CN103717750B - 少数核酸物质的定量 - Google Patents

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Abstract

本技术部分涉及核酸样品中少数核酸物质的定量。在一些实施方式中，提供了用于测定母体样品中胎儿核酸的量(例如，绝对量、相对量)的方法。所述方法使用抑制性寡核苷酸来降低优势核酸的扩增效率，和/或使用靶竞争者来改善所述扩增。

Description

少数核酸物质的定量
相关专利申请
本专利申请要求2011年4月29日提交的题为“少数核酸物质的定量”，以AndersNygren为发明人且以律师案卷号SEQ-6031-PV指定的美国临时申请第61/480,686号的权益。前述临时专利申请通过引用全文纳入本文。
技术领域
本技术部分涉及少数核酸物质的定量。在一些实施方式中，提供了用于测定母体样品中无细胞胎儿DNA的量的方法。
技术背景
无细胞DNA(CF-DNA)由来自细胞死亡和外周血循环的DNA片段组成。高浓度的CF-DNA能指示某些临床病症，例如癌症、创伤、烧伤、心肌梗塞、中风、败血症、感染和其它疾病。此外，无细胞胎儿DNA(CFF-DNA)能在母体血流中检测，并且用于多种非侵入性产前诊断。
胎儿核酸存在于母体血浆中使得通过分析母体血样来进行非侵入性产前诊断。例如，母体血浆中胎儿DNA的定量异常能与多种妊娠相关疾病关联，所述疾病包含先兆子痫，未足月产，产前出血，侵入性胎盘形成，胎儿唐氏综合症和其它胎儿染色体非整倍性。因此，母体血浆中的胎儿核酸分析是监控母婴健康的有力机制。
包括孕期并发症和胎儿遗传缺陷在内的妊娠相关病症的早期检测是重要的，因为这允许就母婴安全而言所必需的早期医疗介入。传统上已经使用通过例如绒膜绒毛取样(CVS)或羊膜穿刺术的方法从胎儿分离的细胞来进行产前诊断。但是，这些常规方法是侵入性的，并对母婴都具有明显的风险。国家卫生系统(National Health Service)目前引用的侵入性羊膜穿刺术和绒膜绒毛取样(CVS)测试后的流产率为1-2%。这些侵入性方法的替代方法是利用循环CFF-DNA的非侵入性筛选技术的应用。
发明内容
在一些实施方式中提供了一种用于测定含有少数物质和多数物质的样品中的少数核酸物质的量的方法，所述少数物质和所述多数物质的组合包含样品中的总核酸，所述方法包括：(a)在扩增条件下使含有所述少数核酸物质的核酸样品接触：(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增含有以下特征的第一区域：(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中，(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和所述第二区域不同，和(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，从而产生少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，其中，所述总核酸扩增产物相对于没有抑制性寡核苷酸存在时会产生的总扩增产物而言有所减少，(b)分离所述少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，从而产生分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，和(c)基于所述经分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物各自的量，来确定所述样品中少数核酸物质相对于所述样品中核酸总量的分数。
在一些情况中，存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中的特征是甲基化。有时，所述第一区域被甲基化且所述第二区域未被甲基化。
在一些实施方式中，所述方法还包括在(a)之前使所述核酸样品接触一种或多种限制性酶。有时，所述一种或多种限制性酶是甲基化敏感的。在一些情况中，所述限制性酶是HhaI和HpaII。
在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增第三区域，以允许测定是否存在胎儿特异性核酸。在一些情况中，所述胎儿特异性核酸是Y染色体核酸。
在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。通常，所述第一、第二、第三和第四区域各自包含一个或多个基因组基因座。在一些情况中，所述基因组基因座的长度相同。在一些情况中，所述基因组基因座为约50个碱基对～约200个碱基对。在一些情况中，所述基因组基因座为约60个碱基对～约80个碱基对。在一些情况中，所述基因组基因座为约70个碱基对。
在一些实施方式中，所述第一区域包含在所述少数物质和多数物质之间差异甲基化的一个或多个基因座。在一些情况中，第一区域包含TBX3和SOX14基因中的基因座。在一些情况中，所述第一区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
在一些实施方式中，所述第二区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座不含有甲基化敏感的限制性酶的限制性位点。在一些情况中，所述第二区域包含POP5和APOE基因中的基因座。在一些情况中，所述第二区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
在一些实施方式中，所述第三区域包含Y染色体中的一个或多个基因座。在一些情况中，所述第三区域包含DDX3Y基因中的基因座。在一些情况中，所述第三区域的基因座包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方式中，所述第四区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座存在于所述样品的各基因组中且在所有物质中未甲基化。在一些情况中，所述第四区域包含POP5或LDHA基因中的基因座。在一些情况中，所述第四区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
在一些实施方式中，所述第一组和第二组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。在一些实施方式中，所述第三组和第四组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。在一些情况中，所述一对或多对扩增引物对还包含5’尾部。有时，各扩增引物组的所述5’尾部的长度不同。在一些情况中，所述扩增引物各自独立地包含SEQ ID NO:1～8和SEQ ID NO:11～16。
在一些实施方式中，所述一种或多种抑制性寡核苷酸的抑制性寡核苷酸包含与所述第二区域中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸和所述第二组扩增引物中的引物与所述第二区域中的相同核苷酸序列互补。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争。在一些情况中，所述竞争者寡核苷酸包含填充序列。在一些情况中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是恒定的。在一些情况中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是可变的。有时，所述填充序列来自非人基因组。有时，所述填充序列来自PhiX174基因组。在一些实施方式中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约100～约150个碱基对。在一些情况中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约115～约120个碱基对。在一些情况中，所述第一和第二竞争者寡核苷酸的长度为约115个碱基对。在一些情况中，所述第三竞争者寡核苷酸的长度为约118个碱基对。在一些情况中，所述第四竞争者寡核苷酸的长度为约120个碱基对。在一些实施方式中，所述一种或多种第一竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。在一些实施方式中，所述一种或多种第二竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。在一些实施方式中，所述第三竞争者寡核苷酸包含SEQ ID NO:26。在一些实施方式中，所述一种或多种第四竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。在一些实施方式中，所述一种或多种竞争者寡核苷酸包含可检测标记。在一些情况中，所述可检测标记是荧光团且有时各竞争者寡核苷酸的荧光团不同。在一些实施方式中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。在一些实施方式中，所述方法还包括基于所用竞争者寡核苷酸的量来测定所述少数核酸物质的拷贝数。在一些实施方式中，所述方法还包括测定所述多数核酸物质的拷贝数。
在一些实施方式中，所述样品核酸是胞外核酸。在一些实施方式中，所述少数核酸物质是胎儿DNA且所述多数核酸物质是母体DNA。在一些情况中，所述核酸样品获自妊娠女性对象。在一些情况中，所述对象是人。在一些实施方式中，所述样品核酸来自血浆。在一些情况中，所述样品核酸来自血清。
在一些实施方式中，所述扩增在单个反应容器中进行。有时，两种或更多种所述扩增产物长度不同。通常，所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前使所述扩增产物接触外切核酸酶。在一些情况中，基于长度来分离扩增产物。通常，所述分离使用电泳进行。在一些情况中，所述电泳是毛细管电泳。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所述核酸样品是否用于测序反应。在一些情况中，所述测序反应是基于可逆终止子的测序反应。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所获得的核酸样品的测序信息是否用于诊断确定。
在一些实施方式中，还提供了一种用于测定包含少数物质和多数物质的样品中少数核酸的量的方法，所述少数物质和所述多数物质的组合包含所述样品中的总核酸，所述方法包括测定所述少数核酸物质的拷贝数的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在扩增条件下使含有所述少数核酸物质的核酸样品接触：(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增含有以下特征的第一区域：(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中，(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中，所述第一区域和所述第二区域不同，(iii)一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争，和(iv)一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争，从而产生扩增产物，其中两种或更多种所述扩增产物的长度不同；(b)分离所述少数核酸、总核酸和竞争扩增产物，从而产生分离的少数核酸、总核酸和竞争扩增产物；和(c)基于所述分离的扩增产物来测定所述样品中少数核酸物质的拷贝数。
在一些情况中，存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中的特征是甲基化。有时，所述第一区域被甲基化但所述第二区域未被甲基化。
在一些实施方式中，所述方法还包括在(a)之前使所述核酸样品接触一种或多种限制性酶。有时，所述一种或多种限制性酶是甲基化敏感的。在一些情况中，所述限制性酶是HhaI和HpaII。
在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增第三区域，以允许测定是否存在胎儿特异性核酸。在一些情况下，所述胎儿特异性核酸是Y染色体核酸。
在一些实施方式中，所述方法该包括在扩增条件下使所述核酸样品接触第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增第四区域以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。通常，所述第一、第二、第三和第四区域各自包含一个或多个基因组基因座。在一些情况中，所述基因组基因座的长度相同。在一些情况中，所述基因组基因座为约50个碱基对～约200个碱基对。在一些情况中，所述基因组基因座为约60个碱基对～约80个碱基对。在一些情况中，所述基因组基因座是为约70碱基对。
在一些实施方式中，所述第一区域包含在所述少数物质和多数物质之间差异甲基化的一个或多个基因座。在一些情况中，第一区域包含TBX3和SOX14基因中的基因座。在一些情况中，所述第一区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
在一些实施方式中，所述第二区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座不含有甲基化敏感的限制性酶的限制性位点。在一些情况中，所述第二区域包含POP5和APOE基因中的基因座。在一些情况中，所述第二区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
在一些实施方式中，所述第三区域包含Y染色体中的一个或多个基因座。在一些情况中，所述第三区域包含DDX3Y基因中的基因座。在一些情况中，所述第三区域的基因座包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方式中，所述第四区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座存在于所述样品的各基因组中且在所有物质中未经甲基化。在一些情况中，所述第四区域包含POP5或LDHA基因中的基因座。在一些情况中，所述第四区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
在一些实施方式中，所述第一组和第二组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。在一些实施方式中，所述第三组和第四组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。在一些情况中，所述一对或多对扩增引物对还包含5’尾部。有时，各扩增引物组的所述5’尾部的长度不同。在一些情况中，所述扩增引物各自独立地包含SEQ ID NO:1～8和SEQ ID NO:11～16。
在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增。在一些实施方式中，所述一种或多种抑制性寡核苷酸的抑制性寡核苷酸包含与所述第二区域中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸和所述第二组扩增引物中的引物与所述第二区域中的相同核苷酸序列互补。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
在一些实施方式中，所述方法还包括基于分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物各自的量，来测定所述样品中少数核酸物质相对于所述样品中核酸总量的分数。
在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争。在一些情况中，所述竞争者寡核苷酸包含填充序列。在一些情况中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是恒定的。在一些情况中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是可变的。有时，所述填充序列来自非人基因组。有时，所述填充序列来自PhiX174基因组。在一些实施方式中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约100～约150个碱基对。在一些情况中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约115～约120个碱基对。在一些情况中，所述第一和第二竞争者寡核苷酸的长度为约115个碱基对。在一些情况中，所述第三竞争者寡核苷酸的长度为约118个碱基对。在一些情况中，所述第四竞争者寡核苷酸的长度为约120个碱基对。在一些实施方式中，所述一种或多种第一竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。在一些实施方式中，所述一种或多种第二竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。在一些实施方式中，所述第三竞争者寡核苷酸包含SEQ ID NO:26。在一些实施方式中，所述一种或多种第四竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。在一些实施方式中，所述一种或多种竞争者寡核苷酸包含可检测标记。在一些情况中，所述可检测标记是荧光团且有时各竞争者寡核苷酸的荧光团不同。在一些实施方式中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。在一些情况中，基于所用竞争者寡核苷酸的量来测定所述少数核酸物质的拷贝数。在一些情况中，测定所述多数核酸物质的拷贝数。
在一些实施方式中，所述样品核酸是胞外核酸。在一些实施方式中，所述少数核酸物质是胎儿DNA而所述多数核酸物质是母体DNA。在一些情况中，所述核酸样品获自妊娠女性对象。在一些情况中，所述对象是人。在一些实施方式中，所述样品核酸来自血浆。在一些情况中，所述样品核酸来自血清。
在一些实施方式中，所述扩增在单个反应容器中进行。有时，两种或更多种所述扩增产物的长度不同。通常，所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前使所述扩增产物接触外切核酸酶。在一些情况中，基于长度来分离扩增产物。通常，所述分离使用电泳进行。在一些情况中，所述电泳是毛细管电泳。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所述核酸样品是否用于测序反应。在一些情况中，所述测序反应是基于可逆终止子的测序反应。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所获得的核酸样品的测序信息是否用于诊断确定。
在一些实施方式中，还提供了一种用于测定含有少数物质和多数物质的样品中的少数核酸物质的量的方法，所述少数物质和所述多数物质的组合包含所述样品中的总核酸，所述方法包括：(a)在扩增条件下使包含所述少数核酸物质的核酸样品接触：(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增第一区域，所述第一区域包含以下特征(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中，(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和所述第二区域不同，(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，(iv)一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争，和(v)一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争，从而产生少数核酸、总核酸和竞争扩增产物，其中两种或更多种所述扩增产物的长度不同，并且所述总核酸扩增产物相对于没有抑制性寡核苷酸存在时会产生的总扩增产物而言有所减少，(b)分离所述扩增产物，从而产生分离的少数核酸、总核酸和竞争扩增产物，和(c)基于所述分离的扩增产物来测定所述样品中少数核酸物质的量。
在一些情况中，存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中的特征是甲基化。有时，所述第一区域被甲基化但所述第二区域未被甲基化。
在一些实施方式中，所述方法还包括在(a)之前使所述核酸样品接触一种或多种限制性酶。有时，所述一种或多种限制性酶是甲基化敏感的。在一些情况中，所述限制性酶是HhaI和HpaII。
在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增第三区域，以允许测定是否存在胎儿特异性核酸。在一些情况中，所述胎儿特异性核酸是Y染色体核酸。
在一些实施方式中，所述方法该包括在扩增条件下使所述核酸样品接触第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。通常，所述第一、第二、第三和第四区域各自包含一个或多个基因组基因座。在一些情况中，所述基因组基因座的长度相同。在一些情况中，所述基因组基因座为约50个碱基对～约200个碱基对。在一些情况中，所述基因组基因座为约60个碱基对～约80个碱基对。在一些情况中，所述基因组基因座是为约70个碱基对。
在一些实施方式中，所述第一区域包含在所述少数物质和多数物质之间差异甲基化的一个或多个基因座。在一些情况中，第一区域包含TBX3和SOX14基因中的基因座。在一些情况中，所述第一区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
在一些实施方式中，所述第二区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座不含有甲基化敏感的限制性酶的限制性位点。在一些情况中，所述第二区域包含POP5和APOE基因中的基因座。在一些情况中，所述第二区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
在一些实施方式中，所述第三区域包含Y染色体中的一个或多个基因座。在一些情况中，所述第三区域包含DDX3Y基因中的基因座。在一些情况中，所述第三区域的基因座包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方式中，所述第四区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座存在于所述样品中的各基因组中且在所有物质中未经甲基化。在一些情况中，所述第四区域包含POP5或LDHA基因中的基因座。在一些情况中，所述第四区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
在一些实施方式中，所述第一组和第二组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。在一些实施方式中，所述第三组和第四组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。在一些情况中，所述一对或多对扩增引物对还包含5’尾部。有时，各扩增引物组的所述5’尾部的长度不同。在一些情况中，所述扩增引物各自独立地包含SEQ ID NO:1～8和SEQ ID NO:11～16。
在一些实施方式中，所述一种或多种抑制性寡核苷酸的抑制性寡核苷酸包含与所述第二区域中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸和所述第二组扩增引物中的引物与所述第二区域中的相同核苷酸序列互补。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
在一些实施方式中，经测定的少数核酸的量是所述样品中少数核酸物质相对于所述样品中核酸总量的分数，所述分数是基于经分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物各自的量。
在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品接触一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争。在一些情况中，所述竞争者寡核苷酸包含填充序列。在一些情况中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度恒定的。在一些情况中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是可变的。有时，所述填充序列来自非人基因组。有时，所述填充序列来自PhiX174基因组。在一些实施方式中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约100～约150个碱基对。在一些情况中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约115～约120个碱基对。在一些情况中，所述第一和第二竞争者寡核苷酸的长度为约115个碱基对。在一些情况中，所述第三竞争者寡核苷酸的长度为约118个碱基对。在一些情况中，所述第四竞争者寡核苷酸的长度为约120个碱基对。在一些实施方式中，所述一种或多种第一竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。在一些实施方式中，所述一种或多种第二竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。在一些实施方式中，所述第三竞争者寡核苷酸包含SEQ ID NO:26。在一些实施方式中，所述一种或多种第四竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。在一些实施方式中，所述一种或多种竞争者寡核苷酸包含可检测标记。在一些情况中，所述可检测标记是荧光团且有时各竞争者寡核苷酸的荧光团不同。在一些实施方式中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。在一些情况中，经测定的少数核酸的量是少数核酸物质的拷贝数，所述拷贝数是基于所用竞争者寡核苷酸的量。在一些情况中，测定所述多数核酸物质的拷贝数。
在一些实施方式中，所述样品核酸是胞外核酸。在一些实施方式中，所述少数核酸物质是胎儿DNA而所述多数核酸物质是母体DNA。在一些情况中，所述核酸样品获自妊娠女性对象。在一些情况中，所述对象是人。在一些实施方式中，所述样品核酸来自血浆。在一些情况中，所述样品核酸来自血清。
在一些实施方式中，所述扩增在单个反应容器中进行。有时，两种或更多种所述扩增产物的长度不同。通常，所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前使所述扩增产物接触外切核酸酶。在一些情况中，基于长度来分离扩增产物。通常，所述分离使用电泳进行。在一些情况中，所述电泳是毛细管电泳。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所述核酸样品是否用于测序反应。在一些情况中，所述测序反应是基于可逆终止子的测序反应。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所获得的核酸样品的测序信息是否用于诊断确定。
在一些实施方式中，还提供了一种用于测定包含胎儿核酸和母体核酸的样品中胎儿核酸的量的方法，所述胎儿物质和所述母体物质的组合包含所述样品中的总核酸，所述方法包括(a)在扩增条件下使包含胎儿核酸的核酸样品接触：(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增第一区域，所述第一区域包含以下特征：(1)存在于所述胎儿核酸中但不存在于所述母体核酸中，或(2)不存在于所述胎儿核酸中但存在于所述母体核酸中，(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，(iv)第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增第三区域，以允许测定是否存在Y染色体核酸，(v)第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增第四区域以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂，其中所述第一、第二、第三和第四区域不同，(vi)一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争，(vii)一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争，(viii)一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争，和(ix)一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争，从而产生胎儿核酸、总核酸、Y染色体核酸、消化效率指示剂和竞争扩增产物，其中两种或更多种所述扩增产物的长度不同，并且所述总核酸扩增产物相对于没有抑制性寡核苷酸存在时会产生的总扩增产物而言有所减少，(b)分离所述扩增产物，从而产生分离的胎儿核酸、总核酸、Y染色体核酸、消化效率指示剂和竞争扩增产物，和(c)基于所分离的扩增产物来测定所述样品中胎儿核酸的量。
在一些实施方式中，存在于所述胎儿核酸中但不存在于所述母体核酸中的特征是甲基化。有时，所述第一区域被甲基化但所述第二区域未被甲基化。在一些实施方式中，所述方法还包括在(a)之前使所述核酸样品接触一种或多种限制性酶。在一些情况中，所述一种或多种限制性酶是甲基化敏感的。有时，所述限制性酶是HhaI和HpaII。
在一些实施方式中，所述第一、第二、第三和第四区域各自包含一个或多个基因组基因座。在一些情况中，所述基因组基因座的长度相同。在一些情况中，所述基因组基因座为约50个碱基对～约200个碱基对。在一些情况中，所述基因组基因座为约60个碱基对～约80个碱基对。在一些情况中，所述基因组基因座是为约70个碱基对。
在一些实施方式中，所述第一区域包含在所述胎儿和母体物质之间差异甲基化的一个或多个基因座。在一些情况中，第一区域包含TBX3和SOX14基因中的基因座。在一些情况中，所述第一区域的基因座各自独立包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
在一些实施方式中，所述第二区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座不含有甲基化敏感的限制性酶的限制性位点的。在一些情况中，所述第二区域包含POP5和APOE基因中的基因座。在一些情况中，所述第二区域的基因座各自独立地包含SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:32。
在一些实施方式中，所述第三区域包含Y染色体中的一个或多个基因座。在一些情况中，所述第三区域包含DDX3Y基因中的基因座。在一些情况中，所述第三区域的基因座包含SEQ ID NO:34。
在一些实施方式中，所述第四区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座存在于所述样品中的各基因组中且在胎儿和母体核酸中未经甲基化。在一些情况中，所述第四区域包含POP5或LDHA基因中的基因座。在一些情况中，所述第四区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
在一些实施方式中，所述第一组和第二组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。在一些实施方式中，所述第三组和第四组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。在一些情况中，所述一对或多对扩增引物对还包含5’尾部。有时，各扩增引物组的所述5’尾部的长度不同。在一些情况中，所述扩增引物各自独立地包含SEQ ID NO:1～8和SEQ ID NO:11～16。
在一些实施方式中，所述一种或多种抑制性寡核苷酸的抑制性寡核苷酸包含与所述第二区域中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸和所述第二组扩增引物中的引物与所述第二区域中的相同核苷酸序列互补。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
在一些实施方式中，所测的胎儿核酸的量是所述样品中胎儿核酸相对于所述样品中核酸总量的分数，所述分数是基于所述分离的胎儿核酸扩增产物和总核酸扩增产物的各自的量。
