CN109312396A - 用于构建标准化核酸文库的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本公开内容总体涉及适用于构建核酸样品，包括构建标准化核酸文库的核酸扩增系统和方法。在一些实施方案中，该方法包括提供一个或更多个输入核酸样品，使输入核酸样品(例如，输入文库)的每一个与包括第一扩增或标准化引物和第二扩增或标准化引物的反应混合物接触，其中第一扩增或标准化引物被固定在固体支持物上并且第二扩增或标准化引物处于溶液相中，并且在使得基本上所有的第一扩增或标准化引物被掺入扩增产物中的条件下扩增输入核酸样品。还提供经配置以执行本文公开的方法的系统和液滴致动器装置。还提供了根据公开的方法和系统制备的包含核酸样品和文库、优选地标准化的文库的组合物。

Description

用于构建标准化核酸文库的方法和系统
相关申请
本申请要求于2016年4月7日提交的美国临时专利申请系列第62/319,746号和于2016年6月10日提交的美国临时专利申请系列第62/348,766号的优先权，所述临时专利申请的每一个通过引用以其整体明确并入本文。
领域
本公开内容总体涉及核酸文库的生产和标准化领域，并且具体地涉及用于制备适用于各种下游分析应用，诸如核酸测序，特别是下一代测序的标准化核酸文库的装置、系统和方法。
背景
本部分中描述的材料不通过包含在本部分中而被承认为现有技术。
作为惯例，将用于制备用于下游分析的核酸文库的生物样品是根据规范化的测定方案进行同样地处理，而不考虑每个样品的定制程序的。重要的质量控制(QC)测量为核酸文库的核酸浓度，因为许多现代核酸分析技术的性能取决于输入核酸的核酸浓度。由于此类下游分析通常使用昂贵的试剂并且引发显著的执行成本，因此在假定样品制备本质上不适合所需应用的情况下，简单地丢弃不满足核酸浓度要求和/或其他QC测量的样品。
例如，在下一代测序(NGS)应用，也称为高通量测序中，制备具有基本上均匀的DNA摩尔浓度的核酸文库通常为期望的，但在逻辑上具有挑战性。该问题经常出现在由多个异质生物样品构建的核酸文库的制备中，特别是当期望的源生物样品不成比例地代表性不足时。当靶核酸分子相比于甚至衍生自相同生物样品的其他核酸，为相对稀少和/或更不稳定的核酸种类时，还会出现该问题。
概述
本节提供本公开内容的总体概述，并且未全面涵盖其全部范围或其特征中的所有。
本公开内容总体涉及用于扩增和/或标准化核酸的系统和方法，该系统和方法可对单个核酸样品或文库执行，以便产生具有定制摩尔浓度的靶核酸分子的核酸文库的主库(master pool)。在一些实施方案中，所公开的方法允许产生跨多个核酸文库具有基本均匀浓度的核酸文库。在一些实施方案中，所公开的系统和方法允许使用数字流体，例如，微流体程序在液滴致动器上制备靶向的扩增子样品或文库。
如本文所述的液滴致动器通常包括经配置以形成用于进行液滴操作的表面或间隙的一个或更多个基底。该一个或更多个基底建立用于进行液滴操作的液滴操作表面或间隙，并且还可包括布置成进行液滴操作的电极。液滴操作基底或基底之间的间隙可涂覆或填充有与形成液滴的液体不混溶的填料流体。
液滴致动器用于其中需要精确和准确地处理少量液体样品和试剂以用于获得可靠的分析结果的各种应用。例如，液滴致动器用于进行各种分子方案，诸如核酸的扩增(例如，聚合酶链式反应(PCR))。在一个示例性应用中，PCR技术用于制备靶向扩增子样品或用于测序的文库。已经开发工作台上方案(例如，基于板的方案)，用于制备靶向扩增子样品或文库。然而，工作台上方案通常涉及多个劳动和时间密集的步骤(例如，移液、试剂制备等)和相对大的样品输入量。此外，序列数据的质量和后续数据分析取决于扩增子样品或文库构建的质量。因此，需要一种用于构建核酸样品或文库的灵活的自动化平台，该自动化平台从相对较低的DNA输入提供跨多个样品和/或文库的高产量、均匀性和特异性，同时减少试剂消耗，并且允许用户对一系列多重操作上操作。
在一个方面，本文公开了用于核酸扩增的方法的实施方案，其包括(a)提供包括靶核酸分子的核酸样品；(b)使核酸样品与包含固相和液相的反应混合物接触，其中固相包括被固定在固体支持物上的多个第一扩增引物，该第一扩增引物能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交，并且其中液相包括溶液中的多个第二扩增引物，该多个第二引物能够与靶核酸分子的第二序列特异性杂交；以及(c)在等温条件下扩增靶核酸分子，使得基本上所有的第一扩增引物被掺入扩增产物中，其中多个第一引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，并且多个第二扩增引物以超过第一扩增引物的量的量提供。
根据本公开内容的该方面和其他方面的方法的实施方案的实施可包括以下特征中的一个或更多个。在一些实施方案中，多个第二扩增引物以在第一扩增引物的量的数量级内的量提供。在一些实施方案中，多个第二扩增引物以超过第一扩增引物的量至少100％的量提供。在一些实施方案中，该方法还包括将扩增产物与固体支持物分离。在一些实施方案中，固体支持物包括多个珠。在一些实施方案中，固体支持物包括选自以下的珠：磁珠、顺磁珠、塑料珠、聚苯乙烯珠、玻璃珠、琼脂糖珠、流式细胞术微珠、聚苯乙烯微米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒、功能化聚苯乙烯微米颗粒、功能化聚苯乙烯纳米颗粒、涂覆的聚苯乙烯微米颗粒、涂覆的聚苯乙烯纳米颗粒、二氧化硅微珠、荧光微米球、荧光纳米球、功能化荧光微米球、功能化荧光纳米球、涂覆的荧光微米球、涂覆的荧光纳米球、着色微米颗粒、着色纳米颗粒、磁微米颗粒、磁纳米颗粒、超顺磁微米颗粒、超顺磁纳米颗粒及其组合。在一些实施方案中，珠在水性反应缓冲液中。在一些实施方案中，珠彼此流体连通。在一些实施方案中，珠包括链霉亲和素珠，第一扩增引物通过缀合的生物素附着在该链霉亲和素珠上。在一些实施方案中，珠为单克隆的。在一些实施方案中，珠为多克隆的。在一些实施方案中，固体支持物为反应位点的表面。在一些实施方案中，反应位点的表面包括孔、凹槽、流通池、反应室或通道的内表面的底部部分。
本文公开的一些实施方案涉及用于核酸扩增的方法，其中核酸样品包括单链核酸分子。本文公开的一些实施方案涉及用于核酸扩增的方法，其中核酸样品包括双链核酸分子。
在本文公开的用于核酸扩增的方法的一些实施方案中，第一扩增引物和第二扩增引物包括与靶核酸分子内的已知核苷酸序列互补的序列。在一些实施方案中，已知核苷酸序列对应于靶核酸分子的第一末端和第二末端。在一些实施方案中，靶核酸分子的第一末端和第二末端包括已添加至靶核酸分子的通用测序尾部衔接子。在一些实施方案中，第一扩增引物和/或第二扩增引物的每一个还包括索引部分。在一些实施方案中，第一扩增引物的至少一部分除了靶核酸分子的已知序列之外，还包括与靶核酸分子的区域具有序列互补性的捕获部分。在一些实施方案中，捕获部分通过使捕获寡核苷酸与被固定在固体支持物上的第一扩增引物杂交并且延伸固定的扩增引物以产生与捕获寡核苷酸具有序列互补性的延伸的扩增引物来产生。
在本文公开的用于核酸扩增的方法的一些实施方案中，对多个核酸样品执行扩增步骤。在一些实施方案中，多个核酸样品的每一个的量未跨多个核酸样品标准化。在一些实施方案中，多个核酸样品在扩增步骤之前合并。在一些实施方案中，将来自多个核酸样品的扩增产物合并以形成核酸汇集的核酸文库。在一些实施方案中，将来自多个核酸样品的扩增产物在与各自的固体支持物分离之前进行合并。在一些实施方案中，将来自多个核酸样品的扩增产物在与各自的固体支持物分离之后进行合并。
本文公开的方法的一些实施方案还包括获得扩增产物的核苷酸序列的步骤。在一些实施方案中，扩增产物的核苷酸序列通过核酸测序获得。在一些实施方案中，核酸测序包括高通量测序，例如下一代测序(NGS)。
在一些实施方案中，本公开内容提供用于核酸扩增的方法，其包括(a)提供包括靶核酸分子的核酸样品；(b)使核酸样品与包含固相和液相的反应混合物接触，其中固相包括被固定在固体支持物上的多个第一扩增引物，该第一扩增引物能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交，并且其中液相包括溶液中的多个第二扩增引物，该多个第二引物能够与靶核酸分子的第二序列特异性杂交；以及(c)在等温条件下扩增靶核酸分子，使得基本上所有的第一扩增引物被掺入扩增产物中，其中多个第一引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，并且其中第一扩增引物的至少一部分除了靶核酸分子的已知序列之外，还包含与靶核酸分子的区域具有序列互补性的捕获部分，并且所述捕获部分通过使捕获寡核苷酸与被固定在固体支持物上的第一扩增引物杂交并且延伸固定的扩增引物以产生与捕获寡核苷酸具有序列互补性的延伸的扩增引物来产生。在本文公开的方法的一些实施方案中，反应混合物还包含重组酶、单链DNA结合蛋白、解旋酶和链置换聚合酶中的一种或更多种。还提供了包括通过根据本公开内容的该方面和其他方面的方法生成的扩增产物的组合物。
在一个方面，本文公开了用于核酸扩增和/或标准化的方法的实施方案，其包括(a)提供包含靶核酸分子的输入核酸样品；(b)使输入核酸样品与包含多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的反应混合物接触，其中多个第一标准化引物被固定在固体支持物上，该第一标准化引物能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交，并且其中多个第二标准化引物在溶液中，该多个第二引物能够与靶核酸分子的第二序列特异性杂交；以及(c)在等温条件下扩增靶核酸分子，使得基本上所有的第一标准化引物被掺入扩增产物中，其中多个第一引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，并且多个第二标准化引物以超过第一标准化引物的量的量提供。
根据本公开内容的方法的实施方案的实施可包括以下特征中的一个或更多个。在一些实施方案中，多个第二标准化引物以在第一标准化引物的量的数量级内的量提供。在一些实施方案中，多个第二标准化引物以超过第一标准化引物的量至少100％的量提供。在一些实施方案中，该方法还包括将扩增产物与固体支持物分离。在一些实施方案中，多个第一标准化引物在被固定在固体支持物上之前与靶核酸分子杂交。在一些实施方案中，多个第一标准化引物在与靶核酸分子杂交之前被固定在固体支持物上。在一些实施方案中，固体支持物包括多个珠。在一些实施方案中，固体支持物包括选自以下的珠：磁珠、顺磁珠、磁响应珠、塑料珠、聚苯乙烯珠、玻璃珠、琼脂糖珠及其组合。在一些实施方案中，固体支持物包括选自以下的珠：磁珠、顺磁珠、塑料珠、聚苯乙烯珠、玻璃珠、琼脂糖珠、流式细胞术微珠、聚苯乙烯微米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒、功能化聚苯乙烯微米颗粒、功能化聚苯乙烯纳米颗粒、涂覆的聚苯乙烯微米颗粒、涂覆的聚苯乙烯纳米颗粒、二氧化硅微珠、荧光微米球、荧光纳米球、功能化荧光微米球、功能化荧光纳米球、涂覆的荧光微米球、涂覆的荧光纳米球、着色微米颗粒、着色纳米颗粒、磁微米颗粒、磁纳米颗粒、超顺磁微米颗粒、超顺磁纳米颗粒及其组合。在一些实施方案中，珠在水性反应缓冲液中。在一些实施方案中，珠彼此流体连通。在一些实施方案中，珠包括链霉亲和素珠，第一标准化引物通过缀合的生物素附着在该链霉亲和素珠上。在一些实施方案中，珠为单克隆的。在一些实施方案中，珠为多克隆的。在一些实施方案中，固体支持物为反应位点的表面。在一些实施方案中，反应位点的表面包括孔、凹槽、流通池、反应室或通道的内表面的底部部分。
