施方案中，通过在95℃下使探针与测序文库变性，然后在65℃下退火来进行杂交反应。在一个优选实施方案中，探针与测序文库以大约1∶1至大约2∶1的比(按质量计)进行杂交反应。
在一个优选实施方案中，任选地，在进行探针与测序文库的杂交之前，向测序文库中加入接头封闭剂(block)。如本文中所使用的，接头封闭剂是能够与测序文库构建过程中所使用的接头杂交的核酸。优选，接头封闭剂的核苷酸序列与接头的核苷酸序列完全互补。在进行探针与测序文库的杂交时，接头封闭剂与接头杂交，从而避免发生接头与探针的杂交以及接头间配对连接。
在一个优选实施方案中，加入的接头封闭剂和文库的比例为大约0.3pM/ng-0.8pM/ng，例如0.5pM/ng。当加入的接头封闭剂的量过大时，文库中的载体片段的去除效率会降低，然而当加入的接头封闭剂的量过少时，大量的非载体的文库DNA片段会被探针捕获而被去除。
在一个优选实施方案中，杂交可以进行1，4，16，24或更多个小时。
在另一个方面，本发明提供了对基因组克隆文库进行测序的方法，所述方法包括：
1)利用基因组克隆文库构建测序文库，并除去测序文库中的载体片段；
2)对去除载体片段后的测序文库进行测序。
在一个优选实施方案中，所述基因组克隆文库是Fosmid克隆文库，并且所述载体是Fosmid载体。在一个优选实施方案中，使用根据本发明的方法来去除测序文库中的载体片段。
在一个优选实施方案中，测序文库的构建包括以下步骤：
1)片段化基因组克隆文库中的DNA；
2)将接头连接至经片段化的DNA的两端；
3)PCR扩增添加了接头的DNA，并回收纯化PCR产物，从而建立测序文库。
在一个优选实施方案中，在构建测序文库后，除去测序文库中的载体片段。在另一个优选实施方案中，在构建测序文库的过程中，例如在片段化基因组克隆文库中的DNA后，除去载体片段。
在一个优选实施方案中，使用Solexa测序仪对测序文库进行测序。
在另一个方面，本发明提供了用于基因组测序的试剂盒，所述试剂盒包括用于构建基因组克隆文库的载体，能够与所述载体或其片段杂交的经标记的探针以及能够特异性结合所述探针的标记的分子实体。
在一个优选实施方案中，所述载体是Fosmid载体。在一个优选实施方案中，所述探针用生物素进行标记，并且特异性结合所述标记的分子实体是亲和素，优选链霉亲和素，例如链霉亲和素磁珠。在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括其他试剂，包括但不限于，接头和接头封闭剂。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案在对测序文库进行测序前，除去了测序文库中的载体片段，由此可以避免对载体进行测序(避免浪费测序资源)，避免产生不需要的测序数据，减少不必要的数据分析，从而降低测序成本，提高测序效率。这对于大规模开展集中化商业性多物种基因组测序，以及开发测序方法的新应用(例如，疾病诊断以及个性化医疗)具有重要的意义。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
具体实施方式
在本发明的实施例中，使用的主要实验仪器及试剂具体如下。
1、主要实验仪器。
 实验仪器名称   型号   厂家
 热循环仪(PCR仪)   Veriti Thermal Cycler   ABI
 实时荧光定量PCR系统   7500   ABI
  分光光度计  NanoDrop 1000   Thermo Fisher Scientific
  电泳槽  DYCP-31DN   北京六一仪器厂
  电泳仪  DYY-6C   北京六一仪器厂
  凝胶成像系统  Tanon   上海天能科技有限公司
  微波炉  MM721AAU.   美的
  低温离心机  5417R   Eppendorf
  台式离心机  SVC-75004334   Heraeus
  电子分析天平  BS 124S   Sartorius
  真空离心浓缩仪  5301   Eppendorf
  磁力架  DYNAL   Invitrogen
  Covaris打碎仪  S2   Covaris
  Thermomixer(加热混匀仪)  Thermomixer comfort   Eppendorf
  QubitTM Fluorometer  Q32857   Invitrogen
2、主要实验试剂及耗材
  实验试剂及耗材   型号   厂家
  D2000marker   MD114-02   TIANGEN
  50bp marker   MD108-2   TIANGEN
  λ-HindIII marker   D3403A   TaKaRa
  QIAquick PCR Purification Kit   28704   QIAGEN