在一些实施方式中，所述竞争者寡核苷酸包含填充序列。在一些情况中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是恒定的。在一些情况中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是可变的。有时，所述填充序列来自非人基因组。有时，所述填充序列来自PhiX174基因组。在一些实施方式中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约100～约150个碱基对。在一些情况中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约115～约120个碱基对。在一些情况中，所述第一和第二竞争者寡核苷酸的长度为约115个碱基对。在一些情况中，所述第三竞争者寡核苷酸的长度为约118个碱基对。在一些情况中，所述第四竞争者寡核苷酸的长度为约120个碱基对。在一些实施方式中，所述一种或多种第一竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22。在一些实施方式中，所述一种或多种第二竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24。在一些实施方式中，所述第三竞争者寡核苷酸包含SEQ ID NO:26。在一些实施方式中，所述一种或多种第四竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。在一些实施方式中，所述一种或多种竞争者寡核苷酸包含可检测标记。在一些情况中，所述可检测标记是荧光团且有时各竞争者寡核苷酸的荧光团不同。在一些实施方式中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。在一些情况中，所测定的胎儿核酸的量是胎儿核酸的拷贝数，所述拷贝数是基于所用竞争者寡核苷酸的量。在一些情况中，测定所述多数核酸物质的拷贝数。
在一些实施方式中，所述样品核酸是胞外核酸。在一些情况中，所述核酸样品获自妊娠女性对象。在一些情况中，所述对象是人。在一些实施方式中，所述样品核酸来自血浆。在一些情况中，所述样品核酸来自血清。
在一些实施方式中，所述扩增在单个反应容器中进行。有时，两种或更多种所述扩增产物的长度不同。通常，所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前使所述扩增产物接触外切核酸酶。在一些情况中，基于长度来分离扩增产物。通常，所述分离使用电泳进行。在一些情况中，所述电泳是毛细管电泳。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所述核酸样品是否用于测序反应。在一些情况中，所述测序反应是基于可逆终止子的测序反应。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所获得的核酸样品的测序信息是否用于诊断确定。
在一些实施方式中，还提供了某种组合物，所述组合物包含两种或更多种经扩增的、长度可区分的靶核酸的混合物，其中，各扩增子包含与靶核酸相同的第一序列和一种或多种与靶核酸不同的、长度可变的第二序列，其中所述靶核酸各自独立地包含(a)第一区域，所述第一区域包含以下特征：(i)存在于少数核酸物质中但不存在于多数核酸物质中，或(ii)不存在于少数核酸物质中但存在于多数核酸物质中，和(b)第二区域，所述第二区域允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一和第二区域不同。
在一些实施方式中，所述第一区域和所述第二区域被差异甲基化。在一些情况中，所述靶核酸还包含第三区域，以允许测定是否存在Y染色体核酸。在一些情况中，所述靶核酸还包含第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。
在一些实施方式中，所述靶核酸包含一种或多种独立基因组DNA靶序列。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列的长度相同。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列各自独立地包含SEQ ID NO:29～32和SEQ ID NO:34～36。有时，所述靶核酸还包含一种或多种独立竞争者寡核苷酸。在一些情况中，所述一种或多种竞争者寡核苷酸包含填充序列。在一些情况中，所述竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:21～24和SEQ ID NO:26～28。
在一些实施方式中，还提供了某种试剂盒，所述试剂盒用于测定含有少数物质和多数物质的样品中的少数核酸物质的量，所述少数物质和所述多数物质的组合包含所述样品中的总核酸，所述试剂盒包含：(a)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增第一区域，所述第一区域包含以下特征：(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中，(b)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和所述第二区域不同，和(c)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增第三区域，以允许测定Y染色体核酸的存在或缺失。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交与所述第三区域竞争。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含一种或多种甲基化敏感的限制性酶。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含说明书或地址(location)，所述说明书或地址用以进行测定含有少数物质和多数物质的样品中少数核酸物质的量，所述少数物质和所述多数物质的组合包含所述样品中的总核酸，所述方法包括(a)在扩增条件下使含有少数核酸物质的核酸样品接触：(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增第一区域，所述第一区域包含以下特征：(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中，(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和所述第二区域不同，和(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，从而产生少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，其中所述总核酸扩增产物相对没有抑制性寡核苷酸存在时会产生的总扩增产物而言有所减少，(b)分离所述扩增产物，从而产生分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，和(c)基于所分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物各自的量来确定所述样品中少数核酸物质相对于所述样品中核酸总量的分数。
在一些实施方式中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。
在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增第三区域，以允许测定是否存在Y染色体核酸。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争。在一些实施方式中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争。
在一些实施方式中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。在一些情况中，经测定的少数核酸的量是少数核酸物质的拷贝数，所述拷贝数是基于所用竞争者寡核苷酸的量。在一些实施方式中，所述少数核酸物质是胎儿DNA而所述多数核酸物质是母体DNA。在一些实施方式中，所述第一区域被甲基化而所述第二区域未被甲基化。
在以下说明书、实施例、权利要求和附图中进一步描述某些实施方式。
附图简要说明
附图描述本技术的实施方式但不具限制性。为了说明的清楚和方便，附图不一定按比例制作，并且在一些情况中，可能夸大或放大多个方面以协助对具体实施方式的理解。
图1显示了基因组DNA靶序列和竞争物的示例扩增方案。多重试验包括四种不同基因组DNA靶序列(各靶序列针对特定区域)和四种对应的竞争物：甲基化(1和5)、总DNA(2和6)、Y染色体(3和7)和消化对照(4和8)。多重PCR使用标志物特异性加尾引物和包含填充序列的竞争物来进行。PCR产物采用电泳分离。
图2显示了对各区域生成多种扩增子的扩增方案的示例。通过使用若干扩增子/区域，并在彼此上方堆叠各组来获得准确扩增。具体地，各区域的基因组DNA靶序列及其对应的竞争物概括在如下方案中：甲基化(1a、1b和5a、5b)、总DNA(2a、2b和6a、6b)、Y染色体(3a、3b和7a、7b)和消化对照(4a、4b和8a、8b)。由多种独立的靶标或竞争物产生各电泳图的峰，编号1～8。
图3A和图3B显示了示例靶标的抑制性PCR方案。包含了特定比例的抑制性寡核苷酸以减少总DNA的基因组DNA靶序列的内源水平。这些抑制性寡核苷酸降低总DNA PCR效率，并且可进行滴定以使产物达到就甲基化而言的基因组DNA靶序列水平。图3A显示了不使用抑制性寡核苷酸的PCR试验。图3B显示了PCR试验，所述PCR试验使用抑制性寡核苷酸以降低电泳图中总DNA信号。
图4A和图4B显示了胎儿DNA定量所用的两个试验间的比较。在图4A中，本文提供的DNA定量试验由三个不同步骤组成，并且能由一个操作者高通量进行。所述整个过程可在5小时内完成，并且包括DNA提取的整个过程可在一天内完成。通常添加体积大于10微升的反应混合物，使技术和取样的可变性减至最小。仅需要的设备是热循环仪和自动化电泳仪器。如图4B所示，另一个DNA定量试验由八个步骤组成，其中六个步骤在PCR之后进行，并且包括蛋白酶K步骤(ProtK)、虾碱性磷酸酶步骤(SAP)、单碱基延伸步骤(TYPEPLEX)、水与树脂步骤(W&R)、分配至芯片上步骤(D)，以及质谱分光光度法(mass spectrophotometry)(MASSARRAY)。该试验包括定量所用的基于MALDI-TOF的方法，所述方法需要特殊仪器以及技术高超的操作员，所述操作员能够诊断PCR进程后的任何步骤中出现的问题。由于涉及到很多步骤，图4B中的完整反应无法在一天完成。
图5A和图5B显示了使用毛细管电泳的胎儿DNA定量试验(FQA)扩增子的图像。使用基因组DNA样品，所述样品由80%分离自PBMC的未经甲基化DNA和20%不同稀释度的胎盘DNA组成。在图5A中，使用女性胎盘DNA。在图5B中，使用男性胎盘DNA。图5B中的箭头指向由对应Y染色体DNA的93bp扩增产物所生成的峰。图5A(女性胎盘DNA)中没有该峰。
图6A和图6B显示靶向抑制性PCR的效果。对特定针对总DNA标志物的试验，不使用抑制剂(图6A)或使用比例为2:1的抑制剂(图6B)进行两个平行反应。观察到所述靶向总标志物(DNA模板和竞争性寡核苷酸)显著减少，而就所述非靶向试验而言没有观察到变化。
图7A和7B显示了靶向抑制性PCR的示例，所述PCR采用了对比PCR引物而言不同比例的抑制剂。使用两种不同的抑制剂/PCR引物比例进行平行反应。在图7A中，使用0.4微摩尔抑制剂/0.6微摩尔PCR引物的比例。在图7B中，使用0.6微摩尔抑制剂/0.4微摩尔PCR引物的比例。尽管总标志物的强度随着抑制剂添加的增长而急剧下降，但是在靶向甲基化和Y染色体标志物的未受影响的试验中未见变化。
图8显示引物二聚体形成的鉴定。使用PCR引物、抑制剂和竞争者寡核苷酸的不同组合进行多重抑制性PCR。就引物二聚体形成而言，分析PCR引物和寡核苷酸的不同组合。通过使用所述竞争物作为PCR的唯一模板，预计有115bp、126bp、141bp和156bp的四种片段。鉴定了两种模板非依赖性产物：1)POP5正向抑制剂和UTY反向引物相互作用生成的70bp的产物，和2)由APOE正向抑制剂和UTY正向引物生成的60bp的产物。P=POP，A=APOE，i=仅正向PCR引物，j=仅反向PCR引物，ij=存在两种引物。
图9A、图9B、图9C和图9D显示定量拷贝数。使从非妊娠女性血液分离的DNA样品与不同量的男性胎盘DNA(0、40、80、120、160、200、240和280个拷贝)混合。在六个平行反应中分析各稀释物。使用各DNA/竞争物峰的比例来计算拷贝数。图9A所示的带状图(stripchart)显示了使用甲基化或Y染色体特异性标志物计算的胎盘拷贝数。图9B所示的带状图显示了计算的总拷贝数。各稀释物包含的基因组总数是恒定的。图9C显示甲基化标志物和Y染色体之间的相关性。通过使用获自甲基化试验和Y染色体标志物与各自竞争物相比的比例来计算不同量的母体未经甲基化DNA中掺入的胎盘DNA的拷贝数。该模型系统显示了基于甲基化定量和Y染色体特异性序列之间的高相关性(rho=0.93(皮尔森相关))。图9D显示将使用甲基化或Y染色体标志物计算的胎盘拷贝数进行比较的Q-Q曲线。
图10显示CpG甲基化DNA的检测。开发了模型系统以模拟从血浆分离的、降解的循环无细胞DNA样品。这些样品包含大约2000个基因组拷贝，其中主体是从母体PBMC分离的DNA，向该DNA掺入不同量的任一男性CpG甲基化的DNA。对所述样品掺入0、40、80、120、160、200、240或280个胎盘拷贝，生成胎盘分数范围为0～14%的样品。所示箭头指向由对应Y染色体DNA的93bp扩增产物生成的峰。
图11A显示男性妊娠和女性妊娠之间的比较。显示从96位妊娠女性分离的DNA样品中获得的男性对比女性DNA样品的胎儿分数的盒须图。上方和下方须线(whisker)代表第5百分点和第95百分点。上方、中部、下方的短线代表第25、第50、第75百分点。就甲基化标志物而言，在男性(n=36)和女性(n=60)样品之间没有观察到显著差异(p值大于0.05)。图11B显示了经计算的胎儿拷贝数之间的成对相关性，所述拷贝数从针对男性样品使用甲基化标志物对比Y染色体标志物来获得。给定值指示所述两种不同测量之间的最小差异，由此验证了该方法的准确性和稳定性。(ρ=0.9，皮尔森(Pearson)相关)。
图12显示使用毛细管电泳的三种连续FQA运行之间的比较。显示了经计算的胎儿分数之间的成对相关性，所述胎儿分数从针对男性样品使用甲基化标志物的平均对比使用Y染色体标志物的平均来获得。给定值指示所述三种不同测量之间的最小差异，由此验证了该方法的准确性和稳定性。
图13A和图13B显示PCR后采用外切核酸酶I处理的结果。所述FQA试验以两次重复形式进行，并使用毛细管电泳来分析。图13A显示没有外切核酸酶处理的试验结果。用圆圈标记非特异性保留的PCR引物。图13B显示在PCR后采用外切核酸酶I处理的样品获得的试验结果。所述非特异性峰不再出现在该电泳图中，标示了单链PCR引物通过所述外切核酸酶处理而被除去，并且没有形成双链引物二聚体。
图14A和图14B显示的盒须图显示了少数物分数，所述少数物分数是基于含有0～10%少数物质的混合DNA样品中的SOX14和TBX3甲基化标志物。所述盒形代表了获自8次重复的分数。上方和下方须线代表第5百分点和第95百分点。上方、中部、下方的短线代表第25、第50、第75百分点。图14A显示了含有总共1500个拷贝/反应的样品。图14B显示了含有总共3000个拷贝/反应的样品。
图15A和图15B显示的盒须图显示了来自少数物分数的、计算的拷贝数，所述少数物分数是基于含有0～10%少数物质的混合DNA样品中的SOX14和TBX3甲基化标志物。所述盒形代表了获自8次重复的分数。上方和下方须线代表第5百分点和第95百分点。上方、中部、下方的短线代表第25、第50、第75百分点。图15A显示了含有总共1500个拷贝/反应的样品。图15B显示了含有总共3000个拷贝/反应的样品。
图16显示了使用MASSARRAY或毛细管电泳方法获得的少数物质拷贝数的相关性示意图。各方法中，每个样品以两次重复形式分析。使用皮尔森(Pearson)相关的全部相关系数都高于0.9，这指示了两种方法和重复之间的非常好的相关性。成对T检验生成的p值表示了所述方法间没有显著差异。
图17显示了使用MASSARRAY或毛细管电泳方法获得的少数物质拷贝数的相关性示意图。各方法中，每个样品以两次重复形式分析。成对T检验生成的p值高于0.05，这指示所述方法间没有显著差异。
发明详述
本文提供了用于测定样品中少数核酸物质的量的方法、用于测定样品中胎儿核酸的量的方法、用于进行此类方法的试剂盒，以及可由此类方法产生的长度来区分的扩增核酸的混合物。以有限拷贝数存在于样品中的核酸物质的定量是个挑战。在一些情况中，需要测定少数核酸物质的准确拷贝数。通常，核酸经扩增并按长度分离以帮助检测和定量。此类技术能够适于高通量筛选方法。然而，在少数核酸和多数核酸共扩增(co-amplified)的情况中，分析所得的扩增产物可能由所述多数核酸物质的存在来主导。在这些情形下，分析窗(analytical window)缩小且所述少数核酸的定量受到影响。样品中少数核酸物质的准确定量和拷贝数测定是通过能够将以较高和较低起始浓度存在的核酸进行共扩增的试验来进行。此类试验由本文所述的组合物和方法来提供。
核酸
本文提供用于定量核酸的方法。术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。所述术语指来自下述任意组合物的核酸，例如：脱氧核糖核酸(DNA，例如，互补DNA(cDNA)，基因组DNA(gDNA)等)、核糖核酸(RNA，例如，信使RNA(mRNA)、短抑制RNA(siRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA、胎儿或胎盘高度表达的RNA等)和/或DNA或RNA类似物(例如，含碱基类似物、糖类似物和/或非天然主链等)、RNA/DNA杂交体和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些可以是单链形式或双链形式，并且除非另有限定，所述核酸可涵盖天然核苷酸的已知类似物，所述类似物能以与天然产生的核苷酸相似的方式起作用。核酸可以是可用于进行本文所述方法的任何形式(例如线性、环状、超螺旋、单链、双链等)。在某些实施方式中，核酸可以是或者可来自：质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、染色体、或者能够在体外或在宿主细胞、细胞、细胞的细胞核或细胞质中复制或被复制的其它核酸。在一些实施方式中，核酸可来自单个染色体(例如核酸样品可来自从二倍体生物所得样品的一个染色体)。所述术语也可包括从核苷酸类似物、单链("正义"或"反义"，"正"链或"负"链，"正向"阅读框或"反向"阅读框)和双链多核苷酸合成的RNA或DNA的等价物、衍生物、变体和类似物。脱氧核糖核苷酸包含脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。就RNA而言，碱基胞嘧啶替换为尿嘧啶。核酸可采用获自对象的核酸来制备。
胞外核酸
在某些实施方式中，核酸可以是胞外核酸。本文所用的术语“胞外核酸”或“无细胞核酸”或“循环无细胞核酸”指从基本不具有细胞(例如，没有可检测的细胞；可包含细胞要素或细胞残余物)的来源分离的核酸。胞外核酸的无细胞来源的示例有血液血浆、血清和尿液。不受理论限制，胞外核酸可以是细胞凋亡(例如，来自凋亡后胎盘细胞的胞外核酸)、细胞坏死和/或细胞破裂的产物，这为胞外核酸提供基础，所述胞外核酸常具有大范围内的系列长度(例如，“梯(ladder)”)。
在某些实施方式中，胞外核酸可包含不同的核酸物质，因而在本文中称作“异质性”。例如，患有癌症的人的血液血清或血浆可包含来自癌细胞的核酸与来自非癌细胞的核酸。在另一例子中，妊娠女性的血液血清或血浆可包含母体核酸和胎儿核酸。在一些例子中，胎儿核酸有时占全部核酸的约1%～约40%(例如，所述核酸中的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40%是胎儿核酸)。在一些实施方式中，核酸中的胎儿核酸的大部分的长度为约500个碱基对或更短(例如，胎儿核酸长度的约80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%是约500个碱基对或更短)。
细胞核酸
在某些实施方式中，核酸可以是细胞核酸。本文所用的术语“细胞核酸”指从具有完整细胞的来源分离的核酸。细胞核酸来源的非限制性示例为：血细胞、组织细胞、器官细胞、肿瘤细胞、毛发细胞、皮肤细胞和骨细胞。
在一些实施方式中，核酸来自外周血单核细胞(PBMC)。PBMC是具有圆细胞核的任何血细胞，例如，淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。这些细胞可从全血中提取，所述提取例如使用使血液分层的亲水多糖菲可(ficoll)和PBMC，使在血浆层下形成暗黄层。此外，PBMC可使用低渗裂解从全血中提取，所述低渗裂解优先裂解血红细胞并释放完整的PBMC。
在一些实施方式中，核酸来自胎盘细胞。所述胎盘是连接发育胎儿和子宫壁的器官，以通过母亲血液供给来进行营养摄取、废物排除和气体交换。所述胎盘由形成该胎儿的相同的精细胞和卵细胞发育而来，并且作为具有两种成分(胎儿部分(叶状绒毛膜(Chorionfrondosum))和母体部分(基蜕膜(Decidua basalis)))的母婴器官行使功能。在一些实施方式中，核酸获自所述胎盘的胎儿部分。在一些实施方式中，核酸获自所述胎盘的母体部分。
核酸定量
本文提供了用于核酸定量的方法。在一些实施方式中，测定相对总核酸量的少数核酸物质的量。在一些实施方式中，测定少数核酸物质的拷贝数。
少数物质对比多数物质
并不意在任何方面严格定义，本文所用的术语“少数”或“多数”。在一方面中，被认为是“少数”的核酸，例如，其丰度可以是样品中总核酸的至少约0.1%～少于样品中总核酸的50%。在一些实施方式中，少数核酸的丰度可以是样品中总核酸的至少约1%～样品中总核酸的约40%。在一些实施方式中，少数核酸的丰度可以是样品中总核酸的至少约2%～样品中总核酸的约30%。在一些实施方式中，少数核酸的丰度可以是样品中总核酸的至少约3%～样品中总核酸的约25%。例如，少数核酸的丰度可以是样品中总核酸的约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%。在一些实施方式中，所述少数核酸是胞外DNA。在一些实施方式中，所述少数核酸是胞外胎儿DNA。
在另一方面中，被认为是“多数”的核酸，例如，其丰度可以是样品中总核酸的多于50%～样品中总核酸的约99.9%。在一些实施方式中，多数核酸的丰度可以是样品中总核酸的至少约60%～样品中总核酸的约99%。在一些实施方式中，多数核酸的丰度可以是样品中总核酸的至少约70%～样品中总核酸的约98%。在一些实施方式中，多数核酸的丰度可以是样品中总核酸的至少约75%～样品中总核酸的约97%。例如，多数核酸的丰度可以是样品中总核酸的至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些实施方式中，所述多数核酸是胞外DNA。在一些实施方式中，所述多数核酸是胞外母体DNA。
竞争者寡核苷酸
在本文提供方法的一些实施方式中，使用一种或多种竞争者寡核苷酸来实现少数核酸物质的定量。本文中所用的“竞争者寡核苷酸”或“竞争性寡核苷酸”或“竞争物”是就与扩增引物杂交而言与靶核苷酸序列竞争的核酸聚合物。通常，所述竞争物的核苷酸序列与所述靶核苷酸序列相同。在一些情况中，所述竞争物可任选地具有与所述靶核苷酸序列不同的额外核苷酸序列长度。所述额外核苷酸序列长度常来自与所述靶核苷酸序列不同的基因组或者是合成序列。在一些实施方式中，使用已知量或拷贝数的竞争物。在一些实施方式中，使用两种或更多种竞争物。在一些情况中，所述两种或更多种竞争物具有相似的特征(例如，长度、可检测标记)。在一些情况中，所述两种或更多种竞争物具有不同的特征(例如，长度、可检测标记)。在一些实施方式中，针对特定区域使用一种或多种竞争物。在一些情况中，就给定区域的各组竞争物而言，
所述竞争物具有独特的特征。不同区域的竞争物常具有不同的特征。
竞争者寡核苷酸可由天然发生的和/或非天然产生的核苷酸(例如带标记的核苷酸)或其混合物组成。适用于本文所述实施方式的竞争者寡核苷酸可采用已知技术合成并标记。竞争者寡核苷酸可按照任何已知的合适方法化学合成，所述方法例如使用固相亚磷酰胺三酯法，该方法首先由Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letts.22:1859-1862(1981)中描述，例如按Needham-VanDevanter等在Nucleic Acids Res.12:6159-6168,1984中所述用自动合成仪化学合成。竞争者寡核苷酸的纯化可通过任何已知的合适方法实现，例如，通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换高效液相色谱(HPLC)(例如，如Pearson和Regnier,J.Chrom.,255:137-149,1983中所述)来实现。
竞争物长度
在一些实施方式中，在多重扩增试验中使用多种竞争物。在一些情况中，针对特定区域所用的竞争物的长度相同。在一些实施方式中，针对不同区域所用的竞争物的长度不同。竞争物的长度可以是，例如，至少约30个碱基对～约500个碱基对。在一些实施方式中，竞争物的长度可以是至少约50个碱基对～约200个碱基对。在一些实施方式中，竞争物的长度可以是至少约100个碱基对～约150个碱基对。在一些实施方式中，竞争物的长度可以是至少约115个碱基对～约125个碱基对。例如，竞争物的长度可以是约115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个碱基对。本文提供的方法中可使用的竞争者寡核苷酸的非限制性示例示于SEQ ID NO:21～28。
在一些实施方式中，所述竞争物具有填充序列。填充序列通常是与所述靶核苷酸序列没有任何序列相似性的核苷酸序列。通常向所述竞争物添加填充物以通过长度把所述竞争物的扩增产物和所述靶核苷酸序列的扩增产物区分开。填充序列可包含在所述竞争者寡核苷酸的任何位置。在一些实施方式中，在所述竞争者寡核苷酸的一个或多个位置包含所述填充序列，所述位置为(i)与正向引物互补的核苷酸序列的下游，和(ii)与反向引物互补的核苷酸序列的上游。在一些情况中，所述填充序列是邻近序列。在一些情况中，所述填充序列以竞争者寡核苷酸中的两个或更多个片段形式存在。就本文提供的方法而言，当提及填充序列时使用的术语“序列长度”指核苷酸序列的邻近长度或核苷酸序列片段长度的总和。在一些实施方式中，填充序列来自与靶基因组不同的基因组。例如，若所述靶基因组是人的，则所述填充序列将常选自非人基因组。就所述靶核苷酸序列来自人基因组的实施方式而言，竞争物填充序列可来自本领域已知的任何非人基因组，例如，非哺乳动物基因组、植物基因组、真菌基因组、细菌基因组或病毒基因组。在一些实施方式中，所述填充序列来自PhiX174基因组。在一些实施方式中，所述填充序列不来自基因组DNA，并且有时是合成的。
在一些实施方式中，就针对给定区域的各组竞争物而言，所述竞争物具有长度(或片段长度的总和)独特或恒定的填充序列。针对不同区域的竞争物常具有长度(或片段长度的总和)不同或可变的填充序列。本文中所用的术语“恒定长度”指一种或多种核苷酸序列(例如填充序列)的核苷酸序列长度相同。本文中所用的术语“可变长度”指一种或多种核苷酸序列(例如填充序列)的核苷酸序列长度不同。竞争物填充序列可以是合适于本文提供方法的任何长度。例如，竞争物填充序列的长度可以是至少约1个碱基对～约100个碱基对。在一些实施方式中，所述填充序列的长度是至少约15个碱基对～约55个碱基对。在一些实施方式中，所述填充序列可以由若干较短的填充序列组成。如果扩增子在PCR过程中趋于形成二级结构则可采用这种设计。例如，所述填充序列的长度可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55个碱基对。本文中提供了使用单一或多种填充序列的竞争物设计的示例，并示于实施例1的表3中。
扩增的竞争物可任选地通过使用加尾扩增引物来进一步互相区分，所述引物含有不同长度的额外非杂交性核苷酸序列。下文将对此进行进一步详细描述。
标记的竞争物
在一些实施方式中，所述竞争者寡核苷酸可通过检测可检测标记、分子或实体或“信号生成部分”(例如，荧光团、放射性同位素、比色剂、颗粒、酶等)来检测。如本文所用术语“信号生成”指能提供可检测效应或可定量效应并能与核酸结合的任何原子或分子。在某些实施方式中，可检测标记生成独特的光信号、荧光信号、发光信号、电性质、化学性质、磁力性质等。
在某些实施方式中，可使用本领域技术人员已知的任何方法修饰所述寡核苷酸以包含可检测标记。所述标记可作为合成的部分掺入，或在本文所述的任何方法使用所述引物之前加入。标记的掺入可在液相或者固相中进行。在一些实施方式中，可检测标记可用于检测靶标。在一些实施方式中，可检测标记可用于定量分析靶核酸(例如，测定特定序列或核酸物质的拷贝数)。技术人员可适当选择并利用适用于检测系统中相互作用或者生物活性的任何可检测的标记。可检测标记的示例有：荧光标记如或标签荧光素、罗丹明(rhodamine)及其它(例如Anantha等，Biochemistry(1998)37:27092714；和Qu和Chaires，Methods Enzymol.(2000)321:353369)；放射性同位素(例如125I、131I、35S、31P、32P、33P、14C、3H、7Be、28Mg、57Co、65Zn、67Cu、68Ge、82Sr、83Rb、95Tc、96Tc、103Pd、109Cd和127Xe)；光散射标记(例如美国专利第6,214,560号、以及加州杰尼康科学公司(Genicon SciencesCorporation)的市售产品)；化学发光标记和酶底物(例如二氧杂环丁烷和吖啶酯)；酶标记或蛋白质标记(例如绿色荧光蛋白(GFP)或其颜色变体、萤光素酶、过氧化物酶)；其它生色标记或染料(例如菁)、和其它辅因子或生物分子如地高辛、链霉亲和素、生物素(例如，如生物素和亲和素的结合对的成员)、亲和捕获部分等。其它可检测标记包括但不限于，核苷酸(带标记或不带标记)、复合体(compomer)、糖、肽、蛋白、抗体、化学物质、导电聚合物、结合部分如生物素、质量标签(mass tag)、比色剂、发光剂、放射性标签、负荷标签(荷电或磁)、挥发标签和疏水标签、生物分子(如抗体/抗原、抗体/抗体、抗体/抗体片段、抗体/抗体受体、抗体/蛋白A或蛋白G、半抗原/抗半抗原、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白、维生素B12/特性因子、化学反应基团/互补化学反应基团(如巯基/马来酰亚胺、巯基/卤化乙酰衍生物、胺/异硫氰酸酯、胺/琥珀酰亚胺酯和胺/磺酰卤化物)等结合对的成员)等。在一些实施方式中，探针可含有信号生成部分，所述部分与靶杂交、改变靶核酸通过纳米孔的通路并且能在当其通过纳米孔从核酸上释放(例如，改变通过已知大小的孔的速度或时间)时生成信号。在一些实施方式中，引物可以用亲和捕获部分标记。可检测的标记中还包含用于质量修饰以用于质谱检测(例如基体辅助激光解吸电离(MALDI)质谱和电喷雾(ES)质谱)的那些标记。
在一些实施方式中，所述可检测标记是荧光团。荧光团是分子中的官能团，其能吸收特定波长的能量，然后以不同(但等同特定的)波长再发射能量。所发射能量的量和波长视所述荧光团和该荧光团的化学环境而定。本领域已知的任何荧光团都可与本文提供方法联用，所述荧光团包含例如，荧光素异硫氰酸酯(FITC)、呫吨衍生物(例如，荧光素、罗丹明(TRITC)、俄勒冈绿、伊红、德克萨斯红、Cal Fluor)、花青衍生物(例如，花青、吲哚羰花青、噁羰花青、硫羰花青、部花青、Quasar)、萘衍生物(例如，丹酰和氟硅酸钠衍生物)、香豆素衍生物、噁二唑衍生物(例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑)、芘衍生物(例如，级联蓝(cascade blue))、噁嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170)、吖啶衍生物(例如，二氨基吖啶、吖啶橙、吖啶黄)、芳基甲川衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀石绿)、四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁、胆红素)、CF DYE(Biotium公司)、BODIPY(英杰公司(Invitrogen))、ALEXA FLUOR(英杰公司)、DYLIGHT FLUOR(热科学公司(ThermoScientific)，皮尔斯(Pierce))、ATTO和TRACEY(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))、FLUOPROBES(英特奇姆公司(Interchim))和MEGASTOKES DYES(戴欧米克斯公司(Dyomics))。在一些实施方式中，就给定区域的各组竞争物而言，所述竞争物具有独特的荧光团。针对不同区域的竞争物常具有不同荧光团。
用于区分少数核酸和多数核酸的特征