本文公开的一些实施方案涉及用于核酸扩增和/或标准化的方法，其中输入核酸样品包括单链核酸分子。本文公开的一些实施方案涉及用于核酸扩增的方法，其中输入核酸样品包括双链核酸分子。在一些实施方案中，输入核酸样品包括单链核酸和双链核酸的混合物。
在本文公开的用于核酸扩增和/或标准化的方法的一些实施方案中，第一标准化引物和/或第二标准化引物中的至少一个包括与靶核酸分子内的已知核苷酸序列具有序列互补性的区域。在一些实施方案中，已知核苷酸序列对应于靶核酸分子的第一末端和第二末端。在一些实施方案中，靶核酸分子的第一末端和第二末端包括已添加至靶核酸分子的通用引物区域。在一些实施方案中，通用引物区域包括合成测序(SBS)引物序列。在一些实施方案中，第一标准化引物和/或第二标准化引物中的至少一个还包括索引部分。在一些实施方案中，第一标准化引物和/或第二标准化引物中的至少一个还包括与添加至靶核酸分子的通用引物区域具有序列互补性的区域。在一些实施方案中，第一标准化引物的至少一部分除了靶核酸分子的已知序列之外，还包含与靶核酸分子的同源区域具有序列互补性的捕获部分。在一些实施方案中，捕获部分通过使捕获寡核苷酸与第一标准化引物杂交并且延伸第一标准化引物以产生与捕获寡核苷酸具有序列互补性的延伸的标准化引物来产生。
在本文公开的用于核酸扩增和/或标准化的方法的一些实施方案中，对多个输入核酸样品执行标准化扩增步骤。在一些实施方案中，输入核酸样品的每一个的量跨多个输入核酸样品不相等。在一些实施方案中，多个输入核酸样品在扩增步骤之前合并。在一些实施方案中，将来自多个输入核酸样品的扩增产物合并以形成核酸汇集的核酸文库。在一些实施方案中，将来自多个输入核酸样品的扩增产物在与各自的固体支持物分离之前进行合并。在一些实施方案中，将来自多个输入核酸样品的扩增产物在与各自的固体支持物分离之后进行合并。
本文公开的方法的一些实施方案还包括获得扩增产物的核苷酸序列的步骤。在一些实施方案中，扩增产物的核苷酸序列通过核酸测序获得。在一些实施方案中，核酸测序包括高通量测序，例如，下一代测序(NGS)。
在一些实施方案中，本公开内容提供用于核酸扩增的方法，其包括(a)提供包含靶核酸分子的输入核酸样品；(b)使输入核酸样品与包含多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的反应混合物接触，其中多个第一标准化引物被固定在固体支持物上，该第一标准化引物能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交，并且其中多个第二标准化引物在溶液中，该多个第二引物能够与靶核酸分子的第二序列特异性杂交；以及(c)在等温条件下扩增靶核酸分子，使得基本上所有的第一标准化引物被掺入扩增产物中，其中多个第一引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，并且其中第一标准化引物的至少一部分除了靶核酸分子的已知序列之外，还包含与靶核酸分子的区域具有序列互补性的捕获部分，并且捕获部分通过使捕获寡核苷酸与第一标准化引物杂交并且延伸第一标准化引物以产生与捕获寡核苷酸具有序列互补性的延伸的标准化引物来产生。
在本文公开的方法的一些实施方案中，反应混合物还包含重组酶、单链DNA结合蛋白、解旋酶和链置换聚合酶中的一种或更多种。
在根据本公开内容的该方面和其他方面的方法的一些实施方案中，在步骤(a)之前，对输入核酸样品中的靶核酸分子进行第一富集扩增反应，该第一富集扩增反应包括第一靶特异性引物和第二靶特异性引物。在一些实施方案中，第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的每一个包括与靶核酸分子的已知序列具有序列互补性的区域。在一些实施方案中，第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的每一个包括通用引物区域。在一些实施方案中，第一靶特异性引物的通用引物区域包括合成测序(SBS)引物序列。
在本文公开的方法的一些实施方案中，在步骤(a)之前，对输入核酸样品中的靶核酸分子进行第二富集扩增反应，该第二富集扩增反应包括第一通用引物和第二通用引物，其中第一通用引物包括与第一靶特异性引物的通用引物区域具有序列互补性的区域，并且第二通用引物包括与第二靶特异性引物的通用引物区域具有序列互补性的区域。在一些实施方案中，第一通用引物和/或第二通用引物的每一个还包括索引部分。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于核酸扩增的方法以多重格式执行。在一些实施方案中，本文公开的方法在液滴致动器上以多重格式执行。
在一个方面，本文公开的一些实施方案涉及用于在液滴致动器上多重扩增核酸样品的方法，该方法包括：(a)提供包括靶核酸分子的多个输入核酸样品；(b)将多个输入核酸样品装载到液滴致动器的液滴操作表面上，该液滴操作表面在其上布置有液滴操作电极；(c)分配包含多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的标准化试剂液滴，其中(i)多个第一标准化引物被固定在固体支持物上并且能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交，(ii)多个第二标准化引物在溶液中并且能够与靶核酸分子的第二序列特异性杂交；以及(d)在等温条件下扩增靶核酸分子，使得基本上所有的第一标准化引物被掺入扩增产物中。在一些实施方案中，该方面和其他方面的方法还包括，在步骤(c)之前，将第一富集PCR试剂液滴分配到液滴致动器的液滴操作表面上，其中第一富集PCR试剂液滴包括第一靶特异性引物和第二靶特异性引物；并且使多个输入核酸样品中的靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。在一些实施方案中，第一靶特异性引物和/或第二靶特异性引物的每一个包括与靶核酸分子的已知序列具有序列互补性的区域。在一些实施方案中，第一靶特异性引物和/或第二靶特异性引物的每一个还包括通用引物区域。在一些实施方案中，第一靶特异性引物的通用引物区域包括合成测序(SBS)引物序列。在一些实施方案中，第一靶特异性引物和/或第二靶特异性引物中的至少一个还包括索引部分。
在一些实施方案中，该方面和其他方面的方法还包括，在步骤(c)之前，将第二富集PCR试剂液滴分配到液滴致动器的液滴操作表面上，其中第二富集PCR试剂液滴包含第一通用引物和第二通用引物；并且使多个输入核酸样品中的靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。在一些实施方案中，第一通用引物和/或第二通用引物中的至少一个还包括引物序列区域。在一些实施方案中，第一通用引物和/或第二通用引物中的至少一个还包括索引部分。
在一些实施方案中，该方面和其他方面的方法还包括，在步骤(c)之前，将第一富集PCR试剂液滴分配到液滴致动器的液滴操作表面上，其中第一富集PCR试剂液滴包括第一靶特异性引物和第二靶特异性引物；将第二富集PCR试剂液滴分配到液滴致动器的液滴操作表面上，其中第二富集PCR试剂液滴包括第一通用引物和第二通用引物；使用液滴操作将第二富集PCR试剂液滴与第一富集PCR试剂液滴合并以形成合并的富集PCR试剂液滴；并且使多个输入核酸样品中的靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。
在一个方面，本文公开的一些实施方案涉及微流体系统，所述微流体系统用于在液滴致动器上执行核酸样品的多重扩增，其中微流体系统包括用于执行代码的处理器、通信地耦合到处理器的存储器以及存储在存储器中的程序代码，该程序代码使得处理器执行核酸样品的多重扩增的方法，其中该方法包括(a)将多个输入核酸样品装载到液滴致动器的液滴操作表面上，所述液滴操作表面在其上布置有液滴操作电极，所述多个输入核酸样品的每一个包含靶核酸分子；(b)分配包含多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的标准化试剂液滴，其中该多个第一标准化引物被固定在固体支持物上并且能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交，并且该多个第二标准化引物在溶液中并且能够与靶核酸分子的第二序列特异性杂交；以及(c)在等温条件下扩增靶核酸分子，使得基本上所有的第一标准化引物被掺入扩增产物中。
在本公开内容的各种实施方案中，本文公开的微流体系统的实施可包括以下组件中的一个或更多个：(a)加热装置；(b)液滴致动器，该液滴制动器热耦合到加热装置；(c)检测器，该检测器光学耦合到液滴致动器；(d)阻抗感测模块；(e)破碎装置，该破碎装置用于裂解包含核酸的生物材料；以及控制器，其电子耦合到(a)至(d)的组件中的一个或更多个。在一些实施方案中，本文公开的微流体系统的控制器包括程序代码、用于执行程序代码的处理器以及与处理器通信的本地存储器，其中程序代码使得处理器执行核酸样品的多重扩增的方法，该方法包括(a)将多个输入核酸样品装载到液滴致动器的液滴操作表面上，所述液滴操作表面在其上布置有液滴操作电极，所述多个输入核酸样品的每一个包含靶核酸分子；(b)分配包括多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的标准化试剂液滴，其中该多个第一标准化引物被固定在固体支持物上并且能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交，该多个第二标准化引物在溶液中并且能够与靶核酸分子的第二序列特异性杂交；(c)在等温条件下扩增靶核酸分子，使得基本上所有的第一标准化引物被掺入扩增产物中。
在一些实施方案中，控制器的程序代码使得处理器执行核酸样品的多重扩增的方法，该方法还包括在步骤(a)之前，将第一富集PCR试剂液滴分配到液滴致动器的液滴操作表面上，其中第一富集PCR试剂液滴包括第一靶特异性引物和第二靶特异性引物；并且使多个输入核酸样品中的靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。在一些实施方案中，程序代码使得处理器执行核酸样品的多重扩增的方法，该方法还包括在步骤(a)之前，将第二富集PCR试剂液滴分配到液滴致动器的液滴操作表面上，其中第二富集PCR试剂液滴包含第一通用引物和第二通用引物，并且使多个输入核酸样品中的靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。在一些实施方案中，程序代码使得处理器执行核酸样品的多重扩增的方法，该方法还包括在步骤(a)之前，将第一富集PCR试剂液滴分配到液滴致动器的液滴操作表面上，其中第一富集PCR试剂液滴包括第一靶特异性引物和第二靶特异性引物；将第二富集PCR试剂液滴分配到液滴致动器的液滴操作表面上，其中第二富集PCR试剂液滴包括第一通用引物和第二通用引物；使用液滴操作将第二富集PCR试剂液滴与第一富集PCR试剂液滴合并以形成合并的富集PCR试剂液滴；并且使多个输入核酸样品中的靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。在一些实施方案中，本文公开的微流体系统还包括一个或更多个磁体，该一个或更多个磁体可移动远离和接近一个或更多个流体贮存器，其中磁体的位置任选地由马达控制。在一些实施方案中，本文公开的微流体系统还包括一个或更多个加热装置以提供其热控制。在一些实施方案中，程序代码部分地或全部地存储在控制器的本地存储器中或远程计算装置上。在一些实施方案中，程序代码在本地执行和/或远程执行。