  MinElute PCR Purification Kit   28004   QIAGEN
  LA Taq Kit   DRR02AG   TaKaRa
  Biotion-dATP   NEL540001EA   Perkinelmer
  Biotion-dGTP   NEL541001EA   Perkinelmer
  Biotion-dCTP   NEL538001EA   Perkinelmer
  Biotion-dUTP   NEL539001EA   Perkinelmer
  DNA clean and ConcentratorTM-25   D4005   Zymo
  Covaris打断小管   CVR-520052   Covaris
  Qubit(HS)   Q32854   Invitrogen
  M280磁珠   DY/610-05   Invitrogen
  Pfx polymerase Kit   C11708-021   Invitrogen
  Sequence Capture Hybridization Kit   05340721001   Nimblegen
Sequence Capture Wash and Elutionkit   05340730001   Nimblegen
  SYBR  Premix Ex TaqTM   DRR041A   Takara
实施例1
1、制备探针。
通过PCR反应，以Fosmid载体(SEQ ID NO：1)为模板制备探针。PCR的反应体系如下：
LA Taq                          0.5μL
10*LA Buffer                    5μL
dNTP混合溶液(1uM)*              20μL
用于制备探针的正向引物(10uM)    5μL
用于制备探针的反向引物(10uM)    5μL
模板(50uM)                      1μL
H2O                             13.5μL
总体积                          50μL
*使用的dNTP混合溶液是以15∶85的比例配置的Biotion-dNTP与普通dNTP的混合溶液，并且其终浓度是1uM。
用于制备探针的正向引物：5′-CCTGGGGTGCCTAATGAGTG-3′(SEQ IDNO：2)。
用于制备探针的反向引物：5′-CGTCGTTTTACAACGTCGTGA-3′(SEQID NO：3)。
PCR反应条件：95℃，2分钟；12个循环的95℃，30秒、65℃，30秒、72℃，8分钟；72℃，10分钟；4℃保存。
PCR完成后，用DNA clean and ConcentratorTM-25 Kit对PCR产物进行纯化，然后用Covaris S2将产物中的DNA打断并进行凝胶电泳检测以确定片段化的DNA的大小。检测结果显示，DNA片段的大小主要为大约300bp。用MinElute PCR Purification Kit纯化回收片段化的DNA，并将其溶于20ul Elution Buffer中，从而获得生物素标记的探针。用Qubit(HS)定量探针的浓度。
2、探针与文库的杂交。
按照以下两种体系进行杂交：
  样品   探针∶文库   是否加接头封闭剂   杂交时间(小时)
  1   1∶1   是   24
  2   1∶1   是   4
在本实施例中，利用小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sptritici)基因组DNA，利用CopyControlTM HTP Fosmid LibraryProduction Kit(Epicentre，USA)，按照生产商的详细说明制备Fosmid克隆文库，并使用Illumina公司的Multiplexing sample preparationoligonucleotide kit(PE-400-1002)构建小麦条锈菌DNA的测序文库。在进行杂交时，文库的用量为120ng，探针的用量为120ng(通过Qubit进行定量)，并且使用接头封闭剂。在本实施例中，使用的接头封闭剂来自Index Sequencing Primer试剂盒(Illumina公司)和Multiplexing Rd2 Sequencing Primer试剂盒(Illumina公司)。特别地，本实施例中使用的接头封闭剂如下：
接头封闭剂1：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQ ID NO：4)；
接头封闭剂2：5′-ACAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCAATGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′(SEQ ID NO：5)。
