CN109777867B - 一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因突变的方法 - Google Patents
一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因突变的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因突变的方法，本方法基于一个用于扩增GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体DNA和GJB3基因耳聋相关突变位点的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～26所示。通过本发明建立的检测方法，利用重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因，仅需要5个PCR反应和测序反应，大幅度减少PCR反应数和测序反应数，可以检测GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体DNA和GJB3基因的主要43个突变位点，并可以发现扩增片度中新的变异位点。所以此检测技术应用于耳聋易感基因突变检测具有重要的临床意义，不仅简化操作步骤，降低检测成本，而且提高检测效率，值得大力推广。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，更具体地，涉及一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因突变的方法。
背景技术
耳聋是一种最常见的严重感官系统缺陷，2005年全球至少有2.78亿人有致残性听力损害。遗传性耳聋分为非综合征型耳聋(NSHI)和综合征型耳聋(SHI)，绝大部分的NSHI和SHI由单基因异常导致。目前每500个新生儿中就有一个被确诊为双耳先天性感音神经性聋，其中约50％～70％是由遗传因素引起。常见致聋基因有GJB2、SLC26A4、线粒体DNA12SrRNA、GJB3基因，不同基因的遗传方式不尽相同。
耳聋基因检测的意义重大：①明确先天性遗传性聋的病因，提高耳聋干预的依从性；②早期发现迟发性耳聋，达到早期干预和预防听力下降的目的；③发现药物性耳聋易感人群，预防耳聋的发生；④进行遗传咨询和婚育指导，减少聋儿出生，减轻家庭和社会负担。
现有的耳聋易感基因突变检测方法有：荧光PCR法、基因芯片法、ARMS-PCR法、高通量测序法和Sanger测序法。荧光PCR法可以快速检测，成本低，无须特殊设备，可避免污染，但是位点少，需后续检测；基因芯片法检测位点多，但是需要特殊设备，成本高；ARMS-PCR法成本低，但是检测操作繁琐，需要跑电泳，覆盖的位点少，需要后续检测；高通量测序法，检测能发现其他突变，但是需要特殊设备，成本高，后续数据分析时间长，更适用于需要一次性对于全基因组进行检测；Sanger测序法是金标准，成本低，技术要求低，适用于临床大批量样本的检测，但是由于Sanger测序读长有限，一个测序反应只能检测800bp，左右，通常只能检测一个位点，每检测一个位点需要进行一次PCR反应。
因此急需一种新的适用检测于临床易感基因突变的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中Sanger测序法一个测序反应只通常只能检测一个突变位点，每检测一个位点需要进行一次PCR反应的不足，提供一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因突变位点的方法。
本发明的第一个目的是提供一个检测耳聋易感相关基因突变的引物组合。
本发明的第二个目的是提供所述引物组合在检测耳聋易感相关基因突变的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一个检测耳聋易感相关基因突变的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一个检测耳聋易感相关基因突变的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～26所示。
所述耳聋易感相关基因为GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体DNA和GJB3基因。
具体序列及对应的扩增片段和检测位点如表1所示。
表1：
以上所述引物组合在检测耳聋易感相关基因突变的试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
一个检测耳聋易感相关基因突变的试剂盒，包括以上所述引物组合。
优选地，所述试剂盒的检测体系由五个独立的PCR体系组成，分别使用引物混合物1～5：
引物混合物1包括核苷酸如SEQ ID No.1～6所示引物；
引物混合物2包括核苷酸如SEQ ID No.7～12所示引物；
引物混合物3包括核苷酸如SEQ ID No.13～18所示引物；
引物混合物4包括核苷酸如SEQ ID No.19～22所示引物；
引物混合物5包括核苷酸如SEQ ID No.23～26所示引物。
优选地，还包括PCR反应的试剂、以上所述引物组合的扩增产物的Sanger测序的PCR引物和Sanger测序的试剂。
优选地，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ ID No.27～28所示。
SP4-F(SEQ ID No.27)GCATGCTGTACTCCATCAAC；
SP4-R(SEQ ID No.28)GATCGTCAGTGAGCAACACATC。
优选地，所述PCR反应的试剂为：GeneAmpTM 10×PCRBufferI、25mM Mg2+、25mMdNTPs、RocheTaq酶、H2O。
优选地，所述PCR反应的体系为：GeneAmpTM 10×PCR Buffer I 3μl，25mM Mg2+2.5μl，25mM dNTPs 0.3μl，每条引物各1μl，Roche Taq酶0.5μl，模板1μl，H2O补足至25μl。
优选地，所述PCR反应的程序为：95℃9min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，58℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min；16℃∞。
优选地，所述Sanger测序的试剂为BigDye Terminator v3.1 Cycle SequencingKit。
更优选地，所述Sanger测序的PCR反应的体系为：BigDye 0.5μl；5×seq Buffer1.75μl；引物各1μl；模板1μl；水补足10μl。
优选地，所述Sanger测序的PCR反应的程序为：96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环；4℃∞。
最优选地，一个检测耳聋易感相关基因的试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ IDNo.1～26所示的引物组合、核苷酸序列如SEQ ID No.27～28所示的测序引物、PCR反应的试剂和Sanger测序的试剂，其中PCR反应的试剂包括：GeneAmp TM 10×PCR Buffer I、25mMMg2+、25mM dNTPs、Roche Taq酶、H2O；Sanger测序的试剂为BigDye Terminator v3.1 CycleSequencing Kit。