在本文提供方法的一些实施方式中，少数核酸所具有的特征存在于所述少数核酸中但不存在于所述多数核酸中。在本文提供方法的一些实施方式中，少数核酸所具有的特征不存在于所述少数核酸中但存在于所述多数核酸中。所述存在或不存在于少数核酸中的特征可以是能够区分所述少数核酸和多数核酸的任何特征，例如，序列旁系同源物或序列变体(例如，单核苷酸多态性(SNP)、添加、插入、删除)或特定表观遗传学状态。本文所用术语"表观遗传学状态"或"表格遗传学状况"指除了一级核苷酸序列外的核酸(例如，DNA或RNA)分子水平上的任何结构特征。例如，基因组DNA的表观遗传学状态可包含二级或三级结构，所述二级或三级结构例如由其甲基化模式或其与细胞蛋白或胞外蛋白的关联性所决定或影响。
甲基化
在一些实施方式中，区分少数核酸和多数核酸的特征是甲基化状态。本文所用的术语"甲基化状态"、“甲基化概况”或"甲基化状况"描述基因组序列的甲基化状态，指DNA区段在特定基因组基因座处与甲基化相关的特征。此类特征包括但不限于：DNA序列内的任意胞嘧啶(C)残基是否被甲基化，一个或多个甲基化的C残基的位置，在任意特定残基片段上甲基化的C的百分数，和甲基化中例如由于等位基因的来源差异造成的等位基因的差异。上述术语还指生物样品中在残基的任意特定片段的甲基化的C或未甲基化的C的相对或绝对浓度。例如，若DNA序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基已甲基化，其可称作“高甲基化”；而若DNA序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基未甲基化，其可称作“低甲基化”。同样，若DNA序列(例如，胎儿核酸)内的一个或多个胞嘧啶(C)残基与来自不同区域或来自不同个体(例如相对母体核酸)的另一序列相比已甲基化，那么该序列与所述其它序列相比视为高甲基化。或者，若DNA序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基与来自不同区域或来自不同个体(例如，母亲)的另一序列相比未甲基化，那么该序列与所述其它序列相比视为低甲基化。这些序列表述为“差异甲基化”，且更具体地，当母亲和胎儿之间的甲基化状态不同时，所述序列视为“差异甲基化的母体和胎儿核酸”。例如，在PCT公开号WO2010/033639中描述了胎儿核酸中的差异甲基化位点的方法和示例。
本文所用的“甲基化核苷酸”或"甲基化核苷酸碱基"指核苷酸碱基上存在甲基部分，其中所述甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不含甲基部分，但5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的位置5处含有甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化的核苷酸而5-甲基胞嘧啶是甲基化的核苷酸。在另一示例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的位置5处含有甲基部分，但就本文目的而言，胸腺嘧啶存在于DNA中时不视为甲基化的核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。DNA的典型核苷酸碱基是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤。RNA的典型碱基是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤。相应地，"甲基化位点"是靶基因核酸区域中发生或可能发生甲基化的位置。例如，含有CpG的位置是甲基化位点，其中的胞嘧啶可以被或未被甲基化。此类甲基化位点易被甲基化，所述甲基化通过体内天然产生或者通过体外设定将核苷酸化学甲基化。
本文所用“含一个或多个CpG位点的核酸”或"含CpG的基因组序列"指个体(如人胎儿或妊娠女性)基因组内指定位置处的DNA序列区段。通常，"含CpG的基因组序列"至少长15个核苷酸，且含有至少一个胞嘧啶。其通常可以长至少30、50、80、100、150、200、250或300个核苷酸且含有至少2、5、10、15、20、25或30个胞嘧啶。对于给定位置处(如以给定遗传基因座为中心的区域内)的任何一个"含CpG的基因组序列"而言，核苷酸序列变化可在个体间存在，且甚至就同一个体而言还可在等位基因间存在。通常，此类以给定遗传基因座(例如，CpG岛)为中心的区域含有所述基因座以及上游序列和/或下游序列。所述上游序列或下游序列(分别从所述遗传基因座的5'或3'边界计数)可以各自长达10kb，在其它情况中可以长达5kb、2kb、1kb、500bp、200bp或100bp。此外，"含CpG的基因组序列"可涵盖就蛋白生成而言转录的或未转录的核苷酸序列，且所述核苷酸序列可以是基因间序列、基因内序列、蛋白编码序列、非蛋白编码序列(例如转录启动子)、或其组合。本文所用的"CpG岛"描述DNA序列区段，所述片段具有在功能性或结构性有偏差的CpG密度。CpG岛通常可以是，例如，长至少400个核苷酸，具有大于50%的GC含量，和大于0.6的OCF/ECF比例。在一些情况中，CpG岛可以表征为长至少200个核苷酸的、具有大于50%的GC含量和大于0.6的OCF/ECF比例。
在一些实施方式中，在提供用于本文所述方法的核酸之前，可使核酸暴露于修饰该核酸中某些核苷酸的方法。例如，可对核酸样品使用根据核酸中核苷酸的甲基化状态来选择性修饰核酸的方法。按照反映核酸分子的甲基化模式的方式修饰核酸分子的方法为本领域已知，其示例参见美国专利第5,786,146号以及美国专利公开第20030180779和20030082600号。例如，核酸中未经甲基化的胞嘧啶核苷酸可通过亚硫酸氢盐处理转化成尿嘧啶，这一处理不改变甲基化的胞嘧啶。
核酸切割
在本文提供方法的一些实施方式中，使所述核酸暴露于一种或多种切割试剂。本文中所用的术语“切割试剂”指一种试剂，有时是一种化学品或酶，其可以在一个或多个特异性或非特异性位点切割核酸。特异性切割试剂通常根据特定的核苷酸序列在特定位点进行特异性切割。在一些情况中，在扩增之前使所述核酸暴露于一种或多种切割试剂。在一些情况中，在扩增之后使所述核酸暴露于一种或多种切割试剂。在一些情况中，在扩增之前和扩增之后使所述核酸暴露于一种或多种切割试剂。
酶切割试剂的例子包括但不限于：内切核酸酶(例如，DNA酶(例如DNA酶I、II)；RNA酶(例如RNA酶E、F、H、P)；CLEAVASE酶；TAQ DNA聚合酶；大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I和真核结构特异性内切核酸酶；鼠FEN-1内切核酸酶；I、II或III型限制性内切核酸酶(即，限制性酶)如Acc I、AciI、Afl III、Alu I、Alw44I、Apa I、Asn I、Ava I、Ava II、BamH I、BanII、Bcl I、Bgl I.Bgl II、Bln I、Bsm I、BssH II、BstE II、BstUI、Cfo I、CIa I、Dde I、DpnI、Dra I、EcIX I、EcoR I、EcoR I、EcoR II、EcoR V、Hae II、Hae II、HhaI、Hind II、HindIII、Hpa I、Hpa II、Kpn I、Ksp I、MaeII、McrBC、Mlu I、MIuN I、Msp I、Nci I、Nco I、NdeI、Nde II、Nhe I、Not I、Nru I、Nsi I、Pst I、Pvu I、Pvu II、Rsa I、Sac I、Sal I、Sau3AI、Sca I、ScrF I、Sfi I、Sma I、Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Sty I、Swa I、Taq I、Xba I、Xho I；糖基化酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶II、嘧啶水合DNA糖基化酶、FaPy-DNA糖基化酶、胸腺嘧啶错配DNA糖基化酶、次黄嘌呤-DNA糖基化酶、5-羟甲基尿嘧啶DNA糖基化酶(HmUDG)、5-羟甲基胞嘧啶DNA糖基化酶或1,N6-亚乙烯基-腺嘌呤DNA糖基化酶)；外切核酸酶(例如外切核酸酶I、外切核酸酶II、外切核酸酶III、外切核酸酶IV、外切核酸酶V、外切核酸酶VI、外切核酸酶VII、外切核酸酶VIII)；核酶和DNA酶。
甲基化敏感的限制性酶消化
在本文提供方法的一些实施方式中，用一种或多种甲基化敏感的限制性酶处理所述核酸。如本文所用，“甲基化敏感的限制性酶”或“甲基化敏感的酶”是在其DNA识别序列处(若未经甲基化)优先或充分切割或消化的限制性酶。因此，用甲基化敏感的限制性酶处理的、未经甲基化的DNA样品会被消化成小片段，而甲基化或高甲基化的DNA样品会保持基本不被消化。相反，也有在其DNA识别序列处(仅当其被甲基化时)切割的甲基化敏感的酶的例子。仅消化甲基化DNA的酶的例子包括但不限于：DpnI(其在识别序列GATC处切割)和McrBC(其切割含有经修饰的胞嘧啶的DNA)(马萨诸塞州贝弗利的NEB公司(New EnglandInc))。
适用于本文提供方法的、消化未甲基化DNA的甲基敏感的酶包括但不限于：HpaII、HhaI、MaeII、BstUI和AciI。在一些实施方式中，能使用仅消化未甲基化DNA的两种或更多种甲基敏感的酶的组合。在一些实施方式中，使用仅切割未甲基化序列CCGG的HpaII。在一些实施方式中，使用仅切割未甲基化序列GCGC的HhaI。这两种酶都可从马萨诸塞州贝弗利的NEB公司获得。
针对用于在特定位点切割DNA的、选定的限制性酶的切割方法和过程为本领域技术人员所熟知。例如，很多限制性酶的供应商提供了关于用特定限制性酶切割的条件和DNA序列类型的信息，所述供应商包括NEB公司、普洛麦格生化公司(Pro-Mega Biochems)、宝灵曼公司(Boehringer Mannheim)等。Sambrook等(见Sambrook等，Molecular Biology:Alaboratory Approach(《分子生物学：实验室手册》)，纽约州冷泉港，1989)提供用于使用限制性酶和其它酶的方法的概述。酶通常在能以约95%-100%、优选以约98%-100%的效率切割DNA的条件下使用。
外切核酸酶处理
在本文提供方法的一些实施方式中，用外切核酸酶处理所述核酸。外切核酸酶是通过水解反应从多核苷酸链的末端一次切割一个核苷酸来起作用的酶，所述水解反应在3’或5’末端断裂磷酸二酯键。本文提供方法可使用本领域已知的任何外切核酸酶，例如，5’～3’外切核酸酶(例如，外切核酸酶II)、3’～5’外切核酸酶(例如，外切核酸酶I)和聚(A)特异性3’～5’外切核酸酶。在一些实施方式中，可任选地用外切核酸酶处理所述核酸以除去任何污染核酸，例如单链PCR引物。该步骤通常在核酸扩增完成之后进行。在一些实施方式中，使用单链特异性外切核酸酶。在一些实施方式中，使用外切核酸酶I。
基因组DNA靶序列
在本文提供方法的一些实施方式中，靶向一种或多种核酸物质，有时靶向一种或多种核苷酸序列物质来扩增和定量。在一些实施方式中，所述靶核酸是基因组DNA序列。例如，使用某些基因组DNA靶序列是因为它们能够对给定试验测定特定特征。本文中，基因组DNA靶序列可指用于给定试验的标志物。在一些实施方式中，多于一种基因组DNA靶序列或标志物能够对给定试验测定特定特征。此类基因组DNA靶序列被视作特定“区域”。本文中所用的“区域”不意在限制对基因组位置(例如特定染色体、染色体DNA段或基因座)的描述。相反，本文中使用术语“区域”来鉴别一种或多种基因组DNA靶序列或标志物的集合，所述系列或标志物能指示特定的试验。此类试验可包括但不限于：用于检测和定量少数核酸物质的试验、用于检测和定量多数核酸的试验、用于检测和定量总DNA的试验、用于检测和定量甲基化DNA的试验、用于检测和定量胎儿特异性核酸(例如，Y染色体DNA)的试验，以及用于检测和定量消化的和/或未消化的DNA(作为消化效率指示剂)的试验。在一些实施方式中，所述基因组DNA靶序列被描述为位于特定基因组基因座内。本文中所用的基因组基因座可包括下面任何一种或其结合：开放阅读框DNA、非转录DNA、内含子序列、外显子序列、启动子序列、增强子序列、侧接序列，或者本领域技术人员视为与给定基因组基因座相关联的任何序列。
测定甲基化DNA的试验
在本文提供方法的一些实施方式中，使用能够允许测定甲基化DNA的一种或多种基因组DNA靶序列。一般而言，用于测定甲基化DNA的基因组DNA靶序列在所述少数物质和多数物质中被差异甲基化，从而根据本文提供方法就甲基化敏感的限制性酶而言被差异性消化。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列是单拷贝基因。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体13上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体18上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体21上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体X上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于Y染色体上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列通常在一种DNA物质(例如，胎盘DNA)中甲基化(即，至少约50%或更多甲基化)。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在另一种DNA物质(例如，母体DNA)中被最低程度地甲基化(即，少于约1%甲基化)。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的单核苷酸多态性(SNP)。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的突变。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的插入或删除。在一些情况中，能与基因组DNA靶序列杂交的PCR引物的解链温度不低于65℃。在一些情况中，能与基因组DNA靶序列杂交的PCR引物的解链温度不高于75℃。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述扩增区域中包含至少两个限制性位点。在一些情况中，所述限制性位点序列是GCGC。在一些情况中，所述限制性位点序列是CCGG。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述扩增区域内包含限制性位点序列GCGC和CCGG的组合。在一些实施方式中，所述基因组DNA靶序列的长度是约50个碱基对～约200个碱基对。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列的长度是70个碱基对。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列就使用mfold预测完整扩增子的二级结构而言不具有任何负ΔG值(M.Zuker,Mfold web server for nucleic acid folding andhybridization prediction(用于核酸折叠和杂交预测的Mfold网络服务器).NucleicAcids Res.31(13),3406-15,(2003))。在一些实施方式中，用于测定甲基化DNA的基因组DNA靶序列在TBX3基因座内。TBX3基因组靶序列的一个示例示于SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，用于测定甲基化DNA的基因组DNA靶序列在SOX14基因座内。SOX14基因组靶标的一个示例示于SEQ ID NO:30。可与本文提供方法联合以用于测定甲基化DNA的其它基因组靶标示于实施例10中的表14和表15。
测定总DNA的试验
在本文提供方法的一些实施方式中，使用能够允许测定总DNA的一种或多种基因组DNA靶序列。用于测定总DNA的基因组DNA靶序列通常存在于各基因组拷贝中(例如，存在于胎儿DNA和母体DNA、癌DNA和正常DNA、病原体DNA和宿主DNA中)。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列是单拷贝基因。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体13上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体18上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体21上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体X上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于Y染色体上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的单核苷酸多态性(SNP)。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的突变。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的插入或删除。在一些情况中，能与基因组DNA靶序列杂交的PCR引物的解链温度不低于65℃。在一些情况中，能与基因组DNA靶序列杂交的PCR引物的解链温度不高于75℃。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述扩增区域中不包含限制性位点GCGC。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述扩增区域中不包含限制性位点CCGG。在一些实施方式中，所述基因组DNA靶序列的长度是约50个碱基对～约200个碱基对。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列的长度是70个碱基对。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列就使用mfold预测完整扩增子的二级结构而言不具有任何负ΔG值(M.Zuker,Mfold web server for nucleic acid folding and hybridizationprediction(用于核酸折叠和杂交预测的Mfold网络服务器).Nucleic Acids Res.31(13),3406-15,(2003))。在一些实施方式中，用于测定总DNA的基因组DNA靶序列在POP5基因座内。POP5基因组靶序列的一个示例示于SEQ ID NO:31。在一些实施方式中，用于测定总DNA的基因组DNA靶序列在APOE基因座内。APOE基因组靶标的一个示例示于SEQ ID NO:32。
测定胎儿DNA的试验
在本文提供方法的一些实施方式中，使用能够允许测定胎儿DNA的一种或多种基因组DNA靶序列。在一些实施方式中，用于测定胎儿DNA的基因组DNA靶序列是Y染色体特异的。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列是单拷贝基因。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的单核苷酸多态性(SNP)。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的突变。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的插入或删除。在一些情况中，能与基因组DNA靶序列杂交的PCR引物的解链温度不低于65℃。在一些情况中，能与基因组DNA靶序列杂交的PCR引物的解链温度不高于75℃。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述扩增区域中不包含限制性位点GCGC。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述扩增区域中不包含限制性位点CCGG。在一些实施方式中，所述基因组DNA靶序列的长度是约50个碱基对～约200个碱基对。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列的长度是70个碱基对。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列就使用mfold预测完整扩增子的二级结构而言不具有任何负ΔG值(M.Zuker,Mfold web server for nucleic acid folding andhybridization prediction(用于核酸折叠和杂交预测的Mfold网络服务器).NucleicAcids Res.31(13),3406-15,(2003))。在一些实施方式中，用于测定胎儿DNA的基因组DNA靶序列在UTY基因座内。UTY基因组靶序列的一个示例示于SEQ ID NO:33。在一些实施方式中，用于测定胎儿DNA的基因组DNA靶序列在DDX3Y基因座内。DDX3Y基因组靶的一个示例示于SEQ ID NO:34。
用于测定消化的和/或未消化的DNA的试验
在本文提供方法的一些实施方式中，使用一种或多种基因组DNA靶序列，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。此类基因组DNA靶序列存在于样品的各基因组(例如，多数物质和少数物质基因组)中。用于测定消化的或未消化的DNA的基因组DNA靶序列通常包含至少一个限制性位点，所述限制性位点存在于用于其它试验的基因组DNA靶序列中。因此，用于检测消化的或未消化的DNA的基因组DNA靶序列作为包含差异性消化的试验的对照。所述基因组DNA靶序列在测试的全部核酸物质中通常是未甲基化的(例如，在多数物质和少数物质基因组中未甲基化)。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述扩增区域内包含至少一个限制性位点GCGC。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述扩增区域内包含至少一个限制性位点CCGG。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述扩增区域内准确包含一个限制性位点GCGC，并在所述扩增区域内准确包含一个限制性位点CCGG。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列是单拷贝基因。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体13上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体18上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体21上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于染色体X上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列不位于Y染色体上。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的单核苷酸多态性(SNP)。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的突变。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列在所述PCR引物杂交序列中不包含任何已知的插入或删除。在一些情况中，与基因组DNA靶序列杂交的PCR引物的解链温度不低于65℃。在一些情况中，与基因组DNA靶序列杂交的PCR引物的解链温度不高于75℃。在一些实施方式中，所述基因组DNA靶序列的长度是约50个碱基对～约200个碱基对。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列的长度是70个碱基对。在一些情况中，所述基因组DNA靶序列就使用mfold预测完整扩增子的二级结构而言不具有任何负ΔG值(M.Zuker,Mfold web server fornucleic acid folding and hybridization prediction(用于核酸折叠和杂交预测的Mfold网络服务器).Nucleic Acids Res.31(13),3406-15,(2003))。在一些实施方式中，用于测定消化的或未消化的DNA的基因组DNA靶序列在POP5基因座内。POP5基因组靶序列的一个示例示于SEQ ID NO:35。在一些实施方式中，用于测定消化的或未消化的DNA的基因组DNA靶序列在LDHA基因座内。LDHA基因组靶标的一个示例示于SEQ ID NO:36。
扩增
在本本提供方法的一些实施方式中，使用合适的扩增方法来扩增核酸物质。如果一种或多种核酸物质以低拷贝数存在，则可能需要特异性扩增核苷酸序列物质。本文中，特定核酸物质的扩增产物(扩增子)称作“扩增的核酸物质”。核酸扩增常涉及酶合成核酸扩增子(拷贝)，所述核酸扩增子含有与待扩增核苷酸序列物质互补的序列。扩增核酸物质和检测合成的扩增子能改进试验的灵敏度(这是因为在该试验开始时需要较少的靶序列)并能帮助检测和定量核酸物质。
术语“扩增”、“扩增反应”或“进行扩增”指用于将核酸靶序列拷贝进行倍增的任何体外方法。有时，扩增指靶核酸的“指数”增加。然而，本文所用的“扩增”也可指选定核酸靶序列数量的线性增加，但是不同于一次、单引物延伸步骤。在一些实施方式中，能进行有限扩增反应，也称为预扩增。预扩增是一种因为进行的循环次数少(例如10轮循环)而发生有限量扩增的方法。预扩增可允许一定的扩增，但在指数期之前停止扩增，并通常产生所需一个或多个所需核苷酸序列的约500个拷贝。例如，采用预扩增还可限制在标准PCR反应中与反应物耗尽相关的不准确性，并且还能降低因所述靶标的核苷酸序列或物种丰度而引起的扩增偏差。在一些实施方式中，可进行一次引物延伸作为线性或指数扩增的开场。
能使用任何合适的扩增技术。多核苷酸扩增的示例包括但不限于，聚合酶链式反应(PCR)；连接扩增(或连接酶链式反应(LCR))；基于应用Q-β复制酶或模板依赖性聚合酶的扩增方法(参见美国专利公开号US20050287592)；解旋酶依赖性等温扩增(Vincent等，"Helicase-dependent isothermal DNA amplification(解旋酶依赖性等温DNA扩增)".EMBO reports5(8):795–800(2004))；链置换扩增(SDA)；基于嗜热SDA核酸序列的扩增(3SR或NASBA)以及转录相关扩增(TAA)。PCR扩增方法的非限定性示例包括标准PCR、AFLP-PCR、等位基因特异性PCR、Alu-PCR、不对称PCR、菌落PCR、热起始PCR、反向PCR(IPCR)、原位PCR(ISH)、序列间特异性PCR(ISSR-PCR)、长PCR、多重PCR、巢式PCR、定量PCR、逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时PCR、单细胞PCR、固相PCR、其组合等。进行PCR的试剂和硬件市售可得。
在此提供扩增过程的概述。例如使引物与靶核酸接触，然后互补序列彼此退火。引物可在感兴趣序列或其附近(例如相邻、毗邻等)处与靶核酸退火。在提及感兴趣核苷酸序列时，术语“接近”或“邻近”指引物末端与所述一个或多个感兴趣核苷酸之间的距离或区域。如本文所用，毗邻是在约5个核苷酸～约500个核苷酸的范围内(例如，距离感兴趣核苷酸约5个核苷酸、距离感兴趣核苷酸约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约150个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个或约500个核苷酸)。在一些实施方式中，所述组内引物在距离感兴趣核酸序列约10个～30个核苷酸内杂交并产生扩增产物。在一些实施方式中，所述引物在感兴趣核酸序列内杂交。
向引物-靶核酸混杂物中添加含有酶功能必要组分的反应混合物，然后在合适条件下发生扩增。扩增反应的组分可包括但不限于，例如引物(如单引物、引物对、引物组等)、多核苷酸模板(如靶核酸)、聚合酶、核苷酸、dNTP等。在一些实施方式中，例如可以使用非天然产生的核苷酸或核苷酸类似物，例如含有可检测标记(例如荧光或比色标记)的类似物。聚合酶可由普通技术人员选择，并且包括用于热循环扩增的聚合酶(如Taq DNA聚合酶;Q-BioTM Taq DNA聚合酶(缺失5’-3’外切酶活性的重组截短形式的Taq DNA聚合酶);SurePrimeTM聚合酶(经化学修饰的用于"热启动"PCR的Taq DNA聚合酶);ArrowTM Taq DNA聚合酶(高灵敏度及长模板扩增))和用于热稳定扩增的聚合酶(例如互联网址URL“gen-probe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf”中所述用于转录介导的扩增(TMA)的RNA聚合酶)。例如，可添加其它酶组分如用于转录介导的扩增(TMA)反应的逆转录酶。
PCR条件可取决于引物序列、靶的丰度和所需扩增量，并且因此本领域技术人员可从多种可用的PCR方案中选择(参见例如美国专利第4,683,195和4,683,202号；和PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990)。数字PCR也为本领域技术人员已知；参见例如2007年2月2日提交的美国专利申请公开号20070202525，通过引用纳入本文)。PCR通常用热稳定性酶以自动过程来进行。该过程中，反应混合物的温度在变性步骤、引物退火步骤与延伸反应步骤之间循环。一些PCR方案还包括活化步骤和终延伸步骤。特定适于该目的的机器市售可得。对本文所述实施方式合适的PCR方案的非限制性示例是：在95℃处理样品5分钟；重复95℃45秒和68℃30秒的三十五轮循环；然后在72℃处理该样品3分钟。可任选将完成的PCR反应留在4℃直至需要进行进一步反应。通常使用市售可得的热循环仪进行多轮循环。在某些实施方式中，也可使用本领域技术人员已知和选用的合适等温扩增方法。
在一些实施方式中，扩增产物可包括天然产生的核苷酸、非天然产生的核苷酸、核苷酸类似物等及上述物质的组合。扩增产物常具有与样品核酸核苷酸序列或其互补体相同或基本相同的核苷酸序列。扩增产物中“基本相同”的核苷酸序列通常与被扩增的核苷酸序列物质或其互补体具有高度序列相同性(例如，序列相同性约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或超过99%)，变化有时是用于延伸和/或扩增的聚合酶失真或用于扩增的引物中添加额外的核苷酸序列所致。
在某些实施方式中，核酸扩增能产生不同或基本相似核酸序列的额外核酸物质。在本文所述的某些实施方式中，序列定量可使用污染的或额外的核酸物质例如本文提供的竞争者寡核苷酸，所述污染或额外核酸物质可包含与感兴趣序列基本互补或可基本相同的序列，前提是污染或额外序列的水平保持恒定，从而可作为水平基本可再现的可靠标志物。可影响序列扩增再现性的其它考虑因素是：PCR条件(循环数、反应体积、引物对间解链温度差异等)、样品中靶核酸的浓度(例如母体核酸背景中的胎儿核酸，宿主背景中的病毒核酸)、感兴趣核苷酸物质(例如旁系同源物序列)所处染色体的数量、制备样品的质量变化等。本文所用术语“基本再现”或“基本可再现”指在基本相似条件下以基本相同方式，在约75%或更多时间，约80%、约85%、约90%、约95%或约99%或更多时间产生的结果(例如可定量的核酸含量)。
通常在以基本可再现水平扩增该物质的条件下扩增各扩增核酸物质。在该情况中，如本文所用术语“基本可再现的水平”指就每单位核酸(例如，每单位含有特定扩增核苷酸序列物质的核酸)的特定扩增核酸物质而言扩增水平的一致性。在某些实施方式中，在对产生特定扩增核酸物质的核酸量进行分解(例如将核酸含量标准化)后，基本可再现的水平变动在约1%或更少范围内。在一些实施方式中，在对产生特定扩增核酸物质的核酸量进行分解后，基本可再现的水平变动在10%、5%、4%、3%、2%、1.5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%或0.001%。或者，基本可再现指任何两次或多次扩增水平的测量在给定均值的特定变异系数(“CV”)范围内。此类CV可以是20%或更少，有时10%或更少，以及有时5%或更少。可在两种或更多种反应和/或两种或更多种所述相同样品类型之间测定两种或更多种扩增水平的检测。
在靶核酸是RNA的一些实施方式中，在所述扩增步骤之前，可合成感兴趣的RNA转录物的DNA拷贝(cDNA)。可通过逆转录合成cDNA，该逆转录可作为单独步骤进行，或均一的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中进行，所述逆转录聚合酶链式反应是为了扩增RNA而改良的聚合酶链式反应。Romero和Rotbart在Diagnostic Molecular Biology:Principlesand Applications(诊断分子生物学：原理及应用)第401-406页；Persing等编著，麦友基金会(Mayo Foundation)，明尼苏达州洛切斯特(Rochester,Minn.)，1993；Egger等，J.Clin.Microbiol.33:1442-1447,1995；和美国专利第5,075,212号中描述了适用于PCR扩增核糖核酸的方法。可使用分支-DNA技术来扩增某些样品(例如母体血液)中的RNA标志物信号。关于分支-DNA(bDNA)信号扩增用于直接定量临床样品中核酸序列的综述参见Nolte，Adv.Clin.Chem.33:201-235,1998。
