JP2005514956A - 胎児ｄｎａの検出および対立遺伝子の定量化のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、母親のDNAから胎児のDNAを識別し、それにより、胎児の異数性および対立遺伝子を検出するための非侵襲性方法を提供する。本発明の方法は、母親の血清から胎児のDNAの単離、および異なるメチル化を示す母親と胎児のDNA間に一次配列の相違を引き起こす試薬での処理を必要とする。定量的PCRを含む様々な方法が、胎児の異数性および対立遺伝子を同定かつ検出するために用いられる。一つの態様において、本発明の方法は、成人を含む被験体においてインプリンティング遺伝子を同定するために有用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. 119(e)による、2002年1月18日に出願された米国仮出願第60/349,877号の優先権を主張し、その内容は、本開示へと参照として本明細書に組み入れられている。

技術分野
本発明は、分子生物学および遺伝学の分野に関し、染色体異常および変異の出生前検出のための方法を提供する。

背景
出生前検査は、染色体異常および他の疾患関連変異を含む、様々な重大な遺伝的問題を同定することができる。典型的には、そのような検査は、例えば、羊水穿刺、絨毛生検、または胎児血液試料採取を含む侵襲性方法を用いて得られた胎児細胞の試料について行われる。その後、これらの細胞内の染色体は、染色体異数性のような総体的な異常を検出する染色体特異的蛍光プローブを用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)で核型を調べるような細胞発生方法により、分析される。または、疾患関連遺伝子における点変異のような特定の遺伝的欠陥は、一塩基多型(SNP)および他の小さな変異を同定するように設計された分子分析により検出されうる。どちらの場合においても、これらの胎児細胞試料を得るために必要とされる侵襲性方法は、母親または胎児を傷つけるという内在するリスクを持ち込み、かつ流産を引き起こしうるため、決して理想であるとは言えない。

非侵襲性出生前遺伝的スクリーニングの開発は、出生前健康管理における、まだ対処されていない大きな要求を満たすものと思われる。実質的努力、投資およびいくつかの最前線における技術的進歩にもかかわらず、出生前診断のための頑強な検査プラットフォームの開発を妨げている重大な難題が存在する。少数の胎児細胞は、胎盤を通過して、血液の1 mLあたり1〜2000個の胎児細胞の範囲の推定値で母親の血液において循環していることが知られている(SenyeiおよびWasserman (1993) Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 20(3):583-598)。完全な遺伝子相補体を含む胎児の有核赤血球(NRBC)は、母親の細胞と比較的異なり、有限の寿命を有する。FISHおよびPCR基盤技術を使用するアッセイ法は、遺伝的評価について信頼性をもって十分な数の胎児細胞を実証する能力が科学界全般により示されていないが、そのような臨床的細胞試料についての診断情報を提供してきた(Bianchi (1997) Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 9(2):121-125)。この不一致は、プラットフォーム開発における技術的向上、特に、バイオイメージング、胎児グロビンの免疫細胞化学、およびFISHと対照して目立つ。例えば、Poon, L.L.M.ら、(2000) Lancet 356:1819-1820は、母親の血漿試料のFISH分析が、トリソミー21(ダウン症候群)により冒された胎児を示す3つの第21染色体シグナルを有する胎児細胞を同定することができることを報告している。

最近の報告は、母親の血清または血漿が、PCR測定に基づく胎児DNAの比較的豊富な供給源でありうることを指摘している。胎児DNAは、早くも7週間で母親の血清において一貫して検出することができ、妊娠期間中豊富に増加し、分娩後2ヶ月目はできないが、1ヶ月目は検出可能である。〜100例中、PCRにより測定される場合の血漿における最低の胎児DNA濃度は、母親の血液1 mLあたり20個より多い胎児細胞相当量であり、いくつかの例では、胎児DNAが血漿における全DNAの5 %ほどを構成していた。この型の胎児供給源は、増幅工程が胎児特異的に行われうる場合、または胎児単位複製配列が、追加的段階により母親の単位複製配列から識別されうる場合には、PCRに基づく遺伝的検査を可能にすることができる。そのような検査は、非侵襲性で、実施が容易で、かつ再現性があるため、胎児の遺伝的欠陥を検出するための現行の方法において価値のある向上を与えるものと思われる。本発明は、そのような分析を行うための方法を提供する。

発明の説明
本発明は、胎児の対立遺伝子および異数性を検出するためのいくつかの非侵襲性方法を提供する。まず、DNAは、母親の血清から単離され、メチル化DNAおよび非メチル化DNAを区別をして改変する試薬、例えば、亜硫酸水素塩で処理される。DNAは、定量的PCRおよび異常の可能性のある染色体上の標的配列を増幅するように選択されたプライマーを用いて増幅される。第二のあらかじめ選択されたプライマーでの対照定量的PCRは、非トリソミーの染色体上で行われ、2つのPCR産物の量の比率が測定され、それにより、胎児異数性を検出する。

