CN109355288B - 一种目标dna富集的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种目标DNA富集的方法和应用。本申请的目标DNA富集方法包括,蛋白核酸复合物制备步骤,将同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成蛋白核酸复合物;同源性重组步骤,采用带有生物素标记的与目标DNA具有同源性的双链DNA探针与蛋白核酸复合物反应;生物素标记分离步骤,包括利用双链DNA探针中的生物素标记,将与之结合的同源性单链目标DNA分离、富集。本申请的富集方法,采用双链DNA探针和同源重组酶能靶向富集待测样本中的单链目标DNA;并且效率高、均匀性和稳定性好,特别适合于多靶标DNA或者拷贝数较低的目标DNA的富集。本申请富集方法采用的双链DNA探针制备方法简单、易操作,且成本低。
Description
技术领域
本申请涉及DNA富集领域,特别是涉及一种目标DNA富集的方法和应用。
背景技术
新一代测序技术(NGS)和平台的快速发展和应用使得多区域同时测序成为可能。尽管全基因组测序成本正在不断下降,但选择感兴趣的目标基因或区域进行测序和分析仍然更加符合当前实际和成本效益。因此,目标DNA富集技术成为新一代测序技术前的最常用技术之一。
目前常用的目标区域富集技术主要有如下几种:1)基于特异性引物扩增的方法;2)基于寡核苷酸探针杂交捕获的方法;3)基于反向探针杂交的方法。这三种常用方法都有其各自的优势和劣势。
基于引物特异性扩增的方法一般比较直接方便,但是对于目标区域特别多的情况,需要采用多组引物对进行多重扩增,而多重扩增时往往会发生各个特异性引物之间错误扩增的情况,并且多重扩增难以保障每一对引物的扩增效率。
基于寡核苷酸探针杂交捕获的方法能够检测大批量的目标区域。常应用在人全外显子的捕获测序中。该方法能够捕获并检测多种变异类型,如单核苷酸变异、小的插入和缺失,甚至拷贝数变异等等。但是该方法中杂交捕获的试剂和探针价格比较昂贵,并且杂交捕获的时间要长,一般都要16小时到48小时。
基于反向探针杂交的方法是指设计一段两端含有目标区域两侧序列互补序列的寡核苷酸探针。与目标分子杂交并延伸连接后形成单链环状。再通过探针上的通用序列设计引物进行扩增。该方法具有特异性引物扩增和寡核苷酸杂交捕获的部分优势,探针设计复杂,杂交效率和分子利用率并不高。
因此,为了满足日益广泛的基因测序需求,研发一种更有效的目标DNA富集试剂或方法,是本领域的研究重点。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的目标DNA富集的方法和应用。
为了实现上述目的,本申请采用了以下技术方案:
本申请的一方面公开了一种目标DNA富集的方法,包括以下步骤,
蛋白核酸复合物制备步骤,包括将同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成稳定的蛋白核酸复合物;
同源性重组步骤,包括采用带有生物素标记的与目标DNA具有同源性的双链DNA探针与蛋白核酸复合物反应,在同源重组酶的作用下,双链DNA探针与单链的目标DNA结合;
生物素标记分离步骤,包括利用双链DNA探针中的生物素标记,将与之结合的同源性单链目标DNA分离、富集。
其中,同源重组酶与单链DNA组装成蛋白核酸复合物,可以参考常规的同源重组酶与单链DNA结合时采用的组装试剂和方法,在此不作具体限定。
需要说明的是,本申请的目标DNA富集方法,创造性的利用同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成稳定的蛋白核酸复合物;然后利用事先设计好的与目标DNA同源性的双链DNA探针,即双链DNA片段,与蛋白核酸复合物同源性结合,并利用双链DNA探针上带有的生物素标记,将待测样本的单链目标DNA分离出来,实现目标DNA富集。本申请的富集方法,一方面,利用同源重组酶的促进识别效果,能够有效的对目标DNA进行结合、分离;另一方面,本申请富集方法采用的双链DNA探针制备方法简单,相对于传统的单链探针而言,本申请的一种实现方式中只需要进行常规的PCR扩增或者对PCR扩增产物进行打断处理,即可获得双链DNA探针,制备简单、方便,降低了目标DNA富集的探针成本。
优选的,本申请的目标DNA富集方法还包括解组装步骤,解组装步骤包括,在生物素标记分离步骤之后,采用解组装试剂,使富集的单链目标DNA从蛋白核酸复合物中解离出来。