在某些实施方式中，扩增还可使用数字PCR来完成(参见例如Kalinina等,“Nanoliter scale PCR with TaqMan detection(带TaqMan检测的纳升级PCR).”NucleicAcids Research.25;1999-2004,(1997)；Vogelstein和Kinzler(Digital PCR(数字PCR).Proc Natl Acad Sci USA.96;9236-41,(1999)；PCT专利公开号WO05023091A2；美国专利公开号US20070202525)。数字PCR利用单分子水平上的核酸(DNA、cDNA或RNA)扩增的优势，并为低拷贝数核酸的定量提供高度灵敏的方法。现有用于核酸的数字扩增和分析的系统(例如，公司)。
引物
提供了用于核酸的检测、扩增、定量、测序和分析的引物。本文中所用的术语“引物”指所含核苷酸序列能够在特定感兴趣区域处或附近(例如邻近)与靶核酸杂交或退火的核酸。例如，引物可允许特异性测定靶核酸核苷酸序列或检测所述靶核酸(例如是否存在序列或序列拷贝数)或其特征。引物可以是天然产生的引物或合成引物。本文中所用的术语“特异性的”或“特异性”指一种分子与另一种分子的结合或杂交，例如引物与靶多核苷酸。即，“特异性的”或“特异性”指两种分子之间的识别、接触和形成稳定复合物，相比之下这两种分子中任一个与其它分子的识别、接触或形成复合物显著较低。本文中所用的术语“退火”指两种分子间形成稳定复合物。当提及引物时，术语“引物”、“寡”、或“寡核苷酸”可在文中互换使用。
引物核酸可使用合适的方法设计并合成，并且可以具有合适与感兴趣核苷酸序列杂交(例如所述核酸在液相中或结合于固体支持物)并进行本文所述分析方法的任何长度。引物可基于靶核苷酸序列来设计。在一些实施方式中，引物的长度可以是约10～约100个核苷酸、约10～约70个核苷酸、约10～约50个核苷酸、约15～约30个核苷酸，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸。引物可由天然产生的和/或非天然产生的核苷酸(例如经标记的核苷酸)或其混合物组成。适用于本文所述实施方式的引物可采用已知技术来合成并标记。引物可按固相亚磷酰胺三酯法化学合成，该方法首先由Beaucage和Caruthers在TetrahedronLetts.22:1859-1862(1981)中描述，例如按Needham-VanDevanter等在Nucleic AcidsRes.12:6159-6168,1984中所述用自动合成仪化学合成。引物的纯化可通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换高效液相色谱(HPLC)来实现，例如，如Pearson和Reanier在J.Chrom.255:137-149(1983)中所述。
在一些实施方式中，引物核酸序列(天然产生或合成)的全部或部分可与靶核酸基本互补。本文所述关于序列的“基本互补”指能够彼此杂交的核苷酸序列。可改变杂交条件的严紧性以容许不同量的序列错配。包含的靶序列和引物序列彼此间的互补性为55%或更高、56%或更高、57%或更高、58%或更高、59%或更高、60%或更高、61%或更高、62%或更高、63%或更高、64%或更高、65%或更高、66%或更高、67%或更高、68%或更高、69%或更高、70%或更高、71%或更高、72%或更高、73%或更高、74%或更高、75%或更高、76%或更高、77%或更高、78%或更高、79%或更高、80%或更高、81%或更高、82%或更高、83%或更高、84%或更高、85%或更高、86%或更高、87%或更高、88%或更高、89%或更高、90%或更高、91%或更高、92%或更高、93%或更高、94%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高，或者99%或更高。
与靶核酸序列基本互补的引物还与所述靶核酸序列的互补体基本相同。即，引物与所述核酸的反义链基本相同。本文所述关于序列的“基本相同”是指核苷酸序列彼此间的相同性为55%或更高、56%或更高、57%或更高、58%或更高、59%或更高、60%或更高、61%或更高、62%或更高、63%或更高、64%或更高、65%或更高、66%或更高、67%或更高、68%或更高、69%或更高、70%或更高、71%或更高、72%或更高、73%或更高、74%或更高、75%或更高、76%或更高、77%或更高、78%或更高、79%或更高、80%或更高、81%或更高、82%或更高、83%或更高、84%或更高、85%或更高、86%或更高、87%或更高、88%或更高、89%或更高、90%或更高、91%或更高、92%或更高、93%或更高、94%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、或者99%或更高。确定两个核苷酸序列之间是否基本相同的一种测试是测定共有的相同核苷酸序列的百分比。
引物序列和长度可以影响与靶核酸序列的杂交。根据引物和靶核酸之间的错配度，可采用低、中、高的严紧条件来实现引物/靶标的退火。本文所用的术语“严紧条件”指杂交和洗涤的条件。杂交反应温度条件优化的方法为本领域技术人员已知，可参见纽约约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，N.Y.)出版的Current Protocols in MolecularBiology(《新编分子生物学实验指南》)中6.3.1-6.3.6部分(1989年)。该文献中所述的水性和非水性方法均可采用。严紧杂交条件的非限制性例子是：约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50℃下用0.2X SSC、0.1%SDS洗涤一次或多次。严紧杂交条件的另一个例子是：约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在55℃下用0.2X SSC、0.1%SDS洗涤一次或多次。严紧杂交条件的另一个例子是：约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在60℃下用0.2X SSC、0.1%SDS洗涤一次或多次。严紧杂交条件通常是：约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在65℃下用0.2X SSC、0.1%SDS洗涤一次或多次。更常见地，严紧条件是在65℃下用0.5M磷酸钠、7%SDS处理，然后在65℃下用0.2X SSC、1%SDS洗涤一次或多次。也可通过添加某些有机溶剂如甲酰胺来改变(即降低)严紧杂交温度。有机溶剂(如甲酰胺)降低双链多核苷酸的热稳定性，从而使得杂交可在较低的温度下进行同时仍能保持严谨条件并延长可能不耐热的核酸的使用寿命。可将引物特征应用至探针和寡核苷酸，例如，本文提供的竞争性和抑制性寡核苷酸。
如本文所用表述“杂交”或其语法变形指在低、中、高的严紧条件下或在核酸合成条件下第一核酸分子与第二核酸分子的结合。杂交可包括第一核酸分子与第二核酸分子结合的情况，其中所述第一与第二核酸分子互补。本文中所用的“特异性杂交”指在核酸合成条件下，与不具有互补序列的核酸分子的杂交相比，引物与具有与引物互补序列的核酸分子优先杂交。例如，特异性杂交包含引物与和与该引物互补的靶核酸序列杂交。
在一些实施方式中，引物能包含可与固相核酸引物杂交序列互补或与固相核酸引物杂交序列基本互补的核苷酸亚序列(例如，对齐时与引物杂交序列互补体的相同性为约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%)。引物可含有与固相核酸引物杂交序列不互补或基本不互补的核苷酸亚序列(例如，在所述与固相引物杂交序列互补或基本互补的引物中的核苷酸亚序列的3’或5’端)。
在某些实施方式中，引物可包含修饰，例如一处或多处肌苷、脱碱基位点、锁核酸(locked nucleic acid)、小沟结合物、双链体稳定剂(如吖啶、亚精胺)、Tm改性剂或改变所述引物或探针结合性质的任何改性剂。在某些实施方式中，引物可包含可检测的分子或实体(例如，如上文所述用于标记竞争者寡核苷酸的荧光团、放射性同位素、比色剂、颗粒、酶等)。
引物还可指某种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与靶核酸的亚序列或其它引物杂交，并且促进例如用分子信标检测引物和/或靶核酸。本文中所用的术语“分子信标”指可检测的分子，其中所述分子的可检测性质仅在某些特定条件下可检测，从而使其能够起到特异性和报告性信号的作用。可检测性质的非限制性示例有：光学性质、电学性质、磁力性质、化学性质和通过已知尺寸开口的时间或速度。
在一些实施方式中，所述引物与基因组DNA靶序列互补。在一些情况下，所述正向引物和反向引物与所述基因组DNA靶序列的5’和3’末端杂交。在一些实施方式中，与所述基因组DNA靶序列杂交的引物还与竞争者寡核苷酸杂交，所述竞争者寡核苷酸设计为就与所述引物结合而言与对应的基因组DNA靶序列竞争。在一些情况中，所述引物以相同或相似的杂交效率与所述基因组DNA靶序列以及对应的竞争者寡核苷酸杂交或退火。在一些情况中，所述杂交的效率不同。可在该反应过程中检测基因组DNA靶扩增子和竞争扩增子之间的比率。例如，如果该比例在28轮循环时为1:1，但在35轮循环时为2:1，这可表示在所述扩增反应结束时，所述引物对一个靶标(即，基因组DNA靶标或竞争物)的再退火比另一个靶标快，或变性不如另一个靶标有效。
在一些实施方式中，引物成组使用。如本文中所用，扩增引物组是针对给定区域的一对或多对正向和反向引物。因此，例如，针对区域1扩增基因组靶标(即，靶标1a和1b)的引物被视为引物组。针对区域2扩增基因组靶标(即，靶标2a和2b)的引物被视为不同的引物组。在一些实施方式中，所述扩增特定区域内靶标的引物组还扩增对应的一种或多种竞争者寡核苷酸。在某些实施方式中，多种引物对可构成引物组(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100对)。在一些实施方式中，可使用多个引物组，每组包含一对或多对引物对。
加尾引物
在一些实施方式中，所述引物由杂交序列(即，与靶标杂交或退火的核苷酸)和非杂交序列(即，与靶标不杂交或不退火的核苷酸)组成。在一些实施方式中，所述非杂交序列位于所述引物的5’末端。含有5’非杂交序列的引物在本文中被称作“加尾引物”或“带5’尾部的引物”。5’尾部可具有本文所述的针对引物的任何特征并且可以是任何长度。例如，5’尾部的长度可以是约1～约100个核苷酸。在一些实施方式中，5’尾部的长度可以是约3～约20个核苷酸。例如，5’尾部的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，引物对的正向和反向引物各包含相同长度的5’尾部。在一些实施方式中，引物对的正向和反向引物各自包含不同长度的5’尾部。在一些实施方式中，仅所述正向或所述反向引物包含5’尾部。在一些实施方式中，一种或多种引物不包含5’尾部。在一些实施方式中，一种或多种引物具有5’尾部且一种或多种引物不具有5’尾部。
在本文提供方法的一些实施方式中，正向和反向引物对能各含有不同长度的5’尾部。此类引物可为给定的扩增产物添加特定长度。本文中所用的“总添加长度”指给定引物对的正向引物5’尾部和反向引物5’尾部的合并长度。在一些实施方式中，扩增基因组DNA靶序列和对应竞争者寡核苷酸的引物各包含相同的总添加长度的5’尾部(参见例如，图1)。在一些实施方式中，当针对特定区域扩增多于一种基因组DNA靶序列时，扩增所述基因组DNA靶序列和对应竞争者寡核苷酸的引物各自包含相同的总添加长度的5’尾部。例如，如果基因组靶标1a和基因组靶标1b在相同区域内，那么扩增基因组靶标1a和1b(和对应的竞争者寡核苷酸)的引物将各自包含相同的总添加长度的5’尾部(参见例如，图2)。在一些实施方式中，当针对特定区域扩增多于一种基因组DNA靶序列且测试多于一个区域时，扩增区域内所述基因组DNA靶序列和竞争者寡核苷酸的引物各自包含相同的总添加长度的5’尾部，并在区域间各自包含不同的总添加长度的5’尾部。例如，若基因组靶标1a和基因组靶标1b在区域1内，且基因组靶标2a和基因组靶标2b在区域2内，扩增区域1内基因组靶标(和对应竞争者寡核苷酸)的引物将各自包含与区域2内引物的5’尾部总添加长度不同的、给定的总添加长度的5’尾部(参见例如，图2)。本文提供方法可用的引物的示例示于SEQ ID NO:1-16。
抑制性PCR
在本文提供方法的一些实施方式中，进行抑制性PCR。在一些情况中，希望富集多核苷酸样品中的少数核酸物质。这种富集常涉及选择性减少对多数核酸物质的扩增。该方法比简单地增加扩增反应中所用起始物质的量有优势。首先，这种方法排除了丰富信号与所述引物的非特异性交叉杂交的潜能。第二，其造成中等相关丰度和低丰度信号的增加。这表示，例如，就扩增反应或其它应用中所用的给定量的材料而言，各残留序列(例如，少数核酸物质)以更高比例存在，并且将因此更易被检测、定量和/或分离。第三，其允许定量分析所述扩增产物，所述分析通过基于分离方法(例如电泳)，通过生成以数量上更成比例的不同的扩增产物来完成。
这些方法在单一反应中将所需物质(即，少数核酸物质)的聚合和/或扩增、以及不需要的物质(即，至少一种多数核酸物质)的聚合和/或扩增的抑制或减少进行合并，并因此简化了富集方法。通过将这些步骤合并成单一步骤，将样品(尤其是样品中的低丰度或稀少物质)的损失和/或降解得以最小化。本文提供的方法通常可不需要大量起始材料，并因而可以特别用于分析起始材料的量有限的样品。本文提供的方法可应用于下面任何情况：多核苷酸样品中多核苷酸丰度低、较高丰度多核苷酸防止或干扰低丰度物质的检测或分离。这种高丰度物质的序列特异性的抑制或减少，以及由此的低丰度物质的富集，使人们能够检测、分离和/或分析低丰度多核苷酸，所述低丰度多核苷酸在所述富集之前由于浓度过低而无法容易地被检测或分离。
在一些实施方式中，本文所述方法提供了样品中一种或多种少数核酸物质的富集。这些方法富集样品的少数核酸物质，所述富集通过使样品中的多核苷酸暴露于用于酶促聚合的条件，并同时抑制样品中至少一种多数核酸物质的聚合来进行。至少一种多数核酸物质的聚合抑制导致所述样品中其它较小丰度物质(即，少数核酸)的相对富集。在一些实施方式中，本文提供的方法使用例如序列特异性不可延伸的寡核苷酸，并因而增加一种或多种少数核酸物质的相对比例，所述序列特异性不可延伸的寡核苷酸可优先封闭核酸池内至少一种多数核酸物质的聚合。在一些实施方式中，所述少数核酸物质是胎儿核酸，而所述多数核酸是母体核酸。在一些实施方式中，所述少数核酸物质是来自癌细胞的核酸，而所述多数核酸是来自正常细胞的核酸。在一些实施方式中，所述少数核酸物质是来自病原体(例如，病毒、细菌、真菌)的核酸，而所述多数核酸是宿主核酸。
用于富集样品中少数核酸物质的方法包括，例如抑制性PCR方法。在一些实施方式中，此类方法可涉及，例如，一种或多种抑制性引物的应用。本文中所用的术语“抑制性寡核苷酸”、“抑制剂”、“抑制性引物”、“不可延伸的寡核苷酸”或“封闭引物/封闭的引物”指为减少扩增核酸物质而设计的寡核苷酸。本文中所用的术语“减少”或“降低”在提及扩增使用时指产生的扩增产物的量少于不使用抑制剂时反应产生的扩增产物的量。能以任意程度减少扩增，例如减少约1%～减少约100%。例如，扩增中的减少能是约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
在一些实施方式中，在开始聚合酶扩增反应之前向所述样品中添加一种或多种抑制性寡核苷酸。所述抑制性寡核苷酸对其靶序列退火并产生双链体，所述双链体通过封闭聚合酶(即，引物延伸)的进行或起始来选择性抑制所述靶多核苷酸的扩增。可按本领域已知方法和/或本文提供的用于引物设计和生成的方法来设计并生成抑制性寡核苷酸。抑制性寡核苷酸可具有本文所述的针对引物的任何特征并且可以是任何长度。在一些实施方式中，抑制性寡核苷酸包含与特定核酸物质杂交的序列。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸能与特定基因组DNA靶序列杂交。在一些情况中，所述抑制性寡核苷酸能与特定竞争者寡核苷酸杂交。相同的抑制性寡核苷酸通常能与基因组DNA靶序列及其对应的竞争者寡核苷酸杂交。不意图特别限制所述抑制性寡核苷酸和靶核酸间形成双链体的位点。在一些实施方式中，双链体形成的位点比较接近聚合酶起始的位点。在一些实施方式中，双链体形成的位点比较远离聚合酶起始的位点。在一些情况中，双链体形成的位点与所述聚合酶起始位点重叠或涵盖所述聚合酶起始位点。
在一些实施方式中，根据特定核酸靶标需要的扩增减少程度来决定使用的抑制性寡核苷酸的量。例如，扩增的小幅减少比扩增的大幅减少需要更少拷贝的抑制性寡核苷酸。特定核酸靶标的扩增可减少至少约1%～约100%。例如，特定核酸靶标(例如总核酸标志物)的扩增可减少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。可如下测定扩增试验中使用的抑制剂的量。就各扩增子而言，使用预订量的扩增引物，例如每个反应使用0.2微摩尔PCR引物。就使用抑制剂的扩增子而言，总浓度(PCR引物+抑制剂)保持相同(例如，0.2微摩尔)，但各引物对的比例不同。为了寻找合适的PCR引物/抑制剂的比例，生成了DNA模型系统，所述系统可包含例如90%多数物质和10%少数物质。可进行若干平行反应，其中PCR引物/抑制剂的比例不同，例如引物/抑制剂是9/1、8/2、7/3、6/4、5/5、4/6等。最优比例是当少数物质扩增子生成与多数物质程度相似的扩增产物时的比例。
在一些实施方式中，使用抑制性寡核苷酸对。抑制性寡核苷酸对包括正向和反向抑制性寡核苷酸。本文中所用的正向抑制性寡核苷酸是能够抑制核酸正义链核苷酸延伸的抑制性寡核苷酸。本文中所用的反向抑制性引物是能够抑制核酸反义链核苷酸延伸的抑制性寡核苷酸。在一些实施方式中，使用正向抑制性寡核苷酸。在一些实施方式中，使用反向抑制性寡核苷酸。在一些实施方式中，成组使用抑制性寡核苷酸。本文中所用的抑制性寡核苷酸组是针对给定区域的一对或多对正向和反向抑制性寡核苷酸。因此，例如，抑制针对区域1的基因组靶标(即，靶标1a和1b)扩增的抑制性寡核苷酸被视为抑制性寡核苷酸组。抑制针对区域2的基因组靶标(即，靶标2a和2b)扩增的引物被视为不同的抑制性寡核苷酸组。在一些实施方式中，抑制特定区域内靶标扩增的抑制性寡核苷酸组还能抑制对应的一种或多种竞争者寡核苷酸的扩增。在某些实施方式中，多种抑制性寡核苷酸对可构成抑制性寡核苷酸组(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100对)。在一些实施方式中，可使用多种抑制性寡核苷酸组，每组包含一个或多个抑制性寡核苷酸对。
抑制性寡核苷酸能通过本领域已知的抑制性寡核苷酸的机制和通过本文提供的机制来抑制核酸物质的扩增。除了所述抑制性寡核苷酸保留以序列特异性方式与互补靶标杂交的能力的情况以外，不意图特别限制所述抑制性寡核苷酸的化学结构。本文提供的方法中可使用任何类型的抑制性寡核苷酸，包括但不限于以下任何寡核苷酸：(i)在3’末端核苷酸中核糖的3’位置上缺失羟基基团；(ii)在封闭聚合酶活性的3’末端核苷酸处或其附近的糖、核碱基或核苷酸间连接发生修饰，例如2′-O-甲基；(iii)在其寡聚结构(例如肽核酸(PNA))中不采用核糖磷酸二酯主链；和/或(iv)在3’末端具有一个或多个错配的核苷酸。抑制性寡核苷酸的示例包括但不限于，锁核酸(LNA；参见WO98/22489；WO98/39352；和WO99/14226)、2′-O-烷基寡核苷酸(例如，2′-O-甲基修饰的寡核苷酸；参见Majlessi等，NucleicAcids Research,26(9):2224-2229[1998])、3′修饰的寡脱氧核糖核苷酸、N3′-P5′氨基磷酸酯(NP)寡聚物、MGB-寡核苷酸(小沟结合子连接的寡聚物)、硫代磷酸酯(PS)寡聚物、C1-C4烷基磷酸酯寡聚物(例如甲基磷酸酯(MP)寡聚物)、氨基磷酸酯、β-磷酸二酯寡核苷酸，和α-磷酸二酯寡核苷酸，以及3’错配的寡核苷酸。
在一些情况中，抑制性寡核苷酸可通过使用终止子核苷酸形成。终止子核苷酸是某种核苷酸，所述核苷酸能够通过聚合酶作用来酶促掺入至多核苷酸的3’末端上但不能进一步延伸。因此，终止子核苷酸能经酶促掺入，但不可酶促延伸。终止子核苷酸的示例包括2,3-二脱氧核糖核苷酸(ddNTP)、2′-脱氧、3′-氟代核苷酸5′-三磷酸，及其标记形式。在一些实施方式中，在扩增试验中可将一种或多种抑制性寡核苷酸和竞争者寡核苷酸(例如本文提供的竞争者寡核苷酸)联用。在一些实施方式中，在不包含竞争者寡核苷酸的扩增试验中使用一种或多种抑制性寡核苷酸。在一些实施方式中，扩增试验包含竞争者寡核苷酸但不包含抑制性寡核苷酸。
在一些实施方式中，使用在3’末端包含一个或多个错配核苷酸的一种或多种抑制性寡核苷酸。此类错配核苷酸不与所述靶核酸序列杂交，并从而防止核苷酸延伸的起始和/或进行。抑制性寡核苷酸在3’末端可包含任意数目的错配核苷酸。在一些实施方式中，抑制性寡核苷酸能具有约1～约20个错配的核苷酸。例如抑制性寡核苷酸能具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个错配核苷酸。本文提供方法中可用的抑制性寡核苷酸的示例示于SEQID NO:17-20。
多重扩增
在一些实施方式中，可采用多重扩增方法扩增靶核酸，从而在单次均匀反应中同时扩增多个扩增子。本文中所用的“多重扩增”指PCR的变化，其中通过在一个反应容器中使用多于一对引物(例如，多于一个引物组)可同时完成多个感兴趣靶标的扩增。在一些实施方式中，多重扩增可与另一扩增(例如PCR)方法(例如，巢式PCR或热启动PCR)联用以提高扩增特异性和再现性。在某些实施方式中，例如多重扩增可以以多次重复形式完成，以降低由扩增引入的差异。用于多重试验的设计方法能包含引物和寡核苷酸设计方法与反应设计方法。尽管多重反应涉及更多引物，就多重试验中的引物与寡核苷酸设计而言，单重反应采用相同的引物设计总体方针，例如避免假启动(priming)和引物二聚体。在一些实施方式中，多重扩增能用于定量试验。
在一些实施方式中，使用多重扩增方法扩增一个或多个核酸靶标。在一些实施方式中，使用多重扩增方法扩增10、20、50、100、200、500、1000或更多个核酸靶标。在一些实施方式中，使用多重扩增方法扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核酸靶标。在一些情况中，所述核酸靶标是一个或多个基因组DNA序列。在一些情况中，所述核酸靶标是一种或多种寡核苷酸，例如，本文提供的竞争者寡核苷酸。在一些实施方式中，所述基因组DNA序列与其对应的竞争者寡核苷酸共扩增。用于扩增基因组DNA靶序列的所述引物对通常与扩增对应竞争者寡核苷酸的引物对相同。
扩增子
在一些实施方式中，各扩增的核酸物质独立地具有约10～约1000碱基对的长度。在某些实施方式中，扩增的核酸物质的长度为约20～约500个碱基对。在某些实施方式中，扩增的核酸物质的长度为约30～约250个碱基对，有时长度为约50～约200个碱基对，而有时长度为约65个碱基对～约160个碱基对。因此，在一些实施方式中，各扩增的核酸物质产物的长度独立地是约65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160个碱基对(bp)。
在某些实施方式中，试验中的一种或多种扩增的核酸物质(即，扩增子)长度相同，而有时所述扩增的核酸物质(即，扩增子)长度不同。例如，一种扩增的核酸物质可以比一种或多种其它扩增的核酸物质长约1～100个核苷酸(例如，长了约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或90个核苷酸)。在某些实施方式中，所述靶DNA序列长度相同，而有时所述靶DNA序列长度不同。在一些实施方式中，当针对特定区域扩增一种或多种基因组DNA靶序列时，所述基因组DNA靶序列长度可相同，且所述扩增子长度可相同。在此类情况中，所述扩增子的长度可与所述靶标的长度相同，或者可以由于例如来自加尾引物的额外长度而较长一些。例如，基因组DNA靶标1a和1b的长度相同且扩增子1a和1b彼此的长度相同，但不必需与所述靶标长度相同(即，例如如果扩增使用了加尾引物)。在此类情况中，相同长度的扩增子监测为单个信号(例如，单个电泳图峰)。在一些实施方式中，单个电泳图峰可以是多个独立扩增的靶标的顶点。例如，单一电泳图峰可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个独立扩增的靶标生成。在一些实施方式中，当针对两个或更多个不同区域扩增两种或更多种基因组DNA靶序列时，所述基因组DNA靶序列的长度可相同而所述扩增子的长度可不同。例如，基因组DNA靶标1a和2a的针对不同区域且长度相同；而扩增子1a和2a长度不同。在此类情况中，例如通过使用带有不同长度的5’尾部的引物可实现不同的扩增子长度。在此类情况中，不同长度的扩增子检测为多个信号(例如，两个或更多个电泳图峰)。因此，在多重扩增试验(例如本文提供的多重扩增试验)中，当扩增多种基因组DNA靶序列时，所述基因组靶序列的长度可全部相同而所述扩增子的长度可以不同，从而各扩增子长度表示针对特定区域的一种或多种扩增产物。
在本文提供方法的一些实施方式中，竞争者寡核苷酸和基因组靶DNA序列共扩增。在某些实施方式中，扩增的竞争者寡核苷酸(即，竞争扩增子)的长度相同，而有时所述扩增的竞争者寡核苷酸(即，竞争扩增子)的长度不同。例如，一种扩增的竞争者寡核苷酸可比一种或多种其它扩增的竞争者寡核苷酸长约1～约100个核苷酸(例如，长了约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或90个核苷酸)。在某些实施方式中，所述竞争者寡核苷酸的长度相同，而有时所述竞争者寡核苷酸的长度不同。在一些实施方式中，当针对特定区域扩增对应于一种或多种基因组DNA靶序列的一种或多种竞争者寡核苷酸时，所述竞争者寡核苷酸的长度可相同，并且所述竞争扩增子的长度可相同。在此类情况中，所述竞争扩增子的长度可与所述竞争者寡核苷酸的长度相同，或可由于例如来自加尾引物的额外长度而较长一些。例如，竞争者寡核苷酸Xa和Xb的长度相同，且竞争扩增子Xa和Xb彼此的长度相同，但不必需与所述竞争者寡核苷酸的长度相同(即，例如如果扩增使用了加尾引物)。在一些实施方式中，当针对两个或更多个不同区域扩增对应于基因组DNA靶序列的两种或更多种竞争者寡核苷酸时，所述竞争者寡核苷酸长度能相同或不同，而所述竞争扩增子的长度能不同。例如，竞争者寡核苷酸Xa、Ya和Za对应于不同区域的基因组DNA靶序列。竞争者寡核苷酸Xa和Ya的长度相同而竞争物Za有不同长度；而竞争扩增子Xa、Ya和Za各自长度都不同。在此类情况中，例如通过使用带有不同长度的5’尾部的引物可实现不同的竞争扩增子长度。因此，在多重扩增试验(例如本文提供的多重扩增试验)中，当扩增多种竞争者寡核苷酸时，所述竞争者寡核苷酸的长度可全部相同或不同，而所述竞争扩增子长度可不同，从而各竞争扩增子长度表示对应于特定区域的基因组DNA靶标的一种或多种竞争扩增产物。在多重扩增试验中，例如当多个基因组DNA靶序列和多种对应的竞争者寡核苷酸共扩增时，所述基因组DNA靶序列的长度可全部相同，而所述竞争者寡核苷酸的长度可相同或不同，从而就各检测区域而言所生成的扩增子(例如，通过使用不同长度的加尾引物)是不同的。在此类情况中，各区域将由两种扩增子的长度表示(即，一种扩增子长度针对该区域的一个或多个基因组DNA靶标，而另一种扩增子长度针对一个或多个对应的竞争者寡核苷酸)。
扩增产物的检测
核苷酸序列物质，或扩增的核酸物质，或由前文制备的可检测产物可通过合适的检测方法来检测。检测、定量、测序等方法的非限制性示例包括质量改性扩增子的质量检测(例如，基体辅助激光解吸电离(MALDI)质谱和电喷雾(ES)质谱)、引物延伸法(例如，iPLEXTM；塞昆纳姆公司(Sequenom,Inc.))、直接DNA测序、来自昂飞(Affymetrix)的分子倒置探针(MIP)技术、限制性片段长度多态性(RFLP分析)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)分析、甲基化特异性PCR(MSPCR)、焦磷酸测序分析、无环引物(acycloprime)分析、逆转点印迹、基因芯片微阵列、动态等位基因特异性杂交(DASH)、肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)探针、TaqMan、分子信标、嵌入染料、FRET引物、AlphaScreen、SNPstream、遗传位点分析(geneticbit analysis,GBA)、多重迷你测序、SNaPshot、GOOD测试、微阵列迷你测序(Microarrayminiseq)、阵列引物延伸(APEX)、微阵列引物延伸、标签阵列(Tag array)、编码微球(Codedmicrospheres)、模板定向掺入(TDI)、荧光极化、比色寡核苷酸连接测试(OLA)、序列编码OLA、微阵列连接、连接酶链式反应、锁式探针(Padlock probe)、侵入测试、使用至少一种探针的杂交、使用至少一种荧光标记探针的杂交、克隆和测序、电泳、杂交探针和定量实时聚合酶链式反应(QRT-PCR)的应用、数字PCR、纳米孔测序、芯片及其组合。可采用2007年12月4日提交的美国专利申请第11/950,395号中所述“封闭管”方法进行等位基因或旁系同源物的检测和定量。在一些实施方式中，通过质谱、引物延伸、测序(例如任何合适方法如纳米孔或焦磷酸测序)、定量PCR(Q-PCR或QRT-PCR)、数字PCR、其组合等来确定各扩增核酸物质的量。
电泳
在本文提供方法的一些实施方式中，扩增的核酸序列能使用电泳检测。可使本领域已知的任何电泳方法(由此扩增的核酸按大小分离)和本文提供的方法联用，其包括但不限于标准电泳技术和专用电泳技术，例如毛细管电泳。本领域中可找到使用标准电泳技术来检测和定量靶核酸序列的方法的示例。本文提供了非限制性示例。在使扩增的核酸样品在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中跑动后，可用溴化乙锭对所述凝胶标记(例如，染色)(参见，Sambrook和Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)第三版.，2001)。存在大小与标准对照相同的条带表明存在靶核酸序列，然后可基于条带强度与对照比较其含量，从而检测和定量感兴趣的靶序列。在某些实施方式中，本文所述的竞争者寡核苷酸可用于检测感兴趣的靶序列的存在。所述竞争者寡核苷酸还可用于根据所述竞争者寡核苷酸给出的信号强度来指示所述靶核酸分子相较于标准对照的量。
在一些实施方式中，使用毛细管电泳来分离和定量扩增的核酸。毛细管电泳(CE)包含相关的分离技术的家族，所述技术使用窄孔融凝二氧化硅毛细管以分离大分子和小分子(例如，不同长度的核酸)的复合物阵列。可使用高电场强度根据不同荷电、大小和疏水性来分离核酸分子。样品引入通过将所述毛细管末端浸入样品瓶并施加压力、真空或电压来完成。根据所用毛细管和电解液的类型，可将所述CE技术分为若干分离技术，其中任何技术能适应本文提供的方法。这些示例在下文中提供。
毛细管区带电泳(CZE)也称为无溶液CE(FSCE)，是CE的最简形式。所述分离机制基于分析物的荷质比差异。CZE的基础是贯穿所述毛细管长度的缓冲溶液均一性和恒定的电场强度。该分离在原理上依赖pH控制的溶质上酸性基团的解离或溶质上的碱性官能的质子化。
毛细管凝胶电泳(CGE)是传统凝胶电泳的适用于毛细管的形式，所述毛细管凝胶电泳采用溶液中的聚合物以形成分子筛(也称作可替换的物理凝胶)。这使具有相似荷质比的分析物能够按大小来分离。该技术通常用于蛋白质的SDS凝胶分子量分析和DNA测序和基因分型应用的筛分中。
毛细管等电聚焦(CIEF)使两性分子(例如蛋白质)能够通过电泳在负极和正极间生成的pH梯度中分离。溶质会迁移至其静电荷为零的位点。在所述溶质等电点(pI)，迁移停止，从而所述样品聚集至紧密区域。在CIEF中，一旦溶质聚集在其pI，该区域通过压力或化学方式移动通过检测器。这种技术作为蛋白质等电点测定机制常用于定性蛋白质。
等速电泳(ITP)是基于样品成分在领先电解质和终末电解质之间迁移的聚集技术。迁移率介于领先电解质和终末电解质之间的溶质堆成清晰、聚集的区域。
电动色谱(EKC)是按电动现象命名的电泳技术的家族，其包含电渗、电泳和色谱。其关键示例参见环糊精介导的EKC。其中，对映异构体和环糊精的差异相互作用使手性化合物得以分离。
胶束电动毛细管色谱(MECC或MEKC)是电动色谱的一个模式，其中向形成胶粒的浓度的缓冲溶液中添加表面活性剂。MEKC的分离原理基于胶粒和溶剂间的差异分配。这种原理能与带电的或中性溶质使用，并可涉及固定的或移动的胶粒。MEKC在含有离子和中性物质的混合物分离中有很大实用性。
微乳液电动色谱(MEEKC)是在缓冲液中随着油滴移动而分配溶质的CE技术。所述微乳液滴通常通过将庚烷或辛烷与水的混溶物超声处理而形成。添加相对高浓度的SDS以稳定该乳液。这使水性化合物和不溶于水的化合物得以分离。
非水毛细管电泳(NACE)涉及在有机溶剂组成的介质中分离分析物。有机溶剂的粘度和电介质常数影响样品离子移动性和电渗流水平。非水介质的使用允许方法开发中采用其它的选择性选项，并且也对分离不溶于水的化合物具有价值。
