CN101501251A - 扩增、检测和定量样品中核酸的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及扩增、检测和定量样品中核酸的方法和试剂盒。本发明方法可用于多种应用中，包括(但不限于)检测和定量来自母体血浆的胎儿核酸、检测和定量来自赘瘤(恶性或非恶性)的循环核酸、精确综合分析低频率等位基因、或任何需要对核酸实施高灵敏度定量分析的其它应用。

Description

扩增、检测和定量样品中核酸的方法和组合物
相关申请交叉参考案
本专利申请案主张在2006年6月16日申请的美国临时专利申请案第60/805,073号的权利，其发明者为李闵博(Min Seob Lee)，标题为扩增、检测和定量样品中核酸的方法和组合物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE AMPLIFICATION，DETECTION AND QUANTIFICATION OF NUCLEIC ACID FROM A SAMPLE)，且具有代理档案号SEQ-6002-PV。这篇临时专利申请案包括所有文本和附图在内的全文是以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及扩增、检测和/或定量样品中核酸的方法和试剂盒。本发明方法可用于多种应用中，其包括(但不限于)检测和定量来自母体血浆的胎儿核酸、检测和定量来自赘瘤(恶性或非恶性)的循环核酸、精确综合分析低频率等位基因、或任何需要对核酸实施高灵敏度定量分析的其它应用。
背景技术
对核酸实施的扩增、检测和随后的定量分析在分子生物学中具有重要作用，包括对疾病或病症的诊断和预后。现已知有多种方法可检测核酸，包括基于不同核酸物质间的序列差异来检测核酸。例如，关于已知方法的综述可参见纳尔逊(Nelson)，临床试验科学评论(Crit Rev Clin Lab Sci.)，1998年9月；35(5)：369-414。然而，已经证明很难检测并精确定量核酸，尤其是在其它高拷贝数核酸种类存在下检测并精确定量低拷贝数核酸。
发明内容
核酸检测领域的不足之处在于难以获得能以高灵敏度检测和定量低拷贝数核酸的检测方法。低拷贝数核酸可在多种应用中提供丰富信息，所述应用包括(但不限于)非侵害性产前测试、癌症诊断和低频率突变检测。因此，本发明提供用于对先前不能检测、或检测难度极大和/或检测结果极不可靠的低拷贝数核酸进行扩增并随后实施检测和分析的改良方法，以使其在(例如)临床环境中达到足以提供可靠信息的程度。在此改良技术的应用中，本发明使得可使用灵敏度更高并且侵害性更小的方法来在(例如)产前测试中检测和定量胎儿核酸。
因此在一方面中，本发明涉及优选地基于低拷贝数核酸物质序列特异性来对所述核酸物质实施偏倚性等位基因特异性(BAS)扩增的方法和试剂盒，其中以比高拷贝数物质特异性引物高的浓度引入低拷贝数物质特异性引物，以将所述物质选择性扩增至适于精确检测和定量的程度。因此，本发明提供相对于高拷贝数核酸物质优先扩增低拷贝数核酸物质并定量两种物质相对含量的方法。在某些实施例中，可同时添加两种或更多种引物，或在其它实施例中可于不同时间添加(例如添加第一引物后添加第二引物或添加第二引物后添加第一引物)。在某些实施例中也可将各种引物添加至同一容器中，或在某些实施例中可将其添加至不同容器中。
更具体来说，本发明一方面提供扩增样品中核酸的方法，所述样品至少含有第一和第二核酸物质，其中所述第一物质具有比所述第二物质高的拷贝数，所述方法包含以下步骤：a)在反应容器中使实质上对第一核酸物质具有特异性的第一扩增引物退火到第一核酸物质上，其中所述第一引物对具有第一浓度；b)在反应容器中使实质上对第二核酸物质具有特异性的第二扩增引物退火到第二核酸物质上，其中所述第二引物具有第二浓度并且其中第二扩增引物的所述第二浓度大于第一扩增引物的所述第一浓度；c)在反应容器中使第一和第二核酸物质通用的且实质上对第一和第二核酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到第一和第二核酸物质上；以及d)在反应容器中实施核酸扩增反应，藉此所述第二核酸物质扩增产物的量相对于所述第一核酸物质扩增产物的量有所增加。步骤(c)中的“另一扩增引物”可为一或多种引物。例如，在涉及使用一种额外引物的实施例中，所述引物可与第一核酸和第二核酸二者通用的核苷酸序列特异性杂交。例如，在涉及使用两种额外引物的实施例中，一种额外引物可特异性地与第一核酸杂交，并且第二种额外引物可特异性地与第二核酸杂交。
在本发明实施例中，扩增方法可包括(但不只包括)聚合酶链反应、自动维持序列反应、连接酶链反应、cDNA末端快速扩增、聚合酶链反应和连接酶链反应、Q-β噬菌体扩增、链置换扩增、或剪接重叠延伸聚合酶链反应。在优选实施例中，扩增方法为PCR。在本发明另一实施例中，扩增方法采用美国专利申请公开案第20050287592号中所述模板依赖性聚合酶，所述专利是以引用方式并入本文中。
在另一实施例中，本发明提供本文所述扩增方法，其另外包含单独检测第一核酸物质的扩增产物、单独检测第二物质、或同时一起检测第一和第二物质的步骤。在另一实施例中，本发明提供本文所述扩增方法，其另外包含以下步骤：a)检测所述第一核酸物质的扩增产物；和b)检测所述第二核酸物质的扩增产物；和c)比较所述第一核酸物质的身份与所述第二核酸物质的身份。在相关实施例中，通过质谱法来实施检测。
在另一实施例中，本发明提供本文所述扩增方法，其另外包含以下步骤：a)定量所述第一核酸物质的扩增产物；和b)定量所述第二核酸物质的扩增产物；和c)比较所述第一核酸物质扩增产物的量与所述第二核酸物质扩增产物的量。在相关实施例中，通过质谱法来实施定量。在优选实施例中，第一核酸物质来源于母体而第二核酸物质来源于胎儿。
在另一方面中，提供在至少含有第一和第二物质的样品中鉴定低拷贝数核酸物质的方法，其中在两个单独反应容器中扩增所述物质。更具体而言，本发明提供扩增样品中核酸的方法，样品至少含有第一和第二核酸物质，其中一种所述物质具有比另一种所述物质高的拷贝数，所述方法包含以下步骤：a)在第一反应容器中，使实质上对所述第一核酸物质具有特异性的第一扩增引物退火到所述第一核酸物质上，其中第一引物具有第一浓度；b)在所述第一反应容器中使实质上对所述第二核酸物质具有特异性的第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中第二引物具有第二浓度并且其中第二扩增引物的所述第二浓度大于第一扩增引物的所述第一浓度；c)在所述第一反应容器中使第一和第二核酸物质通用的且实质上对第一和第二核酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到所述第一和第二核酸物质上，并实施核酸扩增反应，藉此在所述第一物质具有较高拷贝数时使所述第二核酸物质扩增产物相对于所述第一核酸物质扩增产物有所增加；d)在第二反应容器中使第一扩增引物退火到所述第一核酸物质上，其中所述第一扩增引物所存在浓度与步骤b中的所述第二浓度相同；e)在所述第二反应容器中使第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中所述第二扩增引物所存在浓度与步骤a中所述的第一浓度相同，由此所述第一扩增引物的浓度大于所述第二扩增引物的浓度；和f)在所述第二反应容器中使所述第一和第二核酸物质通用的另一扩增引物退火到所述第一和第二核酸物质上，并实施核酸扩增反应，藉此在第二物质具有较高拷贝数时使所述第一核酸物质扩增产物相对于所述第二核酸物质扩增产物有所增加。
在本发明实施例中，二容器扩增方法另外包含检测所述第一核酸物质扩增产物的步骤。在另一实施例中，所述方法另外包含检测所述第二核酸物质扩增产物的步骤。在另一实施例中，所述方法另外包含以下步骤：同时检测所述第一核酸物质和所述第二核酸物质，并比较所述第一与第二核酸物质的身份。在另一实施例中，方法另外包含定量所述第一核酸物质的扩增产物，定量所述第二核酸物质的扩增产物，并比较所述第一核酸物质扩增产物的量与所述第二核酸物质扩增产物的量。
在另一方面中，本发明提供确定高拷贝数引物与低拷贝数引物的适宜或最佳比率的方法。参见以下实例1。
在相关实施例中，本发明提供确定足以优先扩增实例1中所述低拷贝数核酸物质的第一PCR引物浓度的方法。基于不同物质间的核酸基差异(或等位基因)，本发明方法可用于优先扩增不同核酸物质并由此实施检测和定量。在某些实施例中，本发明可用于检测突变和染色体异常，包括(但不限于)易位、颠换、单体性、三体性、和其它非整倍性、缺失、添加、扩增、片段、和重排。可同时检测多种异常。本发明也提供非侵害性方法来测定妊娠雌性样品的胎儿DNA序列。本发明可用于检测任何与野生型基因序列不同的序列改变，包括(但不限于)点突变、读框移位、转换、颠换、添加、插入、缺失、添加-缺失、移码、错义、回复突变、和微卫星改变。在优选实施例中，核酸基差异是单核苷酸多态性(SNP)。在某些优选实施例中，核酸基差异是特征性甲基化状态。例如，第一核酸物质具有第一核酸基甲基化模式并且第二核酸物质具有第二核酸基甲基化模式，而且第一核酸基甲基化模式与第二核酸基甲基化模式不同。在某些实施例中，第一和第二引物是甲基化特异性扩增引物。