需要说明的是,蛋白核酸复合物的作用是,利用同源重组酶的促进识别和同源性结合作用,使得与双链DNA探针具有同源性的单链目标DNA能够准确、有效的与双链DNA探针结合,进而方便将单链目标DNA分离出来,实现富集;可以理解,如果需要获得单独的单链目标DNA产品,则需要采用常规的解组装方法,将单链目标DNA从蛋白核酸复合物中解离出来;当然,如果仅仅是将单链目标DNA分离富集,或者有其它用途,也可以不需要解组装步骤。
优选的,本申请的目标DNA富集方法还包括对待测样本的核酸进行变性处理,获得单链DNA。
优选的,在进行变性处理之前或之后对待测样本进行打断处理。
需要说明的是,一般来说,提取的DNA样品都是双链结构,并且片段都比较长;而本申请的目标DNA富集方法,需要使用短片段的单链DNA,因此,本申请的目标DNA富集方法还可以进一步的包括变性,将双链变性为单链,或者将待测样本打断处理成短片段。当然,对于本申请就是短片段DNA的样本,则不需要打断处理。
优选的,生物素标记分离步骤,具体采用亲和素修饰的磁珠进行。
优选的,同源重组酶为RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR、Rad51和Mre11-Rad50中的至少一种。更优选的,同源重组酶为RecA或Rad51。
优选的,双链DNA探针的长度为50bp-100bp。
优选的,本申请的目标DNA富集方法中使用的双链DNA探针采用以下方法制备获得:
采用扩增引物对待测样本的DNA进行PCR扩增,并且,在PCR扩增的过程中,采用的dATP、dGTP、dCTP和dTTP中的至少一种带有生物素标记;PCR扩增产物即双链DNA探针;其中,扩增引物能够特异性的扩增待测样本的目标DNA的全部或部分序列。
需要说明的是,本申请的双链DNA探针的长度为50bp-100bp,因此,对于大于100bp的PCR扩增产物,本申请进一步的还可以包括对PCR扩增产物进行打断处理。此外,为了获得纯的双链DNA探针,本申请进一步还可以包括对PCR扩增产物或打断处理的产物进行纯化,例如磁珠纯化或其它方式的纯化。
本申请的另一面公开了本申请的目标DNA富集方法在目标DNA的测序或文库构建中的应用。
本申请的再一面公开了一种目标DNA的文库构建方法,包括采用本申请的目标DNA富集方法对目标DNA进行富集,然后再进行后续的文库构建步骤。
本申请的再一面公开了一种目标DNA的测序方法,包括采用本申请的文库构建方法制备测序文库,然后对制备的测序文库进行测序。
可以理解,本申请的目标DNA富集方法,其核心的试剂,例如双链DNA探针和同源重组酶,完全可以单独作为一种用于目标DNA富集的试剂盒使用。因此,在提出本申请的目标DNA富集方法的同时,本申请还提供了一种用于目标DNA富集的试剂盒,包括双链DNA探针和同源重组酶;双链DNA探针中的腺嘌呤脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸中的至少一种上带有生物素标记;同源重组酶用于与待测样本的单链DNA结合,并促进双链DNA探针与待测样本中的同源性单链DNA结合;利用双链DNA探针中的生物素标记,将在同源重组酶作用下与双链DNA探针结合的同源性单链DNA分离、富集,起到目标DNA富集的效果。
需要说明的是,本申请的关键在于利用同源重组酶对同源性核酸的识别和靶标作用,将与双链DNA探针同源性的待测样本目标DNA分离,从而起到目标DNA富集的效果。一般来说,同源重组酶是与单链DNA组合成核酸蛋白复合物,然后,在同源重组酶的作用下,将单链DNA结合到与之同源性的双链DNA上;但是,本申请创造性的,反向操作,将双链DNA作为探针,用双链DNA去靶向待测样本中的单链目标DNA;所以,本申请的试剂盒中包含有双链DNA探针和同源重组酶。
本申请的试剂盒中,同源重组酶可以采用现有的常规使用的同源重组酶,例如RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR、Rad51、Mre11-Rad50等,但是,本申请的优选方案中,优选采用RecA或Rad51。
优选的,本申请的试剂盒中,双链DNA探针的长度为50bp-100bp。
需要说明的是,本申请的一种实现方式中,是通过对长片段的双链DNA进行打断,以获得短链的双链DNA探针;因此,50bp-100bp的长度只是大多数双链DNA探针的常规长度,不排除打断后存在部分双链DNA探针的长度小于或大于本申请限定的范围。