代替の態様において、本発明は、母親の血清から単離された亜硫酸水素塩処理のDNAについて定量的PCRを行うことにより胎児染色体異数性を検出する方法を提供する。定量的PCRは、母親DNAおいておよび胎児DNAにおいて異なってメチル化されている検査染色体配列に相同的なプライマー対を用いて、試料について行われ、プライマー対は、亜硫酸水素塩処理された非メチル化DNAをプライミングするのみである。「対照」定量的PCRは、母親DNAにおいておよび胎児DNAにおいて異なってメチル化されている対照染色体配列に相同的なプライマー対を用い、プライマー対は、亜硫酸水素塩処理された非メチル化DNAをプライミングするのみである。対照染色体と比較された、検査染色体について産生されたPCR産物の量の比率が測定され、それにより胎児異数性を検出する。

さらなる局面において、胎児DNAの対立遺伝子は、母親の血清から単離されたDNAを亜硫酸水素塩で処理することにより検出されうる。PCRは、対象となる遺伝子が亜硫酸水素塩処理により改変されている場合のそれを増幅するプライマー対を用いて行われ、対立遺伝子を同定するためにPCR産物を分析する。分析は、当技術分野において公知の方法、例えば、DNA配列法(MaxamおよびGilbert (1980) Methods in Enzymology 65(pt 1):497ならびにSangerら、(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)、DNAマイクロアレイ法(E.M. Sothern (1996) Tr. Genetics 12(3):110-115; Southern, E.M.ら、(1999) Nature Genetics, Supp. 21:5-9;およびHacia, J.G. (1999) Nature Genetics, Supp. (1999) 21:42-47)、SSCP法(Deanら、(1990) Cell 61:863;GlavacおよびDean (1993) Hum. Mutation 2:404;ならびにPodusloら、(1992) Am. J. Hum. Genet. 49:106)およびLAMP法(米国特許第6,297,010号)により行われうる。

さらに、本発明により、被験体から単離されたDNAを亜硫酸水素塩で処理し、かつ亜硫酸水素塩処理された非メチル化DNAを増幅するのみである多型領域についてのプライマー対を用いてPCRを行うことにより、被験体(胎児に限定されない)においてインプリンティング遺伝子を検出するための非侵襲性方法が提供される。PCR産物は、多型を同定するために分析される。分析は、当技術分野において公知の方法、例えば、DNA配列法、DNAマイクロアレイ法、SSCP法、LAMP法により行われうる。

発明を実施するための形態
本開示を通して、様々な刊行物、特許および公開特許明細書は、識別引用により参照されている。これらの刊行物、特許および公開特許明細書は、本発明が属する技術分野の状態をより完全に記載するために、参照として本明細書により本開示へ組み入れられている。

一般的技術
本発明の実施は、他に規定がない限り、当技術分野の技術内である、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の通常の技術を使用する。そのような技術は、「MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION」(Sambrookら、1989)；「CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」(F.M. Ausubelら編、1987)；「OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS」(M.J. Gait編、1984); 「ANNUL CELL CULTURE」(R.I. Freshney編、1987)；「METHODS IN ENZYMOLOGY」(Academic Press, Inc.)；「HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY」(D.M. Wei &C.C. Blackwell編); 「GENE TRANSFER VECTORS FOR SIAN CELLS」 (J.M. Miller &M.P. Calos編、1987) ;「PCR:THE POLYMERASE CHAIN REACTION」(Mullisら編、1994);「CURRENT PROTOCOLS IN PENOLOGY」(J.E. Coliganら編、1991)；「ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL」 (E. HarlowおよびD. Laneら編、1988)；ならびに「PCR 2: A PRACTICAL APPROACH」(M.J. MacPherson、B.D. Hames、およびG.R. Taylor編、1995)のような文献に完全に説明されている。

定義
本明細書に用いられる場合、ある特定の用語は、以下の定義された意味をもちうる。

本明細書および特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかに別に指示していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「一つの細胞(a cell)」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。

本明細書に用いられる場合、「含む(comprising)」という用語は、組成物および方法が列挙されている要素を含むが、他のものを排除しないことを意味するものとする。組成物および方法を定義するために用いられる場合の「から本質的になる(consisting essentially of)」とは、その組み合わせに対して少しでも本質的な有意性をもつ他の要素を排除することを意味するものとする。このように、本明細書に定義されている要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量混入物、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、保存料などのような薬学的に許容される担体を排除しないことになる。「からなる(consisting of)」とは、他の成分の微量より多い要素、および本発明の組成物を施すための実質的な方法段階を排除することを意味するものとする。これらの変化用語のそれぞれにより定義される態様は、本発明の範囲内である。

「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合体形を指すために互換的に用いられる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはそれらの類似体を含みうる。ヌクレオチドは、任意の三次元構造をもってもよく、既知または未知の任意の機能を果たしうる。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、一本鎖、二本鎖および三本鎖ヘリックスの分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、ならびにプライマーを含む。核酸分子はまた、改変された核酸分子も含みうる。