毛细管电色谱(CEC)是混合分离方法，所述方法将CZE的高分离效率和HPLE结合起来，并且使用电场而不是水压以推动移动相通过填充床。因为存在最小化的背压，所以可使用小直径填充并达到非常高的效率。其最有用的应用似乎是即时(on-line)浓缩分析物的形式，所述浓缩可用于在CZE分离之前浓缩给定样品。
能够进行毛细管电泳的任何装置、仪器或机器都可与本文提供的方法联用。毛细管电泳系统的主要部件通常是样品瓶、源料瓶和目标瓶(destination vial)、毛细管、电极、高压电源、检测器和数据输出以及操纵装置。所述源料瓶、目标瓶和毛细管用电解质(例如水性缓冲溶液)填充。为了引入样品，将所述毛细管进口置于含有所述样品的瓶内，然后回到所述源料瓶(样品通过毛细作用、压力或虹吸引入所述毛细管)。然后通过电场来开始迁移分析物(即，核酸)，所述电场施加在所述源料瓶和目标瓶之间并通过高压电源提供给所述电极。阳离子或阴离子通过电渗流以相同方向引入所述毛细管。所述分析物(即，核酸)由于其电泳迁移性产生的移动而分离开，并在所述毛细管出口端附近检测。所述检测器的输出被送至数据输出装置和操纵装置，例如积分器或计算机。然后，该数据以电泳图显示，其可报告随时间变化的检测器反应。分离的核酸能在电泳图中显示为不同迁移时间出现的峰。
通过毛细管电泳的分离可由若干检测装置来检测。大多数市售系统使用UV或UV-Vis吸收作为其主要检测模式。这些系统中，所述毛细管本身的部分被用作检测室。使用接通管(on-tube)检测使得检测分离的分析物，而不损失分辨率。通常，毛细管电泳中所用的毛细管可用聚合物涂层以增加稳定性。用于UV检测的毛细管部分通常是光学透明的。毛细管电泳中的检测室路径长度(约50微米)远少于传统UV室的长度(约1cm)。根据比尔-朗伯(Beer-Lambert)定律，所述检测器的灵敏度与所述室的路径长度成比例。为增加灵敏度，可增加所述路径长度，尽管这样做会导致分辨率损失。所述毛细管本身可在检测点扩张，形成具有较长路径长度的“气泡室”，或可在所述检测点添加额外管道。然而，这些方法都可能会降低所述分离的分辨率。
毛细管电泳中还可使用荧光检测天然发荧光或经化学修饰以含有荧光标签(例如，本文提供的标记核酸)的样品。这种检测模式就这些样品而言提供高灵敏度和改进的选择性。所述方法需要将光束聚焦在所述毛细管上。可在CE系统中使用激光诱导的荧光，检测极限低达10-18至10-21mol。该技术的灵敏度归因于高的入射光强度和能使所述光准确聚焦在所述毛细管上。
一些毛细管电泳仪为本领域已知，并可与本文提供的方法联用。这些包括但不限于，CALIPER LAB CHIP GX(加利福尼亚州山景城的卡钳生命科学公司(Caliper LifeSciences))、P/ACE2000系列(加利福尼亚州布利市的贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))、HP G1600A CE(加利福尼亚州帕洛阿尔托的惠普公司(Hewlett-Packard))、AGILENT7100CE(利福尼亚州圣克拉拉市的安捷伦技术公司(Agilent Technologies))和ABI PRISM遗传分析仪(加利福尼亚州卡尔斯巴德的应用生物系统公司(AppliedBiosystems))。
核酸定量
在本文提供方法的一些实施方式中，用于定量样品中少数核酸的方法包括以下步骤：(i)限制性消化，(ii)扩增，和(iii)分离。本文分别详细描述这些步骤。在一些实施方式中，所述方法还在扩增之后包括外切核酸酶步骤。在本文提供方法的一些实施方式中，所述用于定量少数核酸的方法在扩增之后不包括蛋白酶(例如，蛋白酶K)步骤。在一些实施方式中，所述方法在扩增之后不包括去磷酸化(例如，虾碱性磷酸酶)步骤。在一些实施方式中，所述方法在扩增之后不包括单碱基延伸步骤。在一些实施方式中，所述方法在扩增之后不包括盐消除(例如，水和树脂)步骤。在一些实施方式中，所述方法在扩增之后不包括结晶步骤。在一些实施方式中，所述方法不包括质谱分光光度法。在本文提供方法的一些实施方式中，用于定量样品中少数核酸的方法由以下步骤构成：(i)限制性消化，(ii)扩增，和(iii)分离。在本文提供方法的一些实施方式中，用于定量样品中少数核酸的方法由以下步骤构成：(i)限制性消化，(ii)扩增，(iii)外切核酸酶，和(IV)分离。在一些实施方式中，用于定量样品中少数核酸的方法可在一天内完成。在一些实施方式中，所述方法可在约4小时～约12小时内完成。例如，所述方法可在约4、5、6、7、8、9、10、11或12小时内完成。
在本文提供方法的一些实施方式中，测定样品中少数核酸物质的量。通常，基于上述分离的扩增产物来测定少数核酸物质的量。本文中所用的关于扩增核酸的术语“量”指任何合适的度量，包括但不限于，绝对量(例如拷贝数)、相对量(例如分数或比例)、重量(例如克)，和浓度(例如克/单位体积(例如毫升)；摩尔单位)。
分数测定
在一些实施方式中，可测定一种扩增的核酸的量相对于另一种扩增的核酸的量的分数或比例。在一些实施方式中，基于分离的少数核酸和(经调整的)总核酸扩增产物各自的量来测定样品中少数核酸物质相对于该样品中核酸总量的分数。为了计算样品中少数核酸物质相对于所述样品中核酸总量的分数，可应用以下等式：
少数核酸的分数=(少数核酸的浓度)/[(总核酸的浓度)×k)]，其中k是阻尼系数，通过该系数来调整多数核酸扩增产物。在一些情况中，所述阻尼系数(k)可以基于上述扩增反应中所用的总引物与抑制剂的比例来用实验方法确定。例如，为了用实验方法测定所述阻尼系数，可以采用1)无抑制剂，和2)设定PCR引物/抑制剂量的比例来分析相同样品。在PCR完成后，能计算扩增产物的浓度。采用抑制剂所获的产物相比没有抑制剂所获的产物间的比例差异是所述阻尼系数。
总核酸浓度乘以所述阻尼系数(k)得到经调整的扩增总核酸的量。在一些情况中，从分离装置(例如，毛细管电泳仪)产生的读出信息中获得总物质和少数物质的浓度。
在一些实施方式中，扩增的少数核酸的量约等于经调整的扩增的总核酸的量(即，扩增的核酸的量约为1:1)。在一些实施方式中，扩增的少数核酸的量为经调整的扩增的总核酸的量的约一半(即，扩增的核酸的量约为1:2)。在一些实施方式中，扩增的少数核酸的量为经调整的扩增的总核酸的量的约三分之一(即，扩增的核酸的量约为1:3)。在一些实施方式中，扩增的少数核酸的量为经调整的扩增的总核酸的量的约四分之一(即，扩增的核酸的量约为1:4)。在一些实施方式中，扩增的少数核酸的量为经调整的扩增的总核酸的量的约十分之一(即，扩增的核酸的量约为1:10)。在一些实施方式中，扩增的少数核酸的量为经调整的扩增的总核酸的量的约百分之一(即，扩增的核酸量约为1:100)。
使用竞争物测定拷贝数
在一些实施方式中，测定少数核酸物质的绝对量(例如拷贝数)。通常基于所用的竞争者寡核苷酸的量来测定少数核酸物质的拷贝数。在一些实施方式中，测定所述多数核酸物质的拷贝数。为了计算样品中少数核酸物质的拷贝数，可应用以下等式：
拷贝数(少数核酸物质)=[(少数核酸的浓度)/(少数竞争物的浓度)]×C，其中C是向所述反应添加的竞争者寡核苷酸的数目。在一些情况中，从分离装置(例如毛细管电泳仪)产生的读出信息中获得少数核酸和少数竞争物的浓度。
测序
在一些实施方式中，可对由本文提供方法生成的扩增产物进行测序分析。在一些实施方式中，确定特定核酸样品是否能用于基于使用本文提供方法所获样品定量数据的测序分析。在一些实施方式中，确定所获核酸测序信息是否能用于一种或多种基于使用本文提供方法所获样品定量数据的诊断确定。可基于给定样品所检测的核酸物质(例如少数核酸、胎儿核酸、来自癌细胞的核酸、病原体核酸)的量做出此类确定。在一些情况中，可基于通过医生对给定核酸物质确定的阈值量来做出确定。在一些实施方式中，所述阈值量可以是样品中总核酸的至少约1%～约40%。例如，所述阈值量可以是样品中总核酸的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40%。
本文中所用的术语“序列分析”指确定扩增产物的核苷酸序列。可确定扩增产物的全部序列或部分序列，确定的核苷酸序列在本文中称为“读数(read)”。例如，在一些实施方式中，可无需进一步扩增即可直接分析线性扩增产物(例如通过使用单分子测序方法(下文中有详述))。在某些实施方式中，可进一步扩增线性扩增产物然后分析(例如采用连接测序或焦磷酸测序方法(下文有详述))。可对读数进行不同类型的序列分析。可采用任何合适的测序方法来检测并确定如上产生的核苷酸序列物质、扩增核酸物质或可检测产物的量。下文描述了某些测序方法的实施例。
在一些实施方式中，对来自一个个体的一种核酸样品测序。在某些实施方式中，将来自两个或更多个样品的核酸样品(其中各样品来自一个个体或两个或更多个个体)收集成库，并对该库测序。在后面的实施方式中，通过一种或多种独特鉴定标签鉴定来自各样品的核酸样品。就收集成库的样品测序运行而言，各库能包含合适数量的样品，例如，2个样品(即，2重)、3个样品(即，3重)、4个样品(即，4重)、5个样品(即，5重)或更多。
在某些实施方式中，在测序之前对运行测序的核酸库的分数进行进一步子选择(sub-select)。在某些实施方式中，可使用基于杂交的技术(例如，使用寡核苷酸阵列)对来自某些染色体(例如不涉及非整倍性测试的、可能的非整倍性的染色体和其它染色体)的核酸序列进行第一次子选择。在一些实施方式中，核酸可按大小分离(如通过凝胶电泳、大小排阻色谱或通过基于微流体的方法)，而在某些示例中，胎儿核酸可通过选择具有较低分子量(例如少于300个碱基对、少于200个碱基对、少于150个碱基对、少于100个碱基对)的核酸来富集。在一些实施方式中，胎儿核酸可通过抑制母体背景核酸(例如通过添加甲醛)来富集。在一些实施方式中，对预选核酸库的部分或子集进行随机测序。
本文所用术语“序列分析设备”和“序列分析组件”指某种装置和可与这种装置联用的一种或多种组件，其可被普通技术人员用于确定由本文所述方法获得的扩增产物(例如，线性和/或指数扩增产物)的核苷酸序列。测序平台的例子包括但不限于：454平台(罗氏公司(Roche))，(Margulies,M.等，2005Nature437,376-380)、Illumina基因组分析仪(或Solexa平台)或SOLID系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))或Helicos True单分子DNA测序技术(Harris TD等，2008Science,320,106-109)、太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的单分子实时(SMRTTM)技术和纳米孔测序(Soni GV和MellerA.2007Clin Chem53:1996-2001)。此类平台能按平行方式以高度多重性对样本中分离的多种核酸分子进行测序(Dear Brief Funct Genomic Proteomic2003;1:397-416)。这些平台中的各个都能测序克隆扩增的或未扩增的单分子核酸片段。例如，某些平台涉及(i)利用染料修饰探针连接来测序(包括环化连接和切割)，(ii)焦磷酸测序，以及(iii)单分子测序。由此产生的核苷酸测序物质、扩增核酸物质和可检测产物可视为用于通过此类测序分析平台来分析核苷酸序列目的的“在研核酸”。大规模平行测序方法通常产生许多短核苷酸序列，有时这些序列被称作“读数(read)”。读数能从核酸片段的一个末端生成("单末端读数")，而有时从核酸片段的两个末端生成("双末端读数")。
在一些实施方式中，进行单末端测序。例如，此类测序可使用亿明达(Illumina)基因组分析仪(加利福尼亚州圣地亚哥的亿明达公司(Illumina))。所述亿明达基因组分析仪对称作流室(flow cell)的固体表面上捕获的克隆扩增单DNA分子进行测序。各个流室(flow cell)具有八条通道以供对八个独立样品或样品库进行测序。各通道能够生成约200Mb的序列，其仅为人基因组中序列的三十亿碱基对的一部分。使用流室(flow cell)的一条通道对各基因组DNA或血浆DNA样品进行测序。使所生成的短序列标签和参照基因组序列对齐，并注意染色体的起始。将与各染色体对齐的单独测序标签的总数制表，并与预计来自参照基因组的各染色体的相对大小做比较。
在一些实施方式中，进行基于可逆终止子的测序。基于可逆终止子的测序能检测掺入生长中的DNA链的单碱基。添加各dNTP以使荧光标记的终止子成像，然后切割以允许下一碱基的掺入。由于全部四种可逆终止子结合的dNTP存在于各测序循环过程中，天然竞争使掺入偏差最小化。可由各循环过程中的信号强度度量直接做出碱基判定，这相较于其它技术可以减少原始误差率。该最终结果是高度准确的碱基-碱基测序，其可消除序列～背景之间的特定误差。此类测序可使用设计来进行基于可逆终止子的测序反应的任何仪器来进行，例如亿明达HISEQ2000基因组分析仪(加利福尼亚州圣地亚哥的亿明达公司)。使用该HISEQ2000基因组分析仪，将流室(flow cell)装载至真空控制的装载停放处(loadingdock)。将足够供200轮循环的预先定制的试剂滴入所述仪器冷却室中的架内。可以单流室或双流室模式操纵该HISEQ200基因组分析仪。独立可操作的流室可允许同时运行需要不同读数长度的应用。
在一些实施方式中，进行连接测序，其为一种依赖DNA连接酶对碱基对错配灵敏度的方法。DNA连接酶将碱基正确配对的DNA末端连接在一起。将DNA连接酶仅连接正确碱基配对DNA末端的能力与荧光标记的寡核苷酸或引物的混合库结合，能通过荧光检测进行序列测定。可通过纳入含有可切割连接的引物实现更长的序列读数，所述可切割连接的引物能在标记识别后进行切割。接头处切割除去标记并在已连接引物的末端再生成5’磷酸，以备所述引物进行另一轮连接。在一些实施方式中，引物可标记有多于一个荧光标记(例如，1个荧光标记，2、3或4个荧光标记)。
普通技术人员可使用的、基于连接测序的系统的示例通常涉及下列步骤。可在乳液微反应器中制备克隆珠群，所述乳液微反应器包含在研核酸("模板")、扩增反应组分、珠和引物的。扩增后，模板被变性，并进行珠富集从而将具有已延伸模板的珠与不需要的珠(如具有未延伸模板的珠)相分离。选定珠上的模板进行3’修饰以能与玻片共价结合，并且经修饰的珠可沉积到玻片上。在珠装载过程中沉积室能将玻片分成1、4或8个隔室。对于序列分析，引物与衔接子序列杂交。四色染料标记探针组竞争连接测序引物。通过研究连接系列中每第4个和第5个碱基来实现探针连接的特异性。经5-7轮连接，检测和切割记录每第5位的颜色，通过所用库的类型确定轮数。每轮连接后，放入在5’方向偏移一个碱基的新互补引物进行另一系列的连接。引物重置和连接轮(每轮5-7个连接循环)顺序重复5次以产生单个标签的25～35个碱基对序列。对于伴侣配对测序，对第二标签重复该过程。此类系统可用于指数扩增本文所述过程产生的扩增产物，例如，通过连接异源核酸与本文所述过程产生的第一扩增产物并采用与初始用于产生所述第一扩增产物相同或不同的固体支持物进行乳液扩增。此类系统也可用于通过绕过指数扩增过程并在玻片上直接分选本文所述固体支持物来分析本文所述过程直接产生的扩增产物。
在一些实施方式中，使用焦磷酸测序，其为基于合成测序且依赖于对核苷酸掺入而释放的焦磷酸进行检测的核酸测序方法。通常，合成测序涉及每次加入一个核苷酸来合成DNA链，所述链与正探求其序列的链互补。在研核酸可固定于固体支持物，与测序引物杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷酰硫酸和荧光素一起孵育。依序添加和除去核苷酸溶液。核苷酸正确掺入可释放焦磷酸，在腺苷5’磷酰硫酸存在下焦磷酸与ATP硫酸化酶相互作用并产生为荧光素反应提供能量的ATP，该反应产生允许序列测定的化学发光信号。
普通技术人员可使用的基于焦磷酸测序的系统的示例通常涉及下列步骤：将衔接子核酸与在研核酸连接并将在研核酸与珠杂交；在乳液中扩增在研核酸中的核苷酸序列；用皮升多孔固体支持物来分选珠；并且通过焦磷酸测序方法对扩增的核苷酸序列进行测序(例如，Nakano等，“Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion(采用油包水乳液的单分子PCR)”Journal of Biotechnology102:117-124(2003))。此类系统可用于指数式扩增本文所述过程产生的扩增产物，例如通过将异源核酸与本文所述过程产生的第一扩增产物进行连接。
某些单分子测序实施方式是基于合成测序的原理，并利用单一配对荧光共振能转移(单一配对FRET)作为核苷酸成功掺入引起光子发射的机理。通常采用强化或高灵敏度冷却电荷耦联装置与内全反射显微镜(TIRM)联合来检测发射的光子。仅当引入的反应溶液含有用于掺入测序过程产生的所合成生长核酸链中的正确核苷酸时，才发射光子。在基于FRET的单分子测序中，能量通过长范围偶极相互作用在两种荧光染料之间转移，所述染料有时是聚甲炔花青染料Cy3和Cy5。在特定激发波长下供体被激发，激发态能量被非放射性地转移至受体染料，后者进而被激发。受体染料最终通过光子的辐射发射返回基态.在单一配对FRET中，能量转移过程中所用的两种染料代表“单一配对”。Cy3常用作供体荧光团，并常掺入作为第一标记核苷酸。Cy5常用作受体荧光团，并用作掺入第一Cy3标记核苷酸以后的后续核苷酸添加的核苷酸标记。为成功发射能量转移，所述荧光团通常相隔10纳米内。
可用于依据单分子测序的系统的示例通常涉及将引物与在研核酸杂交以产生复合物；将所述复合物与固相结合；用标记有荧光分子的核苷酸反复延伸所述引物；并在每次重复后捕获荧光共振能量转移信号的图像(例如，美国专利第7,169,314号；Braslavsky等，PNAS100(7):3960-3964(2003))。此类系统能用于直接测序本文所述过程产生的扩增产物。在一些实施方式中，所释放的扩增产物能和引物杂交，所述引物含有固体支持物(如珠或玻片)上的固定化捕获序列的互补序列。引物-所释放线性扩增产物复合物与固定化捕获序列的杂交将所释放线性扩增产物固定到基于单一配对FRET的合成测序所用的固体支持物上。所述引物通常是荧光的，从而可产生带有固定化核酸的玻片表面的初始参比图像。所述初始参比图像可用于确定发生真实核苷酸掺入的位置。“仅含引物”参比图像中最初未鉴定的阵列位置内测得的荧光信号视为非特异性荧光而弃去。引物-所释放线性扩增产物复合物固定化后，结合的核酸通常通过重复下列步骤来平行测序：a)在一种荧光标记核苷酸存在下的聚合酶延伸，b)采用合适的显微镜如TRIM来检测荧光，c)除去荧光核苷酸，以及d)返回步骤a，采用不同的荧光标记核苷酸。
在一些实施方式中，可通过固相单核苷酸测序方法和过程进行核苷酸测序。固相单核苷酸测序方法涉及在能使单个样品核酸分子与单个固体支持物分子杂交的条件下使样品核酸接触固体支持物。此类条件能包括在"微反应器"中提供固体支持物分子和单个样品核酸分子。此类条件还能包括提供使样品核酸分子能在固体支持物上与固相核酸杂交的混合物。2008年1月17日提交的美国临时专利申请序列号61/021,871中描述了可用于本文所述实施方式的单核苷酸测序方法。
在某些实施方式中，纳米孔测序检测方法包括(a)将待测序核酸("基础核酸"，如连接的探针分子)与序列特异性检测子在所述检测子与基础核酸中基本互补亚序列发生特异性杂交的条件下接触；(b)检测来自检测子的信号以及(c)根据测得的信号确定基础核酸的序列。在某些实施方式中，当检测子随着基础核酸通过孔而干扰纳米孔结构时，与基础核酸杂交的所述检测子从基础核酸上解离(例如，依序解离)，并测得所述检测子从基础序列上的解离。在一些实施方式中，从基础核酸解离的检测子发射可检测信号，而与基础核酸杂交的检测子发射不同的可检测信号或无可检测信号。在某些实施方式中，用对应特定核苷酸的特定核苷酸序列(“核苷酸代表”)取代核酸(如连接的探针分子)中的核苷酸，从而产生扩张的核酸(例如，美国专利第6,723,513号)，而检测器与作为基础核酸的扩张核酸中的核苷酸代表杂交。在此类实施方式中，可以二元或更高阶排列核苷酸代表(例如，Soni和Meller,Clinical Chemistry53(11):1996-2001(2007))。在一些实施方式中，核酸未扩张，不产生扩张的核酸，并直接用作基础核酸(例如，连接的探针分子用作未扩张的基础核酸)，并且检测子直接接触基础核酸。例如，第一检测子可与第一亚序列杂交，而第二检测子可与第二亚序列杂交，其中第一检测子与第二检测子各自具有能相互区分的可检测标记，且当检测子从所述基础核酸解离时，来自第一检测子与第二检测子的信号可彼此区分。在某些实施方式中，检测子包含与基础核酸杂交的区域(例如两个区域)，所述区域的长度能是约3-100个核苷酸(例如，长度是约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95个核苷酸)。检测子还可包含一个或多个不与基础核酸杂交的核苷酸区域。在一些实施方式中，检测子是分子信标。检测子通常包含一个或多个独立选自本文所述的可检测标记。可通过能检测各标记所产生信号的任意便利检测方法(例如，磁性、电学、化学、光学等)测得各可检测标记。例如，可采用CD相机来检测与检测子相连的一种或多种可区分的量子点的信号。
在某些序列分析实施方式中，可采用读数来构建更大的核苷酸序列，这可通过鉴定不同读数中的重叠序列并采用读数中的识别序列得到促进。本领域已知此类序列分析方法和用于从读数来构建更大序列的软件(例如，Venter等，Science291:1304-1351(2001))。在某些序列分析实施方式中，特异性读数、部分核苷酸序列构建和全长核苷酸序列构建可在样品核酸内的核苷酸序列间作比较(即，内部比较)或与参比序列作比较(即，参比对比)。在样品核酸由多个样品或由含有序列变化的单一样品来源来制备的情况下，有时进行内部比较。当已知参比核苷酸序列且目的是确定样品核酸中是否含有与参比核苷酸序列基本相似或相同或不同的核苷酸序列时，有时进行参比对比。本领域已知的序列分析设备和部件使序列分析便利。
诊断确定
在本文提供方法的一些实施方式中，做出诊断确定。可对任何病症做出诊断确定，其中核酸物质的检测、定量和/或测序能指示所述病症。在一些情况中，测定是否存在胎儿染色体异常(例如胎儿非整倍性)，或者进行性别(即性别)测定。在一些情况中，测定是否存在细胞增殖性疾病(例如，癌症)或病原体(例如，病毒、细菌、真菌)。
在一些情况中，联合本文提供的其它方法(例如，测序)来做出诊断确定。在一些情况中，可使用本文提供的方法来确定核酸样品获得的测序信息是否用于诊断确定。能基于给定样品所测的核酸物质(例如，少数核酸、胎儿核酸、来自癌细胞的核酸、病原体核酸)的量做出此类确定。在一些情况中，能基于通过医生对给定核酸物质确定的阈值量来做出确定。在一些实施方式中，所述阈值量能是样品中总核酸的至少约1%～约40%。例如，所述阈值量可以是样品中总核酸的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40%。
染色体异常
在一些实施方式中，测定是否存在胎儿染色体异常。染色体异常包括但不限于整个染色体或者包含一个或多个基因的染色体区域的获得或丢失。染色体异常包含单体性、三体性、多体性、杂合性的丢失、一个或多个核苷酸序列(如一个或多个基因)的缺失和/或重复，包含非平衡移位造成的缺失和重复。本文所用的术语"非整倍性"和"非整倍的"指生物细胞中的染色体数目异常。由于不同生物有广泛不同的染色体套数(complement)，所述术语"非整倍性"并非指染色体的特定数目，而是指给定细胞或生物体细胞中染色体含量异常的情况。
本文使用术语"单体性"指缺乏正常套数(complement)的一个染色体。部分单体性在非平衡的移位或缺失中发生，其中仅有一部分染色体以单个拷贝存在(参见缺失(遗传学))。性染色体的单体性(45，X)导致特纳氏综合症。
术语"二体性"指存在染色体的两个拷贝。就各染色体有两个拷贝的生物体(二倍体或"整倍体"的那些)(例如人)而言，二体性是正常情况。就各染色体通常有三个或更多个拷贝的生物体(三倍体或更多倍体的那些)而言，二体性是非整倍染色体套数的状态。在单亲源二体性中，染色体的两个拷贝来自同一亲本(另一个亲本没有贡献)。
术语“三体性”指特定染色体存在三个拷贝(而不是正常的两个拷贝)。在唐氏综合症中发现存在额外染色体21(被称作21三体性)。18三体性和13三体性是在人类活产儿(live-born)中识别的另外两种常染色体三体性。性染色体的三体性可出现在女性(47,XXX)中或男性(克氏综合症中发现的47,XXY；或47,XYY)中。
本文使用"四体性"和"五体性"指分别存在染色体的四个或五个拷贝。尽管对常染色体罕见，但已报道了人的性染色体的四体性和五体性，包括XXXX、XXXY、XXYY、XYYY、XXXXX、XXXXY、XXXYY、XXYYY和XYYYY。
染色体异常可由多种机制产生。机制包括但不限于(i)有丝分裂检查点弱化导致的不分离，(ii)有丝分裂检查点失活造成多个染色体处的不分离，(iii)当一个着丝粒连接两个有丝分裂纺锤体极时发生单极向型(merotelic)连接，(iv)当形成多于两个纺锤体极时形成多极性纺锤体，(v)当形成仅一个纺锤体极时形成单极性纺锤体，和(vi)单极性纺锤体机制最终导致出现四倍体中间型。
本文使用术语"部分单体性"和"部分三体性"指部分染色体的丧失或获得造成的遗传材料的不平衡。部分单体性或部分三体性可由不平衡移位导致，其中个体载有通过两个不同染色体的破裂与融合形成的衍生染色体。在这种情况下，所述个体可以有一条染色体部分的三个拷贝(两个正常拷贝和所述衍生染色体上存在的部分)，和所述衍生染色体中所带的其它染色体部分的仅仅一个拷贝。
本文所用术语"镶嵌性"指生物体的一些细胞但不是全部细胞中的非整倍性。某些染色体异常能以镶嵌性(mosaic)和非镶嵌性(non-mosaic)染色体异常形式存在。例如，某些21三体性个体有镶嵌性唐氏综合症而一些有非镶嵌性唐氏综合症。不同机制可导致镶嵌性。例如，(i)起始受精卵可以有三条21号染色体，正常情况下会导致简单的21三体性，但是在细胞分裂中一个或多个细胞系丢失了所述21号染色体中的一条；和(ii)起始受精卵可以有两条21号染色体，但是在细胞分裂中所述21号染色体中的一条复制。体细胞镶嵌性最可能通过某种机制发生，所述机制与通常与涉及完全或镶嵌性非整倍性的遗传症状相关联的那些不同。例如已在某些类型的癌症和神经元中鉴定了体细胞镶嵌性。在某些示例中，在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中鉴定了12三体性，而在急性骨髓性白血病(AML)中鉴定了8三体性。同样，有染色体破裂倾向(染色体不稳定性综合症)的个体的遗传症状常与多种类型癌症的风险增加相关联，从而突出了癌发生中体细胞非整倍性的作用。本文所述方法和试剂盒能鉴定是否存在非镶嵌性和镶嵌性的染色体异常。
以下是可能通过本文所述方法和试剂盒鉴定的染色体异常的非限定性列表。
先兆子痫
在本文提供方法的一些实施方式中，确定是否存在先兆子痫。先兆子痫是妊娠中出现高血压(即妊娠诱导的高血压)且与尿中高蛋白含量相关联的病症。在一些情况中，先兆子痫还与胞外核酸水平的升高和/或甲基化模式的改变相关联(参见例如，Kulkarni等.,(2011)DNA Cell Biol.30(2):79-84；Hahn等.,(2011)Placenta32增刊:S17-20)。例如，已经观察到了胞外胎儿源性高甲基化RASSF1A水平和先兆子痫的严重性正相关(Zhao等,(2010)Pretat.Diagn.30(8):778-82)。在另一个示例中，对比正常对照，在先兆子痫胎盘中观察到了H19基因DNA甲基化的增加(Gao等,(2011)Hypertens Res.2月17日(出版前电子公开))。
先兆子痫是世界范围内母体和胎儿/新生儿死亡率和发病率的主要原因之一。因此，需要可广泛应用且担负得起的测试来进行临床症状出现之前的早期诊断。血浆和血清中的循环无细胞核酸是在包括产前诊断在内的不同医学领域中具有临床应用前景的新型生物标志物。不同研究中已报道了将母体血浆中无细胞胎儿(cff)DNA的量变作为即将发生先兆子痫的指示物，例如针对男性特异性SRY或DYS14位点使用实时定量PCR。在早发型先兆子痫的示例中，在头三个月内可以观察到水平提高。症状发作前cffDNA水平的增加可归因为绒毛间空隙中的缺氧/复氧，导致了组织氧化应激和胎盘凋亡及坏死的增加。除有证据证明先兆子痫中排入母体循环的cffDNA增多以外，也有证据证明在先兆子痫中cffDNA的肾清除率降低。由于当前通过定量Y-染色体特异性序列来确定胎儿DNA的量，替代性方法例如测量总的无细胞DNA或使用性别无关的胎儿表观遗传学标志物(如DNA甲基化)提供了其它选择。胎盘源性的无细胞RNA可能是临床实践中用于筛选和诊断先兆子痫的另一种可能有用的生物标志物。胎儿RNA与保护其免于降解的亚细胞胎盘颗粒相关联。其在患有先兆子痫的妊娠女性中的水平比对照高10倍。
癌症
在一些实施方式中，测定是否存在细胞增殖性疾病(例如，癌症)。例如，相较于健康患者，多种类型癌症患者内血清中的无细胞核酸水平会升高。例如，患有转移性疾病的患者的血清DNA水平有时能比无转移患者高出大约两倍。可以与循环DNA水平提高正相关的癌症类型的非限定性示例包含乳腺癌、结直肠癌、胃肠癌、肝细胞癌、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、肝细胞瘤、宫颈癌、食道癌、胰腺癌和前列腺癌。不同癌症可具有与健康细胞核酸特性(例如表观遗传状态和/或序列变异、重复和/或缺失)不同的核酸，并且有时能释放所述核酸进入血流。例如此类特性可对特定类型的癌症有特异性。因此，还考虑本文所提供的方法能用于鉴定特定类型的癌症。
病原体
在一些实施方式中，测定是否存在病原性病症。病原性病症可通过任何病原体(包括但不限于细菌、病毒或真菌)感染宿主而产生。由于病原体通常具有能与宿主核酸区分开的核酸(例如，基因组DNA、基因组RNA、mRNA)，本文提供的方法可用于诊断是否存在病原体。通常，病原体具有特定病原体独有特性的核酸，例如，表观遗传状态和/或序列变异、重复和/或缺失。因此，进一步考虑本文提供的方法能用于鉴定特定病原体或病原体变体(例如，株)。
样品
本文所述的方法和试剂盒中使用的核酸通常从对象获得并分离。对象可以是任何活体或非活体来源，包括但不限于人、动物、植物、细菌、真菌、原生生物。能选择任何人或动物，包括但不限于，非人类、哺乳动物、爬行动物、牛、猫、狗、山羊、猪、家猪、猴、猿、猩猩、公牛、母牛、熊、马、绵羊、家禽、小鼠、大鼠、鱼、海豚、鲸和鲨。
核酸可分离自对象的任何类型的液体或组织，包括但不限于脐带血、绒毛、羊水、脑脊液、脊液、灌洗液(如支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节)、活检样品(如来自移植前胚胎)、膜间液样品、胎儿有核细胞或胎儿细胞残余物、女性生殖道清洗物、尿、粪、痰液、唾液、鼻粘膜、前列腺液、灌洗液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、母乳、乳腺体液、胚胎细胞和胎儿细胞(如胎盘细胞)。在一些实施方式中，生物学样品可以是血液，有时是血浆。如本文所用，术语“血液”涵盖全血或血液的任何部分，例如常规定义的血清和血浆。血液血浆指经抗凝剂处理的血液离心所得的全血的部分。血液血清指血液样品凝结后余留的水样部分。通常按照医院或临床常规遵循的标准方法来采集液体或组织样品。在此类实施方式，对于血液，通常采集适当量的外周血(例如3-40毫升)并在进一步制备前按照标准流程保存。提取核酸所用的液体或组织样品可以是非细胞的。在一些实施方式中，液体或组织样品可含有细胞要素或细胞残余物。在一些实施方式中，胎儿细胞或癌细胞可包含所述样品。
所述样品可以是异质性的，即所述样品中存在多于一种类型的核酸物质。例如，异质性核酸能包括但不限于(i)胎儿源性和母体源性的核酸、(ii)癌症和非癌症核酸、(iii)病原体和宿主核酸、和更常见的(iv)突变的和野生型核酸。样品可以是异质性的原因是，存在多于一种细胞类型，例如胎儿细胞和母体细胞，癌细胞和非癌细胞，或者病原体和宿主细胞。在一些实施方式中，存在少数核酸物质和多数核酸物质。
就本文所述技术的产前应用而言，液体或组织样品可采自孕龄适于测试的女性或经测试可能有孕的女性。适当孕龄可能视所进行的产前测试而不同。在某些实施方式中，妊娠女性对象有时在孕期头三个月，有时在孕期中三个月或有时在孕期末三个月。在某些实施方式中，液体或组织采自胎儿妊娠1～4、4～8、8～12、12～16、16～20、20～24、24～28、28～32、32～36、36～40或40～44周，和有时在5～28周间的妊娠女性。
核酸分离
可用本领域已知方法从一种或多种样品来源(如细胞、土壤等)中获取核酸。细胞裂解过程和试剂是本领域众所周知的，且一般可通过化学、物理或电解的裂解方法来进行。例如，化学方法一般采用裂解剂来破坏细胞并从细胞中提取核酸，随后用离液盐处理。也可利用物理方法如冻/融后进行研磨、使用细胞压碎器等。高盐裂解过程也是常用的。例如，可采用碱裂解法。所述后一种方法传统上包括使用苯酚-氯仿溶液，或可采用替代的包括三种溶液的无苯酚-氯仿方法。在后一种过程中，溶液1能包含15mM Tris，pH8.0；10mM EDTA和100ug/ml RNA酶A；溶液2能包含0.2N NaOH和1%SDS；以及溶液3能包含3M KOAc，pH5.5。这些方法可参见纽约约翰韦利森公司(John Wiley&Sons，Inc.,New York)的《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)的6.3.1-6.3.6(1989)，其全文纳入本文。