优选的,本申请的试剂盒还包括亲和素修饰的磁珠,磁珠用于将带有生物素标记的双链DNA探针分离。
优选的,本申请的试剂盒还包括同源重组酶组装试剂和/或同源重组酶解组装试剂。
需要说明的是,磁珠可以采用市购的亲和素修饰磁珠,为了使用方便,本申请将其组合到本申请的试剂盒中;同样的,同源重组酶组装试剂、同源重组酶解组装试剂,也可以根据具体的同源重组酶市购获得相应的组装试剂或解组装试剂,为了使用方便,本申请也将其组合到本申请的试剂盒中。
还需要说明的是,本申请的一种实现方式中,是利用亲和素修饰的磁珠分离生物素标记的双链DNA探针,其目的是将与双链DNA探针同源性结合的单链目标DNA分离出来;可以理解,磁珠并非唯一的选择,例如还可以通过将生物素标记的双链DNA探针固定在膜、过滤柱等固体载体上,使与之结合的单链目标DNA分离,或者采用亲和素修饰的膜或过滤柱将双链DNA探针分离,从而实现单链目标DNA分离。
本申请的另一面公开了带有生物素标记的双链DNA片段和同源重组酶作为DNA富集试剂的应用。
需要说明的是,本申请的关键就在于,创造性的利用双链DNA和同源重组酶,对单链DNA的反向靶定作用,将单链目标DNA从待测样品中分离出来,从而实现富集效果。
本申请的另一面公开了一种用于目标DNA富集的双链DNA探针的制备方法,包括采用扩增引物对待测样本的DNA进行PCR扩增,并且,在PCR扩增的过程中,采用的dATP、dGTP、dCTP和dTTP中的至少一种带有生物素标记;PCR扩增产物即双链DNA探针;其中,扩增引物能够特异性的扩增待测样本的目标DNA的全部或部分序列。
需要说明的是,本申请的试剂盒中,之所以反向操作,将双链DNA作为探针,就是因为双链DNA探针可以直接采用常规的PCR扩增获得,制备方法简单、方便;特别是相对于现有的寡核苷酸探针杂交捕获而言,单链杂交捕获探针通常只能采用人工化学合成单链DNA,成本高,不利于多靶标、大批量的合成;而本申请的双链DNA探针采用PCR扩增即可制备,对于多靶标可以直接设计多组扩增引物,分别进行PCR扩增获得针对不同靶标的双链DNA探针,方法简单、易操作、成本低。
优选的,本申请的制备方法还包括对PCR扩增产物进行打断处理,获得长度为50bp-100bp的双链DNA探针。
需要说明的是,本申请的PCR扩增制备双链DNA探针,对高保真要求较低,只要与待测样本的目标DNA具有同源性即可起到识别作用;因此,如果所要富集的目标DNA聚集在一个比较大的区域,或者要富集整个基因,则可以进行长片段PCR扩增,每个扩增区域可以长达20kb;但是,作为双链DNA探针,其长度在100bp左右最适宜,因此,对于长度大于100bp的PCR扩增产物,本申请进一步的采用常规的打断处理方法对其进行破碎,以获得50bp-100bp的双链DNA探针。
优选的,本申请的制备方法还包括对PCR扩增产物或打断处理的产物进行纯化,获得双链DNA探针。
需要说明的是,PCR扩增完成后,或打断处理后,一般需要将双链DNA探针从反应体系中提取出来,然后再作为探针添加到同源重组酶的组装反应体系中,因此,本申请的制备方法进一步包括纯化步骤,至于具体的纯化方式可以采用常规的PCR扩增产物纯化方法,例如磁珠法、琼脂糖凝胶电泳分离法、DHPLC纯化等,在此不作具体限定。
本申请的再一面公开了本申请的制备方法制备的双链DNA探针。
本申请的再一面公开了本申请的试剂盒或本申请的双链DNA探针在目标DNA的测序或文库构建中的应用。
由于采用以上技术方案,本申请的有益效果在于:
本申请的目标DNA富集方法,采用双链DNA探针,利用同源重组酶的靶标识别作用,能够靶向富集待测样本中的单链目标DNA;并且基于同源重组酶的双链DNA探针同源性单链目标DNA识别和富集,效率高、均匀性和稳定性好,特别适合于多靶标DNA或者拷贝数较低的目标DNA的富集。本申请目标DNA富集方法采用的双链DNA探针制备方法简单、易操作,且成本低。
附图说明
图1为本申请实施例中目标DNA富集方法的流程示意图;
图2为本申请实施例中同源重组酶富集目标DNA的原理示意图;
图3为本申请实施例一中构建的测序文库的琼脂糖凝胶电泳结果图;
图4为本申请实施例二中构建的测序文库的琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
同源重组是指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化,即同源重组酶。同源重组酶在发挥作用时,通常是先与一段单链DNA结合成稳定的蛋白核酸复合物,然后再与单链DNA具有同源性的双链DNA结合、重组。
