CN103555846A - 一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本snp分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,包括如下步骤:提取生物基因组DNA,并对其进行生物素标记;设计位点特异性杂交引物LSP1和LSP2,并将LSP2进行5’磷酸化;将LSP1混合物和LSP2混合物与基因组DNA杂交获得杂交吸附产物;进行延伸连接反应获得目的DNA片段;通用引物一轮PCR扩增;对回收的目的片段进行Barcode特异性引物PCR扩增;高通量测序;分析得到SNP位点分型信息。本发明所述方法将液相杂交技术的位点选择灵活性和高通量测序技术通量高、成本低的优势结合在一起,在SNP的大规模筛查、全基因组关联分析、群体多样性评价、基因功能分析等研究领域具有重大的应用价值和广泛的推广前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学DNA遗传标记技术领域,具体涉及一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)主要指在基因组水平上,由于单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。SNP具有分布广泛、数量巨大,信息丰富,易于检测等优点,已成为继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记。目前SNP被广泛用于遗传图谱的构建、群体遗传学和亲缘关系、关联分析和基因功能分析等领域。
目前对于已知SNP位点的分型,根据不同研究需要和实验条件,已建立了众多检测方法,主要的分析原理包括限制性内切酶酶切技术、等位基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleotid,ASO)杂交、等位基因特异性引物延伸(allele specific primer extension,ASPE)、单碱基延伸(single baseextension,SBE)、寡核苷酸连接反应(oligonucleotid ligation assay,OLA)等。主要的信号检测方法有基于凝胶电泳的检测、基于微阵列技术的检测、飞行质谱检测和直接测序法等。其中以基于微阵列技术的分型方法通量最高,目前已有多种商业化的SNP分型技术。例如ABI公司利用OLA与微阵列技术结合建立了SNPlex Genotyping System;Affymetrix公司利用ASO与高密度DNA微阵列技术相结合也开发了SNP分型平台;Illumina公司开发的GoldenGateGenotyping Assay,一次实验可对96个样本的1536个SNP位点分型。而随着全基因组扩增技术的发展和超高密度磁珠微阵列的出现,1次对几万甚至几十万个SNP分型也成为可能。
然而目前这些基于微阵列技术的高通量SNP分型方法在基因组信息丰富、芯片平台相对完善的人类和模式生物中应用较多。对于遗传信息相对匮乏的非模式生物,尤其是那些基因组较大,杂合性较高的物种,其芯片造价昂贵;且一次定制的芯片仅对固定位点分型,位点选择灵活性不高;一张芯片只用于一个个体使用,对样本量较大的群体分析和关联分析仍存在较大挑战。因而亟需一种灵活方便、成本低廉、高通量的SNP分型技术解决现有技术的局限性。
随着新一代测序技术通量不断提高和成本持续下降,借助测序技术实现生物高通量SNP分型成为可能。借助已知基因组信息的重测序、以简化基因组测序为基础的RAD、2bRAD等高通量技术目前已成功用于全基因组SNP的开发。然而对于已知SNP位点的定点分型,现有测序分型的方法并没有充分发挥高通量测序的优势,仍属于中低通量分型方法,无法实现同时对多位点、多样本的高通量分型。
发明内容
本发明的目的在于开发一种新型生物高通量、高准确性、高灵活性、低成本、方便快捷的SNP分型方法,以弥补现有技术的上述不足。
为了实现上述目的,本发明采用下述技术方案予以实现:
一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,所述方法包括以下步骤:
1)提取生物基因组DNA,并对其进行生物素标记;
2)根据生物已知SNP位点的侧翼序列,设计引物LSP1和LSP2,分别混合后得到引物LSP1混合物和引物LSP2混合物,并将引物LSP2混合物进行5’磷酸化;
3)将所述引物LSP1混合物和引物LSP2混合物与生物基因组DNA杂交,并进行磁珠吸附获得杂交吸附产物;
4)所述杂交吸附产物进行延伸连接反应获得目的DNA片段;
5)第一轮PCR扩增及目的DNA片段扩增,PCR扩增引物为测序平台通用配对引物5SLD和3SLD,或Slx-1ST-MpPrimer-1和Slx-1ST-MpPrimer-2;
6)对目的DNA片段进行Barcode特异性引物二轮PCR扩增,PCR扩增引物为Multi-P1和Barcode-P2,或Slx-2ND-MpPrimer和Slx-index-Barcode;
7)高通量测序;
8)测序数据分析得到SNP位点分型信息。
对技术方案的进一步改进:所述步骤(2)中引物LSP1包括3’端的位点特异性引物SP1和5’端的5SLD两部分,3’端的引物SP1为与SNP位点邻近的22个碱基互补的序列,5’端为通用引物5SLD5'-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3';