在优选实施例中，可在单一多重反应中同时检测不只一种核酸基差异。在某些实施例中，对多个目标基因座的等位基因实施测序并对其相对含量实施定量和比较。在一实施例中，测定模板DNA中单条染色体上一个至数十个至数百个至数千个目标基因座的等位基因的序列。在另一实施例中，对多条染色体上一个至数十个至数百个至数千个目标基因座的等位基因的序列实施检测和定量。例如，可在单个反应中检测多个SNP(例如2至约100个SNP)。
在另一实施例中，第一和第二核酸物质包含不同等位基因。例如，在母体来源核酸物质和胎儿来源核酸物质的情况下，母体核酸中给定等位基因是纯合型并且胎儿核酸中相同等位基因是杂合型。因此，本发明提供扩增、检测杂合型目标基因座处等位基因并随后定量其相对含量的方法，其中先前已通过测定模板DNA中目标基因座的等位基因的序列来鉴定杂合型目标基因座。
本发明方法可用于相对于高拷贝数核酸物质来扩增、检测或定量低拷贝数核酸物质。在优选实施例中，样品中低拷贝数核酸物质对高拷贝数核酸物质的起始相对百分比为0.5％至49％。在相关实施例中，低拷贝数核酸物质对高拷贝数核酸物质的最终相对百分比为5.0％至80％或更高。
本发明方法可用于扩增、检测或定量约20个碱基或更长的片段化短核酸。更优选地其为约50个碱基或更长。
本发明一方面涉及扩增、检测或定量核酸，例如DNA、RNA、mRNA、寡聚核小体、线粒体、经后生修饰的单链、双链、环形质粒、粘粒、酵母人工染色体、人工或人造DNA(包括单一DNA序列)、和自RNA样品逆转录的DNA(例如cDNA)、和其组合。在优选实施例中，核酸为无细胞核酸。在另一实施例中，核酸衍生自凋亡细胞。在另一实施例中，一种核酸来源于胎儿，而另一种核酸来源于母体。
本发明涉及扩增、检测或定量样品中的核酸，所述样品来自例如全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜检查(athroscopic))生物检查样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗、母乳、乳液、胚胎细胞及胎儿细胞。在优选实施例中，生物样品为血浆。在另一优选实施例中，样品中无细胞或基本无细胞。在相关实施例中，样品为预先提取的核酸样品。在另一实施例中，样品为经收集核酸样品。
本发明尤其可用于扩增、检测或定量来自母体血浆的胎儿核酸。在优选实施例中，样品来自动物，最优选来自人类。在另一优选实施例中，样品来自妊娠的人类。在相关实施例中，在妊娠五周后自妊娠人类收集样品。在另一实施例中，妊娠人类在她的血液、血浆或羊水中含有高浓度游离胎儿核酸。
本文所提供方法可与检测和定量核酸的任何已知方法一起使用，包括引物延伸(例如iPLEXTM，西克诺(Sequenom)公司)、DNA测序、实时PCR(RT-PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP分析)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)分析、甲基化特异性PCR(MSPCR)、焦磷酸测序分析、无环引物(acycloprime)分析、逆向点杂交、基因芯片微阵列、动态等位基因特异性杂交(DASH)、肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)探针、TaqMan、分子信标、嵌入染料、FRET引物、α筛选(AlphaScreen)、SNP分型(SNPstream)、遗传位元分析法(GBA)、多重式微测序、快照(SnaPshot)、GOOD分析、微阵列微测序、阵列引物延伸(APEX)、微阵列引物延伸、标记阵列、编码微球、模板引导掺入(TDI)、荧光偏振、比色法寡核苷酸连接分析(OLA)、序列编码OLA、微阵列连接、连接酶链反应、锁式探针、和侵入分析、或其组合。也可参见美国专利第6,258,538号、第6,277,673号、第6,221,601号、第6,300,076号、第6,268,144号、第6,221,605号、第6,602,662号和第6,500,621号，其均是以引用方式并入本文中。
本文所提供方法也可经修改后引入额外步骤以(例如)改良核酸的扩增或检测，或改良扩增后对靶核酸的分析。例如，另外可通过业内已知方法来抑制高拷贝数核酸物质的扩增。例如参见奈西斯(Nasis)等人，临床化学(Clinical Chemistry)50：694-701，2004。本文所提供方法也可经修改后合并各步骤以(例如)改良自动化。
在另一实施例中，本文所提供方法可在用于提取核酸的另一方法之前、之后或同时实施，所述提取方法例如电泳、液相色谱、尺寸排除法、过滤、微透析、电渗析、离心膜排除、有机或无机提取、亲和色谱、PCR、全基因组PCR、序列特异性PCR、甲基化特异性PCR、引入二氧化硅膜或分子筛、以及片段选择性扩增。
本发明另外也涉及包含实施本文所述方法的试剂的试剂盒。
附图说明
图1展示标准等位基因特异性PCR扩增方法，与高拷贝数核酸相比其检测和定量低拷贝数核酸的分辨能力极低。通过相对于高拷贝数引物浓度选择性增加低拷贝数引物浓度，本发明中偏倚性等位基因特异性(BAS)扩增可通过促进低拷贝数分子扩增和检测同时抑制高拷贝数分子扩增和检测显著增强分辨能力。
图2展示偏倚性等位基因特异性(BAS)扩增的分析设计策略的实例，其使用质量阵列(MassArray)
Figure A200780029777D00111
系统检测和测量单核苷酸或插入/缺失多态性。等位基因特异性引物经设计在引物的3＇末端或附近与特定等位基因互补。在本发明实施例中，等位基因特异性引物在距引物3＇末端约5个或更少核苷酸位置的核苷酸处与特定等位基因互补。在某些实施例中，等位基因特异性引物在距引物3＇末端4、3、2或1个核苷酸位置的核苷酸处与特定等位基因互补。在另一实施例中，等位基因特异性引物在引物3＇末端处与特定等位基因互补。通用引物实质上与核酸物质中与两种模板相同的序列互补。可将检测延伸探针置于多态性位点对侧(a)或在另一序列差异处置于可区分两个等位基因的扩增子(b)上。同样，在图中+图标表示引物和模板的相对浓度，其中+++所表示浓度高于+。
图3展示两种检测方案(情况1和情况2)的实例。标准PCR中区分不明显，而BAS扩增中第二峰降低50％。BAS策略不仅可靠地检测胎儿特异性等位基因(T)，而且精确地测量与母体等位基因对比的不同比率。
在图3中用于情况2的引物列于下表A中。
表A
 
X1-S AGCGGATAACTGCCAGCTCAGCAGCCCGT AMG_X基因的等位基因特异性引物                 
Y1-S AGCGGATAACTGCCAGCTCAGCAGCCCAG AMG_Y基因的等位基因特异性引物                 
X1-L AGCGGATAACTGAGGCTGTGGCTGAACAGG AMG X&Y的通用引物
XY1-E CAGCCAAACCTCCCTC AMG X&Y的延伸探针
图4A至4F展示谱图，其中BAS引物可变(例如在图4D中比率为1:10)并且使靶DNA的比率固定在98:2(雌性:雄性)。图5是展示相同实验运行两次的结果的图，其中BAS引物可变(例如在图4D中比率为1:10)并且将靶DNA的比率固定为98:2(雌性:雄性)。
图6A至6F展示谱图，其中BAS引物是固定的(比率为1:5)并且靶DNA可变(例如在图6B中雌性:雄性比率为99:1)。
图7是展示相同实验运行两次的结果的图，其中BAS引物是固定的(比率为1:5)并且靶DNA可变。
图8A展示非整倍性检测分析设计，其中母体具有CC基因型并且胎儿具有CTT或CCT三体性基因型。所述基因型是以以下比率存在：
CT    97.5:2.5
CTT   96.7:3.4
CCT   98.4:1.7
图8B展示BAS扩增如何在抑制高拷贝物质扩增的同时将低拷贝物质扩增提高至可检测水平。
图9-12展示使用母体与胎儿间不同基因型组合的不同方案。“拭子(swab)”显示仅来源于母体的核酸，而“血浆”既含有母体核酸也含有胎儿核酸。本文所用“拭子”表示不含胎儿核酸的任一核酸样品来源，例如母体细胞。
具体实施方式