本申请正是利用了同源重组酶的同源识别性,创造性的将双链DNA作为杂交探针,对待测样品的单链目标DNA进行分离、富集。其中,双链DNA探针是特别设计的与目标DNA具有同源性的一个双链DNA片段。
因此,本申请研发了一种用于目标DNA富集的试剂盒,其包括双链DNA探针和同源重组酶;双链DNA探针带有生物素标记;同源重组酶用于与待测样本的单链DNA结合,并促进双链DNA探针与待测样本中的同源性单链DNA结合;利用双链DNA探针中的生物素标记,将在同源重组酶作用下与双链DNA探针结合的同源性单链DNA分离、富集,起到目标DNA富集的效果。
在本申请的目标DNA富集试剂盒的基础上,本申请进一步提供了一种目标DNA富集的方法,其包括以下步骤:蛋白核酸复合物制备步骤,包括将同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成稳定的蛋白核酸复合物;同源性重组步骤,包括采用带有生物素标记的与目标DNA具有同源性的双链DNA探针与蛋白核酸复合物反应,在同源重组酶的作用下,双链DNA探针与单链的目标DNA结合;生物素标记分离步骤,包括利用双链DNA探针中的生物素标记,将与之结合的同源性单链目标DNA分离、富集。
以上目标DNA富集方法是在已经制备获得双链DNA探针的情况下,的目标DNA富集方法。但是,对于一个全新的待测样本来说,本申请的目标DNA富集试剂盒或方法,其关键都在于双链DNA探针的设计。因此,本申请从双链DNA探针设计到目标DNA富集,再到最终建库、测序的整个流程,如图1所示,包括制作双链探针步骤11、预处理待测核酸步骤12、复合物组装步骤13、富集分离步骤14、构建NGS文库步骤15、测序和数据分析步骤16等工艺。
其中,制作双链探针步骤11,本申请所设计制作的目标DNA探针为双链DNA。具体制作方法和大小可以根据所要富集的区域特点灵活设计。如果所要富集的区域周围没有其它想要富集的区域则可以只在此区域设计引物进行50-100bp左右的产物扩增,扩增产物即双链DNA探针。如果所要富集的区域聚集在一个比较大的区域,或者要富集整个基因,则可以进行长片段扩增,每个扩增区域可以长达20kb;在将PCR扩增产物使用超声破碎或酶切的方式打断成50bp-100bp的小片段,即获得双链DNA探针。本例的双链DNA探针,制作时需使用部分或全部biotin生物素修饰的碱基,即在PCR过程中所使用的dNTPs中的部分或全部碱基是生物素标记的。
预处理待测核酸步骤12,待测样本的DNA可以是长的或短的、单链的或双链的DNA。如可以是各种来源的碎片化DNA,或经过重亚硫酸盐处理的单链短片段DNA。无论如何,本申请的目标DNA富集方法中,参与反应的需要是50-100nt的单链DNA;因此,对于常规的基因组DNA而言,需要对待测样本的核酸进行预处理,例如打断处理或变性处理等。
复合物组装步骤13,是指使用同源重组酶,例如RecA或Rad51,将待测样本的单链DNA片段,在同源重组酶的组装试剂中,组装成稳定的蛋白核酸复合物,该蛋白核酸复合物即单链DNA片段和同源重组酶组装的复合物。
富集分离步骤14,包括将制备好的双链DNA探针加入到蛋白核酸复合物中,如图2所示,在同源重组酶的作用下,蛋白核酸复合物中的单链目标核酸,即目标DNA,会识别并结合到与之同源性的双链DNA探针上;然后通过双链DNA探针上的生物素标记,采用链霉亲和素包被的磁珠,将双链DNA探针分离,与此同时将与之结合的单链目标DNA分离、洗脱,起到目标DNA富集的效果;最后,采用解组装试剂,将单链目标DNA从蛋白核酸复合物解离出来,即获得富集的单链目标DNA。
本申请解组装分离产物,即从蛋白核酸复合物解离下来的产物,是单链DNA。使用常规的单链文库构建方法进行NGS文库构建,即构建NGS文库步骤15,最终将文库进行上机测序并数据分析,即测序和数据分析步骤16。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明,不应理解为对本申请的限制。
实施例一
本例将人基因组中的EGFR T790M区域作为目标DNA,针对该目标DNA设计并制备了双链DNA探针,并采用同源重组酶RecA,对目标DNA进行富集,详细如下:
1.目标区域引物设计