引物LSP2包括5’端的位点特异性引物SP2和3’端的3SLD-RC两部分,5’端的引物SP2为与SNP位点另一侧第4个碱基后的22个碱基互补的序列,3’端为通用引物3SLD的反向互补序列5'-TTCGCCTTGGCCGTACAGCAG-3'。
对技术方案的进一步改进:所述步骤(2)中位点特异性引物SP1和SP2设计原则如下:1)、SP1和SP2所在的位置不能含有其他SNP位点或插入缺失;2)、SP1和SP2所在的位置序列不能出现5个以上连续的相同碱基;3)、SP1和SP2的Tm值在55-65℃之间;4)、SP1和SP2的长度定为20-24nt。
对技术方案的进一步改进:所述步骤(3)中所述杂交及磁珠吸附方法如下:位点特异性引物与基因组DNA杂交反应总体积为50uL,包含1×杂交液,250nM LSP1引物混合物,250nM5’磷酸化的LSP2引物混合物,200ng生物素标记的基因组DNA,经平衡后悬浮于10ul Wash/Binding Buffer的磁珠;
杂交反应条件为:70℃12分钟,以后每个循环减2℃;69℃12分钟,以后每个循环减2℃,进行20个循环后,保持30℃,整个杂交反应进行至少16小时。
对技术方案的进一步改进:所述步骤(4)中延伸连接反应的体系为50uL,包含经洗涤得到的杂交吸附产物,1U DNA聚合酶,80U DNA连接酶,1×HF Buffer,1mM NAD,5mM dNTPs;45℃反应15分钟。
对技术方案的进一步改进:所述步骤(5)中所述PCR扩增引物序列如下:
5SLD:5'CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
3SLD:5'CTGCTGTACGGCCAAGGCGAA3'
Slx-1ST-MpPrimer-1:5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCT3';
Slx-1ST-MpPrimer-2:5'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT3'。
对技术方案的进一步改进:所述步骤(5)中所述第一轮PCR扩增反应体系为50uL,包含30uL反应模板,5uM5SLD或Slx-1ST-MpPrimer-1引物,5uM3SLD或Slx-1ST-MpPrimer-2引物,15mM dNTPs,1U DNA聚合酶,1×HF buffer;PCR反应条件为98℃变性5s,60℃退火20s,72℃延伸10s,进行17-20个循环,最后72℃延伸5min。
对技术方案的进一步改进:所述步骤(6)中所述PCR扩增引物序列如下:
Multi-P1:
5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
Barcode-P2:
5'CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTXXXXXXXXXXCTGCTGTACGGCCAAGGCGAA3'
Slx-2ND-MpPrimer:
5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCT3';
Slx-index-Barcode:
5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT3';
所述XXXXXX为区分样本所需Barcode序列。
对技术方案的进一步改进:所述步骤(6)中所述Barcode特异性引物二轮PCR扩增反应体系为20uL,包含25ng第一轮PCR扩增纯化产物,2uMMulti-P1或Slx-2ND-MpPrimer引物,2uM Barcode-P2或Slx-index-Barcode引物,6mM dNTPs,1U Phusion超保真DNA聚合酶,1×HF buffer;反应条件为98℃变性5s,60℃退火20s,72℃延伸10s,进行17-20个循环,最后72℃延伸5min。
与现有SNP分型技术相比,本发明的优点和积极效果是:针对现有定点SNP位点分型技术通量不高、位点选择不灵活、分型成本高等局限性,本发明开发了一种位点选择灵活、分型成本低、多测序平台通用、可对多个样本同时分型的基于高通量测序平台的新型SNP分型技术MuLTISNP(Multi-Locus Targeted Indel and SNP genotyping),MuLTISNP是基于高通量测序平台的新型SNP分型技术,该技术将液相杂交技术的位点选择灵活性和高通量测序技术通量高、成本低的优势结合在一起,可实现同时对96个样本的1296个SNP位点的分型;并可同时兼容ABI SOLiD和IlluminaHiSeq2000测序平台。本发明是一种高通量、高准确性、高灵活性、低成本、方便快捷的SNP分型方法
本发明与现有技术相比,其原理安全可靠,工艺步骤简单易控,大规模筛选运行可靠,效果优良,可以大范围广泛应用于实际生产研究中。
附图说明
图1是本发明所述MultiSNP分型方法的流程及原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本发明提供了基于高通量测序平台的新型SNP分型技术MuLTISNP(Multi-Locus Targeted Indel and SNP genotyping),以栉孔扇贝基因组DNA为例进行说明。如图1所示,本实施例以3个栉孔扇贝个体、1296个SNP位点、每个个体两次重复实验为例通过实验的实施详细叙述本发明的技术方案。