核酸还可以在与另一核酸不同的时间点分离得到，其中各样品来自相同或不同的来源。核酸可来自核酸库，例如cDNA或RNA库。核酸可以是样品中核酸分子的核酸纯化或分离和/或扩增的产物。为本文所述方法提供的核酸可包含来自一个样品或来自两个或更多个样品(例如来自1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个的样品)的核酸。
在某些实施方式中，可不经含核酸样品的处理而提供核酸用于进行本文所述方法。在一些实施方式中，在处理含核酸的样品后提供核酸用于进行本文所述方法。例如，可从样品提取、分离、纯化或扩增核酸。如本文所用的术语“分离”指将核酸从其原始环境中取出(例如，天然产生核酸的天然环境或外源表达核酸的宿主细胞)，因此核酸从其原始环境通过人的干预(如“人工”)而被改变。与来源样品中的组分含量相比，分离的核酸一般带有较少的非核酸组分(例如，蛋白质、脂质)。包含分离核酸的组合物可以是基本分离的(例如，约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%不含非核酸组分)。本文所用术语“纯化”是指提供的核酸与其所衍生自的样品来源相比包含更少的核酸种类。包含核酸的组合物可以是基本纯化的(例如，约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%不含其它核酸种类)。如本文所用术语“扩增”是指处理样品中的核酸进行以线性或指数形式产生扩增子核酸，所述扩增子核酸的核苷酸序列与样品中核酸的核苷酸序列或其部分序列相同或基本相同。
试剂盒
试剂盒常由含有一种或多种本文所述组分的一个或多个容器组成。试剂盒在任意数量的独立容器、包、管、小管、多孔板等中包含一种或多种组分，或者组分可以在此类容器中以不同组合合并。例如一种或多种下列组分可以包含在试剂盒中：(i)一种或多种用于切割核酸的酶；(ii)用于扩增针对一个或多个区域的一个或多个核苷酸序列的一对或多对扩增引物对；(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸；(iv)一种或多种竞争者寡核苷酸；(v)用于扩增核酸的试剂和/或装置；(vi)用于将扩增的核酸分离的试剂和/或装置；(vii)用于将所述扩增的核酸分离所获得的信号进行分析的软件和/或机器；(viii)以供计算核酸相对量和/或拷贝数的信息，(ix)用于取血的装置；(x)用于生成无细胞血液的装置；(xi)用于从血浆、血清或尿液分离核酸(例如DNA、RNA)的试剂；(xii)用于稳定血清、血浆、尿液或核酸以供运输和/或处理的试剂。
试剂盒有时与处理联用，并且能包含实行一种或多种方法的说明书和/或一种或多种组合物的说明。试剂盒可以用于进行本文所述的方法。说明书和/或说明可以是有形形式(如纸等)或电子形式(如有形介质(如压缩盘)等上的计算机可读文件)，并且可以包含在试剂盒附件(kit insert)中。试剂盒还可包括提供此类说明书或说明的因特网地址的书面描述(如因特网的URL)。
因此，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含用于针对一个或多个区域扩增一个或多个核苷酸序列的一对或多对扩增引物对、一种或多种抑制性寡核苷酸以及一种或多种竞争者寡核苷酸。在一些实施方式中，所述试剂盒中的一种或多种引物选自本文所述的那些。在一些实施方式中，所述试剂盒中的一种或多种抑制性寡核苷酸选自本文所述的那些。在一些实施方式中，所述试剂盒中的一种或多种竞争者寡核苷酸选自本文所述的那些。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含转换表格、软件、可执行的说明书和/或提供上述内容的因特网址，其中，转换表格、软件和/或可执行的说明书可用于将从扩增的核酸中分离和纯化获得的数据转换成相对量或拷贝数。在某些实施方式中，试剂盒还可包含用于核酸切割的一种或多种酶。在一些实施方式中，试剂盒包含用于进行扩增反应的试剂和/或装置(例如，聚合酶、核苷酸、缓冲溶液、热循环仪、用于产生乳液的油)。
实施例
下述实施例说明某些实施方式而不限制本技术。
实施例1：材料和方法
若无另外说明，该实施例中所述的材料和方法用于进行实施例2～9中所述的诊断试验。
胎儿DNA定量试验
开发了使用基于甲基化的DNA差异来准确定量循环无细胞胎儿(CCFF)DNA的测试。按照若干标准来设计本文所述的胎儿DNA定量试验(FQA)，所述标准包含：1)所述试验将是单孔测试以允许来自相同血液样品的多个度量，同时保留血浆源性DNA的多数部分以供进一步分析试验，例如，RhD、胎儿性别或非整倍性测试，2)所述试验不会消耗获自4mL提取物的多于25%的可用DNA，3)所述试验将是由用于检测和定量胎儿甲基化DNA、总DNA、男性DNA和对照以供限制性消化反应的四种不同类型试验组成的集合性多重试验，4)所述多重试验将包含分别用于四种类型试验以使度量方差(variance)最小化的若干标志物，5)所述分析可使用基于高分辨、微流体(即，毛细管)的电泳核酸分离系统和/或基于可逆终止子的测序系统，以及6)所述试验将对再现性、准确性和精度进行评价，并将设计成具有与其它胎儿DNA定量试验(包括例如基于MassARRAY的FQA)相比有等同或更好的性能。下文描述关于开发所述胎儿DNA定量试验的具体细节。
扩增子设计
设计本文所述的用于胎儿DNA定量的试验，使针对各标志物的扩增的DNA序列和竞争性寡核苷酸可通过扩增子长度来区分。特别地，设计PCR扩增子组，其中各个多重组由四种标志物(即，基因组DNA靶序列)组成：甲基化、总DNA、Y染色体和消化对照。在这个试验中，所有标志物都由长度相同的基因组DNA区域组成。然而，PCR引物含有长度不同的5’非杂交尾部，这使得能采用电泳来分离各扩增子。在这个实验中，为实现DNA的精确定量，共扩增已知量的竞争者寡核苷酸。这些竞争者寡核苷酸的长度或序列不同，并且包含填充序列以区分所述竞争者寡核苷酸扩增子和所述基因组DNA扩增子(参见例如图1)。所述填充序列对人类基因组无特异性，并且获自PhiX174基因组。下表1显示基因组DNA扩增子和竞争者寡核苷酸扩增子的设计方案。
表1：扩增子长度设计
相较于获自所取血液的细胞隔室的DNA，来自血浆的无细胞DNA可以是几个数量级的较小丰度量级。具体而言，通常组成约3%～约25%的全部循环无细胞DNA的胎儿分数会是有限的。因为需要检测的低拷贝数，进行冗余度量以增加结果中的置信度。选择相同长度的片段以避免不必要的扩增偏差。如上所述，使用长度不同的加尾引物来分离不同的扩增子，这允许产生独特扩增子长度。为使冗余度量可行，设计所述试验使电泳图中的各个峰由对每个标志物的若干独立扩增子来产生(参见图2)。特别地，如图2所示，设计独立扩增子1a和1b以表示甲基化标志物，例如，共同生成所示电泳图中的峰#1。使用这种试验设计，落实了多个度量的必要性，尽管电泳分辨率有限。因为所示电泳图中的各峰都由若干独立扩增子组成，减少了所述试验的技术变异性和生物变异性。
选择基因组靶标
如上所述，本文提供的胎儿DNA定量试验(FQA)包含多重PCR反应，其中进行四种类型的试验。这些试验包含，1)用于检测和定量甲基化胎盘(胎儿)DNA的试验，2)用于检测和定量总DNA的试验，3)用于检测和定量Y染色体特异性序列的总拷贝的试验，和4)用于检测和定量未消化DNA的试验。根据下文所述的标准人工设计各试验。
用于检测和定量甲基化胎盘DNA的试验
选择用于检测和定量甲基化胎儿DNA试验的基因组基因座靶标、PCR引物和竞争者寡核苷酸时遵照以下标准。1)各基因座是单拷贝基因，不位于13、18、21、X或Y染色体上。2)就各基因座而言，有最小的母体甲基化(<1%)，和胎盘甲基化(>50%)。3)所述PCR引物序列下没有已知的SNP、突变或插入/缺失。4)各基因座内存在至少两个限制性位点((GCGC CCGG)，任何结合)。5)基因组序列长度和终产物精确地是70bp。6)竞争物长度为115bp，其使用不加尾PCR引物产生的终长度为126bp。7)所述PCR引物的解链温度不低于65℃且不高于75℃。8)使用mfold预测的完整扩增子的二级结构不具有负ΔG值(M.Zuker,Mfold web server fornucleic acid folding and hybridization prediction(用于核酸折叠和杂交预测的Mfold网络服务器).Nucleic Acids Res.31(13),3406-15,(2003))。
用于检测和定量总DNA的试验
选择用于检测和定量总DNA的基因组基因座靶标、PCR引物和竞争者寡核苷酸时遵照以下标准。1)各基因座是缺失限制性位点(GCGC CCGG)的单拷贝基因，不位于13、18、21、X或Y染色体上。2)所述基因组序列长度精确地是70bp，但使用加尾引物(5+6bp)的终扩增子长度是81bp。3)所述PCR引物序列下没有已知的SNP、突变或插入/缺失。4)PCR引物的解链温度不低于65℃且不高于75℃。5)竞争物长度为115bp，其产生的终长度为126bp。6)使用mfold预测的完整扩增子或竞争物的二级结构不具有负ΔG值(M.Zuker,Mfold web serverfor nucleic acid folding and hybridization prediction(用于核酸折叠和杂交预测的Mfold网络服务器).Nucleic Acids Res.31(13),3406-15,(2003))。
用于检测和定量Y染色体特异性序列总拷贝的试验
选择用于检测和定量Y染色体特异性序列总拷贝的基因组基因座靶标、PCR引物和竞争者寡核苷酸时遵照以下标准。1)各基因座是缺失限制性位点(GCGC CCGG)的单拷贝基因，对Y染色体特异。2)所述基因组序列长度精确地为70bp，但使用加尾引物(11+12bp)的终扩增子长度为93bp。3)所述PCR引物序列下没有已知的SNP、突变或插入/缺失。4)所述PCR引物的解链温度不低于65℃且不高于75℃。5)竞争物长度为118bp，其产生的终长度为141bp。6)使用mfold预测的完整扩增子二级结构不具有负ΔG值(M.Zuker,Mfold web server fornucleic acid folding and hybridization prediction(用于核酸折叠和杂交预测的Mfold网络服务器).Nucleic Acids Res.31(13),3406-15,(2003))。
用于检测和定量未消化DNA的试验
选择用于检测和定量未消化DNA的基因组基因座靶标、PCR引物和竞争者寡核苷酸时遵照以下标准。1)各基因座是已知在所有组织中未被甲基化的单拷贝基因，且不位于13、18、21、X或Y染色体上。2)各扩增子针对各限制性酶精确地含有一个位点即(GCGC或CCGG)。3)所述PCR引物序列下没有已知的SNP、突变或插入/缺失。4)所述基因组序列长度精确地为70bp，但使用加尾引物(18+18bp)的终扩增子长度为106bp。5)所述PCR引物的解链温度不低于65℃且不高于75℃。6)竞争物长度为120bp，其产生的终长度为156bp。7)使用mfold预测的完整扩增子二级结构不具有负ΔG值(M.Zuker,Mfold web server for nucleic acidfolding and hybridization prediction(用于核酸折叠和杂交预测的Mfold网络服务器).Nucleic Acids Res.31(13),3406-15,(2003))。
下表2显示分别针对上述四种试验所选择的基因组靶基因座。
表2：基因组靶基因座
表2：基因组靶基因座
在选择了基因组靶基因座之后，按照上述方法设计用于胎儿DNA定量试验的竞争者寡核苷酸。下表3显示所述竞争者寡核苷酸
表3：竞争者寡核苷酸
表3：竞争者寡核苷酸
表3：竞争者寡核苷酸
表3：胎儿DNA定量试验中所用的竞争者寡核苷酸列表。粗体字表示PhiX174基因组DNA填充序列。
靶向抑制性PCR
为了可靠地监测所述靶基因拷贝数的小变化，所述信号强度和比例应不受PCR循环数的影响，且某个基因的拷贝数的大变化应不影响其它标志物的信号。因为甲基化序列的数量仅仅为本文提供的胎儿定量试验中总序列的一部分，所以，若使用传统PCR，电泳图中占优势的是由针对总DNA的标志物生成的峰。这将缩减所述试验的分析窗，并造成定量困难。通过使用靶向抑制性PCR来克服这个问题。
在这个方法中，将抑制性寡核苷酸按与其相对应的PCR引物相比的特定比例来引入。将所述抑制性寡核苷酸设计成与带有额外5bp非杂交3’末端的PCR引物相同。还将所述抑制性寡核苷酸设计成具有与对应PCR引物相同的杂交参数，但由于3’错配，扩增将会被抑制；因而减少总DNA的靶标高拷贝数扩增子的PCR效率(参见图3)。由于实际引物(realprimer)被消耗，而抑制性寡核苷酸的数目保持不变，所以在所述PCR试验过程中，这些抑制性寡核苷酸的作用增加。因此，将所述比例优化至总DNA标志物生成的峰与胎儿特异性标志物的峰等高的水平。
下表4显示设计用于所述胎儿DNA定量试验的PCR引物和抑制性寡核苷酸。
表4：PCR引物和抑制性寡核苷酸
表4：PCR引物和抑制性寡核苷酸
表4：PCR引物和抑制性寡核苷酸
表4：PCR引物和抑制性寡核苷酸
表4：胎儿DNA定量试验中所用的PCR引物和抑制性寡核苷酸列表。粗体字表示非杂交5’尾部，粗斜体字表示非杂交3’抑制剂序列
反应概要
本文提供的胎儿DNA定量试验涉及下面三个步骤。步骤1：使用甲基化敏感的限制性酶与外切核酸酶联用来进行DNA样品的消化，以消除任何残余的单链DNA。当所述反应完成时，抑制所述酶并使用加热步骤使DNA变性。步骤2：消化之后，添加含有所有扩增所需试剂的PCR混合物，所述试剂包含引物、抑制性寡核苷酸、竞争物和聚合酶。PCR使用两步循环约35轮循环来进行。通过使用较低数目的循环，在所述多重反应中引入最小偏差，仍产生足够产物用于具有大的噪音上信号(signal over noise)的准确分析。在一些情况中，进行PCR后的外切核酸酶步骤。步骤3：使用基于高分辨率、微流体(如毛细管)电泳核酸分离系统来进行电泳。在一些情况中，各反应取样三次以消除分析步骤中引入的方差。这三步胎儿定量试验允许高通量和最少的操作员处理时间，并且与其它DNA定量方法(例如基于MALDI-TOF的FQA)相比，显著削减了工作量(这两种方法的比较参见图4)。
生物化学试验和方案
限制性消化反应
先使用甲基化敏感性限制性酶，以20微升的总反应体积(包括10微升试剂和10微升样品)对用于分析的来自模型系统或来自血浆的样品进行DNA消化。考虑到所述循环无细胞(CCF)DNA的稀释特性，以96孔板形式进行消化反应和PCR。选择这种方式是因为血浆中CCF DNA的浓度低(通常为1000～2000基因组拷贝/微升，或0.15～0.30ng/微升)，这需要更多体积的样品以达到所述试剂制备所概括出的最小实用目标值，约5ng/反应。
所述消化混合物如下表5所述混合，并分布至96孔无裙缘板中，然后离心。离心之后，向各孔添加10微升DNA样品并通过重复吹打来混合。根据表6中所示参数进行DNA消化、酶失活和DNA变性。
表6：限制性消化反应方案
聚合酶链式反应(PCR)
在添加20微升PCR混合物之后，在消化板中进行未消化DNA靶标和所述竞争物的扩增。所述PCR试剂和热循环概况各自分别示于下表7和下表8。
表7：PCR试剂方案
*甲基化、Y染色体和消化对照
**总标志物
***总标志物抑制剂
表8：PCR热循环概况
表8：PCR热循环概况
温度 时间 循环 注释
72℃ 3分钟 1 最后的延伸
4℃ 永久 1 储存反应
PCR后
使用外切核酸酶I，通过向所述PCR反应管中直接添加5微升外切核酸酶I混合物来除去剩余的PCR引物。这个步骤的目的在于防止生成来自引物和/或寡核苷酸的干扰电泳图分析的非特异性峰。所述外切核酸酶试剂和反应方案各自分别示于下表9和下表10。
表9：外切核酸酶试剂方案
表10：外切核酸酶反应方案
温度 时间 循环 注释
41℃ 20分钟 1 消化步骤
4℃ 永久 1 储存反应
实施例2：使用毛细管电泳检测多个扩增子
为了确定使用基于高分辨率、微流体电泳核酸分离系统(即，毛细管电泳)定量的可行性，使基因组DNA的稀释物以80%分离自PBMC的母体未经甲基化DNA和20%男性或女性胎盘(胚胎)DNA的比例来混合。将各样品稀释至含有约3000、2000、1000、500、250或0个总基因组拷贝，所述基因组拷贝对应600、400、200、100、50和0个甲基化拷贝/反应(参见图5)。
使用这种试验集合，分离不同的扩增子。在女性样品中未检测到Y染色体的特异性标志物。使用毛细管电泳观察到的扩增子长度比预计长度长约10bp。关于这个结果可能的解释可以是：由于染料结合的聚腺苷酸化和/或较大片段。由于所述试验中的所有扩增子都出现了该现象，因此在扩增子分离中没有破坏。
实施例3：靶向抑制性PCR
在这个实施例中，检测靶向抑制性PCR的效果。结果示于图6A和图6B。进行两个平行反应：不使用抑制剂(图6A)，或对特定针对总DNA标志物的试验以2:1的比例使用抑制剂(图6B)。观察到所述靶向总标志物(DNA模板和竞争性寡核苷酸)的扩增信号显著减少，而所述非靶向试验没有观察到变化。
在另一个试验中，使用不同的抑制剂对比PCR引物的比例进行靶向抑制性PCR。使用两种不同的抑制剂:PCR引物比例进行平行反应。在图7A中，使用0.4微摩尔抑制剂:0.6微摩尔PCR引物的比例。在图7B中，使用0.6微摩尔抑制剂:0.4微摩尔PCR引物的比例。尽管总标志物的强度随着添加抑制剂的增长而急剧下降，但是靶向甲基化和Y染色体标志物的未受影响的试验中未见变化。
实施例4：PCR引物二聚体形成的鉴定
CCFF DNA的成功定量取决于某些因素，例如特异性和效率。例如，与靶标相关的非特异性产物和低效引物会影响数据质量。在PCR引物设计中，所选引物对所需的靶序列特异，在避免二级机构的位置结合，并且使引物二聚体形成的出现最小化，这样的PCR引物设计能成功进行CCFF DNA定量试验。合适的反应条件也能改善扩增效率。特异性和效率还能通过优化来实现，所述优化例如优化检测方法、镁浓度、退火温度、酶浓度、PCR产物长度等。
为确保胎儿DNA灵敏且特异的定量，以及DNA和竞争者寡核苷酸的稳健且有效的扩增，进行了一组试验以鉴定潜在的引物二聚体的形成。在这个设定中，测试所用的全部PCR引物的引物二聚体潜力。所述试验包含仅使用竞争者寡核苷酸、抑制寡核苷酸，以及正向引物和反向引物的扩增。各实验的细节示于下表11、表12和表13。通过使用所述竞争物作为PCR的唯一模板，预计有115bp、126bp、141bp和156bp的四种片段。如图8所示，鉴定了两种模板独立产物。鉴定出对位于Y染色体上的UTY基因具有特异性的PCR引物与总标志物的抑制寡核苷酸的相互作用。具体而言，POP5正向抑制剂与UTY反向引物相互作用(产生70bp的产物)，并且APOE正向抑制剂与UTY正向引物相互作用(产生60bp的产物)，但仅在APOE反向抑制剂不存在的情况下发生。引物二聚体形成的各事件在图8中以圆圈标出。因为该引物二聚体形成，将UTY PCR引物从胎儿DNA定量试验中除去。在除去UTY PCR引物之后，在电泳中没有任何引物二聚体形成的迹象。
表11：主混合物包含针对UTY的PCR引物(FP(正向引物)和RP(反向引物))、针对Tbx3的(FP和RP)、Sox14、Pop5、ApoE、Dig1和Dig2。省略了DDX3Y引物。
表12：主混合物包含针对UTY的PCR引物(RP)、针对Tbx3的(FP和RP)、Sox14、Pop5、ApoE、Dig1和Dig2。省略了DDX3Y引物。
表13：主混合物包含针对UTY的PCR引物(FP)、针对Tbx3的(FP和RP)、Sox14、Pop5、ApoE、Dig1和Dig2。省略了DDX3Y引物。
实施例5：基因组模型系统
为了测定所述方法的灵敏度和准确性，开发了模型系统以模拟分离自血浆的循环无细胞DNA样品。所述样品包含大约2000个基因组拷贝，其中有大量分离自母体PBMC的DNA，并且掺入不同量的男性或女性胎盘DNA。将0、40、80、120、160、200、240或280个胎盘拷贝掺入所述样品，产生含有0～14%胎盘分数的样品。在六个平行反应中分析各稀释度。使用各DNA标志物/竞争物峰的比例来计算拷贝数。图9A所示的带状图显示了使用甲基化或Y染色体特异性标志物计算的胎盘拷贝数。该结果指示样品中胎盘分数与针对甲基化和Y特异性标志物的给定峰计算的拷贝数之间的相关性。图9B所示的带状图显示了计算的总DNA拷贝数。各稀释物包括总数恒定的基因组，其在经计算的拷贝数值中得到反映。如图9C所示，观察到基于甲基化标志物和Y染色体标志物计算的拷贝数之间的相关性。通过使用获自甲基化试验和Y染色体标志物与各自竞争物相比的比例来计算不同量的母体未经甲基化DNA中所掺入的胎盘DNA的拷贝数。所述模型系统显示了基于甲基化的定量和Y染色体特异性序列之间的高相关性(rho=0.93(皮尔森相关))。在图9D中，显示了对使用甲基化计算得到的或使用Y染色体标志物计算得到的胎盘拷贝数做比较的Q-Q曲线。Q-Q曲线(“Q”代表分位数)是概率曲线，其是用于通过绘制彼此相对的分位数来比较两种概率分布的图解方法。如果比较的两种分布相似，那么所述Q-Q曲线中的点大约位于y=x线上。如果所述分布线性相关，则所述Q-Q曲线中的点将近似位于一条线上，但不必需位于y=x线上。如图9D中所示，所述两种分布位于y=x线上，从而是相似的。
实施例6：CpG甲基化模型系统
为了测定所述消化对照的灵敏度和准确性，开发了模型系统以模拟从血浆分离的经降解的和无细胞循环DNA样品。这些样品包含大约2000个基因组拷贝，其中有大量从母体PBMC分离的DNA，并且掺入不同量的男性CpG甲基化的DNA。将0、40、80、120、160、200、240或280个胎盘拷贝掺入所述样品，产生含有0～14%胎盘分数的样品。如图10所示，在反应中掺入了CpG甲基化的DNA的全部样品中，在大约110bp处显示了明显的峰。由于掺入DNA的全部DNA是甲基化的，该限制是不完全的，并且可将生成的峰量化。针对消化对照获得的峰高显示了与甲基化峰和Y染色体的峰的线性关系，从而验证了所述消化对照。
实施例7：血浆源性DNA
为了研究用于临床样品中胎儿DNA定量的方法的灵敏度和准确性，分析了获自妊娠女性的96份血浆样品。使获自4mL提取物的DNA样品洗脱为55微升，并用于四个平行反应中：两个反应使用基于毛细管的FQA，而两个反应使用基于MassARRAY的FQA。将本文提供的采用基于毛细管电泳的FQA获得的结果与基于MASSARRAY的FQA做比较。计算了使用甲基化标志物的平均和总DNA获得的经计算的拷贝数和少数物分数之间的成对相关性。给定值指示了所述两种不同测量之间的最小差异，由此验证了所述方法的准确性和稳定性(参见图16和图17)。
如图11和图12所示分析数据。如图11A所示，在男性妊娠和女性妊娠间做比较。生成了(所述96份DNA样品中)男性对比女性DNA样品的胎儿分数的盒须图。上方和下方须线代表第5百分点和第95百分点。上方、中部、下方的短线代表第25、第50、第75百分点。在男性(n=36)和女性(n=60)样品的甲基化标志物之间没有观察到显著差异(p值>0.05)。图11B显示了针对男性样品使用甲基化标志物对比Y染色体标志物获得的经计算的胎儿拷贝数之间的成对相关性。给定值指示所述两种不同测量之间的最小差异，由此验证了该方法的准确性和稳定性。(ρ=0.9，皮尔森相关)。
上述数据的额外分析包含三种连续毛细管电泳跑动的比较。结果示于图12。显示了针对男性样品使用甲基化标志物平均对比使用Y染色体标志物平均获得的经计算的胎儿分数之间的成对相关性。给定值指示所述三种不同测量之间的最小差异，由此验证了所述方法的准确性和稳定性。
实施例8：PCR后优化
在这个实施例中，使用电泳来显现并定量PCR中产生的多个扩增子，并鉴定所述电泳图中的任何非特异性峰。由于所述试验的特异性取决于PCR引物，新结构会导致电泳图中的噪音，所述新结构例如引物二聚体的形成和反应中存在的基因组DNA或竞争者寡核苷酸的非特异性扩增。仅包含期望峰的干净的电泳图能比含有非特异性峰的电泳图提供更可靠的印记。
如图13A所示，在所述电泳图中检测到对应于PCR引物的非特异性峰(在图13A中以圆圈标示)。为了去除全部残余的单链PCR引物，在41℃用2.5U外切核酸酶I将PCR后的样品处理15分钟。该试验以两次重复进行。如图13B所示，所述外切核酸酶去除了全部PCR引物。此外，因为所述PCR的退火/延长步骤在68℃进行，PCR引物的特异性极好且无引物二聚体形成。这些结构，如果它们存在，将很容易在电泳图中被鉴别，因为它们是双链的，并且会躲避单链特异性外切核酸酶。
实施例9：少数核酸的分数和拷贝数的计算
为了证明使用基于毛细管FQA来测定少数核酸分数，使用以预定比例的少数核酸和多数核酸的混合样品。测定基于含有0～10%的少数物质的混合DNA样品中的SOX14和TBX3甲基化标志物的少数物分数。各样品以以下比例包含1500或3000个(少数物和多数物)总拷贝：少数物比多数物为0%:100%、1%:99%、2%:98%、3%:97%、4%:96%、5%:95%、6%:94%、7%:93%、8%:92%、9%:91%和10%:90%。为计算所述样品中少数核酸相对于所述样品中核酸总量的分数，应用以下等式：
少数核酸的分数=(少数核酸的浓度)/[(总核酸的浓度)×k)]，其中k是阻尼系数，通过该系数来调整多数核酸扩增产物。K基于该扩增反应中总引物与抑制剂的比例来实验测定。在通过毛细管电泳产生的读出中获得总核酸物质和少数核酸物质的浓度。各样品使用基于毛细管的FQA以8次重复的形式来分析，结果示于图14A(1500个总拷贝)和图14B(3000个总拷贝)。预期的少数物分数与各类型样品观察到的少数物分数有良好的相关性。
为了证明使用基于毛细管的FQA来测定少数核酸拷贝数，使用含预定拷贝数的少数核酸的混合样品。测定基于含0～10%少数物质的DNA样品中的SOX14和TBX3甲基化标志物的少数物拷贝数(即，图15A中的0～150少数物质拷贝和图15B中的0～300少数物质拷贝)。各样品以以下比例包含1500或3000个(少数物和多数物)总拷贝：少数物比多数物为0%:100%、1%:99%、2%:98%、3%:97%、4%:96%、5%:95%、6%:94%、7%:93%、8%:92%、9%:91%和10%:90%。为了计算样品中少数核酸的拷贝数，应用如下等式：
拷贝数(少数核酸物质)=[(少数核酸的浓度)/(少数竞争物的浓度)]×C，其中C是向所述扩增反应中添加的竞争者寡核苷酸的数目。在通过毛细管电泳生成的读出中获得少数核酸和少数竞争物的浓度。各样品使用基于毛细管的FQA以8次重复的形式来分析，结果示于图15A(1500个总拷贝)和图15B(3000个总拷贝)。预期的少数物拷贝数与针对各类型样品观察到的少数物拷贝数有良好的相关性。
实施例10：差异甲基化的基因组区域
在这个实施方式中，显示用于测定甲基化或未甲基化的核酸的额外基因组DNA靶标。列于下表14的区域(非21染色体区域)和列于下表15的区域(21染色体区域)显示限定区域内的所测CpG二核苷酸的显著部分中的DNA甲基化的不同水平，并因而描述为与源自胎盘组织和外周血单核细胞(PBMC)的DNA相比的差异甲基化区域(DMR)。CpG位点的差异DNA甲基化采用成对T检验确定，若将胎盘组织与PBMC作比较时p值为p<0.05，则那些位点认为是差异甲基化。各列的定义如下所列。
区域名称：各区域用位于定义区内或其附近的基因命名。未列出基因名称而仅含有基因座的区域在其附近没有refseq基因。
基因区域：对于在基因紧邻处或者在基因内包含的那些区域，基因区域进一步解释所述区域与邻近基因的关系。
染色体：DMR所在的染色体，采用UCSC基因组浏览器的hg18构建(万维网URLgenome.ucsc.edu)。
起始：由UCSC基因组浏览器的hg18构建指定的DMR起始位置(万维网URLgenome.ucsc.edu)。
终止：由UCSC基因组浏览器的hg18构建指定的DMR终止位置(万维网URLgenome.ucsc.edu)。
微阵列分析：描述所述区域是否通过微阵列分析再次/最初确定为差异甲基化。用MBD-Fc蛋白分离10种成对胎盘和PBMC样品的甲基化部分。然后采用BioPrime总基因组标记系统TM用ALEXA FLUOR555–aha–dCTP(针对PBMC)或ALEXA FLUOR647–aha–dCTP(针对胎盘)标记所述两种组织部分并与岛微阵列杂交。这些研究中检查的很多区域不包含在初始的微阵列中。
EPITYPER8样品：描述了所述区域是否采用EPITYPER技术分析并确定为在8种成对的胎盘和外周血单核细胞(PBMC)样品中有差异甲基化。选定用于检查的区域是基于多项标准。首先，基于微阵列分析的数据选定区域。其次，采取对位于染色体21上的所有CpG岛进行全面检查。最后，对染色体21上CpG频率低于CpG岛内的选定区域进行检查。
EPITYPER73样品：描述了所述区域是否随后采用EPITYPER技术在由73种成对胎盘和PBMC样品组成的样品组中进行分析。选择用于所述第二样品组中分析的所有区域都是根据EPITYPER8列中所述实验的结果来选出的。所述额外组中的全部区域显示的甲基化概况与EPITYPER8样品分析中所确定的甲基化概况相似。
预先证实的EPITYPER：描述了所述区域或所述区域的部分在预先实验中是否采用EPITYPER来证实。
胎盘相对母体的甲基化：描述差异甲基化的取向。标为“高甲基化”区域是胎盘样品中指定区域相对于PBMC样品而言有更多甲基化，而“低甲基化”为PBMC样品中指定区段有更多甲基化。
区域长度(bp)使用UCSC基因组浏览器的hg18构建的DMR的长度(万维网URLgenome.ucsc.edu)。
实施例11：序列示例
下方提供了某些核苷酸和氨基酸序列的非限定性示例。
实施例12：实施方式示例
A1.一种用于测定样品中少数核酸物质的量的方法，所述方法包括：
(a)在扩增条件下使含有少数物质和多数物质的核酸样品接触以下物质，其中，所述少数物质和所述多数物质的组合包含所述样品中的总核酸：
(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增样品核酸中的第一区域，所述第一区域包含以下特征(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数物质中但存在于所述多数核酸物质中，
(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增所述样品核酸中的第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和所述第二区域不同，和
(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，从而产生少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，其中，所述总核酸扩增产物相对于没有抑制性寡核苷酸存在下会产生的总扩增产物而言有所减少。
(b)分离所述少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，从而产生分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物；和
(c)基于所述经分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物的各自的量，来测定所述样品中的所述少数核酸物质的分数。
A1.1如实施方式A1或A1.1所述的方法，其中，所述样品中的少数核酸物质分数是相对于所述样品中的核酸总量而言。
A2.如实施方式A1所述的方法，其中，存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中的所述特征是甲基化。
A3.如实施方式A2所述的方法，其中，所述第一区域被甲基化。
A4.如实施方式A3所述的方法，其中，所述第二区域未被甲基化。
A5.如实施方式A1～A4中任一项所述的方法，所述方法还包括在(a)之前使所述核酸样品与一种或多种限制性酶接触。
A6.如实施方式A5所述的方法，其中，所述一种或多种限制性酶是甲基化敏感的。
A7.如实施方式A6所述的方法，其中，所述限制性酶是HhaI和HpaII。
A8.如实施方式A1～A7中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与第三组扩增引物接触，所述第三组扩增引物扩增所述样品核酸中的第三区域，以允许测定是否存在胎儿特异性核酸。
A9.如实施方式A8所述的方法，其中，所述胎儿特异性核酸是Y染色体核酸。
A10.如实施方式A1～A9中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与第四组扩增引物接触，所述第四组扩增引物扩增所述样品核酸中的第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。
A11如实施方式A10所述的方法，其中，所述第一、第二、第三和第四区域各自包含一个或多个基因组基因座。
A12.如实施方式A11所述的方法，其中，所述基因组基因座的长度相同。
A13.如实施方式A12所述的方法，其中，所述基因组基因座为约50个碱基对～约200个碱基对。
A14.如实施方式A13所述的方法，其中，所述基因组基因座为约60个碱基对～约80个碱基对。
A15.如实施方式A14所述的方法，其中所述基因组基因座为约70个碱基对。
A16.如实施方式A1所述的方法，其中，所述第一区域包含所述少数物质和多数物质之间差异甲基化的一个或多个基因座。A17.如实施方式A1所述的方法，其中，所述第一区域包含TBX3和SOX14基因中的基因座。
A18.如实施方式A17所述的方法，其中，所述第一区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
A19.如实施方式A1所述的方法，其中，所述第二区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座不含有甲基化敏感的限制性酶的限制性位点。A20.