本例针对EGFR T790M区域设计了特异性扩增引物Probe-EG-F和Probe-EG-R,其扩增产物为包括靶标片段在内的113bp的片段。Probe-EG-F为Seq ID No.1所示序列,Probe-EG-R为Seq ID No.2所示序列,扩增产物为Seq ID No.3所示序列。
Seq ID No.1:5’-GGACAACCCCCACGTGTGCCGC-3’
Seq ID No.2:5’-CTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCA-3’
Seq ID No.3:
5’-GGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCC ACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTAT GTCCGGGAACACAAAG-3’
2.制作目标区域的双链DNA探针
采用设计的特异性引物对人源基因组DNA进行扩增,获得双链DNA探针,具体的,50μL的PCR反应体系包括:人源基因组DNA 50ng、Takara rTaq DNA聚合酶1μL、10×rTaqbuffer 5μL、10μM的Probe-EG-F 1μL、10μM的Probe-EG-R1μL、dCTP/dGTP/dTTP(2.5mMeach)3μL、2.5mM的Biotin标记dATP 1μL,补充去离子水至50μL。
PCR反应条件为,98℃预变性2min,然后进入30个循环:98℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min,循环结束后,72℃延伸5min,4℃保存。
将PCR产物取5μL进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示,PCR扩增获得了约113bp的靶标片段。
将PCR产物使用QIAquick PCR Purification Kit(50)(28104)进行纯化,最后洗脱获得30μL的双链DNA探针。
3.待测样本处理
取人源外周血2mL,抽取白细胞基因组DNA作为待富集DNA。基因组DNA提取采用DNeasy Blood&Tissue Kits(QIagen Cat No./ID:69504),具体操作步骤详见试剂盒说明书。
将提取的基因组DNA使用超声打断至100bp左右,并采用1.8×Ampure XP beads纯化,并进行qubit定量,定量结果为125.8ng/μL。
4.蛋白核酸复合物组装
取1μg待富集片段化DNA,在PCR仪上98℃变性2min,然后立即置于冰上2min,获得单链DNA。
蛋白核酸复合物组装反应体系为:待检测单链DNA 1μg、RecA蛋白(NEB M0249S)2.5μL、组装buffer 5μL,补充去离子水至20μL。
其中,组装buffer即同源重组酶与单链DNA结合的组装试剂,其中含有RecA蛋白和核酸组装所必需的成分,包括ATP或ATP类似物5mM、70mM Tris-HCI(pH7.6)、10mM MgCl2和5mM DTT。
混合后瞬时离心,在PCR仪上37℃反应15min。
5.富集和分离
向20μL的蛋白核酸复合物组装产物中加入双链DNA探针5μg,在加入富集buffer 5μL,补充去离子水补至50μL。
其中,富集buffer即同源重组酶识别并促进单链DNA与同源性的双链DNA结合的试剂,其中包含70mM Tris-HCI(pH7.6)、10mM MgCl2和5mM DTT。
混合后瞬时离心,在PCR仪上37℃反应20min。
DynabeadsTM MyOneTM Streptavidin T1beads(65602)取20μL,洗两次后用50μLbinding buffer重悬。与上面样本混合,室温放置15min。
上磁力架,吸弃上清。使用富集buffer漂洗3次,每次5min。用水重悬beads,室温放置5min。加入2μL的PK(QIAGEN试剂盒中),50℃温浴10min,然后99℃4min。上磁力架去除beads。将上清回收到新管中。
6.文库构建
富集产物为单链DNA片段,因此,使用1S PLUS DNA LIBRARYKIT(SWIFT Biosciences Cat.Nos 10024)进行Illumina测序平台文库构建,文库构建详见试剂盒说明。