两种接头封闭剂的用量都是0.06nM，从而接头封闭剂与文库的量的比值为0.5pM/ng。
杂交反应体系如下：
Figure BSA00000394611500101
其中，SC Hybridiation Buffer和SC Hybridiation Component A来源于Sequence Capture Hybridization Kit。
杂交条件为，95℃变性10分钟，然后65℃杂交指定的时间，从而获得杂交产物。
3、载体片段的捕获和分离
根据制造商的说明书，使用链霉亲和素磁珠(M280磁珠)捕获和分离杂交产物中与探针杂交的文库DNA(即，载体片段)。分别收集来自样品1和2的去除了载体片段的文库DNA，并标记为24-1-D和4-12-D。测定二者的浓度，结果如下：
  样品名称   24-1-D   4-12-D
  浓度(nM/L)   3.92   6.08
  回收率   0.228967   0.355133
分别收集来自样品1和2的与探针杂交的文库DNA(即，载体片段)，并标记为24-1-V和4-12-V。
根据制造商的说明书，使用QIAquick PCR Purification Kit纯化获得的文库DNA。
4、文库DNA的扩增
使用PFX酶通过PCR扩增步骤3中获得的文库DNA。PCR反应体系如下：
Figure BSA00000394611500102
Figure BSA00000394611500111
用于文库DNA扩增的正向引物：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3′(SEQ ID NO：6)。
用于文库DNA扩增的反向引物：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATC-3′(SEQ ID NO：7)。
PCR反应条件：94℃，2分钟；12个循环的94℃，15秒、58℃，30秒、72℃，30秒；72℃，5分钟；4℃保存。
PCR产物经纯化后，溶于30ul超纯水中。使用Nanodrop测定获得的PCR产物的浓度，结果如下：
  样品名称   24-1-D   4-12-D   24-1-V   4-12-V
  浓度(ng/ul)   369.9   381.9   290.5   320.3
5、载体去除情况的分析
在本实验中，通过Q-PCR来分析本发明的方法去除文库中的载体片段的效果。在分析时，选择未经本发明的方法处理的样品作为对照。为确定去除载体片段的效果，将未经处理的样品和经处理的样品稀释到同一浓度，并进行Q-PCR以检测这两种样品中载体片段的含量。然后利用未经处理的样品和经处理的样品的Ct值来计算载体去除的效果，即：富集度＝ECt(经处理的样品)-Ct(对照样品)，其中，E表示扩增效率。例如，当扩增效率为100％时，E＝2，即，每个扩增循环使得扩增子的拷贝数增加2倍。富集度表示对照样品中载体片段的量相对于经处理的样品中载体片段的量的倍数。因此，当富集度为N时，其表示本发明的方法去除了1-1/N的载体片段。
简言之，以去除了载体片段的文库DNA(即，步骤4中获得的24-1-D和4-12-D)以及未去除载体片段的文库DNA(即，小麦条锈菌DNA测序文库)为模板，进行Q-PCR反应以检测各文库中载体片段的含量。Q-PCR反应体系如下：
Figure BSA00000394611500121
其中，SYBR Premix和Rox Reference Dye II来源于SYBRPremixEx TaqTM。
用于Q-PCR的正向引物：5′-TTgTTCCCACgCCTgCTgAgTTgT-3′(SEQID NO：8)；。
用于Q-PCR的反向引物：5′-ATCCCgAATTTgCTCCTCCATCCAC-3′(SEQ ID NO：9)。
Q-PCR反应条件：95℃，30秒；40个循环的95℃，15秒、60℃，1分钟。
Q-PCR的结果如下：
Figure BSA00000394611500122
从上述结果可以看出，载体片段的富集度都大于5，这表明经本发明的方法处理的样品中载体片段的含量小于对照样品的1/5。因此，本发明的方法去除了初始文库中至少80％的载体片段。
实施例2
1、如实施例1所述，制备探针。
2、探针与文库的杂交。
利用来自一名中国成年男性的血液基因组DNA，构建Fosmid克隆文库，并根据制造商的说明书使用Multiplexing sample preparationoligonucleotide kit(Illumina公司，PE-400-1002)构建测序文库，称为YH Fosmid测序文库。按照以下体系将构建的测序文库与步骤1制备的探针进行杂交。
Figure BSA00000394611500131