如实施方式A1所述的方法，其中，所述第二区域包含POP5和APOE基因中的基因座。
A21.如实施方式A20所述的方法，其中，所述第二区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
A22.如实施方式A9所述的方法，其中，所述第三区域包含Y染色体中的一个或多个基因座。A23.如实施方式A9所述的方法，其中，所述第三区域包含DDX3Y基因中的基因座。
A24.如实施方式A23所述的方法，其中，所述第三区域的基因座包含SEQID NO:34。
A25.如实施方式A10所述的方法，其中，所述第四区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座存在于所述样品的每个基因组中，并且在所有物质中未甲基化。
A26.如实施方式A10所述的方法，其中，所述第四区域包含POP5或LDHA基因中的基因座。
A27.如实施方式A26所述的方法，其中，所述第四区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
A28.如实施方式A1所述的方法，其中，所述第一组和第二组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。A29.如实施方式A10所述的方法，其中，所述第三组和第四组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。A30.如实施方式A28或A29所述的方法，其中，一对或多对扩增引物对还包含5’尾部。
A31.如实施方式A30所述的方法，其中，各扩增引物组的所述5’尾部的长度不同。
A32.如实施方式A28～A31中任一项所述的方法，其中，所述扩增引物各自独立地包含SEQ ID NO:1～8和SEQ ID NO:11～16。
A33.如实施方式A1所述的方法，其中，所述一种或多种抑制性寡核苷酸的抑制性寡核苷酸包含与所述第二区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列。A34.如实施方式A33所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸和所述第二组扩增引物中的引物与所述第二区域中的相同核苷酸序列互补。
A35.如实施方式A33或A34所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。.
A36.如实施方式A35所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸各自独立地包含SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
A37.如实施方式A1～A36中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与一种或多种第一竞争者寡核苷酸接触，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争。
A38.如实施方式A1～A37中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与一种或多种第二竞争者寡核苷酸接触，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争。
A39.如实施方式A8～A38中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与一种或多种第三竞争者寡核苷酸接触，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争。
A40.如实施方式A10～A39中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与一种或多种第四竞争者寡核苷酸接触，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争。
A41.如实施方式A37～A40中任一项所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸包含填充序列。
A42.如实施方式A41中所述的方法，其中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是恒定的。A43.如实施方式A41中所述的方法，其中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是可变的。
A44.如实施方式A42或A43所述的方法，其中，所述填充序列来自非人基因组。A45.如实施方式A44所述的方法，其中，所述填充序列来自PhiX174基因组。
A46.如实施方式A37～A45中任一项所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约100～约150个碱基对。
A47.如实施方式A46所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约115～约120个碱基对。
A48.如实施方式A47所述的方法，其中，所述第一和第二竞争者寡核苷酸的长度为约115个碱基对。
A49.如实施方式A47所述的方法，其中，所述第三竞争者寡核苷酸的长度为约118个碱基对。
A50.如实施方式A47所述的方法，其中，所述第四竞争者寡核苷酸的长度为约120个碱基对。
A51.如实施方式A48所述的方法，其中，所述一种或多种第一竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
A52.如实施方式A48所述的方法，其中，所述一种或多种第二竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
A53.如实施方式A49所述的方法，其中，所述第三竞争者寡核苷酸包含SEQ ID NO:26。
A54.如实施方式A50所述的方法，其中，所述一种或多种第四竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。
A55.如实施方式A37～A54中任一项所述的方法，其中，一种或多种竞争者寡核苷酸包含可检测标记。
A56.如实施方式A55所述的方法，其中，所述可检测标记是荧光团。
A57.如实施方式A56所述的方法，其中，各竞争者寡核苷酸的所述荧光团不同。
A58.如实施方式A37～A57中任一项所述的方法，其中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。
A59.如实施方式A58所述的方法，所述方法还包括基于所用竞争者寡核苷酸的量来测定所述少数核酸物质的拷贝数。
A60.如实施方式A59所述的方法，所述方法还包括测定所述多数核酸物质的拷贝数。
A61.如实施方式A1～A60中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸是胞外核酸。A62.如实施方式A1～A61中任一项所述的方法，其中，所述少数核酸物质是胎儿DNA。
A63.如实施方式A1～A62中任一项所述的方法，其中，所述多数核酸物质是母体DNA。
A64.如实施方式A1～A63中任一项所述的方法，其中，所述核酸样品获自妊娠女性对象。A65.如实施方式A64所述的方法，其中，所述对象是人。
A66.如实施方式A1～A65中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸来自血浆。A67.如实施方式A1～A65中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸来自血清。A68.如实施方式A1～A67中任一项所述的方法，其中，所述扩增在单个反应容器中进行。
A69.如实施方式A1～A68中任一项所述的方法，其中，两种或更多种所述扩增产物的长度不同。
A70.如实施方式A1～A69中任一项所述的方法，其中，所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
A71.如实施方式A1～A70中任一项所述的方法，所述方法还包括在(b)之前使所述扩增产物与外切核酸酶接触。
A72.如实施方式A1～A71中任一项所述的方法，其中，基于长度来分离所述扩增产物。
A73.如实施方式A1～A72中任一项所述的方法，其中，所述分离使用电泳进行。
A74.如实施方式A73所述的方法，其中，所述电泳是毛细管电泳。A75.如实施方式A1～A74中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述核酸样品是否用于测序反应。
A76.如实施方式A75所述的方法，其中，所述测序反应是基于可逆终止子的测序反应。
A77.如实施方式A1～A76中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所获得的核酸样品的测序信息是否用于诊断确定。
B1.一种用于测定样品中少数核酸物质的拷贝数的方法，所述方法包括：
(a)在扩增条件下使含有少数物质和多数物质的核酸样品接触以下物质，其中，所述少数物质和所述多数物质的组合包含所述样品中的总核酸：
(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增样品核酸中的第一区域，所述第一区域包含以下特征(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中。
(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增所述样品核酸中的第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和所述第二区域不同，
(iii)一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争，和
(iv)一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争，从而产生扩增产物，其中两种或更多种所述扩增产物的长度不同；
(b)将所述少数核酸扩增产物、总核酸扩增产物和竞争扩增产物分离，从而产生分离的少数核酸扩增产物、总核酸扩增产物和竞争扩增产物；和
(c)基于所述分离的扩增产物来测定所述样品中少数核酸物质的拷贝数。B2.如实施方式B1所述的方法，其中，存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中的所述特征是甲基化。B3.如实施方式B2所述的方法，其中，所述第一区域被甲基化。B4.如实施方式B3所述的方法，其中，所述第二区域未被甲基化。
B5.如实施方式B1～B4中任一项所述的方法，所述方法还包括在(a)之前使所述核酸样品与一种或多种限制性酶接触。
B6.如实施方式B5所述的方法，其中，所述一种或多种限制性酶是甲基化敏感的。
B7.如实施方式B6所述的方法，其中，所述限制性酶是HhaI和HpaII。
B8.如实施方式B1～B7中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与第三组扩增引物接触，所述第三组扩增引物扩增所述样品核酸中的第三区域，以允许测定是否存在胎儿特异性核酸。
B9.如实施方式B8所述的方法，其中，所述胎儿特异性核酸是Y染色体核酸。
B10.如实施方式B1～B9中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与第四组扩增引物接触，所述第四组扩增引物扩增所述样品核酸中的第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。
B11.如实施方式B10所述的方法，其中，所述第一、第二、第三和第四区域各自包含一个或多个基因组基因座。
B12.如实施方式B11所述的方法，其中，所述基因组基因座的长度相同。
B13.如实施方式B12所述的方法，其中，所述基因组基因座为约50个碱基对～约200个碱基对。
B14.如实施方式B13所述的方法，其中，所述基因组基因座为约60个碱基对～约80个碱基对。
B15.如实施方式B14所述的方法，其中所述基因组基因座为约70个碱基对。
B16.如实施方式B1所述的方法，其中，所述第一区域包含所述少数物质和多数物质之间差异甲基化的一个或多个基因座。
B17.如实施方式B1所述的方法，其中，所述第一区域包含TBX3和SOX14基因中的基因座。
B18.如实施方式B17所述的方法，其中，所述第一区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
B19.如实施方式B1所述的方法，其中，所述第二区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座不含有甲基化敏感的限制性酶的限制性位点。
B20.如实施方式B1所述的方法，其中，所述第二区域包含POP5和APOE基因中的基因座。
B21.如实施方式B20所述的方法，其中，所述第二区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
B22.如实施方式B9所述的方法，其中，所述第三区域包含Y染色体中的一个或多个基因座。
B23.如实施方式B9所述的方法，其中，所述第三区域包含DDX3Y基因中的基因座。
B24.如实施方式B23所述的方法，其中，所述第三区域的基因座包含SEQ ID NO:34。
B25.如实施方式B10所述的方法，其中，所述第四区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座存在于所述样品的每个基因组中，并且在所有物质中未甲基化。
B26.如实施方式B10所述的方法，其中，所述第四区域包含POP5或LDHA基因中的基因座。
B27.如实施方式B26所述的方法，其中，所述第四区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
B28.如实施方式B1所述的方法，其中，所述第一组和第二组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。
B29.如实施方式B10所述的方法，其中，所述第三组和第四组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。
B30.如实施方式B28或B29所述的方法，其中，一对或多对扩增引物对还包含5’尾部。
B31.如实施方式B30所述的方法，其中，各扩增引物组的所述5’尾部的长度不同。
B32.如实施方式B28～B31中任一项所述的方法，其中，所述扩增引物各自独立地包含SEQ ID NO:1～8和SEQ ID NO:11～16。
B33.如实施方式B1～B32中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与一种或多种抑制性寡核苷酸接触，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增。B34.如实施方式B33所述的方法，其中，所述一种或多种抑制性寡核苷酸的抑制性寡核苷酸包含与所述第二区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
B35.如实施方式B34所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸和所述第二组扩增引物中的引物与所述第二区域中的相同核苷酸序列互补。
B36.如实施方式B34或B35所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。.
B37.如实施方式B36所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸各自独立地包含SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
B38.如实施方式B1～B37中任一项所述的方法，所述方法还包括基于所述分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物各自的量来测定所述样品中所述少数核酸物质的分数。
B38.1如实施方式B38所述的方法，其中，所述样品中的所述少数核酸物质的分数是相对于所述样品中的所述核酸总量而言。
B39.如实施方式B8～B38.1中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与一种或多种第三竞争者寡核苷酸接触，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争。
B40.如实施方式B10～B39中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与一种或多种第四竞争者寡核苷酸接触，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争。
B41.如实施方式B1～B40中任一项所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸包含填充序列。
B42.如实施方式B41中所述的方法，其中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是恒定的。
B43.如实施方式B41中所述的方法，其中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是可变的。
B44.如实施方式B42或B43所述的方法，其中，所述填充序列来自非人基因组。
B45.如实施方式B44所述的方法，其中，所述填充序列来自PhiX174基因组。
B46.如实施方式B1～B45中任一项所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约100～约150个碱基对。
B47.如实施方式B46所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约115～约120个碱基对。
B48.如实施方式B47所述的方法，其中，所述第一和第二竞争者寡核苷酸的长度为约115个碱基对。
B49.如实施方式B47所述的方法，其中，所述第三竞争者寡核苷酸的长度为约118个碱基对。
B50.如实施方式B47所述的方法，其中，所述第四竞争者寡核苷酸的长度为约120个碱基对。
B51.如实施方式B48所述的方法，其中，所述一种或多种第一竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
B52.如实施方式B48所述的方法，其中，所述一种或多种第二竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
B53.如实施方式B49所述的方法，其中，所述第三竞争者寡核苷酸包含SEQ ID NO:26。
B54.如实施方式B50所述的方法，其中，所述一种或多种第四竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。
B55.如实施方式B1～B54中任一项所述的方法，其中，一种或多种竞争者寡核苷酸包含可检测标记。
B56.如实施方式B55所述的方法，其中，所述可检测标记是荧光团。
B57.如实施方式B56所述的方法，其中，各竞争者寡核苷酸的所述荧光团不同。
B58.如实施方式B1～B57中任一项所述的方法，其中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。
B59.如实施方式B58所述的方法，其中，基于所用竞争者寡核苷酸的量来测定所述少数核酸物质的拷贝数。
B60.如实施方式B59所述的方法，其中，测定所述多数核酸物质的拷贝数。
B61.如实施方式B1～B60中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸是胞外核酸。
B62.如实施方式B1～B61中任一项所述的方法，其中，所述少数核酸物质是胎儿DNA。
B63.如实施方式B1～B62中任一项所述的方法，其中，所述多数核酸物质是母体DNA。
B64.如实施方式B1～B63中任一项所述的方法，其中，所述核酸样品获自妊娠女性对象。
B65.如实施方式B64所述的方法，其中，所述对象是人。
B66.如实施方式B1～B65中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸来自血浆。
B67.如实施方式B1～B65中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸来自血清。
B68.如实施方式B1～B67中任一项所述的方法，其中，所述扩增在单个反应容器中进行。
B69.如实施方式B1～B68中任一项所述的方法，其中，所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
B70.如实施方式B1～B69中任一项所述的方法，所述方法还包括在(b)之前使所述扩增产物与外切核酸酶接触。
B71.如实施方式B1～B70中任一项所述的方法，其中，基于长度来分离所述扩增产物。
B72.如实施方式B1～B71任一项所述的方法，其中，所述分离使用电泳进行。
B73.如实施方式B72所述的方法，其中，所述电泳是毛细管电泳。
B74.如实施方式B1～B73中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述核酸样品是否用于测序反应。
B75.如实施方式B74所述的方法，其中，所述测序反应是基于可逆终止子的测序反应。
B76.如实施方式B1～B75中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所获得的核酸样品的测序信息是否用于诊断确定。
C1.一种用于测定样品中少数核酸物质的量的方法，所述方法包括：
(a)在扩增条件下使含有少数物质和多数物质的核酸样品接触以下物质，其中，所述少数物质和所述多数物质的组合包含所述样品中的总核酸：
(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增样品核酸中的第一区域，所述第一区域包含以下特征(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中。
(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增所述样品核酸中的第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中，所述第一区域和所述第二区域不同，
(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，
(iv)一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争，和
(v)一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争，从而产生少数核酸扩增产物、总核酸扩增产物和竞争扩增产物，其中，两种或更多种所述扩增产物的长度不同，并且所述总核酸扩增产物相对于没有抑制性寡核苷酸存在下会产生的总扩增产物而言有所减少；
(b)将所述扩增产物分离，从而产生分离的少数核酸扩增产物、总核酸扩增产物和竞争扩增产物；和
(c)基于所述分离的扩增产物来测定所述样品中少数核酸物质的量。
C2.如实施方式C1所述的方法，其中，存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中的所述特征是甲基化。
C3.如实施方式C2所述的方法，其中，所述第一区域被甲基化。
C4.如实施方式C3所述的方法，其中，所述第二区域未被甲基化。
C5.如实施方式C1～C4中任一项所述的方法，所述方法还包括在(a)之前使所述核酸样品与一种或多种限制性酶接触。
C6.如实施方式C5所述的方法，其中，所述一种或多种限制性酶是甲基化敏感的。
C7.如实施方式C6所述的方法，其中，所述限制性酶是HhaI和HpaII。
C8.如实施方式C1～C7中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与第三组扩增引物接触，所述第三组扩增引物扩增所述样品核酸中的第三区域，以允许测定是否存在胎儿特异性核酸。
C9.如实施方式C8所述的方法，其中，所述胎儿特异性核酸是Y染色体核酸。
C10.如实施方式C1～C9中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与第四组扩增引物接触，所述第四组扩增引物扩增所述样品核酸中的第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。
C11.如实施方式C10所述的方法，其中，所述第一、第二、第三和第四区域各自包含一个或多个基因组基因座。
C12.如实施方式C11所述的方法，其中，所述基因组基因座的长度相同。
C13.如实施方式C12所述的方法，其中，所述基因组基因座为约50个碱基对～约200个碱基对。
C14.如实施方式C13所述的方法，其中，所述基因组基因座为约60个碱基对～约80个碱基对。
C15.如实施方式C14所述的方法，其中所述基因组基因座为约70个碱基对。
C16.如实施方式C1所述的方法，其中，所述第一区域包含所述少数物质和多数物质之间差异甲基化的一个或多个基因座。
C17.如实施方式C1所述的方法，其中，所述第一区域包含TBX3和SOX14基因中的基因座。
C18.如实施方式C17所述的方法，其中，所述第一区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
C19.如实施方式C1所述的方法，其中，所述第二区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座不含有甲基化敏感的限制性酶的限制性位点。
C20.如实施方式C1所述的方法，其中，所述第二区域包含POP5和APOE基因中的基因座。
C21.如实施方式C20所述的方法，其中，所述第二区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
C22.如实施方式C9所述的方法，其中，所述第三区域包含Y染色体中的一个或多个基因座。
C23.如实施方式C9所述的方法，其中，所述第三区域包含DDX3Y基因中的基因座。
C24.如实施方式C23所述的方法，其中，所述第三区域的基因座包含SEQ ID NO:34。
C25.如实施方式C10所述的方法，其中，所述第四区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座存在于所述样品的每个基因组中，并且在所有物质中未甲基化。
C26.如实施方式C10所述的方法，其中，所述第四区域包含POP5或LDHA基因中的基因座。
C27.如实施方式C26所述的方法，其中，所述第四区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
C28.如实施方式C1所述的方法，其中，所述第一组和第二组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。
C29.如实施方式C10所述的方法，其中，所述第三组和第四组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。
C30.如实施方式C28或C29所述的方法，其中，一对或多对扩增引物对还包含5’尾部。
C31.如实施方式C30所述的方法，其中，各扩增引物组的所述5’尾部的长度不同。
C32.如实施方式C28～C31中任一项所述的方法，其中，所述扩增引物各自独立地包含SEQ ID NO:1～8和SEQ ID NO:11～16。
C33.如实施方式C1所述的方法，其中，所述一种或多种抑制性寡核苷酸的抑制性寡核苷酸包含与所述第二区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
C34.如实施方式C33所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸和所述第二组扩增引物中的引物与所述第二区域中的相同核苷酸序列互补。
C35.如实施方式C33或C34所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。.