在一些实施方案中，本文公开的微流体系统的液滴致动器包括(a)底部基底和顶部基底，其被间隔液滴操作间隙隔开，其中底部基底和顶部基底中的任一个或两个包括经配置用于在间隙中进行液滴操作的电极；(b)电极布置，该电极布置包括路径、反应道和液滴操作电极阵列中的一个或更多个；(c)多个流体贮存器，该多个流体贮存器通过经配置用于沿着电极分配分离的流体的电极布置互连；(d)多个温度控制区。在一些实施方案中，液滴操作间隙填充有填料流体。在一些实施方案中，填料流体为硅油流体或十六烷填料流体。在一些实施方案中，多个流体贮存器包括一个或更多个试剂贮存器、一个或更多个样品贮存器、一个或更多个索引贮存器、一个或更多个废物贮存器或其组合。在一些实施方案中，液滴致动器还包括一个或更多个生物化学反应区，用于对每个核酸扩增反应执行某些处理步骤。在一些实施方案中，流体贮存器中的至少一个包括用于在其中装载流体的输入端口。在一些实施方案中，本文公开的液滴致动器还包括一个或更多个磁体，该一个或更多个磁体可移动远离和接近一个或更多个液滴操作电极。在一些实施方案中，磁体为永磁体。在一些实施方案中，磁体为电磁体。在一些实施方案中，温度控制区包括彼此不同的温度。在一些实施方案中，温度控制区包括基本相同的温度。在一些实施方案中，本文公开的液滴致动器中的电极布置包括分配操作电极、运输操作电极、融合(merging)操作电极、孵育操作电极、分裂操作电极、混合操作电极或其组合中的一个或更多个。
在一个方面，本文公开的一些实施方案涉及一种计算机可读介质，该计算机可读介质存储用于在液滴致动器上执行多重核酸扩增的方法的处理器可执行指令，该方法包括(a)将多个输入核酸样品装载到液滴致动器的液滴操作表面上，该液滴操作表面在其上布置有液滴操作电极，所述多个输入核酸样品的每一个包括靶核酸分子；(b)分配包括多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的标准化试剂液滴，其中该多个第一标准化引物被固定在固体支持物上并且能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交，该多个第二标准化引物在溶液中并且能够与靶核酸分子的第二序列特异性杂交；(c)在等温条件下扩增靶核酸分子，使得基本上所有的第一标准化引物被掺入扩增产物中。
在本公开内容的一个方面，还提供了包括通过本文公开的方法或系统生成的扩增产物的组合物。
前述概述仅为说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图和详细描述以及权利要求，本公开内容的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全明显。
附图简述
图1示出适用于进行多重靶向扩增子样品制备方案的液滴致动器的电极布置的实例的俯视图。
图2示出根据本公开内容的一些实施方案的核酸扩增和标准化的方法的非限制性实例的流程图。靶核酸分子与第一扩增或标准化引物之间的杂交发生在固体支持物上。在该实例中，固体支持物为多个捕获珠。可选地，固体支持物也可为反应位点的表面。
图3以图形方式显示图2的方法的步骤。
图4描绘如本文所述的核酸扩增和标准化的方法的另一个非限制性实例的流程图，其中靶核酸分子与第一扩增或标准化引物之间的杂交发生在溶液相中。
图5以图形方式显示图4的方法的步骤。
图6示出制备用于下游分析应用，例如测序的扩增样品和/或标准化样品的方法的另一个非限制性实例的流程图。
图7A和图7B以图形方式显示图6的方法的步骤。
图8描绘根据本公开内容的一些实施方案的核酸扩增和标准化的方法的另一个非限制性实例的流程图。
图9A和图9B以图形方式显示图8的方法的步骤。
图10显示使用三种不同方案制备的三种靶向的扩增子样品中片段大小分布的绘图，其中一种方案为图6的方法的两阶段式致动器上扩增反应。
图11A和图11B显示每个循环的PCR效率的条形图和图10的每个文库中扩增子的均匀性的条形图。图11A：每个PCR循环的PCR效率。图11B：均匀性改进。
图12A和图12B显示预测延伸的中间产物产量的三维图以及基于PCR产物和捕获探针输入的预测产量与实际产量的绘图。
图13显示在使用图6的方法制备的文库中根据PCR产物输入变化的相对文库输出的绘图。
图14A和图14B分别显示在使用图6的方法制备的文库中，根据PCR产物输入(输入稀释)变化的文库均匀性和倍数扩增的绘图以及扩增偏差的绘图。
图15A和图15B显示根据P5引物和P7-生物素引物浓度变化的ExAmp产量的三维图以及预测ExAmp产量与实际ExAmp产量的绘图。
图16显示从使用液滴致动器上的热变性从链霉亲和素珠洗脱的样品以及已经通过工作台上的NaOH处理另外变性的样品中获得的每个目标样品读数的绘图。
图17显示根据针对5种不同样品的基因组DNA输入变化的文库均匀性的绘图。
图18A和图18B分别显示图17的NA20mix样品中TP(真阳性)变体调用准确度的绘图以及HD200样品中TP变体调用准确度的绘图。
图19A显示在使用图6的方法，使用工作台上方案和致动器上方案制备的基因组文库中，根据染色体和位置变化的TP和FP(假阳性)变体频率的绘图。
图19B示出图19A的工作台上样品和致动器上样品中FP变体调用的平均数量的绘图。
图20显示根据基因组DNA和引物汇集物复杂性变化的文库均匀性的绘图。
图21A、图21C和图21B显示图20中描述的192-plex Pool 1文库中的目标覆盖的绘图，384-plex Pool Mix 1-2文库中192-plex Pool 1目标覆盖的绘图，以及580-plex PoolMix 1-3文库中的192-plex Pool 1目标覆盖的绘图。
图22示出包括液滴致动器的微流体系统的非限制性实例的功能框图，该液滴致动器为流体盒(cartridge)的一个实例。
图23图示示出根据本公开内容的一些实施方案，使用用于核酸扩增和标准化的Ex-Amp试剂的方法的非限制性实例。
图24示出根据本公开内容的一些实施方案，使用用于核酸扩增和标准化的Ex-Amp试剂的方法的另一个非限制性实例。取决于具体工作流程，该示例性方法中使用的可延伸引物可为扩增引物或标准化引物。固定在固体支持物上的第一扩增或标准化引物P7提供标准化核酸样品和易于纯化的能力，而溶液相中的第二扩增或标准化引物P5提供快速动力学。
图25图示总结根据本公开内容的一些实施方案的核酸扩增方法的非限制性实例的净效应。
图26示出根据本公开内容的一些实施方案的核酸扩增和标准化的方法的非限制性实例，其中输入样品含有双链核酸。在该实验中，双链DNA(dsDNA)通过链侵入，通过在溶液相中的第一扩增或标准化引物P5或者通过固定在珠表面上的第二扩增或标准化引物P7(由加框珠表示)进入反应核心。
图27示出根据本公开内容的一些实施方案的核酸扩增和标准化的方法的非限制性实例，其中输入核酸样品含有单链核酸，例如单链DNA(ssDNA)。单链DNA通过与固定在珠表面的引物P7杂交或者通过被溶液相中的引物P5(由加框珠表示)转化成dsDNA而进入。
图28示出根据本公开内容的一些实施方案的核酸扩增和标准化的方法的另一个非限制性实例。含有已经附着在珠(加框)上的核酸的输入核酸样品通过与在溶液相中的引物P5杂交而进入反应核心。
图29图示总结为示出根据本公开内容的一些实施方案的文库标准化的方法的非限制性实例而执行的实验的结果。29A：输入核酸文库中的稀释因子；29B：从标准文库制备程序获得的文库产量；29C：从根据本公开内容的核酸扩增和标准化的方法的非限制性实例执行的文库制备程序获得的文库产量。
详细描述
本公开内容总体涉及核酸扩增装置、系统和方法，包括适用于构建核酸样品的新颖方法，包括构建扩增/标准化的核酸样品和文库(任选地以定制方式)，用于下游分析应用，包括利用诸如下一代测序(NGS)的技术和诸如测序基因分型(GBS)的相关方法的测序应用。在一些实施方案中，该方法包括使多个输入核酸样品与包括第一引物和第二引物的反应混合物接触，其中取决于具体工作流程，第一引物和第二引物可为扩增引物或标准化引物。在一些实施方案中，第一扩增或标准化引物被固定在固体支持物上并且第二扩增或标准化引物在溶液相中，并且输入核酸样品的扩增或标准化在这样的条件下执行，即无论输入样品的量如何，所得扩增/标准化样品中的核酸的量相对于彼此处于基本相似的浓度。在一些实施方案中，基本上所有的第一扩增或标准化引物被掺入扩增产物中。例如，在一些实施方案中，第一扩增或标准化引物的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、100％或由前述值中的任何两个限定的范围被掺入扩增产物中。还提供了经配置以执行本文公开的方法的系统和液滴致动器装置。还提供了根据所公开的方法制备的核酸文库。
在一个方面，本公开内容的一些实施方案涉及用于下游分析应用，例如测序应用的靶向扩增子样品或文库的液滴致动器装置和制备方法。使用数字微流体技术，本公开内容的液滴致动器装置和方法提供自动液体处理，用于扩增和选择基因组DNA的靶向区域，用于加工成扩增子样品或文库，用于下游分析应用，例如测序。在各种实施方案中，文库构建参数，诸如DNA输入(例如，1ng或更少)、文库产量和均匀性、获得结果的耗时(time-to-result)和试剂消耗，与现有技术相比显著改进。
在一个方面，本文公开的方法的一些实施方案使用2阶段式扩增反应，其中第一扩增反应由靶特异性引物驱动并且第二扩增反应由通用引物驱动。2阶段式扩增反应允许选择对于每种类型的扩增，例如靶特异性引物扩增或通用引物扩增，特定的反应条件(例如，退火和延伸温度、孵育时间和PCR循环数)，并且提供更有效的靶向扩增(例如，改进的文库产量和均匀性)。
在一些实施方案中，然后使用靶特异性捕获探针将所得核酸样品或文库中的靶向扩增子富集在基于溶液的杂交反应中，然后固定在捕获珠上用于后续加工步骤。在本文公开的方法的一些实施方案中，相比于固相杂交反应，基于溶液的杂交反应通常在动力学上更有利，从而生成更稳健的系统并且提供改进的靶捕获，以及跨多个样品和/或文库的改进的均匀性和特异性。
在一个方面，本文公开的方法的一些实施方案在核酸文库的扩增或标准化期间采用在溶液相中的至少一组第一扩增或标准化引物和固定在固相支持物上的至少另一组第二扩增或标准化引物。本公开内容的该方面的该特征有利地不同于当前文库制备程序，在当前文库制备程序中，两种引物都处于溶液相或者两种引物都附着在固相上。另外，在本文公开的方法的一些特定实施中，固定在固体支持物上的第一引物组以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，并且溶液中的第二引物组以超过第一引物的量的量提供。通过这种特定引物配置实现的优点为双重的：(1)它允许方便地洗去扩增之后在溶液中发现的任何扩增产物，引起扩增/标准化量的扩增产物保持固定在随后可隔离的固体支持物上，使得可产生预定量的扩增产物。相比之下，现有的文库制备方法通常生成过量的扩增产物，需要对其进行测量，然后进行稀释步骤以获得所需的量；(2)在一些特定实施中，本文公开的方法允许构建多个核酸文库，其中不管输入DNA样品的量如何，输出DNA量被跨文库标准化为基本相同的浓度。
在一个方面，本公开内容的方法使用动力学排除扩增程序，也称为排除扩增(ExAmp)反应，以使样品量相等并且调节扩增子DNA的浓度用于后续测序应用。在一些实施方案中，ExAmp文库标准化反应为等温扩增反应，其使用固定在捕获珠上的第一引物序列(例如，包括P7引物序列的引物)和溶液中的第二引物序列(例如，包括P5引物序列的引物)，作为用于文库标准化的标准化引物。通常，文库标准化的过程可在大范围的PCR产物(扩增子)输入(例如，具有超过至少两个数量级的输入变化的那些)上执行。此外，可选择反应条件(例如，孵育时间、P7和/或P5引物浓度和反应组分)，使得固定在捕获珠上的所有可用引物延伸到扩增子中，例如，允许反应运行达到饱和。