本发明包括扩增、检测和/或分析核酸的方法，并且尤其可用于在高拷贝数核酸(例如宿主或母体核酸)存在下扩增、检测和定量无细胞低拷贝数核酸。具体来说，在某些实施例中，可使用自细胞外来源获得之核酸来实施本发明方法。外周血中无细胞核酸的存在是公认现象。尽管无细胞核酸可来源于若干种来源，但已显示一种循环细胞外核酸来源来自于程序性细胞死亡，也称作细胞凋亡。由于细胞凋亡产生的核酸来源可存在于多种体液中并且来自若干种来源，包括(但不限于)宿主中正常程序性细胞死亡、在自身免疫性疾病情况下的诱导程序性细胞死亡、感染性休克、赘瘤(恶性或非恶性)、或非宿主来源，例如同种异体移植(移植组织)、或孕妇的胎儿或胎盘。扩增、检测和分析来自外周血或其它体液的细胞外核酸的应用很普遍并且尤其可包括非侵害性产前诊断、癌症诊断、病原体检测、自身免疫反应和同种异体移植排斥。
本文所用术语“低拷贝数”核酸或引物意指以比另一核酸物质更少的量存在的核酸物质。优选地，“较少量”意指较低浓度，但可意指较少分子数、以重量计的较少量、或诸如此类。低拷贝数核酸可以比率来定量，例如低拷贝数核酸与较高拷贝数核酸之比或低拷贝数核酸与总核酸之比。低拷贝数核酸也可以数量来定量，例如通过拷贝数(例如约1、约2、约3、约4、约5、约10份拷贝)或通过克、摩尔或浓度(例如约0.001ng至约1ng、或约0.001ng至约0.1ng、约0.001ng至约0.01ng)来定量。
本文所用术语“高拷贝数”核酸或引物意指以比另一核酸物质更大的量存在的核酸物质。优选地，“更大量”意指更高浓度，但可意指更多分子数、以重量计的较大量、或诸如此类。
术语低拷贝数和高拷贝数核酸或引物也可意指相对于彼此一者具有较低浓度，但也可意指相对于另一者具有较少分子数、以重量计的较少量、或诸如此类。
本文所用术语“宿主细胞”是可将外源核酸引入其中的任一细胞，此产生除宿主细胞核酸外含有外源核酸的宿主细胞。本文所用术语“宿主细胞核酸”和“内源核酸”是指在获得细胞时存于宿主细胞中的核酸物质(例如基因组或染色体核酸)。本文所用术语“外源”是指除宿主细胞核酸外的核酸；可通过将外源核酸引入宿主细胞中或引入原代宿主细胞中而使外源核酸存于宿主细胞中。因此，例如对于特定宿主细胞来说属于外源的核酸物质是非内源核酸物质(在获得宿主细胞时不存于宿主细胞中或不存于原代宿主细胞中)。适宜宿主细胞包括(但不限于)细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
在整个本发明中术语“核酸”与“核酸分子”可互换使用。所述术语是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸聚合物(DNA)、核糖核苷酸聚合物(RNA)、RNA/DNA杂合体和聚酰胺核酸(PNA)，并且除非另外加以限制，否则其可涵盖可以与天然存在核苷酸类似的方式发挥作用的天然核苷酸的已知类似物。
本文所用术语“核酸物质”是指样品中的目标核酸。基于核酸差异，核酸物质可与另一核酸物质不同，所述核酸差异包括(但不限于)突变、插入、缺失、来自不同有机体的独特核酸序列、或胎儿来源对母体来源。在相关实施例中，核酸物质来自细胞凋亡DNA、胎儿DNA、致癌DNA、或任何非宿主DNA。在另一相关实施例中，核酸物质是无细胞核酸。在另一相关实施例中，核酸物质是在程序性细胞死亡期间生成的寡聚核小体核酸。不同核酸物质可为不同等位基因，其中每一种等位基因都在一或多个基因座上具有不同序列(下文中更详细地阐述术语“等位基因”)。
本文所用术语“基因座”和“目标基因座”是指在更大核酸区域内的选定核酸区域。目标基因座可包括(但不限于)1-100、1-50、1-20、或1-10个核苷酸，有时包括1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个核苷酸。
本文所用术语“等位基因”是在染色体上占据相同位置的基因或DNA中非编码区域的若干种替代形式之一。术语等位基因可用于描述来自任何有机体的DNA，包括(但不限于)细菌、病毒、真菌、原生动物、霉菌、酵母、植物、人类、非人类、动物、和古细菌。
等位基因可具有相同序列或可改变单一核苷酸或不只一个核苷酸。对于每条染色体具有两份拷贝的有机体来说，如果两条染色体具有相同等位基因，则这种情况称作纯合。如果两条染色体上的等位基因不同，则这种情况称作杂合。例如，如果目标基因座是在染色体1上的SNP X，并且母体染色体在SNP X中含有腺嘌呤(A等位基因)并且父系染色体在SNP X中含有鸟嘌呤(G等位基因)，则此个体在SNP X处为杂合。
在本文中术语“量化”和“定量”以及其语法变形可互换使用。
本文所用术语“身份”意指聚核苷酸中一个核苷酸或一个以上邻近核苷酸的序列。在单一核苷酸(例如SNP)情况下，“序列”与“身份”在本文中可互换使用。在特征性甲基化状态情况下，身份是指特定CpG岛的甲基化状态。例如，可参见美国专利申请案第20050272070号，其是以引用方式并入本文中。
本文所用术语“模板”是指在本发明中可用于扩增的任何核酸分子。可自任一生物或非生物来源获得模板核酸。
本文所用“引物”是指适用于杂交、链延伸、扩增和测序的寡核苷酸。类似地，探针是用于杂交的引物。引物是指具有足够低质量(通常具有约5至200个核苷酸，一般具有约70或少于70个核苷酸)和足够尺寸的核酸以便用于本文所提供扩增方法以及检测和测序方法中。这些引物包括(但不限于)用于对核酸实施检测和测序的引物，其需要足够数量的核苷酸以形成稳定双链体，通常具有约6-30个核苷酸、约10-25个核苷酸和/或约12-20个核苷酸。因此，出于本发明目的，引物是含有任何适宜长度的核苷酸序列，其根据引物的序列和应用而定通常含有约6-70个核苷酸、12-70个核苷酸、或大于约14个至约70个核苷酸的上限。
本文所用术语“甲基化特异性引物”是指与具有特定甲基化状态而非其它甲基化状态的序列特异性杂交的引物。核苷酸序列可经甲基化，并且特定核苷酸序列可具有不同甲基化状态。所属领域技术人员已知并且可选择甲基化特异性引物(例如美国专利申请案第10/346,514号，其在2003年11月13日以专利申请公开案第20030211522号公开)。
本文所用“特异性杂交”是指相对于非靶序列，探针或引物优先与靶序列杂交。所属领域技术人员熟知可影响杂交的参数，例如温度、探针或引物长度和组成、缓冲组合物和盐浓度，并且其可容易地调节这些参数以达成核酸与靶序列的特异性杂交。例如，与靶序列优先杂交包括很少或不包括与非靶序列的可检测杂交。
在本发明某些实施例中，样品可包括(但不限于)全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜检查(athroscopic))、生物检查样品、组织、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、阴道分泌物、汗、母乳、乳液、胚胎细胞和胎儿细胞。本文所用术语“血液”涵盖全血或血液中任一部分，例如传统意义上所定义的血清和血浆。血浆是指对经抗凝剂处理的血液实施离心获得的全血部分。血清是指在血液样品凝固后所保留的水样流体部分。在优选实施例中，样品为血液、血清或血浆。因此，在某些实施例中，模板DNA分离自血清，而在其它实施例中模板DNA分离自血浆。在某些优选实施例中，样品中不含细胞或基本不含细胞。在相关实施例中，样品是含有先前已提取、分离或纯化的核酸的样品。一种靶向核酸物质的方式是使用生物样品中的非细胞部分；由此限制完整细胞材料的量(例如长链基因组DNA)以防其污染样品。在本发明实施例中，首先通过添加酶、离液物质、洗涤剂或其任一组合来处理诸如预清除血浆、尿和类似物以钝化细胞内核酸酶。在某些实施例中，首先通过任一业内已知方法处理样品以基本上自样品去除所有细胞，所述方法例如离心、过滤、亲和色谱、和诸如此类。
胎儿核酸存在于妊娠期前三个月后的母体血浆中，其浓度随孕龄增加而升高(罗(Lo)等人，美国人类遗传学期刊(Am J Hum Genet)(1998)62：768-775)。分娩后，胎儿核酸极快地自母体血浆消失(罗等人，美国人类遗传学期刊(1999)64：218-224)。母体血浆中所存在胎儿核酸的分数浓度远远高于母体血液细胞部分中的胎儿核酸(罗等人，美国人类遗传学期刊(1998)62：768-775)。因此在另一实施例中，核酸物质来源于胎儿，而其它核酸物质来源于母体。
在某些实施例中，样品含有游离母体模板DNA和游离胎儿模板DNA。在某些实施例中，模板DNA可包括母体DNA与胎儿DNA的混合物，并且在一实施例中，在测定模板DNA目标基因座中等位基因的序列之前，对母体DNA实施测序已鉴定纯合目标基因座，并且纯合目标基因座就是在模板DNA中所分析的目标基因座。在某些实施例中，对母体DNA实施测序以鉴定杂合目标基因座，并且杂合目标基因座就是在模板DNA中所分析的目标基因座。在某些实施例中，在测定序列之前，分离模板DNA。在某些实施例中，在测定胎儿DNA上目标基因座的序列之前，测定母体模板DNA上目标基因座的序列。在某些实施例中，在测定胎儿DNA上目标基因座的序列之前，测定父系模板DNA上目标基因座的序列。在某些实施例中，目标基因座具有单核苷酸多态性。在其它实施例中，目标基因座具有突变。在某些实施例中，测定多个目标基因座的序列。在某些所述实施例中，多个目标基因座位于多条染色体上。