本试剂盒是使用方法为，包括以下步骤：
S1.采集EDTA抗凝血或血斑卡样本；
S2.提取DNA；
S3.使用核苷酸序列如SEQ ID No.1～26所示的引物组合进行PCR反应，
PCR反应的体系25μl，具体组成如下：
PCR反应的程序如下：
S4.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收
用2％(W/V)的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为120V，20min，回收目的片段；
S5.使用核苷酸序列如SEQ ID No.27～28所示的测序引物进行Sanger测序。
优选地，采用BigDye Terminator试剂盒进行测序PCR，将测序PCR产物用酒精纯化，加入Hi-Di甲酰胺，上样，按照ABI3500XLDx的仪器说明书进行设置开始运行程序，结果下机后进行分析。
优选地，所述Sanger测序的试剂为BigDye Terminator v3.1 Cycle SequencingKit
其中，测序PCR反应的体系为10μl，具体体系如下：
测序PCR反应的程序如下：
本检测方法主要是根据四个耳聋易感基因分别设计特异性引物，分别用重叠延伸PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在35～45个碱基之间，无特殊修饰。反应的PCR反应的体系采用独特的配方及比例，使不同基因位点的PCR扩增条件一致。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
通过本发明建立的检测方法，利用重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因，仅需要5个PCR反应和测序反应，大幅度减少PCR反应数和测序反应数，可以检测GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体DNA和GJB3基因的主要43个突变位点，并可以发现扩增片段中新的变异位点。所以此检测技术应用于耳聋易感基因突变检测具有重要的临床意义，不仅简化操作步骤，降低检测成本，而且提高检测效率，值得大力推广。
附图说明
图1为四个耳聋易感基因搭接PCR5个反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果；1～5表示各引物组合扩增后电泳检测结果，下方数字为扩增片段大小；M表示DNA maker(DL1000 DNAmarker，片段大小从上至下依次为：1000bp、700bp、500bp、300bp、200bp、100bp)。
图2为PCR反应1的测序结果峰图。
图3为PCR反应1的测序结果比对图截图(方框内为搭接反应1检测的第一个和最后一个位点)。
图4为PCR反应2的测序结果峰图。
图5为PCR反应2的测序结果比对图截图(方框内为搭接反应2检测的第一个和最后一个位点)。
图6为PCR反应3的测序结果峰图。
图7为PCR反应3的测序结果比对图截图(方框内为搭接反应3检测的第一个和最后一个位点)。
图8为PCR反应4的测序结果峰图。
图9为PCR反应4的测序结果比对图截图(方框内为搭接反应4检测的第一个和最后一个位点)。
图10为PCR反应5的测序结果峰图。
图11为PCR反应5的测序结果比对图截图(方框内为搭接反应5检测的第一个和最后一个位点)。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一个基于Sanger测序法的检测耳聋相关基因的试剂盒
一、组成
核苷酸序列如SEQ ID No.1～26所示的引物组合、核苷酸序列如SEQ ID No.27～28所示的测序引物和PCR反应的试剂，其中PCR反应的试剂包括：GeneAmpTM 10×PCRBufferI(ABITM 4379876)、25mM Mg2+、25mM dNTPs、Primers、Roche Taq酶(货号：03501221190)、H2O；Sanger测序的试剂为BigDye Terminator v3.1 Cycle SequencingKit(包括：BigDye，5×seq Buffer)。
二、使用方法
S1.采集EDTA抗凝全血样本；
S2.过柱法提取DNA；
S3.PCR反应，共有五个独立的PCR体系，分别使用引物混合物1～5：
引物混合物1包括核苷酸如SEQ ID No.1～6所示引物；
引物混合物2包括核苷酸如SEQ ID No.7～12所示引物；
引物混合物3包括核苷酸如SEQ ID No.13～18所示引物；
引物混合物4包括核苷酸如SEQ ID No.19～22所示引物；
引物混合物5包括核苷酸如SEQ ID No.23～26所示引物。
PCR反应的体系如下：
每个独立的PCR反应体系均加入相应的引物组合物，每个引物1μl。
PCR反应的程序如下：
S4.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收
用2％(W/V)的琼脂糖凝胶进行电泳；电泳条件为120V，20min，采用商品化的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段；
S5.Sanger测序
使用核苷酸序列如SEQ ID No.27～28所示的测序引物进行Sanger测序，采用BigDye Terminator试剂盒进行测序PCR，将测序PCR产物用酒精纯化，加入Hi-Di甲酰胺，上样，按照ABI 3500XL Dx的仪器说明书进行设置开始运行程序，结果下机后进行分析，
其中，Sanger测序的PCR反应的体系如下
Sanger测序的PCR反应的程序如下：
实施例2耳聋相关基因突变位点的检测
一、实验方法
利用实施例1中的一个基于Sanger测序法的检测耳聋相关突变位点的试剂盒对一个已知阳性样本血液进行检测，得到DNA，样本浓度为32ng/μl。
已知阳性样本的突变情况与引物及引物混合对应关系如表2到表6：
表2：
表3：
表4：
表5：
表6：
二、实验结果
结果如图1到11所示，所检测43个位点均能成功覆盖及检测。并对同个样本进行各单个位点进行单独的片段测序，各位点均与搭接结果为相同结果。
实施例3
一、实验方法
利用实施例1中的一个基于重叠延伸PCR的Sanger测序法的检测耳聋易感相关四个基因常见位点(共5个反应)，通过对20例已知结果样本的检测，并与普通PCR的单个位点Sanger测序法对耳聋易感相关四个基因常见位点(共13个反应)进行实验结果对比，确定一致性。
二、实验结果
序列表
<110> 广州凯普医药科技有限公司
广州凯普医学检验所有限公司
广州凯普生物科技有限公司
<120> 一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因突变的方法
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatgctcta ctccatcaac agaaacacgg ggaccag 37
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagtacgaa ccagacgg 18