通常，液滴致动器装置的灵活性和可编程性提供对在构建靶向扩增子样品或文库期间执行的各种生物化学反应的精确控制。
在一个示例性应用中，本公开内容的液滴致动器和方法用于制备用于鉴定遗传变体例如单核苷酸多态性(SNP)的靶向扩增子样品或文库。
在以下详细描述中，参考附图，附图构成本说明书的一部分。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着为限制性的。在不脱离这里呈现的主题的精神或范围的情况下，可使用其他实施方案并且可进行其他改变。容易理解的是，如本文一般描述的并且在附图中示出的本公开内容的实施方案可以各种不同的配置来布置、替换、组合和设计，这些配置中的所有都为明确考虑的并且构成本公开内容的一部分。
除非另有明确定义，否则本文所使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或术语学旨在具有本公开内容所属领域的技术人员在按照本公开内容阅读时通常理解的含义。
一些定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或术语学旨在具有本公开内容所属领域的技术人员在按照本公开内容阅读时通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应被解释为代表与本领域通常理解的内容的显著差异。本文描述或提及的技术和程序中的许多被本领域技术人员很好地理解并且通常使用常规方法。
除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。例如，术语“分子”包括一种或更多种分子，包括其混合物。如在本公开内容和所附权利要求中所使用的，术语“和/或”可为单数的或包含性的。例如，“A和/或B”在本文中用于包括以下替代中的所有：“A”、“B”以及“A和B”。
如本文所用，术语“约”具有大约的普通含义。如果上下文中没有另外明确的近似程度，则“约”意指在提供值的正负10％范围内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下均包括提供值。在提供范围的情况下，它们包括边界值。
如本文中关于一个或更多个电极所使用的术语“激活”意指影响一个或更多个电极的电状态的变化，这在存在液滴的情况下引起液滴操作。可使用交流电(AC)或直流电(DC)来完成电极的激活。可使用任何合适的电压。例如，可使用大于约150V、或大于约200V、或大于约250V、或从约275V至约1000V或约300V的电压来激活电极。在使用AC信号的情况下，可采用任何合适的频率。例如，可使用频率从约1Hz至约10MHz、或从约10Hz至约60Hz、或从约20Hz至约40Hz或约30Hz的AC信号来激活电极。
如本文所用，术语“液滴”意指液滴致动器上的液体体积。通常，液滴至少部分地由填料流体界定。例如，液滴可完全由填料流体包围，或者可由填料流体和液滴致动器的一个或更多个表面界定。作为另一个实例，液滴可由填料流体、液滴致动器的一个或更多个表面和/或大气界定。作为又一个实例，液滴可由填料流体和大气界定。液滴可为例如水性或非水性的，或者可为包括水性和非水性组分的混合物或乳液。液滴可采取各种形状；非限制性实例通常包括圆盘形、块形(slug shaped)、截头球形、椭球形、球形、部分压缩球形、半球形、卵形、圆柱形、此类形状的组合，以及在液滴操作，诸如融合或分裂期间形成的各种形状或者由于此类形状与液滴致动器的一个或更多个表面接触而形成。对于可使用本公开内容的方法进行液滴操作的液滴流体的实例，参见Eckhardt等人，于2007年10月25日公布的题为“Droplet-Based Biochemistry”的国际专利公布第WO/2007/120241号，其全部公开内容通过引用并入本文。
在本公开内容的各种实施方案中，液滴可包括生物样品，诸如全血、淋巴液、血清、血浆、汗液、泪液、唾液、痰、脑脊髓液、羊水、精液、阴道分泌物、浆液、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、渗出液、渗出物(exudates)、囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便样品、含有单细胞或多细胞的液体、含有细胞器的液体、流化组织、流化生物、含有多细胞生物体的液体、生物拭子和生物洗涤物。此外，液滴可包括试剂，诸如水、去离子水、盐水溶液、酸性溶液、碱性溶液、洗涤剂溶液和/或缓冲液。液滴可包括核酸，诸如DNA、基因组DNA、RNA、mRNA或其类似物；核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物，诸如具有终止子部分的类似物，诸如以下中所述的那些：Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)；Gormley等人，于2013年9月12日公布的题为“Improved Methods of Nucleic Acid Sequencing”的国际专利公布第WO/2013/131962号；Barnes等人，于2006年6月6日授权的题为“Labelled Nucleotides”的美国专利第7,057,026号；Kozlov等人，于2008年4月10日公布的题为“Compositions andMethods for Nucleotide Sequencing”的国际专利公布第WO/2008/042067号；Rigatti等人，于2013年8月15日公布的题为“Targeted Enrichment and Amplification of NucleicAcids on a Support”的国际专利公布第WO/2013/117595号；Hardin等人，于2008年2月12日授权的题为“Methods for Real-Time Single Molecule Sequence Determination”的美国专利第7,329,492号；Hardin等人，于2007年5月1日授权的题为“Enzymatic NucleicAcid Synthesis:Compositions and Methods for Altering Monomer IncorporationFidelity”的美国专利第7,211,414号；Turner等人，于2008年1月1日授权的题为“Arraysof Optical Confinements and Uses Thereof”的美国专利第7,315,019号；Xu等人，于2008年7月29日授权的题为“Fluorescent Nucleotide Analogs and Uses Therefor”的美国专利第7,405,281号；和Ranket等人，于2008年5月8日公布的题为“Polymerase Enzymesand Reagents for Enhanced Nucleic Acid Sequencing”的美国专利第20080108082号，其全部公开内容通过引用并入本文；酶，诸如聚合酶、连接酶、重组酶或转座酶；结合配偶体，诸如抗体、表位、链霉亲和素、亲和素、生物素、凝集素或碳水化合物；或其他生物化学活性分子。液滴内容物的其他实例包括试剂，诸如用于生物化学方案的试剂，诸如核酸扩增方案、基于亲和力的测定方案、酶测定方案、测序方案和/或用于生物流体分析的方案。根据本文公开的一些实施方案，取决于具体工作流程和/或下游应用，液滴可包括一个或更多个珠。
如本文所用的术语“液滴致动器”意指用于操纵液滴的装置。关于液滴致动器的实例，参见Pamula等人，于2005年6月28日授权的题为“Apparatus for ManipulatingDroplets by Electrowetting-Based Techniques”的美国专利第6,911,132号；Pamula等人，于2006年8月31日公布的题为“Apparatuses and Methods for ManipulatingDroplets on a Printed Circuit Board”的美国专利公布第20060194331号；Pollack等人，于2007年10月25日公布的题为“Droplet-Based Biochemistry”国际专利公布第WO/2007/120241号；Shenderov，于2004年8月10日授权的题为“Electrostatic Actuators forMicrofluidics and Methods for Using Same”的美国专利第6,773,566号；Shenderov，于2003年5月20日授权的题为“Actuators for Microfluidics Without Moving Parts”的美国专利第6,565,727号；Kim等人，于2003年11月6日公布的题为“Electrowetting-drivenMicropumping”的美国专利公布第20030205632号；Kim等人，于2006年7月27日公布的题为“Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Dropsfrom a Nozzle”的美国专利公布第20060164490号；Kim等人，于2007年2月1日公布的题为“Small Object Moving on Printed Circuit Board”的美国专利公布第20070023292号；Shah等人，于2009年11月19日公布的题为“Method for Using Magnetic Particles inDroplet Microfluidics”的美国专利公布第20090283407号；Kim等人，于2010年4月22日公布的题为“Method and Apparatus for Real-time Feedback Control of ElectricalManipulation of Droplets on Chip”的美国专利公布第20100096266号；Velev，于2009年6月16日授权的题为“Droplet Transportation Devices and Methods Having a FluidSurface”的美国专利第7,547,380号；Sterling等人，于2007年1月16日授权的题为“Method,Apparatus and Article for Microfluidic Control via Electrowetting,forChemical,Biochemical and Biological Assays and the Like”的美国专利第7,163,612号；Becker等人，于2010年1月5日授权的题为“Method and Apparatus for ProgrammableFluidic Processing”的美国专利第7,641,779号；Becker等人，于2005年12月20日授权的题为“Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing”的美国专利第6,977,033号；Decre等人，于2008年2月12日授权的题为“System for Manipulation of aBody of