本发明所述基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法
MuLTISNP具体包括以下步骤:
1、提取扇贝基因组DNA,并进行生物素标记,方法如下:
1)提取栉孔扇贝基因组DNA:取栉孔扇贝个体的闭壳肌约0.1g,加入500μl STE裂解缓冲液(NaCl:100mM;EDTA:1Mm,pH=8.0;Tris-HCl,10nM,pH=8.0),剪碎,再加入50μl10%的SDS,以及5μl蛋白酶K(20mg/ml),56℃水浴消化,至组织碎块完全裂解,裂解液澄清。加入等体积饱和酚(250μl)以及氯仿/异戊醇(24:1)(250μl),抽提3次,取上清液,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)(500μl)抽提1次,取上清液,加入1/10体积NaAc(3M,pH5.2)(50μl)和2倍体积-20℃保存无水乙醇(1000ul),缓慢摇匀;-20℃沉淀30min.12000rpm离心10min,核酸将沉淀于管底。70%乙醇(1000ul)洗涤沉淀并干燥至乙醇全部挥发,加入100μl无菌水以及少量(1-2μl)RNase A,4℃冰箱保存备用。
2)基因组DNA生物素标记:标记方法参照Photoprobe Biotin Kit(Vector)说明,反应体积为20ul,包含1ug基因组DNA,10ul PhotoprobeBiotin reagent(1ug/uL);95℃温育30min。温育后向反应产物中加入144ul无菌水和16ul Tris Buffer,充分混匀后加入等体积(160ul)的异丁醇,萃取两次,去除多余的生物素,弃上清,加入2.5ul沉淀剂和150ul95%乙醇,充分混匀后13000rpm离心15min,标记好的基因组DNA沉淀于管底。70%乙醇洗涤沉淀并干燥至乙醇全部挥发,加入20ul TE溶解DNA,4℃冰箱保存。
2、位点特异性引物混合物的制备,方法如下:
1)设计位点特异性引物:为了验证本发明的有效性,本实施例采用栉孔扇贝454转录组测序得到的SNP位点,选取其中已经过高分率溶解曲线(High-resolution melting,HRM)分型验证的1296个SNP位点,根据其侧翼序列设计两个引物LSP1和LSP2。
所述引物LSP1包括3’端的位点特异性引物SP1和5’端的5SLD两部分,其中3’端的位点特异性引物SP1为与SNP位点邻近的22个碱基互补的序列,5’端的5SLD为通用引物5SLD序列(SEQ ID No:5)。
所述引物LSP2包括5’端的位点特异性引物SP2和3’端的3SLD-RC两部分,其中5’端的位点特异性引物SP2为与SNP位点另一侧第4个碱基后的22个碱基互补的序列,3’端为通用引物3SLD的反向互补序列,(3SLD序列如SEQ ID No:6)。
所述引物LSP1和LSP2序列如下:
LSP1:
5'CTCTCTATGGGCAGTCGGTGATXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX3'
LSP2:
5'XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTCGCCTTGGCCGTACAGCAG3'
所述LSP1和LSP2中的X分别为位点特异性引物SP1和SP2,具体序列因位点序列不同而不同,所述LSP15’端已知序列和LSP23’端已知序列与ABI SOLiD测序平台的通用测序引物相同。
所述位点特异性引物SP1和SP2引物设计还遵循以下原则:1、SP1和SP2所在的位置不能含有其他SNP位点或插入缺失;2、SP1和SP2所在的位置序列不能出现5个以上连续的相同碱基;3、SP1和SP2的长度一般定为22nt,对于个别SNP位点,为了满足Tm值的需要,SP1和SP2的长度可在20-24nt之间波动;4、SP1和SP2的Tm值在55-65℃之间;Tm值采用在线软件OligoCalc(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)计算,选择2Salt Adjusted。设计好的引物LSP1和LSP2由上海生工合成。4、SP1和SP2的长度一般定为22nt,对于个别SNP位点,为满足Tm值的需要,SP1和SP2的长度可在20-24nt微调。
2)制备多位点引物混合物:将1000个SNP位点的LSP1等量混合,得到LSP1混合物;将1000个SNP位点的LSP2等量混合后,将得到的LSP2混合物进行5’磷酸化,反应体积为50ul,包含62.5uM混合物,10U T4多聚核苷酸激酶(NEB),1×T4连接Buffer;37℃温育30min将LSP2混合物磷酸化,65℃温育20min灭活T4多聚核苷酸激酶。将LSP1混合物和LSP2混合物稀释至适当浓度,-20℃冰箱保存备用。
3、位点特异性引物杂交及磁珠吸附,方法如下:
1)磁珠的平衡:将磁珠(Hydrophilic Streptavidin Magnetic Beads,NEB)轻轻摇匀,吸出5ul至微量离心管中,放在磁力架上静置2min,吸去上清,用30ul1×杂交液(5×Denhart’s solution,0.5%SDS,5×SSC)仔细洗涤一次,每次洗涤结束时在磁力架上静置2min,吸去上清液。洗涤完毕后备用。