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtctgcatgt tactcattgt tctcggagat gctg 34
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acttttggta ctgacactgc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtgtcagta ggaaatgagt tcagcattat ttggttgac 39
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
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gatcgtcagt gagcaacaca tctaagagga acaccacact ca 42
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
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ctgcatgctc tactggatca taccagaaaa ctacgatagc c 41
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cactttccct tacacttacc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 41
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgcatgctc tactggatcg ccggcaatag aatgagactc tgt 43
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctcttgcta tttcacttgg t 21
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
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<400> 15
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<210> 16
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<212> DNA
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tggtaaggtt ctggcattct ccagtctctt ccttaggaat 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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ctgcatgctc tactgagtca actgtgttgt gtgcattcgt c 41
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ctctttactt cccccttga 19
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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aggaaagcag ggttatacct 20
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
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aggtataacc ctgagtctct tatgggcaga taaggttgtt 40
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcatgctgta ctccatcaac 20
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gatcgtcagt gagcaacaca tc 22
Claims (9)
1.一个检测耳聋易感相关基因突变的引物组合，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1～26所示。
2.权利要求1所述引物组合在制备检测耳聋易感相关基因突变的试剂盒中的应用。
3.一个检测耳聋易感相关基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物组合。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测体系由五个独立的PCR体系组成，分别使用引物混合物1～5：
引物混合物1包括核苷酸如SEQ ID No.1～6所示引物；
引物混合物2包括核苷酸如SEQ ID No.7～12所示引物；
引物混合物3包括核苷酸如SEQ ID No.13～18所示引物；
引物混合物4包括核苷酸如SEQ ID No.19～22所示引物；
引物混合物5包括核苷酸如SEQ ID No.23～26所示引物。
5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应的试剂、权利要求1所述引物组合的扩增产物的Sanger测序的PCR引物和Sanger测序的试剂。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述Sanger测序的PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID No.27～28所示。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述PCR反应的试剂为：
10×GeneAmpTM10×PCR Buffer I、25mM Mg2+、25mM dNTPs、Roche Taq酶、H2O。
8.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述PCR反应的体系为：GeneAmpTM10×PCRBufferI 3μl，25mM Mg2+2.5μl，25mM dNTPs 0.3μl，每条引物各1μl，Roche Taq酶0.5μl，模板1μl，H2O补足至25μl。
9.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述PCR反应的程序为：95℃9min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，58℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min；16℃∞。
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| CN109777867A (zh) | 2019-05-21 |
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