「ハイブリダイゼーション」とは、1つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン-クリック型塩基対形成、フーグスティーン（Hoogstein）型結合により、または任意の他の配列特異的様式で生じうる。複合体は、二重鎖構造を形成する2つの鎖、多重鎖複合体を形成する3つもしくはそれ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズしている鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、PCR反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のようなより広範な過程において段階を構成しうる。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には以下のものが含まれる：約25℃〜約37℃のインキュベーション温度；約6 X SSC〜約10 X SSCのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約0 %〜約25 %のホルムアミド濃度；および約6 X SSCの洗浄溶液。中程度のハイブリダイゼーションの例には以下のものが含まれる：約40℃〜約50℃のインキュベーション温度；約9 X SSC〜約2 X SSCの緩衝液濃度；約30 %〜約50 %のホルムアミド濃度；および約5 X SSC〜約2 X SSCの洗浄溶液。高ストリンジェントな条件の例には以下のものが含まれる：約55℃〜約68℃のインキュベーション温度；約1 X SSC〜約0.1 X SSCの緩衝液濃度；約55 %〜約75 %のホルムアミド濃度；および約1 X SSC、0.1 X SSCまたは脱イオン水の洗浄溶液。一般的に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、1回、2回またはそれ以上の洗浄段階と共に、5分間から24時間までであり、洗浄インキュベーション時間は、約1分、2分または15分間である。SSCは、0.15 M NaClおよび15 mM クエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を用いるSSCの等価物が使用されうることは、理解されている。

「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片が、天然において通常、付随している細胞およびその他の構成要素から分離されることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されたポリヌクレオチドは、それが染色体において通常、付随している5'および3'配列から分離されているものである。当業者にとって明らかであるが、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片は、それをそれの天然に存在する対応物から区別するために「単離」の必要はない。さらに、「濃縮された」、「分離された」もしくは「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、濃度または容量あたりの分子の数が、それの天然に存在する対応物のそれより「濃縮された」ものより多い、または「分離された」ものより少ない点において、それの天然に存在する対応物と区別できる。一次配列において、もしくは例えば、グリコシル化パターンにより、天然に存在する対応物と異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片は、それの一次配列により、またはグリコシル化パターンのような別の特徴により、それがそれの天然に存在する対応物から区別できるため、それの単離された形で存在する必要はない。本明細書に開示された本発明のそれぞれについて明確に述べられていないが、下記に開示されている組成物のそれぞれについての、適切な条件下における、上記の態様のすべてが、本発明により提供されていることは、理解されるべきである。このように、天然に存在しないポリヌクレオチドは、単離された天然に存在するポリヌクレオチドとは別々の態様として提供される。細菌細胞において産生されたタンパク質は、それが天然において産生される真核細胞から単離された天然に存在するタンパク質とは別々の態様として提供される。

「染色体異常(chromosomal abnormalities)」および「染色体異常(chromosomal aberrations)」という用語は、異常的または病理学的表現型を生じさせる染色体における数的および構造的変化を指すために互換的に用いられる。染色体異常は、いくつかの型、例えば、特に、余分または欠損の個々の染色体、余分または欠損の染色体部分(分節の重複または欠失)、切断、環および再編成からなりうる。

数的変化は、染色体異数性を含む。「異数性」という用語は、不均衡な染色体相補体へと導く、正常な倍数の染色体数より少なくとも1本多いまたは1本少ない染色体の発生を指す。染色体異数性は、多数の遺伝的疾患および変性疾患と関連している。よくある異数性状態の例には、ダウン症候群(トリソミー21)、エドワード症候群(トリソミー18)、パトー症候群(トリソミー13)、X染色体の欠損に関連したターナー症候群(X0)、余分のX染色体に関連したクラインフェルター症候群(XXY)、XYY症候群、トリプルX症候群などを含む。

「抗原」という用語は、当技術分野においてよく理解されており、免疫原性である物質、すなわち、免疫原、および免疫学的不反応性、またはアネルギーを引き起こす物質、すなわち、アネルゲンを含む。

「被験体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、限定されるものではないが、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物およびペットを含む。

「組成物」は、活性物質、および不活性の(例えば、検出可能薬剤または標識)もしくはアジュバントのような活性のある別の化合物または組成物の組み合わせを意味するものとする。

「薬学的組成物」は、インビトロ、インビボもしくはエキソビボでの診断的または治療的使用に適した組成物を作製する、不活性または活性のある担体と活性薬剤の組み合わせを含むものとする。

本明細書に用いられる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、ならびに油/水または水/油乳剤のような乳剤、および様々な型の湿潤剤のような標準的薬学的担体のいずれかを含む。組成物はまた、安定化剤および保存料を含みうる。担体、安定化剤およびアジュバントの例については、Martin REMINGTON'S PHARM. SCI.、第15版(Mack Publ. Co., Easton (1975))を参照されたい。

「有効量」とは、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与、適用、または投薬において施されうる。

本発明は、胎児異数性を検出するための非侵襲性方法を提供する。まず、DNAが母親の血清から単離され、メチル化および非メチル化DNAを区別して改変する試薬、例えば、亜硫酸水素塩で処理される。