Fluid”的美国专利第7,328,979号；Yamakawa等人，于2006年2月23日公布的题为“Chemical Analysis Apparatus”的美国专利公布第20060039823号；Wu，于2011年3月3日公布的题为“Digital Microfluidics Based Apparatus for Heat-exchanging ChemicalProcesses”的美国专利公布第20110048951号；Fouillet等人，于2009年7月30日公布的题为“Electrode Addressing Method”的美国专利公布第20090192044号；Fouillet等人，于2006年5月30日发布的题为“Device for Displacement of Small Liquid Volumes Alonga Micro-catenary Line by Electrostatic Forces”的美国专利第7,052,244号；Marchand等人，于2008年5月29日公布的题为“Droplet Microreactor”的美国专利公布第20080124252号；Adachi等人，于2009年12月31日公布的题为“Liquid Transfer Device”的美国专利公布第20090321262号；Roux等人，于2005年8月18日公布的题为“Device forControlling the Displacement of a Drop Between Two or Several SolidSubstrates”的美国专利公布第20050179746号；和Dhindsa等人，“VirtualElectrowetting Channels:Electronic Liquid Transport with Continuous ChannelFunctionality,”Lab Chip，10:832-836(2010)，其全部公开内容通过引用并入本文。
在本文公开的一些实施方案中，某些液滴致动器将包括其间布置有液滴操作间隙的一个或更多个基底，以及与一个或更多个基底相关联(例如，层叠在一个或更多个基底上、附接到一个或更多个基底和/或嵌入一个或更多个基底中)并且布置成进行一个或更多个液滴操作的电极。例如，某些液滴致动器将包括基部(或底部)基底、与基底相关联的液滴操作电极、基底顶上的一个或更多个介电层和/或电极，以及任选地基底顶上的一个或更多个疏水层，介电层和/或电极形成液滴操作表面。还可提供顶部基底，该顶部基底通过间隙与液滴操作表面分离，该间隙通常称为液滴操作间隙。在本文所引用的专利和申请中论述顶部基底和/或底部基底上的各种电极布置，并且在本公开内容的描述中论述某些新颖的电极布置。在液滴操作期间，优选液滴保持与接地电极或参考电极的连续接触或频繁接触。接地电极或参考电极可在间隙中与面向间隙的顶部基底、面向间隙的底部基底相关联。在电极设置在两个基底上的情况下，用于将电极耦合到用于控制或监测电极的液滴致动器仪器的电触点可与一个或两个板相关联。在一些情况下，一个基底上的电极电耦合到另一个基底，使得仅一个基底与液滴致动器接触。在一些实施方案中，导电材料(例如，环氧树脂，诸如MASTER BONDTM Polymer System EP79，可从Master Bond,Inc.,Hackensack,NJ获得)提供一个基底上的电极和另一个基底上的电路径之间的电连接，例如，顶部基底上的接地电极可通过此类导电材料耦合到底部基底上的电路径。在本文公开的使用多个基底的一些实施方案中，可在基底之间设置间隔件以确定其间的间隙的高度并且限定致动器上分配贮存器。间隔件高度可为例如至少约5μm、100μm、200μm、250μm、275μm或更大。可选地或另外地，间隔件高度可为至多约600μm、400μm、350μm、300μm或更小。例如，间隔件可由形成顶部基底或底部基底的凸起层和/或插入顶部基底和底部基底之间的材料形成。一个或更多个开口可设置在一个或更多个基底中，用于形成流体路径，液体可通过该流体路径输送到液滴操作间隙中。在一些情况下，一个或更多个开口可对准以用于与一个或更多个电极相互作用，例如，对准成使得流过开口的液体将与一个或更多个液滴操作电极足够接近，以允许液滴操作电极使用液体来实现液滴操作。在一些情况下，基部(或底部)和顶部基底可形成为一个整体组件。一个或更多个参考电极可设置在基部(或底部)基底和/或顶部基底上和/或间隙中。参考电极布置的实例在本文引用的专利和专利申请中提供。在各种实施方案中，液滴致动器对液滴的操纵可为电极介导的，例如电润湿介导的或介电电泳介导的或库仑力介导的。
可以在本公开内容的液滴致动器中使用的用于控制液滴操作的其他技术的实例包括使用引起流体动力流体压力的装置，诸如基于以下原理操作的装置：机械原理(例如，外部注射泵、气动隔膜泵、振动隔膜泵、真空装置、离心力、压电/超声波泵和声力)；电或磁原理(例如，电渗流、动电泵、铁磁流体塞、电流体动力泵、使用磁力的吸引或排斥以及磁流体动力泵)；热力学原理(例如，气泡产生/相变引起的体积膨胀)；其他种类的表面润湿原理(例如，电润湿和光电润湿，以及化学、热、结构和放射性引起的表面张力梯度)；重力；表面张力(例如，毛细管作用)；静电力(例如，电渗流)；离心流动(设置在光盘上并旋转的基底)；磁力(例如，振荡离子引起流动)；磁流体动力；以及真空或压差。在某些实施方案中，可采用前述技术中的两种或更多种的组合来在本公开内容的液滴致动器中进行液滴操作。类似地，前述中的一个或更多个可用于将液体输送到液滴操作间隙中，例如，从另一装置中的贮存器或从液滴致动器的外部贮存器(例如，与液滴致动器基底相关联的贮存器和从贮存器进入液滴操作间隙中的流动路径)。
本公开内容的某些液滴致动器的液滴操作表面可由疏水材料制成，或者可被涂覆或处理以使它们疏水。例如，在一些情况下，液滴操作表面的一些部分或全部可用低表面能材料或化学物质衍生，例如通过沉积或使用化合物，诸如溶液中的聚氟化化合物或全氟化化合物或者可聚合单体的原位合成。实例包括AF(可从DuPont,Wilmington,DE获得)、家族疏水和超疏水涂层中的全氟树脂(cytop)材料家族的成员(可从Cytonix Corporation,Beltsville,MD获得)、硅烷涂层、氟硅烷涂层、疏水性膦酸酯衍生物(例如，Aculon,Inc.出售的那些)和NOVECTM电子涂料(可从3M Company,St.Paul,MN获得)、用于等离子体增强化学气相沉积(PECVD)的其他氟化单体以及用于PECVD的有机硅氧烷(例如，SiOC)。在一些情况下，液滴操作表面可包括厚度范围从约10nm至约1,000nm的疏水涂层。此外，在一些实施方案中，液滴致动器的顶部基底包括导电有机聚合物，然后用疏水涂层涂覆或以其他方式处理以使液滴操作表面疏水。例如，沉积在塑料基底上的导电有机聚合物可为聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)聚(苯乙烯磺酸盐)(PEDOT：PSS)。导电有机聚合物和替代导电层的其他实例描述于Pollack等人，于2011年1月6日公布的题为“DropletActuator Devices and Methods”的国际专利公布第WO/2011/002957号，其全部公开内容通过引用并入本文。在本文公开的一些实施方案中，可使用印刷电路板(PCB)、玻璃、氧化铟锡(ITO)涂覆的玻璃和/或半导体材料作为基底来制造一个或两个基底。当基底为ITO涂覆的玻璃时，ITO涂层的厚度例如为至少约20nm、50nm、75nm、100nm或更大。可选地或另外地，厚度可为至多约200nm、150nm、125nm或更小。在一些情况下，顶部基底和/或底部基底包括涂覆有介电质，诸如聚酰亚胺介电质的PCB基底，该介电质在某些情况下也可被涂覆或以其他方式处理以使液滴操作表面疏水。当基底包括PCB时，以下材料为合适材料的实例：MITSUITM BN-300(可从MITSUIChemicals America,Inc.,San Jose CA获得)；ARLONTM 11N(可从Arlon,Inc.,Santa Ana,CA获得)；N4000-6和N5000-30/32(可从ParkElectrochemical Corp.,Melville,NY获得)；ISOLATM FR406(可从Isola Group,Chandler,AZ获得)，尤其是IS620；含氟聚合物家族(适用于荧光检测，因为它具有低背景荧光)；聚酰亚胺家族；聚酯；聚萘二甲酸乙二醇酯；聚碳酸酯；聚醚醚酮；液晶聚合物；环烯烃共聚物(COC)；环烯烃聚合物(COP)；芳族聚酰胺；非织造芳族聚酰胺增强剂(可从DuPont,Wilmington,DE获得)；牌纤维(可从DuPont,Wilmington,DE获得)；以及纸。各种材料也适合用作基底的介电组件。实例包括：气相沉积的电介质，诸如PARYLENETM C(特别是在玻璃上)、PARYLENETM N和PARYLENETM HT(用于高温，～300℃)(可从Parylene Coating Services,Inc.,Katy,TX获得)；AF涂层；全氟树脂；阻焊层，诸如液体可光成像的阻焊层(例如，在PCB上)，如TAIYOTM PSR4000系列，TAIYOTM PSR和AUS系列(可从Taiyo America,Inc.Carson City,NV获得)(对于涉及热控制的应用具有良好热特性)，以及PROBIMERTM 8165(对于涉及热控制的应用具有良好热特性)(可从HuntsmanAdvanced Materials Americas Inc.,Los Angeles,CA获得)；干膜阻焊层，诸如干膜阻焊层生产线中的那些(可从DuPont,Wilmington,DE获得)；膜介电质，诸如聚酰亚胺膜(例如，聚酰亚胺膜，可从DuPont,Wilmington,DE获得)、聚乙烯和含氟聚合物(例如，FEP)、聚四氟乙烯；聚酯；聚萘二甲酸乙二醇酯；环烯烃共聚物(COC)；环烯烃聚合物(COP)；上面列出的任何其他PCB基底材料；黑色基质树脂；聚丙烯；和黑色柔性电路材料，诸如DuPontTM HXC和DuPontTM MBC(可从DuPont,Wilmington,DE获得)。
可选择液滴运输电压和频率以用于特定测定方案中使用的试剂的性能。设计参数可变化，例如，致动器上贮存器的数量和放置、独立电极连接的数量、不同贮存器的尺寸(体积)、磁体/珠洗涤区的放置、电极尺寸、电极间间距(pitch)和间隙高度(在顶部基底和底部基底之间)可变化以用于特定试剂、方案、液滴体积等。在一些情况下，本公开内容的基底可用低表面能材料或化学物质衍生，例如，使用在溶液中的聚氟化化合物或全氟化化合物或可聚合单体的沉积或原位合成。实例包括用于浸涂或喷涂的AF涂层和涂层，用于等离子体增强化学气相沉积(PECVD)的其他氟化单体和用于PECVD的有机硅氧烷(例如，SiOC)。另外，在一些情况下，液滴操作表面的一些部分或全部可涂覆有用于降低背景噪声，诸如来自PCB基底的背景荧光的物质。例如，降噪涂层可包括黑色基质树脂，诸如可从Toray industries,Inc.,Japan获得的黑色基质树脂。
液滴致动器的电极通常由控制器或处理器控制，该控制器或处理器本身作为系统的一部分提供，该系统可包括处理功能以及数据和软件存储以及输入和输出能力。试剂可设置在液滴致动器上的液滴操作间隙中或者流体联接到液滴操作间隙的贮存器中。试剂可为液体形式，例如液滴，或者它们可以可重构形式提供在液滴操作间隙中或者流体联接到液滴操作间隙的贮存器中。可重构试剂通常可与液体组合用于重构。适用于本文所述方法和设备的可重构试剂的实例包括Meathrel等人，于2010年6月1日授权的题为“Disintegratable Films for Diagnostic Devices”的美国专利第7,727,466号中描述的那些，其全部公开内容通过引用并入本文。