最终文库取5μL进行2%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图3所示。图3中,第一泳道为DNAmarker,第二泳道为构建的文库;图3的结果显示,在约300bp处有靶标片段,与预期相符。需要说明的是,虽然目标DNA片段是100bp左右的长度,但是经过文库构建,加接头等处理,最终的文库构建产物应该在约300bp左右有靶标片段。
7.测序
采用荧光定量PCR质控检测本例构建的测序文库,结果显示,其符合后续测序使用需求。因此,本例进一步采用Illumina公司NextSeq500测序平台进行75bp双端测序。
将高通量测序下机数据经过质控过滤后,进行BWA比对,用于评估文库的特异性,分析结果如表1所示。
表1测序数据分析结果
表1的结果显示,采用本例的双链DNA探针进行富集后,测序得到的有效数据中有16.13%的reads为目标区域EGFR T790M的数据,远远超过了该区域在人全基因组中所占的比例;该实验结果说明本例的双链DNA探针及基于该双链DNA探针的目标DNA富集方法能够非常有效的对目标区域进行富集。
实施例二
本例将人基因组中BRCA1基因的五段区域分别作为目标DNA,并分别针对五个目标DNA设计和制备了5组双链DNA探针,然后将5组双链DNA探针等量混合作为混合双链DNA探针,采用同源重组酶RecA,对五个目标DNA进行富集,详细如下:
1.目标区域引物设计
本例针对基因BRCA1的五段区域分别设计了5对特异性扩增引物对,能够覆盖所需要富集的目标区域。5对特异性扩增引物对分别为:Probe-BRCA1-1F/R、Probe-BRCA1-2F/R、Probe-BRCA1-3F/R、Probe-BRCA1-4F/R、Probe-BRCA1-5F/R,5对特异性扩增引物对的上下游引物依序为Seq ID No.4至13所示序列。
Probe-BRCA1-1F:Seq ID No.4:5’-TAAAGTTCATTGGAACAGAAAG-3’
Probe-BRCA1-1R:Seq ID No.5:5’-CTTACCAGATGGGACACTCTAAG-3’
Probe-BRCA1-2F:Seq ID No.6:5’-CCCTACCCTGCTAGTCTGGAGTTG-3’
Probe-BRCA1-2R:Seq ID No.7:5’-AATGGAGCCACATAACACATTCAA-3’
Probe-BRCA1-3F:Seq ID No.8:5’-TCTTTATAATTTATAGATTTTGCAT-3’
Probe-BRCA1-3R:Seq ID No.9:5’-GCATCATTACCAAATTATATAC-3’
Probe-BRCA1-4F:Seq ID No.10:5’-TTCTCAAACAATTTAATTTCAG-3’
Probe-BRCA1-4R:Seq ID No.11:5’-TTCTTGGGATATTCAACACTTAC-3’
Probe-BRCA1-5F:Seq ID No.12:5’-TATTTTACAGATGCAAACAGCTA-3’
Probe-BRCA1-5R:Seq ID No.13:5’-GTTTTACCAAGGAAGGATTTTCGG-3’
2.制作目标区域双链DNA探针
本例分别采用5对特异性扩增引物对进行PCR扩增,每个PCR扩增的反应体系为:人源基因组DNA50ng、Takara rTaq DNA聚合酶1μL、10×rTaqbuffer5μL、10μM的正向引物1μL、10μM的反向引物1μL、dCTP/dGTP/dTTP(2.5mM each)3μL、2.5mM的Biotin标记dATP 1μL,补充去离子水至50μL。
PCR反应条件为,98℃预变性2min,然后进入30个循环:98℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min,循环结束后,72℃延伸5min,4℃保存。
PCR反应结束后,取5μL的PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示,5对特异性扩增引物对都分别有扩增出符合预期的靶标片段。
5个PCR产物分别使用QIAquick PCR Purification Kit(50)(28104)进行纯化,洗脱获得30μL的产物。将5个PCR扩增的纯化产物等量混合,即获得本例的双链DNA探针。
3.待测样本处理
采用实施例一制备的基因组DNA,将提取的基因组DNA使用超声打断至100bp左右,并采用1.8×Ampure XP beads纯化,并进行qubit定量,定量结果为102.9ng/μL。
4.蛋白核酸复合物组装