一般的に、胎児DNAは、発生の初期に発現される特定の遺伝子の転写サイレシングを反映している成人DNAと比較して低メチル化である。胎児特異的PCR産物を生じることの一つの方法は、胎児DNAにおいてメチル化されておらず、かつ成人/母親DNAにおいてメチル化されている遺伝子座を同定することである。胎児特異的DNAを検出するためのもう一つの方法は、胎児DNAにおいてメチル化されており、かつ成人/母親DNAにおいてメチル化されていない遺伝子座を同定することである。この型の遺伝子座は、亜硫酸水素塩に異なった反応を示し、DNAにおける非メチル化Cは、酸化脱アミノを受け、結果としてCからUへの移行を生じる。メチル化Cは、亜硫酸水素塩に反応せず、従って、変化を受けない。母親の血清に存在する胎児および母親のDNAの亜硫酸水素塩処理は、異なるメチル化を示している胎児および母親の遺伝子座の間に一次配列の相違を生じると考えられる。DNAは、定量的PCRおよび異常の可能性のある染色体上における配列を増幅するように選択されたプライマーを用いて増幅される。第二のあらかじめ選択されたプライマーでの対照定量的PCRは、正常または対照染色体(すなわち、疑わしい異常をもたない染色体)上で行われ、2つのPCR産物の量の比率を測定し、それにより、胎児異数性を検出する。対象となる遺伝子座が第13、第18または第21染色体由来である場合には、定量的PCRストラテジー、例えば、リアルタイムPCRが用いられ、染色体コピー数が測定されうる。同様に、遺伝子座がまた、両方の対立遺伝子が識別されうるほど高度に多型である場合には、染色体異数性は容易に明らかにすることができる。

代替の態様において、本発明は、母親の血清から単離されたDNAを亜硫酸水素塩で処理し、その後、母親DNAにおいておよび胎児DNAにおいて異なってメチル化されている検査染色体配列に相同的なプライマー対を用いて試料上で定量的PCRを行うことにより、胎児染色体異数性を検出する方法であって、そのプライマー対が亜硫酸水素塩処理された非メチル化DNAをプライミングするのみである方法を提供する。「対照」定量的PCRは、母親DNAにおいておよび胎児DNAにおいて異なってメチル化されている対照染色体配列に相同的なプライマー対で行われ、そのプライマー対は、亜硫酸水素塩処理された非メチル化DNAをプライミングするのみである。検査染色体について産生されたPCR産物の量の比率は、対照染色体と比較され、それにより、胎児異数性を検出する。

別のグループ(Poonら、(2002) Clin. Chem. 48(1):35-45)は、本発明とは全く異なる方法を提案した。Poonらの文献における著者らは、インプリンティング遺伝子座に頼っており、メチル化状態が、対立遺伝子が母親または父親から受け継がれているかどうかに依存している。これは、起源の親に依存していない、胎児対成人のメチル化におけるより全般的な相違を活用している本発明とは全く異なる。本発明の利点は、それが、すべての胎児対立遺伝子が分析されることを可能にすることであり、Poonら、(2002)前記の著者らにより企図されてはいない。

定量的PCRを行うためのいくつかの方法は、当技術分野において公知である。そのような例には、限定されるものではないが、ABI PRISM（登録商標)7700配列検出システム(Applied Biosystems、フォスターシティー、CA)で測定される蛍光プローブの使用、放射性標識ヌクレオチドでの一塩基伸長、または一塩基伸長後の質量分析法を含む。

さらなる局面において、胎児DNAの対立遺伝子は、母親の血清から単離されたDNAを亜硫酸水素塩で処理することにより検出されうる。PCRは、亜硫酸水素塩処理により改変された対象となる遺伝子を増幅するプライマー対で行われ、対立遺伝子を同定するためにPCR産物を分析する。例えば、米国特許第5,786,146号を参照されたい。分析は、当技術分野において公知の方法、例えば、DNA配列法、DNAマイクロアレイ法、SSCP法、LAMP法により行うことができる。

特定の例には、限定されるものではないが、αフェトプロテイン、グロビン、鎌状赤血球貧血、β-地中海貧血症、ダウン症候群、RhD病、デュシェンヌ病、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、およびゴーシェ症候群を含む変異対立遺伝子を含む。

さらに、本発明により、被験体から単離されたDNAを亜硫酸水素塩で処理し、亜硫酸水素塩処理された非メチル化DNAを増幅するのみである多型領域についてのプライマー対でPCRを行うことにより、被験体(胎児に限定されない)におけるインプリンティング遺伝子についての非侵襲性方法が提供される。PCR産物は、多型を同定するために分析される。分析は、当技術分野において公知の方法、例えば、DNA配列法、DNAマイクロアレイ法、SSCP法、LAMP法により行うことができる。

以下の実施例は、例示するものであり、本発明を限定するものではない。

実施例
材料および方法
母親の血液から胎児DNAの分離
血漿分離プロトコール：母親の血液を、ACDA血液収集管(Becton Dickinson、フランクリンレイクス、NJ)または他の適当な収集管へ収集する。血液を新しいラベルを貼った15 mlの円錐形管へ移し、600 x gで10分間、遠心分離する。赤血球ペレットより上の透明な血漿を10 mlのピペットを用いて取り出し、別の新しいラベルを貼った15 mlの円錐形管へ移す。血漿を1500 x gで10分間、遠心分離し、新しいラベルを貼った円錐形管へ移し、DNA単離まで-80℃で保存する。

DNA単離プロトコール：DNAを市販のQIAamp(登録商標)DNA血液ミニキット(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を用いて単離することができる。キットは、以下の試薬を供給する：緩衝液AL(溶解)、緩衝液AW1およびAW2(洗浄緩衝液)、ならびに緩衝液AE(溶出)。手順を実行する前に、以下の予備段階が必要とされる：1)室温に試料を平衡化する；2)室温でプロテイナーゼKを解凍する；3)WPCR加熱ブロックのスイッチを入れて56℃にする；4)緩衝液AW1および緩衝液AW2を平衡化し、緩衝液ALに沈殿が形成されている場合には、70℃でインキュベートすることにより溶解する。すべての遠心分離段階は、室温で行われる。