本发明样品可涉及细胞溶解、细胞核酸酶的钝化和自细胞碎片分离期望核酸。通用溶解程序包括机械破坏(例如研磨、低渗溶解)、化学处理(例如洗涤剂溶解、离液剂、硫醇还原)、和酶消化(例如蛋白水解酶K)。在本发明中，可首先在溶解缓冲液、离液剂(例如盐)和蛋白水解酶或蛋白酶存在下溶解生物样品。可组合细胞膜破坏与细胞内核酸酶钝化。例如，单一溶液可含有洗涤剂以溶解细胞膜并含有强离液盐以钝化细胞内酶。在细胞溶解和核酸酶钝化后，可通过过滤或沉淀容易地去除细胞碎片。
在另一实施例中，可阻断溶解。在这些实施例中，如果存在细胞，可将样品与可抑制细胞溶解的试剂混合以抑制细胞溶解，其中所述试剂为膜稳定剂、交联剂、或细胞溶解抑制剂。在某些所述实施例中，试剂为细胞溶解抑制剂，并且可为戊二醛、戊二醛衍生物、甲醛、福尔马林(formalin)、或甲醛衍生物。参见美国专利申请案第20040137470号，其是以引用方式并入本文中。
本发明方法可包括检测核酸物质序列。可使用任何业内已知检测方法，包括(但不限于)凝胶电泳、毛细管电泳、微通道电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、荧光检测、荧光偏振、DNA测序、桑格(Sanger)双脱氧测序法、ELISA、质谱、飞行时间质谱、四极质谱、扇形磁场质谱、扇形电场质谱、荧光计、红外光谱、紫外光谱、恒电势电流滴定法、DNA杂交、DNA微阵列、基因芯片阵列、HuSNP阵列、磁珠阵列(BeadArrays)、质量延伸(MassExtend)、SNP-IT、TaqMan分析、侵入分析、质量裂解(MassCleave)、南方印迹法、狭缝印迹法、或斑点印迹法。
本发明方法可用于相对于高拷贝数核酸物质扩增、检测或定量低拷贝数核酸物质。在优选实施例中，样品中低拷贝数核酸物质对高拷贝数核酸物质的起始相对百分比为0.5％至49％。在相关实施例中，样品中低拷贝数核酸物质对高拷贝数核酸物质的起始相对百分比为0.5-1.0％低拷贝数核酸物质、约1.0-2.0％低拷贝数核酸物质、约2.0-3.0％低拷贝数核酸物质、约3.0-4.0％低拷贝数核酸物质、约4.0-5.0％低拷贝数核酸物质、约5.0-6.0％低拷贝数核酸物质、约7.0-8.0％低拷贝数核酸物质、约8.0-9.0％低拷贝数核酸物质、约9.0-10％低拷贝数核酸物质、约10-12％低拷贝数核酸物质、约12-15％低拷贝数核酸物质、约15-20％低拷贝数核酸物质、约20-25％低拷贝数核酸物质、约25-30％低拷贝数核酸物质、约30-35％低拷贝数核酸物质、或约35-45％低拷贝数核酸物质。
在相关实施例中，低拷贝数核酸物质对高拷贝数核酸物质的最终相对百分比为5％至80％。在相关实施例中，样品中低拷贝数核酸物质对高拷贝数核酸物质的最终相对百分比为5.0-6.0％低拷贝数核酸物质、约6.0-7.0％低拷贝数核酸物质、约7.0-8.0％低拷贝数核酸物质、约8.0-9.0％低拷贝数核酸物质、约9.0-10％低拷贝数核酸物质、约10-15％低拷贝数核酸物质、约15-20％低拷贝数核酸物质、约20-25％低拷贝数核酸物质、约25-30％低拷贝数核酸物质、约30-35％低拷贝数核酸物质、约35-40％低拷贝数核酸物质、约40-45％低拷贝数核酸物质、约45-50％低拷贝数核酸物质、约50-55％低拷贝数核酸物质、约55-60％低拷贝数核酸物质、约60-65％低拷贝数核酸物质、约65-70％低拷贝数核酸物质、约70-75％低拷贝数核酸物质、约75-80％低拷贝数核酸物质、或大于80％低拷贝数核酸物质。
在另一实例中，本发明方法可与业内适用于提取、分离或纯化核酸的任一技术一起使用，所述技术包括(但不限于)氯化铯梯度、梯度、蔗糖梯度、葡萄糖梯度、离心法、煮沸、车摩根(Chemagen)病毒DNA/RNA 1k试剂盒、车摩根血液试剂盒、凯杰(Qiagen)纯化系统、QIA DNA血液纯化试剂盒、高速质粒Maxi(HiSpeed PlasmidMaxi)试剂盒、QIA过滤质粒试剂盒、普洛麦格(Promega)DNA纯化系统、满格希尔(MangeSil)顺磁颗粒基系统、威赛德(Wizard)SV技术、威赛德基因组DNA纯化试剂盒、安玛西亚(Amersham)纯化系统、GFX基因组血液DNA纯化试剂盒、英杰生命技术(Invitrogen Life Technologies)纯化系统、CONCERT纯化系统、莫氏生物实验室(MoBio Laboratories)纯化系统、超净血液旋转(UltraClean BloodSpin)试剂盒、超净血液DNA试剂盒、和通过麦克罗康(Microcon)100滤纸(亚米康(Amicon)，MA)过滤。
在另一实施例中，并非必须对核酸实施提取、纯化、分离或富集；仅需要以能实施扩增的形式提供核酸。在扩增之前，不需要使核酸模板与引物杂交。例如，可在细胞或样品溶解物中使用业内熟知的标准方案来实施扩增。位于固体支撑物上、存于固定生物制剂中、或存于含有非DNA物质的组合物中并且不需要首先自固体支撑物或固定制剂或组合物中的非DNA物质提取即可扩增的DNA可不经进一步纯化即直接使用，只要DNA可与适宜引物退火，并且可被复制，尤其可被扩增，并且所复制或扩增产物可如本文所述加以回收和利用即可。
在另一实施例中，所述方法可与用于快速鉴定未知生物试剂的方法组合使用，所述鉴定方法使用核酸扩增以及通过分子质量分析测定可提供信息的扩增子的碱基组成二者而达成，如以下文献所揭示和主张：已公开美国专利申请案第20030027135号、第20030082539号、第20030124556号、第20030175696号、第20030175695号、第20030175697号、和第20030190605号和美国专利申请案第10/326,047号、第10/660,997号、第10/660,122号和第10/660,996号，所有所述专利都是全文以引用方式并入本文中。
本发明另外也涉及实践本发明方法的试剂盒。试剂盒可包含一或多个容器，容器中含有一或多种本文所述组合物和/或组份。试剂盒可在任一数量的单独容器、封包、小管、小瓶、微量滴定板和类似物中包含一或多种组份，或在所述容器中可以各种组合合并所述组份。试剂盒可与本文所述方法一起使用，并且有时包括实施一或多种本文所述方法的说明书和/或一或多种本文所述组合物或试剂的说明。说明书和/或说明可呈印刷品形式并且可包括于试剂盒插入物中。试剂盒也可包括对提供所述说明书或说明的网址的书面描述。
细胞凋亡核酸的检测和定量分析
本发明方法尤其可用于扩增、检测和定量样品中的细胞凋亡核酸。程序性细胞死亡或细胞凋亡是所有多细胞有机体中形态发生、发育、分化、和体内稳态中的主要机制。通常，细胞凋亡与坏死的不同之处在于其可活化产生特有形态特征的特定路径，所述形态特征包括DNA片段化、染色质凝聚、细胞质与核断裂、以及凋亡小体形成。
已显示经胱天蛋白酶活化的DNA酶(CAD)(或称为DNA片段化因子(DFF或DFF40))可在染色质核小体间连接子区域导致双链DNA断裂，产生由具有约180个碱基对的DNA寡聚体或其多倍体组成的核小体梯。大部分梯片段(高至70％)以180bp的核小体单体形式存在。所有片段都具有5＇-磷酸化末端并且其大部分为平头末端(威德莱克(Widlak)等人，生物化学期刊(J Biol Chem.)，2000年3月17日；275(11)：8226-32，其是以引用方式并入本文中)。
因此，越来越需要在高背景野生型DNA存在下以靶特异性方式定性来自特定细胞或组织、或在生物流体中作为细胞外片段存在的特定DNA片段的已知突变和表面突变(例如，细胞响应于异型生物质药物处理所致的DNA体细胞突变；来自发炎、恶性或其它患病组织的DNA体细胞突变；来自移植物或来自妊娠期间胎儿DNA与母体DNA差异的DNA体细胞突变)。
因此本发明提供选择性扩增、检测和定量以低浓度存于样品中的片段化短核酸物质的方法。所述方法尤其可用于检测寡聚核小体。寡聚核小体是染色质的重复结构单元，每个寡聚核小体由缠绕在组蛋白核心周围的约200个碱基对的DNA组成，所述组蛋白核心可部分保护DNA以防其被体外和体内的核酸酶消化。这些单元可以单体或多聚体形式存在并且可产生通常称为细胞凋亡DNA梯的结构。所述单元是通过以核酸酶消化未与组蛋白结合的侧翼DNA来形成，此导致大部分寡聚核小体具有平头末端并且经5＇-磷酸化。在仅有较小百分比的细胞发生细胞凋亡或细胞凋亡异步发生的生物系统中，很难检测到寡聚核小体而且更难将其分离；然而，其可用作疾病和其它病况的预测因子(参见美国专利申请案第20040009518号，其是以引用方式并入本文中)。因此，本文所述方法可用于检测尺寸为约1000个碱基对或更小、约750个碱基对或更小、约500个碱基对或更小、和约300个碱基对或更小的核酸(例如胎儿核酸)。