取1μg待富集片段化DNA,在PCR仪上98℃变性2min,然后立即置于冰上2min,获得单链DNA。
蛋白核酸复合物组装反应体系为:待检测单链DNA 1μg、RecA蛋白(NEB M0249S)2.5μL、组装buffer 5μL,补充去离子水至20μL。
其中,组装buffer与实施例一相同。
混合后瞬时离心,在PCR仪上37℃15min。
5.富集和分离
向20μL的蛋白核酸复合物组装产物中加入双链DNA探针5μg,在加入富集buffer 5μL,补充去离子水补至50μL。
其中,富集buffer与实施例一相同。
混合后瞬时离心,在PCR仪上37℃反应20min。
DynabeadsTM MyOneTM Streptavidin T1beads(65602)取20μL,洗两次后用50μLbinding buffer重悬。与上面样本混合,室温放置15min。
上磁力架,吸弃上清。使用富集buffer漂洗3次,每次5min。用水重悬beads,室温放置5min。加入2μL的PK(QIAGEN试剂盒中),50℃温浴10min,然后99℃4min。上磁力架去除beads。将上清回收到新管中。
6.文库构建
富集产物为单链DNA片段,因此,使用1S PLUS DNA LIBRARYKIT(SWIFT Biosciences Cat.Nos 10024)进行Illumina测序平台文库构建,文库构建详见试剂盒说明。
最终文库取5μL进行2%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图4所示。图4中,第一泳道为DNAmarker,第二泳道为构建的文库;图4的结果显示,在约300bp处有靶标片段,与预期相符。
7.测序
采用荧光定量PCR质控检测本例构建的测序文库,结果显示,其符合后续测序使用需求。因此,本例进一步采用Illumina公司NextSeq500测序平台进行75bp双端测序。
将高通量测序下机数据经过质控过滤后,进行BWA比对,用于评估文库的特异性,分析结果如表2所示。
表2测序数据分析结果
表2的结果显示,采用本例的混合双链DNA探针进行富集后,测序得到的有效数据中有25.73%的reads为目标区域BRCA1五段区域的数据,远远超过了该区域在人全基因组中所占的比例;该实验结果说明本例的混合双链DNA探针及基于该混合双链DNA探针的目标DNA富集方法能够非常有效的对多个目标区域进行富集。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明,不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 人和未来生物科技(长沙)有限公司
<120> 一种目标DNA富集的方法和应用
<130> 18I27612
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggacaacccc cacgtgtgcc gc 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctttgtgttc ccggacatag tcca 24
<210> 3
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggacaacccc cacgtgtgcc gcctgctggg catctgcctc acctccaccg tgcagctcat 60
cacgcagctc atgcccttcg gctgcctcct ggactatgtc cgggaacaca aag 113
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taaagttcat tggaacagaa ag 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cttaccagat gggacactct aag 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccctaccctg ctagtctgga gttg 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatggagcca cataacacat tcaa 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tctttataat ttatagattt tgcat 25