約20 μlのRNA分解酵素A(100 mg/ml)を1.5 mlのマイクロ遠心分離管の底へ添加する。約200 μlの血漿試料をマイクロ遠心分離管へ添加し、上下にピペッティングすることによりよく混合する。試料容量が200 μl未満である場合には、適切な量のPBSを添加して200 μlにする。試料容量が200 μlより多い場合には、それぞれにおいて200 μl試料の複数の管に調製する。カラムを連続的に充填し、取っておく。

20 μlの20 mg/ml プロテイナーゼKを添加し、上下にピペッティングすることによりよく混合する。その後、200 μlの緩衝液ALを試料へ添加し、50秒間、パルス-ボルテックスすることにより徹底的に混合する。その後、試料を56℃で10分間、インキュベートする。蓋の内側から滴を除去するために1.5 mlのマイクロ遠心分離管を短時間だけ遠心分離する。200 μlの100 % エタノールを試料に添加し、15秒間、パルス-ボルテックスすることにより混合する。混合後、蓋の内側から滴を除去するために試料を遠心分離する。

この混合物を、縁をぬらすことなく2 mlの収集管における充填されたカラム(上記参照)へ添加する。管を6000 x g(8000 rpm)で1分間、遠心分離する。スピンカラムを新しい2 mlの収集管に置く。6000 x g(8000 rpm)での遠心分離は、ほとんどの血漿をカラムを通して引っ張るのに十分である。その後、500 μl 緩衝液AW1を縁をぬらすことなく添加し、20,000 x g(14000 rpm)で3分間、遠心分離する。スピンカラムを新しい2 mlの収集管に置き、最高速度で再び、回転させる。

その後、スピンカラムを新しいラベルを貼った1.5 mlのマイクロ遠心分離管に置き、50 μlの56℃の緩衝液AEをカラムの中心へ添加し、その後、56℃で(加熱ブロック)で5分間、インキュベートする。インキュベーション後、カラムを6000 x g(8000 rpm)で1分間、遠心分離する。

上記のように、さらにもう50 μlの56℃の緩衝液AEをカラムの中心へ添加し、インキュベーションおよび遠心分離を繰り返す。

DNAの亜硫酸水素塩処理
プロトコールA：試料DNAを剪断する、または制限酵素で消化する(1 μg未満のDNAを使用する場合には、1 μgの酵母tRNAまたは1 μgのサケ精子DNAを担体として使用することができる)。DNAを0.3 M NaOHで15分間、37℃で変性させ、その後、5.36 M 尿素、3.44 M 亜硫酸水素ナトリウム、および0.5 mM ヒドロキノン(NaOHでpH 5.0に調整されている)で、15時間、55℃で改変する。試料は、インキュベーションの間、100 μlのミネラルオイルで表面を覆われている。改変されたDNAを製造会社の使用説明書に従って、Wizard(登録商標)DNAクリーンアップキット(Promega、マディソン、WI)で脱塩する。DNAを50 μlのTEに溶出する。脱塩された改変DNAを0.3 M NaOHと15分間、37℃でインキュベートすることにより、遊離の亜硫酸水素塩を除去する。NH₄OAc、pH 7.0を3 Mまで添加することにより、試料を中和する。DNAをエタノール沈殿させ、100 μl TEに再懸濁する。-20℃で保存する。

プロトコールB：新鮮な4 M 亜硫酸水素ナトリウムおよび100 mM ヒドロキノンを調製する。亜硫酸水素ナトリウムは、1.6 g 亜硫酸水素ナトリウムを3 ml HPLC H₂O中に添加することにより調製される。約160 μlの5 M NaOHでpH 5に調整する。全容量を4 mlへ調整する。ヒドロキノンは、0.11 gを9 mlに添加することにより調製される(100 mMとして)。NaOHでpH 5に調整する。全容量を10 mlへ調整する。

剪断されていないDNAを95℃で5分間、変性させる。(1 μg未満のDNAを使用する場合には、1 μgのサケ精子DNAを担体として使用することができる)。DNA試料を氷上に置き、すばやく遠心分離する。5 M NaOHを試料に、100 μlの全容量において0.3 Mの最終濃度まで添加し、37℃で30分間、インキュベートする。

その後、4 M 亜硫酸水素ナトリウムおよび100 mM ヒドロキノンを、pH 5で、500 μlの全容量において、それぞれ、3.1 Mおよび0.5 mMの最終濃度まで添加する。その後、試料を100 μlのミネラルオイルで表面を覆い、55℃で16時間、インキュベートする。

試料を製造会社の使用説明書に従って、Wizard(登録商標)クリーンアップキット(Promega、マディソン、WI)で脱塩する(すなわち、100 μlに溶出し、約96 μlを生じる)。5 M NaOHを、100 μlの全容量における0.3 Mの最終濃度まで添加し、その後、試料を37℃で15分間、インキュベートする。

DNAを60 μlの10 M NH₄OAc(最終濃度約3 M)および40 μl HPLC H₂Oで中和する。DNAを、800 μlの冷たい96 % エタノールを添加することにより沈殿させ、-20℃で30分間、保存する；および14,000 x g、4℃で30分間、遠心分離する；上清を除去し、ペレットを70 % 冷たいエタノールに再懸濁させ、4℃で30分間、再遠心分離する。70 % エタノール洗浄を繰り返し、すべての残留するエタノールを除去する。