诊断应用
存于患者血浆和血清中的循环核酸与某些疾病和病况相关(参见罗YMD等人，新英格兰医学期刊(N Eng J Med)，1998；339：1734-8；陈(Chen)XQ等人，国家医学杂志(Nat Med)，1996；2：1033-5，纳若兹(Nawroz)H等人，国家医学杂志，1996；2：1035-7；罗YMD等人，柳叶刀(Lancet)1998；351：1329-30；罗YMD，等人，临床化学(Clin Chem)2000；46：319-23)。此外，可证实可检测和精确定量这些在血液中循环的疾病相关低拷贝数核酸的能力对疾病诊断和预后极为有益(王(Wang)等人，临床化学，2004年1月；50(1)：211-3)。
人们尚未完全了解循环核酸的特征和生物来源。然而，可能包括细胞凋亡在内的细胞死亡是一主要因素(佛恩尼(Fournie)等人，老年学(Gerontology)，1993；39：215-21；佛恩尼等人，癌症快报(Cancer Lett)，1995；91：221-7)。不受限于理论，当发生细胞凋亡的细胞将核酸排放至凋亡小体中时，存于人类个体血浆或血清中的至少一部分循环核酸可能是呈颗粒缔合核小体形式的片段化短DNA。本发明提供扩增、检测和定量相对于同样存于血浆或血清中的其它高拷贝数物质以低浓度存于个体血浆或血清中的片段化短循环核酸物质的方法。
本发明提供在被疑患有或已知患有病状的患者中评估所述病状的方法。在本发明一实施例中，本发明包括自被疑患有或已知患有病状的患者获得生物样品，优先使用本文所提供方法扩增、检测或定量低拷贝数核酸物质，通过测定核酸物质的量或浓度或特征并将所述核酸物质的量或浓度或特征与对照(例如来自生物样品的背景基因组DNA、高拷贝数物质、高频率等位基因等)作比较来评估病状。
词组“评估病状”是指评价患者的病状。例如，评估患者病况可包括在患者中检测疾病存在与否。一旦在患者中检测到疾病存在，评估患者病状即可包括在患者中测定疾病严重度。其另外可包括使用所述测定结果来实施疾病预后，例如预后或治疗计划。评估患者病况也可包括确定患者是否患有疾病或在过去是否曾患过病状。此时评估病状也可包括确定病状复发的可能性或在患者中监测复发。评估病状也可包括在患者中监测疾病迹象。因此评估病状包括在患者中检测、诊断、或监测病状以及确定患者预后或治疗计划。评估病状的方法有助于危险分层。
癌症
本文所提供方法可用于扩增、检测和定量致癌核酸，其另外可用于癌症相关病症的诊断或预后。在来自癌症患者的血浆中，已知可存在包括DNA和RNA在内的核酸(罗KW等人，临床化学(1999)45，1292-1294)。这些分子可能封装于凋亡小体中并且由此变得比‘游离RNA’更稳定(安克尔(Anker)P和斯特劳恩(Stroun)M，临床化学(2002)48，1210-1211；Ng EK等人，美国国家科学院学报(Proc NatlAcad Sci USA)(2003)100，4748-4753)。
在二十世纪八十年代末期和九十年代，若干团体证实，得自癌症患者的血浆DNA表现出肿瘤特异性特征，包括链稳定性降低、Ras和p53突变、微卫星改变、所选基因的启动子异常过甲基化、线粒体DNA突变和肿瘤相关病毒DNA(斯特劳恩M等人，肿瘤学(Oncology)(1989)46，318-322；陈XQ等人，国家医学杂志(1996)2，1033-1035；安克尔P等人，癌症转移研究(CancerMetastasis Rev)(1999)18，65-73；詹(Chan)KC和罗YM，组织病理学(Histol Histopathol)(2002)17，937-943)。已发现多种恶性肿瘤的肿瘤特异性DNA：血癌、结肠直肠癌、胰癌、皮肤癌、头颈癌、肺癌、乳癌、肾癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌和子宫颈癌。总之，上述数据显示血浆中源自肿瘤的DNA在受影响患者中普遍存在，并且可能是诸如细胞凋亡等常见生物过程所导致的。对这些来自癌症患者的血浆DNA片段的研究揭示，大部分片段显示其长度为核小体DNA的多倍，这是细胞凋亡DNA片段化的特征(吉尔(Jahr)S等人，癌症研究(Cancer Res)(2001)61，1659-1665).
如果癌症显示特异性病毒DNA序列或肿瘤抑制基因和/或癌基因突变序列，那么本发明方法。然而，对于大多数癌症(以及大多数孟德尔(Mendelian)病)来说，临床应用中相对于同样存于血浆中的患者正常DNA分离、定量和定性肿瘤特异性DNA的方法仍有待优化。因此，为在此领域获得进步必须了解正常个体血浆中DNA的分子结构和动力学。
因此，本发明涉及检测人类或动物血液的血浆或血清部分中与瘤形成、恶化前或增生性疾病相关的特异性细胞外核酸。具体来说，本发明涉及检测得自突变癌基因或其它肿瘤相关DNA的核酸，并且涉及那些通过使用DNA提取富集此处所述突变DNA来检测和监测存于血液的血浆或血清部分中的细胞外突变癌基因或肿瘤相关DNA的方法。具体来说，本发明涉及在含有赘瘤相关突变的人类或其它动物中检测、鉴定或监测良性、恶化前、或恶性赘瘤的存在、进展或临床状态，其是通过实施本文所提供尺寸选择性富集方法，并且随后在富集DNA中检测赘瘤突变核酸来达成。
本发明特征在于鉴定源自生物样品中肿瘤的DNA的方法。这些方法可用于在生物样品中区分或检测呈凋亡小体或核小体形式的肿瘤衍生DNA。在优选实施例中，非癌症性DNA和肿瘤衍生DNA可通过观察核酸尺寸差异来区分，其中低碱基对DNA与癌症相关。
产前诊断
自1997年以来，人们已知可在孕妇血液循环中检测到游离胎儿DNA。在不存在妊娠相关并发症的情况下，循环DNA的总浓度在10-100ng或1,000至10,000基因组当量/ml血浆范围内(比绍夫(Bischoff)等人，人类生殖快讯(Hum Reprod Update.)，2005年1-2月；11(1)：59-67和其中所引用参考文献)，而胎儿DNA部分的浓度自妊娠期前三个月的约20拷贝/ml增加至妊娠期末三个月的>250拷贝/ml。在实施电子显微研究和超滤富集实验后，作者得出结论：具有源于胎盘的片段化核小体DNA的凋亡小体是母体血浆中胎儿DNA的来源。
现已证实，孕妇中循环DNA分子的尺寸显著大于未妊娠雌性，其中妊娠和未妊娠雌性中>201bp的总血浆DNA的中值百分比分别为57％和14％，而尺寸>193bp和>313bp的胎儿源DNA的中值百分比仅分别为20％和0％(詹等人，临床化学，2004年1月；50(1)：88-92)。
这些发现各自都已被证实(李(Li)等人，临床化学，2004年6月；50(6)：1002-11；美国专利申请案第200516424号，其以引用方式并入本文中)，其作为概念性证据表明，胎儿DNA自约5％至>28％的总循环血浆DNA的>5倍相对富集可通过制备型琼脂糖凝胶电泳使用尺寸排除色谱和<300bp尺寸流份的洗脱液来进行。可惜的是，所述方法并不十分适用于可靠常规应用，因为其难以自动化，并且可能会损失DNA材料，而且自相关琼脂糖凝胶区段中回收的DNA浓度较低。
因此，本发明特征在于区分生物样品中源自不同个体的DNA物质的方法。这些方法可用于区分、检测或定量母体样品中的胎儿DNA。
现有各种非侵害性和侵害性技术可用于产前诊断，包括超声检查、羊膜腔穿刺、绒毛膜绒毛取样(CVS)、母体血液中的胎儿血细胞、母体血清α-胎蛋白、母体血清β-HCG、和母体血清雌三醇。然而，非侵害性技术特异性较低，并且具有高特异性和高敏感度的技术具有高侵害性。此外，为达成最大效用，大多数技术只能在妊娠期间的特定时间段加以实施。
所研发的用于母体血浆中胎儿DNA检测的第一种标记是Y染色体，其存于雄性胎儿中(罗等人，美国人类遗传学期刊(1998)62：768-775)。许多业内技术人员可再现Y染色体标记的坚固性(科斯塔(Costa)JM等人，产前诊断(Prenat Diagn)，21：1070-1074)。此技术构成测定胎儿性别的高精确度方法，其可用于性别相关疾病的产前研究(科斯塔JM，埃尔诺(Ernault)P(2002)临床化学48：679-680)。
母体血浆DNA分析也可用于产前非侵害性测定RhD阴性孕妇中的胎儿RhD血型状态(罗等人(1998)，新英格兰医学期刊，339：1734-1738)。此技术的准确性已被许多团体证实并且自2001以来已被英国国家血液服务处(British National BloodService)列为常规服务(芬宁(Finning)KM等人，(2002)输血(Transfusion)42：1079-1085)。