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcatcattac caaattatat ac 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttctcaaaca atttaatttc ag 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttcttgggat attcaacact tac 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tattttacag atgcaaacag cta 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gttttaccaa ggaaggattt tcgg 24
Claims (13)
1.一种目标DNA富集的方法,其特征在于:包括以下步骤,
蛋白核酸复合物制备步骤,包括将同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成稳定的蛋白核酸复合物;
同源性重组步骤,包括采用带有生物素标记的与目标DNA具有同源性的双链DNA探针与所述蛋白核酸复合物反应,在同源重组酶的作用下,双链DNA探针与单链的目标DNA结合;
生物素标记分离步骤,包括利用所述双链DNA探针中的生物素标记,将与之结合的同源性单链目标DNA分离、富集;
所述双链DNA探针采用以下方法制备获得,
采用扩增引物对待测样本的DNA进行PCR扩增,并且,在PCR扩增的过程中,采用的dATP、dGTP、dCTP和dTTP中的至少一种带有生物素标记;PCR扩增产物即双链DNA探针;其中,扩增引物能够特异性的扩增待测样本的目标DNA的全部或部分序列。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:还包括解组装步骤,所述解组装步骤包括,在生物素标记分离步骤之后,采用解组装试剂,使富集的单链目标DNA从蛋白核酸复合物中解离出来。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:还包括对待测样本的核酸进行变性处理,获得单链DNA。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:在进行变性处理之前或之后对待测样本进行打断处理。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述生物素标记分离步骤,具体采用亲和素修饰的磁珠进行。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述同源重组酶为RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR、Rad51和Mre11-Rad50中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述同源重组酶为RecA或Rad51。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述所述双链DNA探针的长度为50bp-100bp。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述双链DNA探针,其制备方法还包括对PCR扩增产物进行打断处理,获得长度为50bp-100bp的双链DNA探针。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述双链DNA探针,其制备方法还包括对PCR扩增产物或打断处理的产物进行纯化,获得双链DNA探针。
11.根据权利要求1-10任一项所述的方法在目标DNA的测序或文库构建中的应用。
12.一种目标DNA的文库构建方法,其特征在于:包括采用权利要求1-10任一项所述的方法对目标DNA进行富集,然后再进行后续的文库构建步骤。
13.一种目标DNA的测序方法,其特征在于:包括采用权利要求12所述的文库构建方法制备测序文库,然后对制备的测序文库进行测序。
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