如本文所用，“液滴操作”意指液滴致动器上的液滴的任何操纵。液滴操作可例如包括：将液滴装载到液滴致动器中；从源液滴分配一个或更多个液滴；将液滴分裂、分离或分开成两个或更多个液滴；在任何方向上将液滴从一个位置运输到另一个位置；将两个或更多个液滴融合或合并成单个液滴；稀释液滴；混合液滴；搅动液滴；使液滴变形；将液滴保持在适当位置；孵育液滴；加热液滴；蒸发液滴；冷却液滴；处理液滴；将液滴运输出液滴致动器；本文所述的其他液滴操作；和/或前述的任何组合。术语“融合”、“融合的”、“合并”、“合并的”等用于描述从两个或更多个液滴产生一个液滴。应当理解，当关于两个或更多个液滴使用此类术语时，可使用足以引起两个或更多个液滴合并成一个液滴的液滴操作的任何组合。例如，“将液滴A与液滴B融合”可通过将液滴A运输到与静止液滴B接触，将液滴B运输到与静止液滴A接触，或者将液滴A和液滴B运输到彼此接触来实现。术语“分裂”、“分离”和“分开”并不旨在暗示关于所得液滴的体积(即，所得液滴的体积可相同或不同)或所得液滴的数量(所得液滴的数量可为2、3、4、5或更多)的任何特定结果。术语“混合”是指引起液滴内的一种或更多种组分更均匀分布的液滴操作。“装载”液滴操作的实例包括微透析装载、压力辅助装载、机器人装载、被动装载和移液管装载。液滴操作可为电极介导的。在一些情况下，通过使用在表面上的亲水和/或疏水区域和/或通过物理障碍物来进一步促进液滴操作。对于液滴操作的非限制性实例，参见上文在“液滴制动器”的定义下引用的专利和专利申请。阻抗或电容传感或成像技术有时可用于确定或确认液滴操作的结果。此类技术的实例描述于Sturmer等人，于2010年8月5日公布的题为“Capacitance Detection in aDroplet Actuator”的美国专利公布第20100194408号中，其全部公开内容通过引用并入本文。一般而言，感测或成像技术可用于确认特定电极处液滴的存在或不存在。例如，在液滴分配操作之后在目的地电极处存在分配的液滴确认液滴分配操作为有效的。类似地，在测定方案中适当步骤的检测点处的液滴的存在可确认先前的一组液滴操作已成功产生用于检测的液滴。液滴运输时间可相当快。例如，在各种实施方案中，液滴从一个电极到下一个电极的运输可超过约1秒、或约0.1秒、或约0.01秒、或约0.001秒。在本文公开的一些实施方案中，电极以AC模式操作，但是切换到DC模式以用于成像。对液滴的印迹区域进行液滴操作以使其类似于电润湿区域为有帮助的；换句话说，分别使用1个、2个和3个电极有效地控制操作1x-液滴、2x-液滴、3x-液滴。如果液滴印迹大于在给定时间可用于进行液滴操作的电极数量，则液滴尺寸与电极数量之间的差通常不应大于1；换句话说，使用1个电极有效地控制2x液滴，并且使用2个电极有效地控制3x液滴。当液滴包括珠时，液滴尺寸等于控制液滴(例如，运输液滴)的电极数量为有用的。
“填料流体”意指与液滴致动器的液滴操作基底相关联的流体，该流体与液滴相充分不混溶，以使液滴相经受电极介导的液滴操作。例如，液滴致动器的液滴操作间隙通常填充有填充液。填料流体可为例如或包括低粘度油，诸如硅油或十六烷填料流体。填料流体可为或包括卤化油，诸如氟化油或全氟化油。填料流体可填充液滴致动器的整个间隙，或者可涂覆液滴致动器的一个或更多个表面。填料流体可为导电的或非导电的。可选择填料流体以改进液滴操作和/或减少试剂或目标物质从液滴中的损失、改进微滴的形成、减少液滴之间的交叉污染、减少液滴致动器表面的污染、减少液滴致动器材料的降解等。例如，可选择填料流体以与液滴致动器材料相容。例如，氟化填料流体可有效地与氟化表面涂层一起使用。氟化填料流体可用于减少亲脂性化合物的损失，所述亲脂性化合物诸如伞形酮基质如6-十六烷酰基酰胺基-4-甲基伞形酮基质(例如，用于Krabbe、Niemann-Pick或其他测定中)；其他伞形酮基质描述于Winger等人，于2011年5月19日公布的题为“Enzymatic AssaysUsing Umbelliferone Substrates with Cyclodextrins in Droplets of Oil”的美国专利公布第20110118132号中，其全部公开内容通过引用并入本文。合适的氟化油的实例包括Galden生产线中的那些，诸如Galden HT170(bp＝170℃，粘度＝1.8cSt，密度＝1.77)、Galden HT200(bp＝200℃，粘度＝2.4cSt，d＝1.79)、Galden HT230(bp＝230℃，粘度＝4.4cSt，d＝1.82)(均来自Solvay Solexis)；Novec生产线中的那些，诸如Novec 7500(bp＝128℃，粘度＝0.8cSt，d＝1.61)、Fluorinert FC-40(bp＝155℃，粘度＝1.8cSt，d＝1.85)、Fluorinert FC-43(bp＝174℃，粘度＝2.5cSt，d＝1.86)(均来自3M)。通常，全氟化填料流体的选择是基于运动粘度(<7cSt为优选的，但不是必需的)，并且基于沸点(>150℃为优选的，但不是必需的，用于基于DNA/RNA的应用(PCR等)中)。填料流体可例如掺杂有表面活性剂或其他添加剂。例如，可选择添加剂以改进液滴操作和/或减少试剂或目标物质从液滴中的损失、微滴的形成、液滴之间的交叉污染、液滴致动器表面的污染、液滴致动器材料的降解等。包括表面活性剂掺杂的填料流体的组成可被选择用于特定测定方案中使用的试剂的性能以及与液滴致动器材料的有效相互作用或非相互作用。适用于本文所述方法和设备的填料流体和填料流体制剂的实例提供于Srinivasan等人，于2010年6月3日公布的题为“Droplet Actuators,Modified Fluids and Methods”的国际专利公布第WO/2010/027894号；Srinivasan等人，于2009年2月12日公布的题为“Use of Additives for EnhancingDroplet Operations”的国际专利公布第WO/2009/021173号；Sista等人，于2009年1月15日公布的题为“Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads”的国际专利公布第WO/2008/098236号；以及Monroe等人，于2008年11月20日公布的题为“Electrowetting Devices”的美国专利公布第20080283414号中，其全部公开内容通过引用并入本文，以及本文引用的其他专利和专利申请。在一些情况下，氟化油可掺杂有氟化表面活性剂，例如Zonyl FSO-100(Sigma-Aldrich)和/或其他。填料流体通常为液体。在一些实施方案中，可使用填料气体代替液体。
如本文所用，术语“杂交”通常是指核酸分子经由互补碱基链配对结合的能力。当在合适的条件和/或环境下接触核酸分子时，可发生此类杂交。如本文所用，如果两个分子能够形成反向平行双链核酸结构，则认为两个核酸分子能够彼此特异性杂交。如果两个核酸分子表现出完全互补性，则认为一个核酸分子为另一核酸分子的“互补物”。如本文所用，当分子中的一个的每个核苷酸与另一个分子的碱基配对配偶核苷酸互补时，则认为核酸分子表现出“完全互补性”。如果两个分子能够以足够的稳定性彼此杂交以允许它们在至少常规的“低严格”条件下保持彼此退火，则认为两个分子为“最小互补的”。在某些情况下，如果分子能够以足够的稳定性彼此杂交以允许它们在常规的“高严格”条件下保持彼此退火，则认为分子为“互补的”。与其他核酸分子杂交的核酸分子，例如，至少在低严格条件下与其他核酸分子杂交的核酸分子被认为是其他核酸分子的“可杂交同源物”。常规的严格条件通过以下描述：Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Handbook,Cold SpringHarbor Laboratory Press,(1989)和Haymes等人，In:Nucleic Acid Hybridization,APractical Approach,IRL Press,Washington,D.C.(1985)，其中的每一个通过引用整体并入本文，并且用于本文所论述的公开内容。因此，在一些实施方案中，完全互补性的偏离为允许的，只要此类偏离不完全排除分子形成双链结构的能力即可。因此，为了使本公开内容的核酸分子或其片段在一些实施方案中充当引物或探针，其仅需要在序列上足够互补以能够在所采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。在其他实施方案中，本文公开的核酸与其靶标完全互补。
如本文关于磁响应珠所用的术语“固定”意指珠基本上被约束在液滴中或液滴致动器上的填料流体中的适当位置。例如，在本文公开的一些实施方案中，固定的珠被充分约束在液滴中的适当位置以允许执行液滴分裂操作，产生具有基本上所有的珠的一个液滴和基本上没有珠的一个液滴。关于核酸分子，例如，引物或寡核苷酸，如本文所用，术语“固定”及其派生词是指核酸分子通过至少一种中间组分，例如生物素，直接附接到固体支持物上。如本文所用，术语“附接”和“附着”及其各自的派生词包括聚合物质或核酸分子与固体支持物的吸附，诸如物理吸附或化学吸附、配体/受体相互作用、共价键合、氢键合、或离子键合。
如本文所用，术语“磁响应”意指对磁场响应。“磁响应珠”包括磁响应材料或由磁响应材料组成。磁响应材料的实例包括顺磁材料、铁磁材料、亚铁磁材料和变磁材料(metamagnetic material)。合适的顺磁材料的实例包括铁、镍和钴，以及金属氧化物，诸如Fe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3和CoMnP。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指RNA分子和DNA分子二者，包括核酸分子，包含cDNA、基因组DNA、合成DNA和含有核酸类似物的DNA分子或RNA分子。核酸分子可具有任何三维结构。核酸分子可为双链或单链的(例如，有义链或反义链)。核酸分子的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、siRNA、微RNA、tracrRNA、crRNA、向导RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、核酸探针和核酸引物。核酸分子可含有非常规或修饰的核苷酸。如本文所用的术语“多核苷酸序列”和“核酸序列”可互换地指多核苷酸分子的序列。本文使用37CFR§1.822中所述的核苷酸碱基的命名法。
“贮存器”意指被配置用于保持、存储或供应液体的外壳或部分外壳。在一些实施方案中，本公开内容的液滴致动器系统可包括盒上贮存器(on-cartridge reservoir)和/或盒外贮存器(off-cartridge reservoir)。盒上贮存器可为(1)致动器上贮存器(on-actuator reservoir)，其为在液滴操作间隙中或在液滴操作表面上的贮存器；(2)致动器外贮存器(off-actuator reservoir)，其为液滴致动器盒上的贮存器，但是在液滴操作间隙之外，并且不与液滴操作表面接触；或(3)具有致动器上区域和致动器外区域的混合贮存器(hybrid reservoir)。致动器外贮存器的实例为顶部基底中的贮存器。致动器外贮存器通常与开口或流动路径流体连通，该开口或流动路径布置成用于使液体从致动器外贮存器流入液滴操作间隙中，诸如流入致动器上贮存器中。盒外贮存器可为完全不是液滴致动器盒的一部分的贮存器，但是其使液体流到液滴致动器盒的某些部分。例如，盒外贮存器可为系统或对接站(docking station)的一部分，在操作期间液滴致动器盒联接到该系统或对接站。类似地，盒外贮存器可为试剂贮存容器或用于迫使流体进入盒上贮存器中或进入液滴操作间隙中的注射器。在一些实施方案中，使用盒外贮存器的系统通常将包括流体通道工具，由此液体可从盒外贮存器转移进入盒上贮存器中或者进入液滴操作间隙中。