DNAを25 μlの0.1 X TEに再懸濁する。

プロトコールC：新鮮な4 M 亜硫酸水素ナトリウムおよび100 mM ヒドロキノンを調製する。亜硫酸水素ナトリウムは、1.6 g 亜硫酸水素ナトリウムを3 ml HPLC H₂O中に添加することにより調製される。約160 μlの5 M NaOHでpH 5に調整する。全容量を4 mlへ調整する。ヒドロキノンは、0.11 gを9 mlに添加することにより調製される(100 mMとして)。NaOHでpH 5に調整する。全容量を10 mlへ調整する。

剪断されていないDNAを95℃で5分間、変性させる。(1 μg未満のDNAを使用する場合には、1 μgのグリコーゲンを担体として添加することができる)。DNAを氷上に置き、すばやく遠心分離する。5 M NaOHを試料に、100 μlの全容量において0.3 Mの最終濃度として添加し、37℃で30分間、インキュベートする。4 M 亜硫酸水素ナトリウムおよび100 mM ヒドロキノンを、pH 5で、500 μlの全容量での最終において、それぞれ、3.1 Mおよび0.5 mMの最終濃度まで添加する。試料を100 μlのミネラルオイルで表面を覆い、55℃で16時間、インキュベートする。

試料を製造会社の使用説明書に従って、QIA(登録商標)クィックPCR精製キット(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)で脱塩する(すなわち、100 μlに溶出し、約96 μlを生じる)。5 M NaOHを、100 μlの全容量における0.3 Mの最終濃度まで添加し、その後、試料を37℃で15分間、インキュベートする。

DNAを60 μlの10 M NH₄OAc(最終濃度約3 M)および40 μl HPLC H₂Oで中和し、製造会社の使用説明書に従って、QIA(登録商標)クィックPCR精製キット(quick PCR purification kit)(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)で精製する。28 μlに溶出し、約25 μlを生じる。

プロトコールD：DNAを製造会社の使用説明書を用いて、CpGenome(商標)DNA改変キット(DNA Modification kit)(Intergen Co.、パーチェイス、NY)を使用して亜硫酸水素塩処理する。簡単には、DNAをNaOHにおいて変性させ、メチル化部位を亜硫酸水素塩およびヒドロキノンの溶液で改変する。DNAを脱塩、精製し、遊離の亜硫酸水素塩を除去するためにアルカリで処理する。酢酸アンモニウムを中和するために添加する。DNAをエタノール沈殿させて精製する。

定量的PCR：この手順は、当技術分野においてよく知られた方法を用いて、例えば、Nuovo, G.J.ら、(1999) J. Histochem. & Cytochem. 47(3):273-279の手順を用いて、達成される。この方法において、任意の標的特異的プライマー対が、ユニバーサルエネルギー移動標識プライマーと組み合わせて用いられる。ユニプライマー(UniPrimer)に基づくインサイチューPCRは、標識ヌクレオチドを用いる場合パラフィン包埋化組織において常に明らかであるDNA修復からのバックグランドについて心配することなく、任意のDNAまたはRNA標識の迅速かつ簡単な検出を可能にする。

代替の手順は、Pertl, B.ら、(1999) Hum. Gen. 98:55-59および(1999) J. Med. Genet. 36:300-303、加えて、Cirigliano, V.ら、(1999) Prenat. Diagn. 19:1099-1103に報告されている。

異数性または疾患遺伝子の検出のためのプライマー配列：いくつかのプライマー配列が、異数性または疾患遺伝子の検出について実証された。Findlay, I.ら、(1998) J. Clin. Pathl: Mol. Pathol. 51:164-167は、ダウン症候群の検出のためのいくつかのプライマーを開示している。Cheung, M-C.ら、(1996) Nature Gen. 14:264-268は、鎌状赤血球貧血およびβ-地中海貧血症の増幅のためのプライマーを開示している。Sekizawa, A.ら、(1996) Neurology 46:1350は、デュシェンヌ病についてのマーカーDNAの増幅のためのいくつかのプライマーを提供している。Sekizawa, A.ら、(1996) Obstet. Gynecol. 87:501は、RhD病についてのマーカーDNAの増幅のためのプライマーを開示している。

実験例
実施例1：亜硫酸水素塩処理および定量的PCR
図1Aは、胎児対立遺伝子検出を同定するための本発明の方法の適用の特定の例を示す。メチル化特異的部位を、他の対立遺伝子、例えば第16染色体(この染色体上における異数性は、初期に致死となるため)において比較する。

図1Bは、胎児対立遺伝子検出を同定するための本発明の方法の適用の特定の例を示す。メチル化特異的部位を、異数性を示している可能性がある他の染色体上の部位と比較する。

実施例2：亜硫酸水素塩処理および定量的一塩基伸長
図2Aは、いくつかの対立遺伝子において異なってメチル化された部位を比較する、本発明の方法の特定の実施例を示す。DNAをビーズのような固体支持体上で捕獲PCRする。フォワードプライマー領域に相補的であり、かつ既知のメチル化システイン(C)に対して1塩基5'側に結合するプローブを添加する。一塩基伸長は、検査染色体(例えば、13、18または21)対妊娠12週間で異数性を示さない染色体(例えば、1または16)上におけるいくつかの異なってメチル化された部位において取り込まれる³²P-ddATPの存在下で行われる。