最近，已证实母体血浆DNA分析可用于产前非侵害性排除胎儿β-重型地中海贫血(邱(Chiu)RWK等人，(2002)柳叶刀，360：998-1000)。类似技术也可用于产前检测HbE基因(富察罗恩(Fucharoen)G等人，(2003)产前诊断23：393-396)。
母体血浆中胎儿DNA的其它遗传应用包括检测软骨发育不全(斋藤(Saito)H等人(2000)，柳叶刀，356：1170)、强直性肌营养不良(阿姆古西(Amicucci)P等人(2000)，临床化学46：301-302)、囊性纤维化(冈萨雷斯(Gonzalez)-冈萨雷斯MC等人(2002)，产前诊断22：946-948)、亨廷顿氏病(Huntington disease)(冈萨雷斯-冈萨雷斯MC等人(2003)，产前诊断23：232-234)、和先天性肾上腺增生(雷珍德(Rijnders)RJ等人(2001)，妇产科期刊(Obstet Gynecol)98：374-378)。预计在以后数年中所述应用的范围将会扩大。
在本发明另一方面中，患者处于妊娠期并且评估患者或其胎儿的疾病或生理情况的方法有助于检测、监测、预后或治疗患者或其胎儿。更具体来说，本发明的特征在于通过在自母体获得的生物样品中检测胎儿DNA来检测胎儿中异常的方法。本发明方法通过根据DNA特征(例如尺寸、重量、5＇磷酸化、平头末端)区分胎儿DNA与母体DNA来提供对母体样品中胎儿DNA的检测。参见詹等人，临床化学，2004年1月；50(1)：88-92；和李等人，临床化学，2004年6月；50(6)：1002-11。采用所述方法可鉴定据预测具有遗传异常或遗传性疾病的胎儿DNA，由此提供产前诊断方法。这些方法可应用于任一或所有妊娠相关病况，所述病况中核酸变化、突变或其它特征(例如甲基化状态)与疾病状态相关。本发明方法和试剂盒使得可分析胎儿遗传性状，包括染色体畸变(例如非整倍性或与唐氏综合症(Down＇s syndrome)相关的染色体畸变)或遗传性孟德尔遗传病中所涉及的性状，以及分别与其相关的遗传标记(例如诸如囊性纤维化或血红蛋白病等单基因病)。可诊断的其它疾病包括(例如)先兆子痫、早产、妊娠剧吐、异位妊娠、胎儿染色体非整倍性(例如三体性18、21、或13)、和宫内发育迟缓。
在另一实施例中，对多个目标基因座的等位基因实施测序并对其相对含量实施定量和比较。在一实施例中，测定模板DNA单染色体上一个至数十个至数百个至数千个目标基因座的等位基因的序列。在另一实施例中，检测并定量多条染色体上一个至数十个至数百个至数千个目标基因座的等位基因的序列。
对于可分析的染色体并无限制。可比较任一染色体上杂合目标基因座中等位基因的比率与任一其它染色体上杂合目标基因座中等位基因的比率。在另一实施例中，比较一条染色体上杂合目标基因座中等位基因的比率与两条、三条、四条或多于四条染色体上杂合目标基因座中等位基因的比率。在另一实施例中，比较一条染色体上多个目标基因座中等位基因的比率与两条、三条、四条或多于四条染色体上多个目标基因座中等位基因的比率。在某些所述实施例中，所比较染色体是人类染色体，例如染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X、或Y。在相关实施例中，比较染色体13、18、和21上杂合目标基因座中等位基因的比率。在另一实施例中，在自妊娠雌性样品获得的模板DNA上测定一个至数十个至数百个至数千个目标基因座的序列。在一实施例中，目标基因座位于一条染色体上。在另一实施例中，目标基因座位于多条染色体上。
术语“染色体异常”是指目标染色体的结构与正常同源染色体不符。术语“正常”是指特定物种的健康个体中所发现的主要核型或带型。染色体异常可为数量性或结构性，并且包括(但不限于)非整倍性、多倍性、倒位、三体性、单体性、重复、缺失、缺失部分染色体、添加、添加部分染色体、插入、染色体片段、染色体区域、染色体重排、和易位。染色体异常可能与病理性状态的存在相关或与引发病理性状态的诱因相关。
其它疾病
多种疾病、病症和病况(例如组织或器官排斥)产生可通过本文所提供方法来检测的细胞凋亡DNA或核小体DNA。据信可产生细胞凋亡DNA的疾病和病症包括糖尿病、心脏病、中风、创伤和类风湿性关节炎。红斑狼疮(SLE)(鲁玛尔(Rumore)和斯坦曼(Steinman)，临床研究期刊(J Clin Invest.)，1990年7月；86(1)：69-74)。鲁玛尔等人注意到，自SLE血浆纯化的DNA形成离散带，其对应于约150-200、400、600、和800bp的尺寸，此与寡聚核小体DNA所表现的特征性200bp“梯”十分相似。
本发明也提供评估被疑患有创伤或已知患有创伤的患者病状的方法。所述方法包括自被疑患有创伤或已知患有创伤的患者获得血浆或血清样品，并检测样品中线粒体核酸的量或浓度。
实例
以下实例是说明性而非限制性。下文所述偏倚性等位基因特异性(BAS)扩增方法可用于检测和测量低拷贝数核酸并且可在调整后用于测定(例如)个体的基因型。在此实例中此一基因型是单核苷酸多态性。可用于使用(例如)以质谱为主的系统测定此一基因型的步骤的实例阐述于下文中。某些步骤(例如实例1和2中的步骤)仅需要实施一次即可获得随后用于(或提供于、或纳入测试试剂盒或算法中)实施SNP(或其它)分析的数据。
实例1：引物比率优化
在特定SNP的鉴定(SNP分析)中，测定高拷贝数引物与低拷贝数引物的最佳比率。用于实施此一测定的实验性方案的实例展示于表1和2中。具体扩增条件展示于表3-5和相关文本中。
Figure A200780029777D00241
以表中所列不同比率的等位基因特异性寡核苷酸对雄性与雌性样品具有不同混合比率的8(8)ng基因组DNA实施PCR扩增。
表3
PCR
 
试剂 浓度 1孔(μl)
H2O 1.35
PCR缓冲液 10X 0.625
MgCI2 25mM 0.325
dNTP混合物 25mM 0.2
F/R引物 1.25 0.4
酶Taq 5μ 0.1
基因组DNA 4ng 2
总体积 μl 5
PCR循环45周，其中每次循环包括在94℃下培养15分钟，在94℃下培养20秒，在56℃下培养30秒，在72℃下培养1分钟，在72℃下培养3分钟，此后将产物维持在4℃下。
表4
SAP步骤 微升
 
H2O 1.33
10XSAP缓冲液 0.17
SAP酶 0.5
总体积 2
将2微升SAP混合物添加至每个5微升PCR反应中。在以下温度下培养并维持经SAP处理的PCR反应物：在37℃培养20分钟，在85℃下培养5分钟并且此后维持在4℃下。
表5
质量延伸
 
试剂 浓度 1孔(微升)
H2O 0.5
EXT缓冲液 10X 0.2
MgCl2 100mM 0.02
最终混合物 iPLEX 0.2
E寡核苷酸混合物 2层 1
酶 TP 0.1
总体积 微升 2
对于iPLEX延伸，实施200次短循环，其中每次循环包括在94℃下培养30秒，在94℃下培养5秒，在52℃下培养5秒，在80℃下培养5秒和在72℃下培养3分钟，此后将产物维持在4℃下。其它处理和分析包括用6mg树脂脱盐，分配至光谱芯片生物阵列(SpectroChip Bioarrays)和实施MALDI-TOF MS分析。
在此实例中，以一定比例混合具有已知浓度核酸的来自雄性和雌性的核酸样品以提供Y轴上所示特定Y染色体等位基因比率(Y DNA比率)。在此实例中，选择使用已知仅存于Y染色体上(或至少不存于X染色体上)的特定SNP，并且选择使用已知仅存于X染色体上(或至少不存于Y染色体上)的另一特定SNP。例如，比率为0.00％表示不存在雄性核酸，并且因此不存在Y等位基因。以50％比率混合Y DNA，因此其中雄性样品量多于雌性样品量以提供50％Y等位基因，其中考虑到XX染色体构成雌性核酸并且XY染色体构成雄性核酸。表1的X轴展示X和Y特异性寡核苷酸溶液的体积比，将其混合以提供所示X寡核苷酸比率。然后在此情况下，通过质谱法分析表1所示96种反应条件下各自的核酸样品(此处提供可获得结果的扩增反应的其它细节)。同样参见表2。
如图4A-F中所示，可获得各个质谱图。两个峰各自具有特异性，一个代表X染色体SNP而另一个代表Y染色体SNP。例如，图4A-F中的谱图对应于C组(表示为(靶DNA F:M 98:2))，此意指雄性或Y等位基因以2％存在。然而，图4A展示引物的X:Y比率为1:10，此与第6列中所示条件大体一致。如上所述，当低拷贝数引物(在此情况下代表Y染色体SNP)比例升高时，右手侧峰尺寸增加。在图4A中，存在0Y特异性引物，不能检测到雄性特异性(右手侧)峰。在图4F中，Y特异性引物过量50倍，雄性峰极大。对于许多(即使不是大多数)应用(即检测方法)来说，最佳引物比率是可产生约1:1峰尺寸比率者。如图4C-D中所示，1:5的引物比率太小并且1:10的引物比率太大，而约1:7的比率预计可产生1:1面积峰(未显示)。这些特征也展示于图5中。对于此用于检测和定量SNP并使用这些引物的特定分析，可通过使用1:10的高拷贝数与低拷贝数引物比率分析任何其中包含低拷贝数物质(例如血浆或血清中的母体核酸中的胎儿核酸)的核酸占核酸约1％至约15％的其它样品。类似考虑和步骤可用于将分析调整至适合其它检测方案，例如实时PCR和荧光检测系统。此1:10的引物比率可产生最佳1:1峰比率，其可随分析而改变，并且可根据低拷贝数对高拷贝数的核酸百分比而变化。例如，此一变化可为1:2至约1:20。