2)位点特异性引物与基因组DNA杂交及磁珠吸附:反应总体积为50uL,包含1×杂交液(5×Denhart’s solution,0.5%SDS,5×SSC),250nM LSP1引物混合物,250nM5’磷酸化的LSP2引物混合物,200ng生物素标记的基因组DNA,经平衡后悬浮于10ul Wash/Binding Buffer的磁珠。
杂交反应在PCR仪中进行,反应条件为:70℃12分钟(以后每个循环减2℃),69℃12分钟(以后每个循环减2℃),进行20个循环之后,保持30℃,保证整个杂交反应进行至少16小时。
3)杂交产物洗涤:杂交及磁珠吸附完毕后,用磁架固定磁珠,静置2min,吸去杂交混合液。用50ul Solution I(2×SSC,0.5%SDS)洗涤磁珠一次,再用50ul Solution II(2×SSC)洗涤磁珠一次,以去除多余的LSP1混合物和LSP2混合物,得到纯净的杂交吸附产物。
4、延伸连接反应获得目的DNA片段
1)位点特异性延伸连接反应:反应体积大约为50uL,包含上步洗涤得到的杂交吸附产物,1U Phusion DNA聚合酶(NEB),80U Taq DNA连接酶(NEB),1×HF Buffer,5mM dNTPs,1mM NAD;45℃反应15分钟。
2)目的DNA片段的洗脱:连接延伸反应结束后,用50uL SolutionIII(10mM Tris,pH8.5)洗涤1次后,将吸附在磁珠上的反应产物重悬于35uL无菌水中,95℃温育1分钟,用磁力架固定磁珠后,吸取上清约30ul至微量离心管中,得到PCR反应模板。
5、通用引物一轮PCR扩增及目的片段扩增:
PCR扩增引物为5SLD和3SLD(ABI SOLiD测序平台)或Slx-1ST-MpPrimer-1和Slx-1ST-MpPrimer-2(Illumina HiSeq2000测序平台)。
5SLD:5'CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
3SLD:5'CTGCTGTACGGCCAAGGCGAA3'
Slx-1ST-MpPrimer-1:
5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTCTCTATGGGCAGTCGGTG3'
Slx-1ST-MpPrimer-2:
5'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTGCTGTACGGCCAAGGCG3'
PCR反应体系为50uL:包含30uL反应模板,5uM5SLD引物,5uM3SLD引物,15mM dNTPs,1U Phusion超保真DNA聚合酶(NEB),1×HF buffer;反应条件为98℃变性5s,60℃退火20s,72℃延伸10s,进行17-20个循环,最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增产物大小约为90bp,切胶回收PCR产物。
6、对回收的目的片段进行Barcode特异性引物PCR扩增:
为了实现多个个体混合测序分型,可以通过对每个个体添加不同的Barcode来区分,利用PCR反应的不同引物引入不同的Barcode。
所述PCR扩增引物序列如下:
Multi-P1:5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
Barcode-P2:5'CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTXXXXXXXXXXCTGCTGTACGGCCAAGGCGAA3'
Slx-2ND-MpPrimer:5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCT3';
Slx-index-Barcode:5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT3';
所述Barcode-P2和Slx-index-Barcode中的XXXXXX为Bacrdoe序列,用于不同样本的区分。不同Barcode的碱基不同。
PCR反应体系为20uL,包含25ng一轮PCR扩增纯化产物,2uM Multi-P1引物,2uM Barcode-P2引物,6mM dNTPs,1U Phusion超保真DNA聚合酶(NEB),1×HF buffer;反应条件为98℃变性5s,60℃退火20s,72℃延伸10s,进行17-20个循环,最后72℃延伸5min。平行扩增3管,PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增产物大小约为140bp,利用QIAGENEPCR产物纯化试剂盒回收纯化PCR产物。利用ABI SOLiD4测序平台测序,此部分由由测序公司完成。
6、数据分析:
利用生物信息学软件分析数据,对3个个体的1296个SNP位点同时进行分型。
7、有效性验证:
为了验证本发明的有效性,同时对3个栉孔扇贝的1296个SNP位点进行了MuLtiSNP分型,且每个个体有两次重复实验。实验结果显示在单管反应1296个SNP位点的实验中,MultiSNP对位点的检测效率可以达到98.5%,位点的分型率达到97.2%,两次重复实验的分型一致率达到100%。因此,充分验证了本方法能快速、高效的对扇贝SNP进行分型,即可实现短时间内对多个个体的多个SNP位点同时分型。