図2Bは、いくつかの対立遺伝子において異なってメチル化された部位を、亜硫酸水素塩処理および定量的質量分析法を用いて比較する、本発明の方法の特定の実施例を示す。DNAをビーズのような固体支持体上で捕獲PCRする。フォワードプライマー領域に相補的であり、かつ既知のメチル化システイン(C)に対して1塩基5'側に結合するプローブを添加する。一塩基伸長は、³²P-ddATPの存在下において行われる。プローブプライマーを洗浄かつ溶離し、質量分析法により定量化する。同時反応において、他の染色体上の異なってメチル化された部位において伸長されたプローブプライマーの量を定量化する。各プローブプライマーは、異なる染色体上における遺伝子座に特異的であり、プローブプライマーの比率は、お互いに比較して決定される。

実施例3：亜硫酸水素塩処理および半定量的ハイブリダイゼーション
図3は、いくつかの対立遺伝子において異なってメチル化された部位を、亜硫酸水素塩処理および半定量的ハイブリダイゼーションを用いて比較する、本発明の方法の特定の実施例を示す。ハイブリダイゼーションは、ビーズに結合したプローブ上で行われ、各ビーズが各プローブを同定するように特異的に異なって着色されている。そのような分析に有用なハイスループット技術プラットフォームは、当技術分野において知られており、例えば、ミクロスフェアアレイ分析システム、例えば、LabMAP(商標)(Luminex Corp.、オースチン、TX)またはBeadArray(商標)(Illumina、サンディエゴ、CA)を含む。ハイブリダイゼーションを示す蛍光も呈している特定のビーズの量は、色により定量化される。異なってメチル化された部位対他の異なってメチル化された対立遺伝子における全ハイブリダイゼーション事象(同じシステムにおける同時ハイブリダイゼーションにより検出される)の比率は、対立遺伝子の相対的比率、およびこのゆえに、異数性の存在を決定する。

実施例4：ERGメチル化プロフィールの検出
血漿処理：母親、胎児の帯(終結した(terminated)10〜18週目の臍由来)および正常な妊娠していない血液をACDA管に収集し、15 mlの円錐形管へ移し、3000 rpm(1500 x g)で10分間、回転させた。RBCペレットより上の血漿層を収集し、15 mlの円錐形管へ移し、1500 x gで再び回転させ、その後、DNA単離まで-80℃で凍結させた。

DNA抽出/改変：DNAをQIAamp(登録商標)DNA血液ミニキット(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を用いて血漿から抽出した。DNAを、製造会社のプロトコールに従って、CpGenome(商標)改変キット(Modification kit)(Intergen Co.、パーチェイス、NY)を用いて亜硫酸水素塩改変をし、27 μlの最終容量において溶出した。

ネステッド(nested)PCR/クローニング：ダウンの重要な領域(NCBI参照配列番号NM 004449；GenBank配列番号M17254; M21535)内の第21染色体上に位置するヒトERG遺伝子の21の可能性のあるCpG部位を含む396 bp領域に特異的なフランキングプライマーを設計し、標準的条件下におけるPCRに使用した。反応のPCR後精製をQIAquick(登録商標)PCR精製キット(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を用いて行った。その後、ネステッドプライマーを用いて第一次PCR産物をさらに増幅し、その後、その結果生じた産物を精製し、TOPOベクターへクローニング、形質転換させて、寒天上に蒔いた。

プラスミドプレップ/シーケンシング：各試料型についてプレートから最少限25個の陽性コロニーを選び取り、1 X TBにおいて20時間増殖させ、QIAprep(登録商標)96ターボミニキット(Turbo Minikit)(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を用いて、DNAを抽出した。各クローンのダイターミネーターシーケンシングをABI PRISM(登録商標)7700配列検出システム(Applied Biosystems、フォスターシティ、CA)において行った。その結果生じたクロマトグラムを、最終分析として、Sequencher(商標)シーケンシング分析ソフトウェア(Gene Codes Corp.、アナーバー、MI)へエクスポートした。

配列分析：メチル化状態を、本来のCpG部位におけるシトシン(メチル化)またはチミジン(非メチル化)の存在についての配列データを分析することにより測定した。その結果生じたデータは、メチル化のパーセントを決定するために、メチル化シトシン残基の数、割る、シーケンシングされたクローンの総数で表されている。

プライマー配列：
第一次プライマー：

ネステッドプライマー：

ERGメチル化プロフィール：

(Nor = 正常な妊娠していない血漿/Plac = 胎盤組織/Mat = 母親の血漿)

母親の血漿試料に存在する循環しているDNAの総量を、すべてのゲノムに存在するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(GAPDH)について定量的リアルタイムPCRアッセイ法により測定した。(Zhong, X.Y.ら、(2001)Am. J. Obstet. Gynecol. 184:414-419)。
プライマー：

プローブ：

全血からのDNA回収率：

実施例5：母親の血漿における男性胎児DNAの検出
血漿処理：血液試料をACDA管に収集し、15 mlの円錐形管へ移し、3000 rpm(1500 x g)で10分間、回転させた。RBCペレットより上の血漿層を収集し、15 mlの円錐形管へ移し、1500 x gで再び回転させ、細片ペレットより上の血漿を新しい50 mlの円錐形管へ移し、DNA単離まで-80℃で凍結させた。