实例2：低拷贝数核酸的扩增
在获知最佳引物比率后，此引物比率可用于扩增具有不同比例的低拷贝数和高拷贝数核酸，如图6A-6F中所示。例如，高拷贝数(雌性)与低拷贝数(雄性)核酸的比例可自图4A中的100:0变至图4F中的50:50。可如图7中所示来标绘一个峰的面积占两个峰总面积之比。
实例3：测定基因型信息
可测定个体的基因型，并且具体来说，可在某些技术应用中测定胎儿与母体间的RhD相容性或不相容性。在所述实施例中，在母体与胎儿之间存在四种可能的基因型组合，其展示于图9-12中。通过获得纯母体样品并对所述母体样品实施三个单独反应，并且将其与对母体样品加胎儿样品实施的三个单独反应进行比较，可测定母体与胎儿的基因型。所述三个单独反应是高拷贝数C等位基因引物反应、高拷贝数T等位基因引物反应、和等浓度C等位基因与T等位基因引物反应。对两种样品类型实施这三个相同的反应。
实例4：定量评价基因型信息
对于某些技术应用(例如染色体非整倍性测定)来说，需要实施定量测定。获得曲线图(例如图7中所示)后，当获得含有未知百分比低拷贝数与高拷贝数核酸的样品的谱图时，可通过比较样品中所形成峰的面积来分析谱图。具体来说，可获得如X轴上所示的比率(介于0与1之间)，然后在Y轴上测定对应高：低拷贝数比率。例如，如果面积比为0.6，那么如图7所示，F:M比率为98:2。为测定非整倍性结果，优选地使用至少两次SNP分析，每次分析提供不同的低拷贝数：高拷贝数比率。此技术的实例如下所述。将测定胎儿基因型对母体背景(经常为1％-5％胎儿对99％-95％母体；图8A-8B)。母体基因型为纯合(野生型或突变/显性或隐性)，并且胎儿基因型为杂合。假定在一等位基因处母体为CC并且胎儿为CCT。如果母体和胎儿二者都是纯合的，那么分析就无法提供信息。通过使用多重SNP分析(例如大于5次分析，或更优选地大于约10次分析)可消除这种可能性，以使所有分析都无法提供信息的可能性变得极低。因此在此实例中，确定另一SNP基因型并且母体为CC并且胎儿为CTT。使用如上所述计算的比率对每种SNP实施偏倚性等位基因扩增反应。通过比较所获得谱图峰的比率既可检测三体性也可确定三体性是CCT还是CTT。
每个专利、专利申请案、公开案和本文所引用文献都是全文以引用方式并入本文中。引用上述专利专利申请案公开案和文献并不代表认可上述任一文献都是相关的先前技术，也不代表对这些出版物或文献中的内容或日期的认可。
可在不背离本发明基本方面的情况下对上文加以修改。尽管已经参照一或多个具体实施例十分详细地阐述了本发明，但所属领域技术人员应了解，可对本申请案中具体揭示的实施例进行改变，而且这些修改和改良都在本发明范围和精神内。
可在不存在本文未详细揭示的任何要素的情况下以适宜方式实践本文说明性阐述的本发明。因此，例如，在本文中每一情形中，词语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任一者都可用其它两个词语替代。所用词语和表达是用作说明性词语而非限制性，并且使用所述词语和表达并不排除所示和所述特征或其部分的任何等效形式，并且可在本发明所主张范围内作出各种修改。除非上下文中明确阐述一种要素或不止一种要素，否则词语“一”是指其所修饰的一种或多个要素(例如“一装置”可意指一或多个装置)。本文所用词语“约”是指数值有时在基础参数10％范围内(即加或减10％)，数值有时在基础参数5％范围内(即加或减5％)，数值有时在基础参数2.5％范围内(即加或减2.5％)，或数值有时在基础参数1％范围内(即加或减1％)，并且有时是指无变化的参数。例如，“约100克”的重量可包括介于90克与110克之间的重量。因此，应了解，尽管已通过代表性实施例和可选特征来具体揭示本发明，但所属领域技术人员仍可采取本文所揭示概念的修改和变化形式，并且所述修改和变化形式视为在本发明范围内。
本发明实施例阐述于上文权利要求中。

Claims (31)

1、一种扩增样品中核酸的方法，所述样品至少含有第一和第二核酸物质，其中所述第一物质具有比所述第二物质高的拷贝数，所述方法包含以下步骤：
a)在反应容器中使实质上对所述第一核酸物质具有特异性的第一扩增引物退火到所述第一核酸物质上，其中所述第一引物具有第一浓度；和
b)在所述反应容器中使实质上对所述第二核酸物质具有特异性的第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中所述第二引物具有第二浓度并且其中所述第二扩增引物的所述第二浓度大于所述第一扩增引物的所述第一浓度；和
c)在所述反应容器中使所述第一和第二核酸物质通用的且实质上对所述第一和第二核酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到所述第一和所述第二核酸物质上；和
d)在所述反应容器中实施核酸扩增反应，藉此使所述第二核酸物质扩增产物的量相对于所述第一核酸物质扩增产物的量有所增加。
2、如权利要求1所述的方法，其另外包含检测所述第一核酸物质扩增产物的步骤。
3、如权利要求1所述的方法，其另外包含检测所述第二核酸物质扩增产物的步骤。
4、如权利要求1所述的方法，其另外包含以下步骤：a)检测所述第一核酸物质的扩增产物；和b)检测所述第二核酸物质的扩增产物；和c)比较所述第一核酸物质的身份与所述第二核酸物质的身份。
5、如权利要求4所述的方法，其中所述检测是通过质谱法来实施。
6、如权利要求1所述的方法，其另外包含以下步骤：a)定量所述第一核酸物质的扩增产物；和b)定量所述第二核酸物质的扩增产物；和c)比较所述第一核酸物质扩增产物的量与所述第二核酸物质扩增产物的量。
7、如权利要求6所述的方法，其中所述定量是通过质谱法来实施。
8、如权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸物质来源于母体而所述第二核酸物质来源于胎儿。
9、如权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸物质具有第一核酸基甲基化模式而所述第二核酸物质具有第二核酸基甲基化模式，并且所述第一核酸基甲基化模式不同于所述第二核酸基甲基化模式。
10、如权利要求9所述的方法，其中所述第一和第二引物是甲基化特异性扩增引物。
11、一种扩增样品中核酸的方法，所述样品至少含有第一和第二核酸物质，其中一种所述物质具有比另一所述物质高的拷贝数，所述方法包含以下步骤：
a)在第一反应容器中使实质上对所述第一核酸物质具有特异性的第一扩增引物退火到所述第一核酸物质上，其中所述第一引物具有第一浓度；和
b)在所述第一反应容器中使实质上对所述第二核酸物质具有特异性的第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中所述第二引物具有第二浓度并且其中所述第二扩增引物的所述第二浓度大于所述第一扩增引物的所述第一浓度；和
c)在所述第一反应容器中使所述第一和第二核酸物质通用的且实质上对所述第一和第二核酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到所述第一和所述第二核酸物质上，并且实施核酸扩增反应，藉此在所述第一物质具有较高拷贝数时使所述第二核酸物质的扩增产物相对于所述第一核酸物质的扩增产物有所增加；和
d)在第二反应容器中使所述第一扩增引物退火到所述第一核酸物质上，其中所述第一扩增引物是以与步骤b中所述第二浓度相同的浓度存在；和
e)在所述第二反应容器中使所述第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中所述第二扩增引物是以与步骤a中所述第一浓度相同的浓度存在，藉此使所述第一扩增引物的浓度大于所述第二扩增引物的浓度；和
f)在所述第二反应容器中使所述第一和第二核酸物质通用的另一扩增引物退火到所述第一和所述第二核酸物质上，并实施核酸扩增反应，藉此在所述第二物质具有较高拷贝数时使所述第一核酸物质的扩增产物相对于所述第二核酸物质的扩增产物有所增加。
12、如权利要求11所述的方法，其进一步包含检测所述第一核酸物质扩增产物的步骤。
13、如权利要求11所述的方法，其进一步包含检测所述第二核酸物质扩增产物的步骤。