C36.如实施方式C35所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸各自独立地包含SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
C37.如实施方式C1～C36中任一项所述的方法，其中，经测定的所述少数核酸的量是所述样品中的所述少数核酸物质的分数，所述分数是基于所述分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物各自的量。
C37.1如实施方式C37所述的方法，其中，所述样品中的所述少数核酸物质的分数是相对于所述样品中的所述核酸总量而言。
C38.如实施方式C8～C37.1中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与一种或多种第三竞争者寡核苷酸接触，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争。
C39.如实施方式C10～C38中任一项所述的方法，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸样品与一种或多种第四竞争者寡核苷酸接触，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争。
C40.如实施方式C1～C39中任一项所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸包含填充序列。
C41.如实施方式C40中所述的方法，其中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是恒定的。
C42.如实施方式C40中所述的方法，其中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是可变的。
C43.如实施方式C41或C42所述的方法，其中，所述填充序列来自非人基因组。
C44.如实施方式C43所述的方法，其中，所述填充序列来自PhiX174基因组。
C45.如实施方式C1～C44中任一项所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约100～约150个碱基对。
C46.如实施方式C45所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约115～约120个碱基对。
C47.如实施方式C46所述的方法，其中，所述第一和第二竞争者寡核苷酸的长度为约115个碱基对。
C48.如实施方式C46所述的方法，其中，所述第三竞争者寡核苷酸的长度为约118个碱基对。
C49.如实施方式C46所述的方法，其中，所述第四竞争者寡核苷酸的长度为约120个碱基对。
C50.如实施方式C47所述的方法，其中，所述一种或多种第一竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
C51.如实施方式C47所述的方法，其中，所述一种或多种第二竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
C52.如实施方式C48所述的方法，其中，所述第三竞争者寡核苷酸包含SEQ ID NO:26。
C53.如实施方式C49所述的方法，其中，所述一种或多种第四竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。
C54.如实施方式C1～C53中任一项所述的方法，其中，一种或多种竞争者寡核苷酸包含可检测标记。
C55.如实施方式C54所述的方法，其中，所述可检测标记是荧光团。
C56.如实施方式C55所述的方法，其中，各竞争者寡核苷酸的所述荧光团不同。
C57.如实施方式C1～C56中任一项所述的方法，其中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。
C58.如实施方式C57所述的方法，其中，经测定的所述少数核酸的量是所述少数核酸物质的拷贝数，所述拷贝数是基于所用竞争者寡核苷酸的量。
C59.如实施方式C58所述的方法，所述方法还包括测定所述多数核酸物质的拷贝数。
C60.如实施方式C1～C59中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸是胞外核酸。
C61.如实施方式C1～C60中任一项所述的方法，其中，所述少数核酸物质是胎儿DNA。
C62.如实施方式C1～C61中任一项所述的方法，其中，所述多数核酸物质是母体DNA。
C63.如实施方式C1～C62中任一项所述的方法，其中，所述核酸样品获自妊娠女性对象。
C64.如实施方式C63所述的方法，其中，所述对象是人。
C65.如实施方式C1～C64中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸来自血浆。
C66.如实施方式C1～C64中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸来自血清。
C67.如实施方式C1～C66中任一项所述的方法，其中，所述扩增在单个反应容器中进行。
C68.如实施方式C1～C67中任一项所述的方法，其中，所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
C69.如实施方式C1～C68中任一项所述的方法，所述方法还包括在(b)之前使所述扩增产物与外切核酸酶接触。
C70.如实施方式C1～C69中任一项所述的方法，其中，基于长度来分离所述扩增产物。
C71.如实施方式C1～C70任一项所述的方法，其中，所述分离使用电泳进行。
C72.如实施方式C71所述的方法，其中，所述电泳是毛细管电泳。
C73.如实施方式C1～C72中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述核酸样品是否用于测序反应。
C74.如实施方式C73所述的方法，其中，所述测序反应是基于可逆终止子的测序反应。
C75.如实施方式C1～C74中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所获得的核酸样品的测序信息是否用于诊断确定。
D1.一种用于测定样品中胎儿核酸的量的方法，所述方法包括：
(a)在扩增条件下使含有胎儿核酸和母体核酸的核酸样品接触以下物质，其中，所述胎儿物质和所述母体物质的组合包含所述样品中的总核酸：
(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增样品核酸中的第一区域，所述第一区域具有以下特征(1)存在于所述胎儿核酸中但不存在于所述母体核酸中，或(2)不存在于所述胎儿核酸中但存在于所述母体核酸中，
(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增所述样品核酸中的第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，
(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，
(iv)第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增所述样品核酸中的第三区域，以允许测定是否存在Y染色体核酸，
(v)第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增所述样品核酸中的第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂，其中，所述第一、第二、第三和第四区域不同，
(vi)一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争，
(vii)一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争，
(viii)一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争，和
(ix)一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争，从而产生胎儿核酸扩增产物、总核酸扩增产物、Y染色体核酸扩增产物、消化效率指示剂扩增产物和竞争扩增产物，其中两种或更多种所述扩增产物的长度不同，并且所述总核酸扩增产物相对于没有抑制性寡核苷酸存在下会产生的总扩增产物而言有所减少；(b)将所述扩增产物分离，从而产生分离的胎儿核酸扩增产物、总核酸扩增产物、Y染色体核酸扩增产物、消化效率指示剂扩增产物和竞争扩增产物；和
(c)基于所述分离的扩增产物来测定所述样品中胎儿核酸的量。
D2.如实施方式D1所述的方法，其中，存在于所述胎儿核酸中但不存在于所述母体核酸中的所述特征是甲基化。D3.如实施方式D2所述的方法，其中，所述第一区域被甲基化。
D4.如实施方式D3所述的方法，其中，所述第二区域未被甲基化。
D5.如实施方式D1～D4中任一项所述的方法，所述方法还包括在(a)之前使所述核酸样品与一种或多种限制性酶接触。
D6.如实施方式D5所述的方法，其中，所述一种或多种限制性酶是甲基化敏感的。
D7.如实施方式D6所述的方法，其中，所述限制性酶是HhaI和HpaII。
D8.如实施方式D1～D7中任一项所述的方法，其中，所述第一、第二、第三和第四区域各自包含一个或多个基因组基因座。
D9.如实施方式D8所述的方法，其中，所述基因组基因座的长度相同。
D10.如实施方式D9所述的方法，其中，所述基因组基因座为约50个碱基对～约200个碱基对。
D11.如实施方式D10所述的方法，其中，所述基因组基因座为约60个碱基对～约80个碱基对。
D12.如实施方式D11所述的方法，其中所述基因组基因座为约70个碱基对。
D13.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第一区域包含在所述胎儿核酸和母体核酸之间差异甲基化的一个或多个基因座。
D14.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第一区域包含TBX3和SOX14基因中的基因座。
D15.如实施方式D14所述的方法，其中，所述第一区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
D16.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第二区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座不含有甲基化敏感的限制性酶的限制性位点。
D17.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第二区域包含POP5和APOE基因中的基因座。
D18.如实施方式D17所述的方法，其中，所述第二区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
D19.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第三区域包含Y染色体中的一个或多个基因座。
D20.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第三区域包含DDX3Y基因中的基因座。
D21.如实施方式D20所述的方法，其中，所述第三区域的基因座包含SEQ ID NO:34。
D22.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第四区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座存在于所述样品的每个基因组中，并且在胎儿和母体核酸中未甲基化。
D23.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第四区域包含POP5或LDHA基因中的基因座。
D24.如实施方式D23所述的方法，其中，所述第四区域的基因座各自独立地包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
D25.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第一组和第二组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。
D26.如实施方式D1所述的方法，其中，所述第三组和第四组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。
D27.如实施方式D25或D26所述的方法，其中，一对或多对扩增引物对还包含5’尾部。
D28.如实施方式D27所述的方法，其中，各扩增引物组的所述5’尾部的长度不同。
D29.如实施方式D25～D28中任一项所述的方法，其中，所述扩增引物各自独立地包含SEQ ID NO:1～8和SEQ ID NO:11～16。
D30.如实施方式D1所述的方法，其中，所述一种或多种抑制性寡核苷酸的抑制性寡核苷酸包含与所述第二区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
D31.如实施方式D30所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸和所述第二组扩增引物中的引物与所述第二区域中的相同核苷酸序列互补。
D32.如实施方式D30或D31所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。.
D33.如实施方式D32所述的方法，其中，所述抑制性寡核苷酸各自独立地包含SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
D34.如实施方式D1～D33中任一项所述的方法，其中，经测定的所述胎儿核酸的量是所述样品中胎儿核酸的分数，所述分数是基于所述分离的胎儿核酸扩增产物和总核酸扩增产物各自的量。
D34.1如实施方式D34所述的方法，其中，所述胎儿核酸的分数是相对于所述样品中的核酸总量而言。D35.如实施方式D1～D34.1中任一项所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸包含填充序列。
D36.如实施方式D35中所述的方法，其中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是恒定的。
D37.如实施方式D35中所述的方法，其中，所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸的一种或多种填充序列的长度是可变的。
D38.如实施方式D36或D37所述的方法，其中，所述填充序列来自非人基因组。
D39.如实施方式D38所述的方法，其中，所述填充序列来自PhiX174基因组。
D40.如实施方式D1～D39中任一项所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约100～约150个碱基对。
D41.如实施方式D40所述的方法，其中，所述竞争者寡核苷酸的长度为约115～约120个碱基对。
D42.如实施方式D41所述的方法，其中，所述第一和第二竞争者寡核苷酸的长度为约115个碱基对。
D43.如实施方式D41所述的方法，其中，所述第三竞争者寡核苷酸的长度为约118个碱基对。
D44.如实施方式D41所述的方法，其中，所述第四竞争者寡核苷酸的长度为约120个碱基对。
D45.如实施方式D42所述的方法，其中，所述一种或多种第一竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
D46.如实施方式D42所述的方法，其中，所述一种或多种第二竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
D47.如实施方式D43所述的方法，其中，所述第三竞争者寡核苷酸包含SEQ ID NO:26。
D48.如实施方式D44所述的方法，其中，所述一种或多种第四竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
D49.如实施方式D1～D48中任一项所述的方法，其中，一种或多种竞争者寡核苷酸包含可检测标记。
D50.如实施方式D49所述的方法，其中，所述可检测标记是荧光团。
D51.如实施方式D50所述的方法，其中，各竞争者寡核苷酸的所述荧光团不同。
D52.如实施方式D1～D51中任一项所述的方法，其中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。
D53.如实施方式D52所述的方法，其中，经测定的所述胎儿核酸的量是所述胎儿核酸的拷贝数，所述拷贝数是基于所用竞争者寡核苷酸的量。
D54.如实施方式D53所述的方法，所述方法还包括测定所述母体核酸物质的拷贝数。
D55.如实施方式D1～D54中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸是胞外核酸。
D56.如实施方式D1～D55中任一项所述的方法，其中，所述核酸样品获自妊娠女性对象。
D57.如实施方式D56所述的方法，其中，所述对象是人。
D58.如实施方式D1～D57中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸来自血浆。
D59.如实施方式D1～D57中任一项所述的方法，其中，所述样品核酸来自血清。
D60.如实施方式D1～D59中任一项所述的方法，其中，所述扩增在单个反应容器中进行。
D61.如实施方式D1～D60中任一项所述的方法，其中，所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
D62.如实施方式D1～D61中任一项所述的方法，所述方法还包括在(b)之前使所述扩增产物与外切核酸酶接触。
D63.如实施方式D1～D62中任一项所述的方法，其中，基于长度来分离所述扩增产物。
D64.如实施方式D1～D63中任一项所述的方法，其中，所述分离使用电泳进行。
D65.如实施方式D64所述的方法，其中，所述电泳是毛细管电泳。
D66.如实施方式D1～D65中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述核酸样品是否用于测序反应。
D67.如实施方式D66所述的方法，其中，所述测序反应是基于可逆终止子的测序反应。
D68.如实施方式D1～D67中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所获得的核酸样品的测序信息是否用于诊断确定。
E1.一种组合物，所述组合物包含两种或更多种经扩增的、可通过长度区分的靶核酸的混合物，其中，各扩增子包含与靶核酸相同的第一序列和一种或多种与靶核酸不同的、长度可变的第二序列，其中，所述靶核酸各自独立地包含：
(a)第一区域，所述第一区域包含以下特征(i)存在于少数核酸中但不存在于多数核酸物质中，或(ii)不存在于少数核酸物质中但存在于多数核酸物质中，和
(b)第二区域，所述第二区域允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和第二区域不同。
E2.如实施方式E1所述的组合物，其中，所述第一区域和所述第二区域被差异甲基化。
E3.如实施方式E1或E2所述的组合物，其中，所述靶核酸还包含第三区域，以允许测定是否存在Y染色体核酸。
E4.如实施方式E1～E3中任一项所述的组合物，其中，所述靶核酸还包含第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。
E5.如实施方式E1～E4中任一项所述的组合物，其中，所述靶核酸包含一种或多种独立的基因组DNA靶序列。
E6.如实施方式E5所述的组合物，其中，所述基因组DNA靶序列的长度相同。
E7.如实施方式E6所述的组合物，其中，所述基因组DNA靶序列各自独立地包含SEQID NO:29～32和SEQ ID NO:34～36。
E8.如实施方式E1～E7中任一项所述的组合物，其中，所述靶核酸还包含一种或多种独立的竞争者寡核苷酸。
E9.如实施方式E8所述的组合物，其中，所述一种或多种竞争者寡核苷酸包含填充序列。E10.如实施方式E9所述的组合物，其中，所述竞争者寡核苷酸各自独立地包含SEQ IDNO:21～24和SEQ ID NO:26～28。
F1.一种用于测定样品中少数核酸物质的量的试剂盒，所述样品包含少数物质和多数物质，所述少数物质和所述多数物质的组合包含所述样品中的总核酸，所述试剂盒包含：(a)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增样品核酸中的第一区域，所述第一区域包含以下特征(i)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(ii)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中。
(b)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增所述样品核酸中的第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和所述第二区域不同，和
(c)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增。
F2.如实施方式F1所述的试剂盒，所述试剂盒还包含第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增所述样品核酸中的第三区域，以允许测定是否存在Y染色体核酸。F3.如实施方式F1或F2所述的试剂盒，所述试剂盒还包含第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增所述样品核酸中的第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。F4.如实施方式F1～F3中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组中的引物杂交而言与所述第一区域竞争。F5.如实施方式F1～F4中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组中的引物杂交而言与所述第二区域竞争。
F6.如实施方式F2～F5中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组中的引物杂交而言与所述第三区域竞争。
F7.如实施方式F3～F6中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组中的引物杂交而言与所述第四区域竞争。
F8.如实施方式F1～F7中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种甲基化敏感的限制性酶。
F9.如实施方式F1～F8中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含说明书或部位，所述说明书或部位用于遵照测定样品中少数核酸物质的量的方法，所述方法包括：
(a)在扩增条件下使含有少数物质和多数物质的核酸样品接触以下物质，其中，所述少数物质和所述多数物质的组合包含所述样品中的总核酸：
(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增样品核酸中的第一区域，所述第一区域包含以下特征(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中。
(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增所述样品核酸中的第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和所述第二区域不同，和
(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，从而产生少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，其中所述总核酸扩增产物相对于没有抑制性寡核苷酸存在下会产生的总扩增产物而言有所减少；
(b)将所述扩增产物分离，从而产生分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物；和
(c)基于所述分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物各自的量来测定所述样品中所述少数核酸物质的分数。
F9.1如实施方式F9所述的试剂盒，其中，所述样品中的所述少数核酸物质的分数是相对于所述样品中的所述核酸总量而言。
F10.如实施方式F1～F9.1中任一项所述的试剂盒，其中，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。
F11.如实施方式F9或F10所述的试剂盒，其中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸与第三组扩增引物接触，所述第三组扩增引物扩增所述样品核酸中的第三区域，以允许测定是否存在Y染色体核酸。F12.如实施方式F9～F11中任一项所述的试剂盒，其中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸与第四组扩增引物接触，所述第四组扩增引物扩增所述样品核酸中的第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。
F13.如实施方式F9～F12中任一项所述的试剂盒，其中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸与一种或多种第一竞争者寡核苷酸接触，所述第一竞争者寡核苷酸就与所述第一扩增引物组的引物杂交而言与所述第一区域竞争。
F14.如实施方式F9～F13中任一项所述的试剂盒，其中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸与一种或多种第二竞争者寡核苷酸接触，所述第二竞争者寡核苷酸就与所述第二扩增引物组的引物杂交而言与所述第二区域竞争。
F15.如实施方式F11～F14中任一项所述的试剂盒，其中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸与一种或多种第三竞争者寡核苷酸接触，所述第三竞争者寡核苷酸就与所述第三扩增引物组的引物杂交而言与所述第三区域竞争。
F16.如实施方式F12～F15中任一项所述的试剂盒，其中，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸与一种或多种第四竞争者寡核苷酸接触，所述第四竞争者寡核苷酸就与所述第四扩增引物组的引物杂交而言与所述第四区域竞争。
F17.如实施方式F4～F16中任一项所述的试剂盒，其中，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。
F18.如实施方式F17所述的试剂盒，其中，经测定的所述少数核酸的量是所述少数核酸物质的拷贝数，所述拷贝数是基于所用竞争者寡核苷酸的量。
F19.如实施方式F1～F18中任一项所述的试剂盒，其中，所述少数核酸物质是胎儿DNA而所述多数核酸物质是母体DNA。
F20.如实施方式F1～F19中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一区域被甲基化而所述第二区域未被甲基化。
***
本文中引用的各专利、专利申请、出版物和文献的全部内容均通过引用纳入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的现有技术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。
可对上述内容进行改变而不背离本技术的基本方面。尽管参考一个或多个具体实施方式充分详细描述了本技术，但是本领域普通技术人员应认识到可对本申请中具体公开的实施方式进行改良，只要这些改良和改进在本技术的范围和精神内。
本文中适当描述的技术可在没有任何本文未具体公开的元素的情况下实施。因此，例如，在本文的各个例子中，术语“包含”、“基本由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可用其它两个中的任一个代替。已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，此类术语和表达的使用并不排除对所显示和所描述的特征或其部分的任何等价物，以及在要求权利的本技术范围内可进行各种改良。术语“一个”或“一种”表示一种或多种其修饰的元素(例如“一种试剂”可表示一种或多种试剂)，除非上下文清楚表示所描述的是元素之一或是一种以上的元素。本文所使用的术语“约”表示在基础参数的10%范围内的数值(即±10%)，在一列数值的开头处使用术语的“约”表示修饰该列数值中的各数值(即“约1、2和3”指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量能包含90克-110克的重量。此外，当本文描述数值列表(例如，约50%、60%、70%、80%、85%或86%)时，该列表包含其所有中间值和分数值(例如，54%、85.4%)。因此，应理解，尽管通过代表性实施方式和任选的特征具体公开了本技术，但是本领域技术人员能对本文所公开内容进行改良和变化，应认为此类改良和变化落在本技术的范围内。
在所附权利要求书中陈述了本技术的某些实施方式。

Claims (99)

1.试剂(i)、(ii)和(iii)在制备用于测定样品中少数核酸物质的量的试剂盒中的应用，所述测定如下进行：
(a)在扩增条件下使含有少数物质和多数物质的核酸样品接触所述试剂(i)、(ii)和(iii)，其中，所述少数物质和所述多数物质的组合构成所述样品中的总核酸，由此产生少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物；
(b)分离所述少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，从而产生分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物；和
(c)基于所述分离的少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物各自的量，来确定所述样品中的所述少数核酸物质的分数，其中：
试剂(i)包含第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增样品核酸中的第一区域，所述第一区域包含以下特征(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中，
试剂(ii)包含第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增所述样品核酸中的第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中所述第一区域和所述第二区域不同，和
试剂(iii)包含一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，从而产生少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，其中，所述第二组扩增引物的量相对于所述一种或多种抑制性寡核苷酸的量具有一定比例，由此所述总核酸扩增产物相对于没有抑制性寡核苷酸存在下会产生的总扩增产物而言有所减少，并且，由此所述总核酸扩增产物被扩增至与所述少数核酸扩增产物相似的程度。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样品中的所述少数核酸物质的分数是相对于所述样品中的所述核酸的总量而言。
3.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中的特征是甲基化。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第一区域被甲基化。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第二区域未被甲基化。
6.如权利要求1或权利要求2中任一项所述的应用，其特征在于，在(a)之前使所述核酸样品进一步接触一种或多种限制性酶。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述一种或多种限制性酶是甲基化敏感的。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述限制性酶是HhaI和HpaII。
9.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，在扩增条件下使所述核酸样品进一步接触第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增所述样品核酸中的第三区域，以允许测定是否存在胎儿特异性核酸。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述胎儿特异性核酸是Y染色体核酸。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，在扩增条件下使所述核酸样品进一步接触第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增所述样品核酸中的第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述第一、第二、第三和第四区域各自包含一个或多个基因组基因座。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述基因组基因座的长度相同。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述基因组基因座为50个碱基对～200个碱基对。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述基因组基因座为60个碱基对～80个碱基对。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述基因组基因座为70±其10％个碱基对。
17.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一区域包含在所述少数物质和多数物质之间差异甲基化的一个或多个基因座。
18.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一区域包含TBX3和SOX14基因中的基因座。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述第一区域的所述基因座各自独立地包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
20.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座不含有甲基化敏感的限制性酶的限制性位点。
21.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二区域包含POP5和APOE基因中的基因座。
22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述第二区域的所述基因座各自独立地包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
23.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述第三区域包含Y染色体中的一个或多个基因座。
24.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述第三区域包含DDX3Y基因中的基因座。
25.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述第三区域的所述基因座包含SEQ IDNO:34。
26.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述第四区域包含一个或多个基因座，所述一个或多个基因座存在于所述样品的每个基因组中，并且在所有物质中未甲基化。
27.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述第四区域包含POP5或LDHA基因中的基因座。
28.如权利要求27所述的应用，其特征在于，所述第四区域的所述基因座各自独立地包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
29.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一组和第二组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。
30.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述第三组和第四组扩增引物各自包含一对或多对正向和反向引物。
31.如权利要求29或权利要求30所述的应用，其特征在于，一对或多对扩增引物对还包含5’尾部。
32.如权利要求31所述的应用，其特征在于，各扩增引物组的所述5’尾部的长度不同。
33.如权利要求29或权利要求30所述的应用，其特征在于，所述扩增引物各自独立地选自SEQ ID NO:1～8和SEQ ID NO:11～16。
34.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述一种或多种抑制性寡核苷酸中的一种抑制性寡核苷酸包含与所述第二区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
35.如权利要求34所述的应用，其特征在于，所述抑制性寡核苷酸和所述第二组扩增引物中的一种引物与所述第二区域中的相同核苷酸序列互补。
36.如权利要求34或权利要求35所述的应用，其特征在于，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。
37.如权利要求36所述的应用，其特征在于，所述抑制性寡核苷酸各自独立地选自SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
38.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在扩增条件下使所述核酸样品进一步接触一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸与所述第一区域竞争杂交所述第一扩增引物组的引物。
39.如权利要求38所述的应用，其特征在于，在扩增条件下使所述核酸样品进一步接触一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸与所述第二区域竞争杂交所述第二扩增引物组的引物。
40.如权利要求39所述的应用，其特征在于，在扩增条件下使所述核酸样品进一步接触一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸与所述第三区域竞争杂交所述第三扩增引物组的引物。
41.如权利要求40所述的应用，其特征在于，在扩增条件下使所述核酸样品进一步接触一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸与所述第四区域竞争杂交所述第四扩增引物组的引物。
42.如权利要求38～41中任一项所述的应用，其特征在于，所述竞争者寡核苷酸包含填充序列。
43.如权利要求42所述的应用，其特征在于，对于所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸中的一种或多种而言，所述填充序列的长度是恒定的。
44.如权利要求42所述的应用，其特征在于，对于所述第一竞争者寡核苷酸、第二竞争者寡核苷酸、第三竞争者寡核苷酸和第四竞争者寡核苷酸中的一种或多种而言，所述填充序列的长度是可变的。
45.如权利要求42所述的应用，其特征在于，所述填充序列来自非人基因组。
46.如权利要求45所述的应用，其特征在于，所述填充序列来自PhiX 174基因组。
47.如权利要求38～41中任一项所述的应用，其特征在于，所述竞争者寡核苷酸的长度为100～150个碱基对。
48.如权利要求47所述的应用，其特征在于，所述竞争者寡核苷酸的长度为115～120个碱基对。
49.如权利要求48所述的应用，其特征在于，所述第一和第二竞争者寡核苷酸的长度为115个碱基对。
50.如权利要求48所述的应用，其特征在于，所述第三竞争者寡核苷酸的长度为118个碱基对。
51.如权利要求48所述的应用，其特征在于，所述第四竞争者寡核苷酸的长度为120个碱基对。
52.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述一种或多种第一竞争者寡核苷酸各自独立地选自SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
53.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述一种或多种第二竞争者寡核苷酸各自独立地选自SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
54.如权利要求50所述的应用，其特征在于，所述第三竞争者寡核苷酸是SEQ ID NO:26。
55.如权利要求51所述的应用，其特征在于，所述一种或多种第四竞争者寡核苷酸各自独立地选自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。
56.如权利要求38～41中任一项所述的应用，其特征在于，所述一种或多种竞争者寡核苷酸包含可检测标记物。
57.如权利要求56所述的应用，其特征在于，所述可检测标记物是荧光团。
58.如权利要求57所述的应用，其特征在于，所述各竞争者寡核苷酸的荧光团不同。
59.如权利要求38～41中任一项所述的应用，其特征在于，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。
60.如权利要求59所述的应用，其特征在于，基于所用竞争者寡核苷酸的量来进一步测定所述少数核酸物质的拷贝数。
61.如权利要求60所述的应用，其特征在于，进一步测定所述多数核酸物质的拷贝数。
62.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样品核酸是胞外核酸。
63.如权利要求62所述的应用，其特征在于，所述少数核酸物质是胎儿DNA。
64.如权利要求63所述的应用，其特征在于，所述多数核酸物质是母体DNA。
65.如权利要求63或权利要求64所述的应用，其特征在于，所述核酸样品获自妊娠女性对象。
66.如权利要求65所述的应用，其特征在于，所述对象是人。
67.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样品核酸来自血浆。
68.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样品核酸来自血清。
69.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，所述扩增在单个反应容器中进行。
70.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，两种或更多种所述扩增产物的长度不同。
71.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
72.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，在(b)之前使所述扩增产物进一步接触外切核酸酶。
73.如权利要求70所述的应用，其特征在于，基于长度来分离所述扩增产物。
74.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，采用电泳进行所述分离。
75.如权利要求74所述的应用，其特征在于，所述电泳是毛细管电泳。
76.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，进一步确定所述核酸样品用于测序反应的适用性。
77.如权利要求76所述的应用，其特征在于，所述测序反应是基于可逆终止子的测序反应。
78.如权利要求76所述的应用，其特征在于，进一步确定所获得的核酸样品的测序信息用于诊断确定的用途。
79.一种用于测定样品中少数核酸物质的量的试剂盒，所述样品包含少数物质和多数物质，所述少数物质和所述多数物质的组合构成所述样品中的总核酸，所述试剂盒包含：
(a)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增样品核酸中的第一区域，所述第一区域包含以下特征(i)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(ii)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中，
(b)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增所述样品核酸中的第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中，所述第一区域和所述第二区域不同，和
(c)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的扩增，其中所述第二组扩增引物的量相对于所述一种或多种抑制性寡核苷酸的量具有一定比例，由此所述总核酸扩增产物被扩增至与所述少数核酸扩增产物相似的程度。
80.如权利要求79所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增所述样品核酸中的第三区域，以允许测定是否存在Y染色体核酸。
81.如权利要求80所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增所述样品核酸中的第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。
82.如权利要求79所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸与所述第一区域竞争杂交所述第一扩增引物组的引物。
83.如权利要求82所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸与所述第二区域竞争杂交所述第二扩增引物组的引物。
84.如权利要求83所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸与所述第三区域竞争杂交所述第三扩增引物组的引物。
85.如权利要求84所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸与所述第四区域竞争杂交所述第四扩增引物组的引物。
86.如权利要求79～85中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含一种或多种甲基化敏感的限制性酶。
87.如权利要求79～81中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含说明书或提供所述说明书的因特网地址的书面描述以遵循用于测定样品中少数核酸物质的量的方法，所述方法包括：
(a)在扩增条件下使含有少数物质和多数物质的核酸样品接触以下物质，其中，所述少数物质和所述多数物质的组合构成所述样品中的总核酸：
(i)第一组扩增引物，所述第一组扩增引物特异性扩增样品核酸中的第一区域，所述第一区域包含以下特征(1)存在于所述少数核酸物质中但不存在于所述多数核酸物质中，或(2)不存在于所述少数核酸物质中但存在于所述多数核酸物质中，
(ii)第二组扩增引物，所述第二组扩增引物扩增所述样品核酸中的第二区域，以允许测定所述样品中的总核酸，其中，所述第一区域和所述第二区域不同，和
(iii)一种或多种抑制性寡核苷酸，所述抑制性寡核苷酸减少所述第二区域的所述扩增，从而产生少数核酸扩增产物和总核酸扩增产物，其中所述第二组扩增引物的量相对于所述一种或多种抑制性寡核苷酸的量具有一定比例，由此所述总核酸扩增产物相对于没有抑制性寡核苷酸存在下会产生的总扩增产物而言有所减少，并且由此所述总核酸扩增产物被扩增至与所述少数核酸扩增产物相似的程度；
(b)分离所述扩增产物，从而产生分离的少数扩增产物和总核酸扩增产物；和
(c)基于所述分离的少数扩增产物和总核酸扩增产物各自的量来测定所述样品中所述少数核酸物质的分数。
88.如权利要求87所述的试剂盒，其特征在于，所述样品中的所述少数核酸物质的所述分数相对于所述样品中的所述核酸的总量而言。
89.如权利要求87所述的试剂盒，其特征在于，所述抑制性寡核苷酸包含一个或多个3’错配的核苷酸。
90.如权利要求87所述的试剂盒，其特征在于，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触第三组扩增引物，所述第三组扩增引物扩增所述样品核酸中的第三区域，以允许测定是否存在Y染色体核酸。
91.如权利要求90所述的试剂盒，其特征在于，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触第四组扩增引物，所述第四组扩增引物扩增所述样品核酸中的第四区域，以允许测定消化的或未消化的核酸的量，作为消化效率的指示剂。
92.如权利要求87所述的试剂盒，其特征在于，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触一种或多种第一竞争者寡核苷酸，所述第一竞争者寡核苷酸与所述第一区域竞争杂交所述第一扩增引物组的引物。
93.如权利要求92所述的试剂盒，其特征在于，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触一种或多种第二竞争者寡核苷酸，所述第二竞争者寡核苷酸与所述第二区域竞争杂交所述第二扩增引物组的引物。
94.如权利要求93所述的试剂盒，其特征在于，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触一种或多种第三竞争者寡核苷酸，所述第三竞争者寡核苷酸与所述第三区域竞争杂交所述第三扩增引物组的引物。
95.如权利要求94所述的试剂盒，其特征在于，所述方法还包括在扩增条件下使所述核酸接触一种或多种第四竞争者寡核苷酸，所述第四竞争者寡核苷酸与所述第四区域竞争杂交所述第四扩增引物组的引物。
96.如权利要求82～85中任一项所述的试剂盒，其特征在于，使用预定拷贝数的各竞争者寡核苷酸。
97.如权利要求96所述的试剂盒，其特征在于，所测定的所述少数核酸的量是所述少数核酸物质的拷贝数，所述拷贝数基于所用竞争者寡核苷酸的量。
98.如权利要求79～85中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述少数核酸物质是胎儿DNA且所述多数核酸物质是母体DNA。
99.如权利要求79～85中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一区域被甲基化，而所述第二区域未被甲基化。
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