本实施例具有通量高、效率高、成本低的特点,适用于大规模筛查栉孔扇贝SNP标记,在实际运行中效果安全达到了发明目的的要求。
表1本发明中涉及的引物序列表
*由于位点数较多,这里仅列出栉孔扇贝两个SNP位点(C162S257和C3148S333)的LSP1和LSP2的序列信息,其中小写部分为通用序列,大写部分为位点特异性序列。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国海洋大学
<120> 一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctctctatgg gcagtcggtg atagttacaa tcccaggggt ccta 44
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacctatgtc cagtaatagg acttcgcctt ggccgtacag cag 43
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctctctatgg gcagtcggtg atgcagtaac cagggagtac tcat 44
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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acatcaggcg atacgcacga ttttcgcctt ggccgtacag cag 43
<210> 5
<211> 22
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<213> 人工序列
<400> 5
ctctctatgg gcagtcggtg at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgctgtacg gccaaggcga a 21
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acactctttc cctacacgac gctctctcta tgggcagtcg gtg 43
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgactggag ttcagacgtg tgctctgctg tacggccaag gcg 43
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagtcggtga t 41
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<211> 54
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<213> 人工序列
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ctgccccggg ttcctcattc tctgtgtaag aggctgctgt acggccaagg cgaa 54
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<211> 48
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agataacctg gtgactggag ttcagacgtg t 51
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
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<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caagcagaag acggcatacg agatacagtg gtgactggag ttcagacgtg t 51
Claims (9)
1.一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:
1)提取生物基因组DNA,并对其进行生物素标记;
2)根据生物已知SNP位点的侧翼序列,设计引物LSP1和LSP2,分别混合后得到引物LSP1混合物和引物LSP2混合物,并将引物LSP2混合物进行5’磷酸化;
3)将所述引物LSP1混合物和引物LSP2混合物与生物基因组DNA杂交,并进行磁珠吸附获得杂交吸附产物;
4)所述杂交吸附产物进行延伸连接反应获得目的DNA片段;
5) 第一轮PCR扩增及目的DNA片段扩增,PCR扩增引物为测序平台通用配对引物5SLD和3SLD,或Slx-1ST-MpPrimer-1和Slx-1ST-MpPrimer-2;
6)对目的DNA片段进行Barcode特异性引物二轮PCR扩增,PCR扩增引物为Multi-P1和Barcode-P2,或Slx-2ND-MpPrimer和Slx-index-Barcode;
7)高通量测序;
8)测序数据分析得到SNP位点分型信息。