如本文所用，术语“核酸样品”是指核酸分子的集合。在一些实施方案中，核酸样品来自单一生物来源，例如，一个个体或一个组织样品，并且在其他实施方案中，核酸样品为汇集的样品，例如含有来自多于一种生物体、个体或组织的核酸。
术语核酸样品涵盖“核酸文库”，其如本文所用，包括通过本领域已知的任何方法制备的核酸文库。在一些实施方案中，提供核酸文库包括制备文库所需的步骤，例如，包括将一种或更多种核酸样品掺入基于载体的集合中的过程，诸如通过接合到载体中和转化宿主。在一些实施方案中，提供核酸文库包括将核酸样品掺入非基于载体的集合中的过程，诸如通过接合到衔接子。在一些实施方案中，衔接子可退火至PCR引物以促进通过PCR的扩增，或者可为通用引物区域，例如测序尾部衔接子。在一些实施方案中，衔接子可为通用测序衔接子。
如本文所用的术语“基本上”具有根据说明书阅读的普通含义，并且可意指例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
“运输到磁体的磁场中”、“向磁体运输”等，在本文用于指液滴和/或液滴内的磁响应珠，旨在是指运输到能够基本上吸引液滴中的磁响应珠的磁场区域中。类似地，“远离磁体或磁场运输”，“运输出磁体的磁场”等，在本文用于是指液滴和/或液滴内的磁响应珠，旨在是指远离能够基本上吸引液滴中的磁响应珠的磁场区域运输，无论液滴或磁响应珠是否完全从磁场中移除。应当理解，在本文所述的此类情况中的任何下，液滴可朝向或远离磁场的期望区域运输，和/或磁场的期望区域可朝向或远离液滴移动。对“在磁场内”或“在磁场中”的电极、液滴或磁响应珠等的提及旨在描述这样一种情况，其中电极以允许电极将液滴运输到磁场的期望区域中和/或远离磁场的期望区域运输的方式定位，或者液滴或磁响应珠位于磁场的期望区域中，在每种情况下，期望区域中的磁场能够基本上吸引液滴中的任何磁响应珠。类似地，对“在磁场之外”或“远离磁场”的电极、液滴或磁响应磁珠等的提及旨在描述这样一种情况，其中电极以允许电极将液滴远离磁场的某个区域运输的方式定位，或者液滴或磁响应珠远离磁场的某个区域定位，在每种情况下，此类区域中的磁场基本上不能吸引液滴中的任何磁响应珠，或者其中任何剩余的吸引力不能消除在该区域中进行的液滴操作的有效性。在本公开内容的各个方面，系统、液滴致动器、或系统的另一组件可包括磁体，诸如一个或更多个永磁体(例如，单个圆柱形或条形磁体或此类磁体的阵列，诸如Halbach阵列)或电磁体或电磁体阵列，以形成用于与磁响应珠或芯片上的其他组件相互作用的磁场。例如，此类相互作用可包括在储存期间或在液滴操作期间在液滴中基本上固定或约束磁响应珠的移动或流动，或者将磁响应珠拉出液滴。
如本文所用，术语“通用序列”是指两个或更多个核酸分子共有的序列区域，其中分子还具有彼此不同的序列区域。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可允许使用与通用序列互补的通用捕获核酸群体捕获多种不同的核酸。类似地，存在于分子集合的不同成员中的通用序列可允许使用与通用序列互补的通用引物群体复制或扩增多种不同的核酸。因此，通用捕获核酸或通用引物，诸如通用测序尾部衔接子，包括可与通用序列特异性杂交的序列。在本文公开的方法的一些实施方案中，可修饰靶核酸分子以在例如不同靶序列的一端或两端处，通过例如接合或通过使用引物定向扩增进行扩增，附接通用衔接子。
关于洗涤珠的“洗涤”意指从与珠接触的液滴减少与珠接触的或暴露于珠的一种或更多种物质的量和/或浓度。物质的量和/或浓度的降低可为部分的、基本上完全的或甚至完全的。该物质可为各种物质中的任何一种；实例包括用于进一步分析的目标物质和不需要的物质，诸如样品的组分、污染物和/或过量试剂。在一些实施方案中，洗涤操作开始于与磁响应珠接触的起始液滴，其中液滴包括初始量和初始浓度的物质。洗涤操作可使用各种液滴操作进行。洗涤操作可产生包括磁响应珠的液滴，其中液滴具有小于物质的初始量和初始浓度的物质的总量和总浓度。合适的洗涤技术的实例描述于Pamula等人，于2008年10月21日发布的题为“Droplet-Based Surface Modification and Washing”的美国专利第7,439,014号中，其全部公开内容通过引用并入本文。
在整个说明书中，参考液滴致动器的组件的相对位置，诸如液滴致动器的顶部基底和底部基底的相对位置，使用术语“顶部”、“底部”、“上方”，“下方”和“上”。应当理解，无论其在空间中的取向如何，液滴致动器都是起作用的。
当任何形式的液体(例如，液滴或连续体，无论是移动的还是静止的)被描述为在电极、阵列、矩阵或表面“上”、“处”或“上方”时，此类液体可与电极/阵列/矩阵/表面直接接触，或者可与介于液体和电极/阵列/矩阵/表面之间的一个或更多个层或膜接触。在一个实例中，填料流体可被认为是此类液体和电极/阵列/矩阵/表面之间的膜。
当液滴被描述为在液滴致动器“上”或“装载在”液滴致动器上时，应当理解，液滴以便于使用液滴致动器对液滴进行一个或更多个液滴操作的方式布置在液滴致动器上，液滴以便于感测液滴的特性或来自液滴的信号的方式布置在液滴致动器上，和/或液滴已经在液滴致动器上经受液滴操作。
在整个说明书中使用的术语“流体盒”、“数字流体盒”，“液滴致动器”和“液滴致动器盒”可为同义的。
如本领域普通技术人员将理解的，出于任何和所有目的，诸如就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可容易地被识别为充分描述并且使得相同的范围能够分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文论述的每个范围可容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所叙述的数量，并且是指随后可分解成如上所论述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1个至3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1个至5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
在本文描述的方法或过程的一些实施方案中，步骤可以任何顺序进行，除非明确地叙述时间或操作顺序。此外，在一些实施方案中，除非明确的权利要求语言叙述它们是分开执行的，否则可同时执行指定的步骤。例如，在一些实施方案中，要求保护的X步骤和要求保护的Y步骤可在单个操作中同时进行，并且所得到的过程将落入要求保护的过程的字面范围内。
如本文所用，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且为包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未叙述的要素或方法步骤。如本文所用，“由......组成”不包括在要求保护的组合物或方法中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由......组成”不排除实质上不影响所要求保护的组合物或方法的基本和新颖特征的材料或步骤。本文中对术语“包含”的任何提及，特别是在组合物的组分的描述中或在方法的步骤的描述中，应理解为涵盖那些基本上由所叙述组分或步骤组成并且由所叙述组分或步骤组成的组合物和方法。
标题，例如(a)、(b)，(i)等仅仅是为了便于阅读说明书和权利要求而呈现，并且不以任何方式限制本公开内容或其替代方案的范围。在说明书或权利要求中使用标题不要求步骤或要素按字母或数字顺序或它们的呈现顺序执行。
I.用于标准化核酸样品的方法
本公开内容的各种实施方案总体涉及用于构建核酸样品的系统和方法，包括构建扩增/标准化的核酸样品和用于下游分析应用的核酸文库。在一个方面，本文公开的方法的一些实施方案在核酸样品或核酸文库的标准化期间，采用固定在固相支持物上的至少一组第一扩增或标准化引物和在溶液相中的至少另一组第二扩增或标准化引物。如上所述，所公开方法的这种双相特征不同于当前的文库制备程序，在当前的文库制备程序中，两种引物都处于溶液相或者两种引物都附着在固相上。溶液相中的第一扩增或标准化引物提供快速动力学，而固定在固相支持物上的第二扩增或标准化引物提供使核酸样品标准化和易于纯化的能力。另外，在本文公开的方法的一些特定实施中，固定在固体支持物上的第一引物组以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，并且溶液中的第二引物组以超过第一引物的量的量提供。在一些实施方案中，引物配置可提供以下优点中的一个或更多个：(1)方便地洗去扩增后在溶液中发现的任何扩增产物，引起扩增/标准化量的扩增产物保持固定在随后可隔离的固体支持物上，使得可产生预定量的扩增产物；(2)构建多个核酸样品或核酸文库，其中不管原始样品中的输入DNA的量如何，DNA量跨核酸文库被标准化为基本相同的浓度。
在一个方面，本公开内容提供用于核酸扩增的方法，该方法包括提供包含靶核酸分子的核酸样品；使核酸样品与包含固相和液相的反应混合物接触，固相包括固定在固体支持物上的多个第一扩增引物，该第一扩增引物能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交，并且液相包括溶液中的多个第二扩增引物，该多个第二引物能够与靶核酸分子的第二序列特异性杂交；以及在等温条件下扩增靶核酸分子，使得基本上所有的第一扩增引物被掺入扩增产物中，其中多个第一引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，并且多个第二扩增引物以超过第一扩增引物的量的量提供。
图2示出根据本公开内容的一些实施方案的扩增和/或标准化核酸样品的方法的非限制性实例的流程图，其中核酸样品中的靶核酸分子的量在包括固相和液相的反应混合物中被扩增/标准化。取决于具体工作流程和下游应用，本公开内容的该示例性方法和其他示例性方法中使用的可延伸引物可为扩增引物或标准化引物。方法200可包括但不限于以下步骤。
在步骤210，提供包含靶核酸分子的输入核酸样品，例如基因组DNA样品。该步骤可以通过例如将核酸样品装载到液滴致动器的样品贮存器中来实现。在步骤230，使靶核酸分子与包含固相和液相的反应混合物接触。反应混合物的固相包括能够与靶核酸分子的第一序列特异性杂交的多个第一扩增或标准化引物(例如，包括P7引物序列的引物)，其中第一扩增或标准化引物被固定在固体支持物，例如捕获珠上。反应混合物的液相包括溶液中的多个第二扩增或标准化引物，该多个第二引物能够与靶核酸分子的第二序列(例如，包括P5引物序列的引物)特异性杂交。在步骤235，将与靶向核酸序列杂交的第一扩增或标准化引物延伸以形成固定的互补DNA链，并且在步骤245，在等温条件下扩增延伸的靶核酸分子，使得基本上所有的第一扩增或标准化引物中被掺入扩增产物中。在所公开方法的一些实施方案中，多个第一固定引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，并且多个第二扩增或标准化引物以超过第一扩增或标准化引物的量的量提供。在任选的步骤250，从捕获珠中洗脱扩增/标准化的核酸样品，用于下游分析应用，例如高通量测序。