在本实施例中，文库与探针以1∶2的比进行杂交，并且使用的接头封闭剂与实施例1使用的相同。
杂交条件为，95℃变性10分钟，然后65℃杂交24小时，从而获得杂交产物。
3、载体片段的捕获和分离
如实施例1中所述，进行载体片段的捕获和分离。收集去除了载体片段的文库DNA(标记为YH-DNA-1)，并测定其浓度。结果如下。
  样品名称   YH-DNA-1
  浓度(nM/L)   2.28
  回收率   39.95％
收集与探针杂交的文库DNA(即，载体片段)，并标记为YH-Vector-1。
根据制造商的说明书，使用QIAquick PCR Purification Kit纯化获得的文库DNA。
4、文库DNA的扩增
如实施例1中所述，使用PFX酶通过PCR扩增步骤3中获得的文库DNA。
PCR产物经纯化后，溶于30ul超纯水中。使用Nanodrop测定获得的PCR产物的浓度，结果如下：
  样品   YH-DNA-1   YH-Vector-1
  浓度(ng/ul)   238.1   246.2
5、载体去除情况的分析
如实施例1中所述，通过Q-PCR来分析本发明的方法去除文库中的载体片段的效果。
Q-PCR的结果如下：
Figure BSA00000394611500141
从上述结果可以看出，载体片段的富集度大于5，这表明经本发明的方法处理的样品中载体片段的含量小于对照样品的1/5。因此，本发明的方法去除了初始文库中至少80％的载体片段。
Figure ISA00000394611600011
Figure ISA00000394611600021
Figure ISA00000394611600051
Figure ISA00000394611600061
Figure ISA00000394611600071

Claims (23)

1.用于除去测序文库中的载体片段的方法，其包括步骤：
1)制备经标记的探针，所述探针能够与所述载体片段杂交；
2)将所述探针与测序文库进行杂交反应，从而使探针与所述载体片段形成带标记的双链核酸；
3)利用特异性结合探针上的标记的分子实体，去除步骤2)中形成的带标记的双链核酸，从而除去测序文库中的载体片段。
2.权利要求1的方法，其中所述载体是Fosmid载体。
3.权利要求1的方法，其中所述探针用生物素进行标记，并且特异性结合所述标记的分子实体是亲和素。
4.权利要求3的方法，其中特异性结合所述标记的分子实体是链霉亲和素。
5.权利要求4的方法，其中所述链霉亲和素是链霉亲和素磁珠。
6.权利要求1的方法，其中将探针与测序文库进行液相杂交反应。
7.权利要求1的方法，其中探针与测序文库以按质量计1∶1至2∶1的比进行杂交反应。
8.权利要求1的方法，其中在进行杂交反应前，向测序文库中加入接头封闭剂。
9.权利要求8的方法，其中所述接头封闭剂和文库的比例为0.3pM/ng-0.8pM/ng。
10.权利要求8的方法，其中所述接头封闭剂和文库的比例为0.5pM/ng。
11.权利要求1的方法，其中杂交反应进行的时间为1，4，16，24或更多个小时。
12.用于对基因组克隆文库进行测序的方法，所述方法包括：
1)利用基因组克隆文库构建测序文库，并除去测序文库中的载体片段，其中使用权利要求1-11任一项的方法去除测序文库中的载体片段；
2)对去除载体片段后的测序文库进行测序。
13.权利要求12的方法，其中所述基因组克隆文库是Fosmid克隆文库，并且所述载体是Fosmid载体。
14.权利要求12的方法，其中通过下列步骤来构建测序文库：
(1)片段化基因组克隆文库中的DNA；
(2)将接头连接至经片段化的DNA的两端；
(3)PCR扩增添加了接头的DNA，并回收纯化PCR产物，从而建立测序文库。
15.权利要求12的方法，其中在构建测序文库后，或在构建测序文库的过程中，除去载体片段。
16.权利要求15的方法，其中所述在构建测序文库的过程中是指在片段化基因组克隆文库中的DNA后。
17.权利要求12的方法，其中使用Solexa测序仪对测序文库进行测序。
18.用于除去测序文库中的载体片段的试剂盒，所述试剂盒包括用于构建基因组克隆文库的载体，能够与所述载体片段杂交的经标记的探针以及能够特异性结合所述探针的标记的分子实体。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述载体是Fosmid载体。
20.权利要求18的试剂盒，其中所述探针用生物素进行标记，并且特异性结合所述标记的分子实体是亲和素。
21.权利要求20的试剂盒，其中特异性结合所述标记的分子实体是链霉亲和素。
22.权利要求21的试剂盒，其中所述链霉亲和素是链霉亲和素磁珠。
23.权利要求18的试剂盒，其中所述试剂盒还包括其他试剂，所述其它试剂为接头和接头封闭剂。
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