2.根据权利要求1所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,其特征在于所述步骤(2)中引物LSP1包括3’端的位点特异性引物SP1和5’端的5SLD两部分, 3’端的引物SP1为与SNP位点邻近的22个碱基互补的序列,5’端为通用引物5SLD 5'-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3';
引物LSP2包括5’端的位点特异性引物SP2和3’端的3SLD-RC两部分, 5’端的引物SP2为与SNP位点另一侧第4个碱基后的22个碱基互补的序列,3’端为通用引物3SLD 的反向互补序列5'- TTCGCCTTGGCCGTACAGCAG-3'。
3.根据权利要求2所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,其特征在于所述步骤(2) 中位点特异性引物SP1和SP2设计原则如下: 1)、SP1和SP2所在的位置不能含有其他SNP位点或插入缺失;2)、SP1和SP2所在的位置序列不能出现5个以上连续的相同碱基;3)、SP1和SP2的Tm值在55-65℃之间; 4)、SP1和SP2的长度定为20-24nt。
4.根据权利要求1所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,其特征在于所述步骤(3)中所述杂交及磁珠吸附方法如下:位点特异性引物与基因组DNA杂交反应总体积为50uL,包含1×杂交液,250nM LSP1 引物混合物,250nM 5’磷酸化的LSP2 引物混合物,200ng生物素标记的基因组DNA,经平衡后悬浮于10ul Wash/Binding Buffer的磁珠;
杂交反应条件为:70℃ 12分钟,以后每个循环减2℃;69℃ 12分钟,以后每个循环减2℃,进行20个循环后,保持30℃,整个杂交反应进行至少16小时。
5.根据权利要求1所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,其特征在于所述步骤(4) 中延伸连接反应的体系为50uL,包含经洗涤得到的杂交吸附产物,1U DNA 聚合酶,80U DNA 连接酶,1×HF Buffer,1mM NAD, 5mM dNTPs;45℃反应15分钟。
6.根据权利要求1所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,其特征在于所述步骤(5)中所述PCR扩增引物序列如下:
5SLD:5'CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
3SLD: 5'CTGCTGTACGGCCAAGGCGAA3'
Slx-1ST-MpPrimer-1: 5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 3';
Slx-1ST-MpPrimer-2: 5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT 3'。
7.根据权利要求6所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,其特征在于所述步骤(5)中所述第一轮PCR扩增反应体系为50uL,包含30uL反应模板,5uM 5SLD或Slx-1ST-MpPrimer-1引物,5uM 3SLD或Slx-1ST-MpPrimer-2引物,15mM dNTPs, 1U DNA 聚合酶,1× HF buffer;PCR反应条件为98℃变性5 s,60℃退火20 s,72℃延伸10 s,进行17-20个循环,最后72℃延伸 5min。
8.根据权利要求1所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,其特征在于所述步骤(6)中所述PCR扩增引物序列如下:
Multi-P1: 5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
Barcode-P2: 5'CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTXXXXXXXXXXCTGCTGTACGGCCAAGGCGAA3'
Slx-2ND-MpPrimer:
5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCT 3';
Slx-index-Barcode:
5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT 3';
所述XXXXXX为区分样本所需Barcode序列。
9.根据权利要求8所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法,其特征在于所述步骤(6)中所述Barcode特异性引物二轮PCR扩增反应体系为20uL,包含25ng第一轮PCR扩增纯化产物,2uM Multi-P1或Slx-2ND-MpPrimer引物,2uM Barcode-P2或Slx-index-Barcode引物, 6mM dNTPs, 1U Phusion 超保真 DNA 聚合酶,1× HF buffer;反应条件为98℃变性5 s,60℃退火20 s,72℃延伸10 s,进行17-20个循环,最后72℃延伸5min。
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