DNA抽出/亜硫酸水素塩改変：DNAをQIAamp(登録商標)DNA血液ミニキット(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を用いて血漿から抽出した。DNAを、製造会社のプロトコールに従って、CpGenome DNA改変キット(Intergen Co.、パーチェイス、NY)を用いて亜硫酸水素塩改変をし、27 μlの最終容量において溶出した。

変換後MS-FCY定量化：女性および男性胎児を身ごもっている母親の血漿、正常な血漿ならびに女性のゲノム源DNA試料を、亜硫酸水素塩処理へ導入されることになっている男性DNAの量を測定するために、亜硫酸水素塩変換の前に標準的非MSのPCRを用いてFCYについて定量化した。その結果生じたデータは、回収効率を測定するために亜硫酸水素塩変換の前および後に、タックマン(TaqMan)アッセイあたり検出されるゲノム等価物の量を表している。

リアルタイムPCR(タックマン)アッセイ設計：Y染色体領域、DYS1(NCBI参照番号S86117)由来の配列を定量化することとして男性DNAを検出するために、以下のプライマーおよびプローブを用いた。この実施例の目的のために、FCYは、亜硫酸水素塩変換されていないDNAを表し、MS-FCYは、メチル化特異的亜硫酸水素塩変換後のDNAを表す。

フォワードプライマー：

リバースプライマー：

タックマンプローブ：

単位複製配列サイズ：
FCY 85 bp
MS-FCY 102 bp

タックマン試料/対照：正常な妊娠していない試料および女性胎児を身ごもっている母親の試料の両方を、血漿源DNA陰性対照として用いた。正常な妊娠していない女性のPBMC由来の追加的DNAを、ゲノムDNA源を表している陰性対照として用いた。男性と確認された胎児からの母親の血漿を、陽性対照として用いた。CpGenome(商標)ユニバーサルメチル化DNA-男性(Intergen Co.、パーチェイス、NY)を検量線のために使用し、鋳型なしの対照をブランクとして使用した。試料命名：ML：正常な妊娠していない女性の血漿DNA；50-E-1：正常な妊娠していない女性のゲノムDNA；50-E-2：正常な妊娠していない女性のゲノムDNA；23341-2：男性胎児を身ごもっている母親の血漿；23343-2：男性胎児を身ごもっている母親の血漿；23324-1：女性胎児を身ごもっている母親の血漿；23324-2：女性胎児を身ごもっている母親の血漿。タックマンアッセイ法の結果は、下記に示されている。

本発明は上の態様と共に記載されてきたが、前記の説明および実施例は、例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではないことは、理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明が属する技術分野の業者にとって明らかであるものと思われる。

AおよびBは、胎児対立遺伝子を検出するための本発明の方法の適用を示す図である。 AおよびBは、一塩基伸長を検出および定量化するための本発明の方法の適用を示す図である。 いくつかの対立遺伝子上の異なってメチル化された部位を比較するための半定量的ハイブリダイゼーションを用いる本発明の方法の態様を示す図である。

Claims (4)

1. 以下の段階を含む、胎児の異数性を検出する方法：
   a)母親の血清から単離されたDNAを、メチル化および非メチル化DNAを区別して改変する試薬で処理する段階；
   b)異数性の可能性のある染色体において第一のプライマー対で定量的PCRを行う段階；
   c)非異数性の染色体において第二のプライマー対で対照定量的PCRを行う段階；および
   d)2つのPCR産物の量の比率を測定し、それにより胎児の異数性を検出する段階。
2. 以下の段階を含む、胎児の染色体異数性を検出する方法：
   a)母親の血清から単離されたDNAを亜硫酸水素塩で処理する段階；
   b)母親のDNAにおいておよび胎児のDNAにおいて異なってメチル化されている検査染色体配列に相同的なプライマー対で試料において定量的PCRを行う段階であって、プライマー対が亜硫酸水素塩処理された非メチル化DNAをプライミングするのみである段階；
   c)母親のDNAにおいておよび胎児のDNAにおいて異なってメチル化されている対照染色体配列に相同的なプライマー対で対照定量的PCRを行う段階であって、プライマー対が亜硫酸水素塩処理された非メチル化DNAをプライミングするのみである段階；および
   d)対照染色体と比較した、検査染色体について産生されたPCR産物の量の比率を測定する段階。
3. 以下の段階を含む、胎児のDNAにおいて対象となる遺伝子の対立遺伝子を検出する方法：
   a)母親の血清から単離されたDNAを亜硫酸水素塩で処理する段階；
   b)段階b)の対象となる遺伝子を増幅するプライマー対でPCRを行う段階；および
   c)対象となる遺伝子の対立遺伝子を同定するために、得られたPCR産物を分析する段階。
4. 以下の段階を含む、被験体においてインプリンティング遺伝子を検出する方法：
   a)被験体から単離されたDNAを亜硫酸水素塩で処理する段階；
   b)亜硫酸水素塩処理された非メチル化DNAを増幅するのみである多型領域についてのプライマー対でPCRを行う段階；および
   c)多型を同定するためにPCR産物を分析し、それにより、被験体においてインプリンティング遺伝子を検出する段階。

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