14、如权利要求11所述的方法，其进一步包含以下步骤：a)检测如权利要求11所述步骤a中所述第一核酸物质的扩增产物；和b)检测如权利要求11所述步骤b中所述第二核酸物质的扩增产物；和c)比较如权利要求11所述步骤a中所述第一核酸物质的身份与如权利要求11所述步骤b中所述第二核酸物质的身份。
15、如权利要求14所述的方法，其中所述检测是通过质谱法来实施。
16、如权利要求11所述的方法，其另外包含以下步骤：a)检测如权利要求11所述步骤d中所述第一核酸物质的扩增产物；和b)检测如权利要求11所述步骤e中所述第二核酸物质的扩增产物；和c)比较如权利要求11所述步骤d中所述第一核酸物质的身份与如权利要求11所述步骤e中所述第二核酸物质的身份。
17、如权利要求16所述的方法，其中所述检测是通过质谱法来实施。
18、如权利要求11所述的方法，其另外包含以下步骤：
a)检测如权利要求11所述步骤a中所述第一核酸物质的扩增产物；和
b)检测如权利要求11所述步骤b中所述第二核酸物质的扩增产物；和
c)检测如权利要求11所述步骤d中所述第一核酸物质的扩增产物；和
d)检测如权利要求11所述步骤e中所述第二核酸物质的扩增产物；和
e)比较如权利要求11所述步骤a和b中所述第一和第二核酸物质的身份与如权利要求11所述步骤d和e中所述第一和第二核酸物质的身份。
19、如权利要求11所述的方法，其另外包含以下步骤：a)定量如权利要求11所述步骤a中所述第一核酸物质的扩增产物；和b)定量如权利要求11所述步骤b中所述第二核酸物质的扩增产物；和c)比较如权利要求11所述步骤a中所述第一核酸物质扩增产物的量与如权利要求11所述步骤b中所述第二核酸物质扩增产物的量。
20、如权利要求11所述的方法，其另外包含以下步骤：a)定量如权利要求11所述步骤d中所述第一核酸物质的扩增产物；和b)定量如权利要求11所述步骤e中所述第二核酸物质的扩增产物；和c)比较如权利要求11所述步骤d中所述第一核酸物质扩增产物的量与如权利要求11所述步骤e中所述第二核酸物质扩增产物的量。
21、如权利要求11所述的方法，其另外包含以下步骤：
a)定量如权利要求11所述步骤a中所述第一核酸物质的扩增产物；和
b)定量如权利要求11所述步骤b中所述第二核酸物质的扩增产物；和
c)定量如权利要求11所述步骤d中所述第一核酸物质的扩增产物；和
d)定量如权利要求11所述步骤e中所述第二核酸物质的扩增产物；和
e)比较如权利要求11所述步骤a和b中所述第一和第二核酸物质扩增产物的量与如权利要求11所述步骤d和e中所述第一和第二核酸物质扩增产物的量。
22、如权利要求11所述的方法，其中所述第一核酸物质来源于母体而所述第二核酸物质来源于胎儿。
23、如权利要求11所述的方法，其中所述第一核酸物质具有第一核酸基甲基化模式而所述第二核酸物质具有第二核酸基甲基化模式，并且所述第一核酸基甲基化模式不同于所述第二核酸基甲基化模式。
24、如权利要求23所述的方法，其中所述第一和第二引物是甲基化特异性扩增引物。
25、一种检测样品中所存在靶核酸身份的方法，所述样品中还含有非靶核酸，其中所述靶核酸和非靶核酸具有较高和较低拷贝数，所述方法包含以下步骤：
a)制备第一反应混合物，其包含所述核酸样品、实质上对所述靶核酸具有特异性的靶扩增引物、实质上对所述非靶核酸具有特异性的非靶扩增引物、和实质上对靶和非靶核酸二者都具有特异性的第三扩增引物，其中所述靶扩增引物以相对于所述非靶扩增引物低的浓度存在；和
b)制备第二反应混合物，其包含所述核酸样品、实质上对所述靶核酸具有特异性的靶扩增引物、实质上对所述非靶核酸具有特异性的非靶扩增引物、和实质上对靶和非靶核酸二者都具有特异性的第三扩增引物，其中所述靶扩增引物以相对于所述非靶扩增引物高的浓度存在；和
c)扩增所述第一和第二反应混合物以获得第一组扩增产物和第二组扩增产物，其中所述第一组扩增产物与所述第二组扩增产物不同。
26、如权利要求25所述的方法，其另外包含比较所述第一组扩增产物与所述第二组扩增产物的步骤，藉此可将较低拷贝数赋予所述靶或非靶核酸。
27、如权利要求25所述的方法，其另外包含比较所述第一组扩增产物与所述第二组扩增产物的步骤，藉此确定所述靶核酸的基因型。
28、如权利要求1所述的方法，其中所述样品至少含有第三和第四核酸物质，其中所述第三物质具有比所述第四物质高的拷贝数，所述方法另外包含以下步骤：
e)在步骤a)-d)的所述相同反应容器中使实质上对所述第三核酸物质具有特异性的第三核酸物质扩增引物退火到所述第三核酸物质上，其中所述第三引物具有第三浓度；和
f)在步骤a)-d)的所述相同反应容器中使实质上对所述第四核酸物质具有特异性的第四扩增引物退火到所述第四核酸物质上，其中所述第四引物具有第四浓度并且其中所述第四扩增引物的所述第四浓度大于所述第三扩增引物的所述第三浓度；和
g)在步骤a)-d)的所述相同反应容器中使所述第三和第四核酸物质均通用的且实质上对所述第三和第四核酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到所述第三和所述第四核酸物质上；和
d)在步骤a)-d)的所述相同反应容器中实施核酸扩增反应，藉此使所述第三核酸物质扩增产物的量相对于所述第四核酸物质扩增产物的量有所增加。
29、如权利要求11所述的方法，其中所述样品至少含有第三和第四核酸物质，其中所述第三物质具有比所述第四物质高的拷贝数，所述方法另外包含以下步骤：
g)在步骤a)-c)的所述相同第一反应容器中使实质上对所述第三核酸物质具有特异性的第三核酸物质扩增引物退火到所述第三核酸物质上，其中所述第三引物具有第三浓度；和
h)在步骤a)-c)的所述相同第一反应容器中使实质上对所述第四核酸物质具有特异性的第四扩增引物退火到所述第四核酸物质上，其中所述第四引物具有第四浓度并且其中所述第四扩增引物的所述第四浓度大于所述第三扩增引物的所述第三浓度；和
i)在步骤a)-c)的所述相同第一反应容器中使所述第三和第四核酸物质均通用的且实质上对所述第三和第四核酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到所述第三和所述第四核酸物质上，并且实施核酸扩增反应，藉此在所述第三物质具有较高拷贝数时使所述第四核酸物质的扩增产物相对于所述第三核酸物质的扩增产物有所增加；和
j)在步骤d)-f)的所述相同第二反应容器中使所述第三扩增引物退火到所述第三核酸物质上，其中所述第三扩增引物是以与步骤h中所述第四浓度相同的浓度存在；和
k)在步骤d)-f)的所述相同第二反应容器中使所述第四扩增引物退火到所述第四核酸物质上，其中所述第四扩增引物是以与步骤g中所述第三浓度相同的浓度存在，藉此使所述第三扩增引物的浓度大于所述第四扩增引物的浓度；和
l)在步骤d)-f)的所述相同第二反应容器中使所述第三和第四核酸物质通用的另一扩增引物退火到所述第三和所述第四核酸物质上，并实施核酸扩增反应，藉此在所述第四物质具有较高拷贝数时使所述第三核酸物质的扩增产物相对于所述第四核酸物质的扩增产物有所增加。
30、如权利要求1所述的方法，其另外包含以下步骤：
e)在第二反应容器中使实质上对所述第一核酸物质具有特异性的第一扩增引物退火到所述第一核酸物质上，其中所述第一引物具有第一浓度；和
f)在所述第二反应容器中使实质上对所述第二核酸物质具有特异性的第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中所述第二引物具有第二浓度并且其中所述第二扩增引物的所述第二浓度等于所述第一扩增引物的所述第一浓度；和
g)在所述第二反应容器中使所述第一和第二核酸物质通用的且实质上对所述第一和第二核酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到所述第一和所述第二核酸物质上。
31、如权利要求11所述的方法，其另外包含以下步骤：
g)在第三反应容器中使实质上对所述第一核酸物质具有特异性的第一扩增引物退火到所述第一核酸物质上，其中所述第一引物具有第一浓度；和
h)在所述第三反应容器中使实质上对所述第二核酸物质具有特异性的第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中所述第二引物具有第二浓度并且其中所述第二扩增引物的所述第二浓度等于所述第一扩增引物的所述第一浓度；和
i)在所述第三反应容器中使所述第一和第二核酸物质通用的且实质上对所述第一和第二核酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到所述第一和所述第二核酸物质上。
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