图3以图形方式显示图2的方法200的步骤。即，输入核酸样品(未显示)包括靶核酸分子310。第一扩增或标准化引物(例如，反向引物)包括靶特异性区域340。第二扩增或标准化引物(例如，正向引物)包括靶特异性区域330。在一些实施方案中，靶特异性区域330和靶特异性区域340位于靶核酸分子310上的感兴趣区域的侧翼。在一些实施方案中，靶特异性区域可与靶核酸中的衔接子或通用引物序列具有序列互补性，该衔接子或通用引物序列可以序列特异性方式添加至靶核酸中。在一些实施方案中，如下文更详细公开的，靶核酸中的衔接子或通用引物序列可以序列非依赖性方式添加至靶核酸。然后使用正向引物和反向引物合成扩增子350。在反应中，将第一扩增或标准化引物(例如，反向引物)固定在固体支持物上。例如，反向扩增或标准化引物与生物素标记380缀合并且固定在链霉亲和素(SA)涂覆的捕获珠385上。
在根据本公开内容的该方面和其他方面的方法的一些实施方案中，在固定在固体支持物上之前，将多个第一扩增或标准化引物(例如，反向引物)与靶核酸分子杂交。在图4和图5中显示根据本公开内容的这些实施方案的方法的非限制性实例的流程图。在步骤425，第一扩增或标准化引物340与核酸样品的靶核酸分子310杂交以形成靶分子\标准化引物双链体。该杂交步骤在溶液相中进行。在步骤430，将捕获珠，例如，链霉亲和素涂覆的捕获珠添加至杂交反应中以用于捕获杂交的靶分子/引物双链体。杂交的分子/标准化引物双链体和未杂交的引物通过形成生物素-链霉亲和素结合复合物固定在捕获珠上。其余步骤435、步骤445和步骤450类似于图2和图3中描述的示例性方法的对应步骤235、步骤245和步骤250来执行。
根据本文公开的方法的一些实施方案，靶核酸的样品或文库可具有对于本文所述的方法或组合物的特定应用而言期望的或适合的平均链长度。例如，平均链长度可小于约100,000个核苷酸、50,000个核苷酸、10,000个核苷酸、5,000个核苷酸、1,000个核苷酸、500个核苷酸、100个核苷酸或50个核苷酸。可选地或另外地，平均链长度可大于约10个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、500个核苷酸、1,000个核苷酸、5,000个核苷酸、10,000个核苷酸、50,000个核苷酸或100,000个核苷酸。如本文所公开的靶核酸群体的平均链长度可在上述最大值和最小值之间的范围内。
固体支持物
在一些实施方案中，本文公开的方法的扩增和/或标准化反应混合物包括一种或更多种固体支持物。适用于本文公开的方法的固体支持物通常可具有任何方便的尺寸并且由任何数量的已知材料制成。优选地，本文公开的方法中使用的固体支持物可为提供已知结合能力的任何合适类型，引起每固定量的固体支持物基本上不波动的结合核酸量。此类材料的实例包括：无机物、天然聚合物和合成聚合物。这些材料的具体实例包括：纤维素、纤维素衍生物、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、明胶、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、与二乙烯基苯等交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、胶乳凝胶、硅、塑料、硝化纤维素、聚苯乙烯、葡聚糖、橡胶、天然海绵、硅胶、控制孔玻璃、金属、交联葡聚糖(例如，SephadexTM)琼脂糖凝胶(SepharoseTM)和本领域技术人员已知的其他固体支持物。
在一些实施方案中，固体支持物可包括合成聚合物支持物，诸如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯(例如，羧化或胺化的聚苯乙烯)、聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚氯乙烯等，或任何可用于核酸亲和层析的材料。
在本文公开的方法的一些实施方案中，固体支持物可包括珠。如本文关于液滴致动器上的珠所使用的术语“珠”意指能够与液滴致动器上或液滴致动器附近的液滴相互作用的任何珠或颗粒。珠可为各种形状中的任何一种，诸如球形、大致球形、蛋形、盘形、立方形、无定形和其他三维形状。例如，珠可以能够在液滴致动器上的液滴中经受液滴操作，或者以允许液滴致动器上的液滴与液滴致动器上和/或液滴致动器外的珠接触的方式相对于液滴致动器另外配置。珠可设置在液滴中、在液滴操作间隙中、或在液滴操作表面上。珠可设置在液滴操作间隙外部或位于与液滴操作表面分开的贮存器中，并且贮存器可与允许包括珠的液滴进入液滴操作间隙中或与液滴操作表面接触的流动路径相关联。珠可使用多种材料制造，包括例如树脂和聚合物。珠可为任何合适的尺寸，包括例如微珠、微米颗粒、纳米珠和纳米颗粒。在某些情况下，珠为磁响应的；在其他情况下，珠没有显著的磁响应。对于磁响应珠，磁响应材料可基本上构成珠的全部、珠的一部分或珠的仅一种组分。其余的珠可包括，除了其他以外，聚合物材料、涂层和允许附接测定试剂的部分。合适的珠的实例包括流式细胞术微珠、聚苯乙烯微米颗粒和纳米颗粒、功能化聚苯乙烯微米颗粒和纳米颗粒、涂覆的聚苯乙烯微米颗粒和纳米颗粒、二氧化硅微珠、荧光微米球和纳米球、功能化荧光微米球和纳米球、涂覆的荧光微米球和纳米球、着色微米颗粒和纳米颗粒、磁微米颗粒和纳米颗粒、超顺磁微米颗粒和纳米颗粒(例如，颗粒，可从Invitrogen Group,Carlsbad,CA获得)、荧光微米颗粒和纳米颗粒、涂覆的磁微米颗粒和纳米颗粒、铁磁微米颗粒和纳米颗粒、涂覆的铁磁微米颗粒和纳米颗粒，以及描述于以下中的那些：Watkins等人，于2005年11月24日公布的题为“Multiplex Flow Assays Preferably with MagneticParticles as Solid Phase”的美国专利公布第20050260686号；Chandler，于2003年7月17日公布的题为“Encapsulation of Discrete Quanta of Fluorescent Particles”的美国专利公布第20030132538号；Chandler等人，于2005年6月2日公布的题为“MultiplexedAnalysis of Clinical Specimens Apparatus and Method”的美国专利公布第20050118574号；Chandler等人，于2005年12月15日公布的题为“Microparticles withMultiple Fluorescent Signals and Methods of Using Same”的美国专利公布第20050277197号；和Chandler等人，于2006年7月20日公布的题为“Magnetic Microspheresfor use in Fluorescence-based Applications”的美国专利公布第20060159962号，所述专利的全部公开内容通过引用并入本文，用于其关于珠和磁响应材料和珠的教导。珠可与生物分子或能够结合并与生物分子形成复合物的其他物质预偶联。珠可与抗体、蛋白质或抗原、DNA/RNA探针或对所需靶标具有亲和力的任何其他分子预偶联。用于固定磁响应珠和/或非磁响应珠和/或使用珠进行液滴操作方案的液滴致动器技术的实例描述于以下：Pollack等人，于2008年3月6日公布的题为“Droplet-Based Particle Sorting”的美国专利公布第20080053205号；于2008年3月25日提交的题为“Multiplexing Bead Detectionin a Single Droplet”的美国专利申请第61/039,183号；Pamula等人，于2008年4月25日提交的题为“Droplet Actuator Devices and Droplet Operations Using Beads”的美国专利申请第61/047,789号；于2008年8月5日提交的题为“Droplet Actuator Devices andMethods for Manipulating Beads”的美国专利申请第61/086,183号；Eckhardt等人，于2008年8月14日公布的题为“Droplet Actuator Devices and Methods EmployingMagnetic Beads”的国际专利公布第WO/2008/098236号；Grichko等人，于2008年11月6日公布的题为“Bead-based Multiplexed Analytical Methods and Instrumentation”的国际专利公布第WO/2008/134153号；Eckhardt等人，于2008年9月25日公布的题为“BeadSorting on a Droplet Actuator”的国际专利公布第WO/2008/116221号；和Eckhardt等人，于2007年10月25日公布的题为“Droplet-based Biochemistry”的国际专利公布第WO/2007/120241号，所述专利的全部公开内容通过引用并入本文。珠特性可用于本公开内容的多路方面。具有适用于多路的特性的珠的实例，以及检测和分析从此类珠发射的信号的方法可见于以下：Whitman等人，于2008年12月11日公布的题为“Systems and Methods forMultiplex Analysis of PCR in Real Time”的美国专利公布第20080305481号；Roth，于2008年6月26日公布的题为“Methods and Systems for Dynamic Range Expansion”的美国专利公布第20080151240号；Sorensen等人，于2007年9月6日公布的题为“Methods,Products,and Kits for Identifying an Analyte in a Sample”的美国专利公布第20070207513号；Roth，于2007年3月22日公布的题为“Methods and Systems for ImageData Processing”的美国专利公布第20070064990号；Chandler等人，于2006年7月20日公布的题为“Magnetic Microspheres for use in Fluorescence-based Applications”的美国专利公布第20060159962号；Chandler等人，于2005年12月15日公布的题为“Microparticles with Multiple Fluorescent Signals and Methods of Using Same”的美国专利公布第20050277197号；和Chandler等人，于2005年6月2日公布的题为“Multiplexed Analysis of Clinical Specimens Apparatus and Method”的美国专利公布第20050118574号，所述专利的全部公开内容通过引用并入本文。
因此，在一些优选的实施方案中，适用于本文公开的方法的珠可具有任何方便的尺寸并且由任何数量的已知材料制成。在一些实施方案中，珠可为例如磁珠、顺磁珠、塑料珠、聚苯乙烯珠、玻璃珠、琼脂糖珠及其组合。在一些实施方案中，珠为大约直径2μm至100μm，或直径10μm至80μm，或直径20μm至40μm的珠。在一些实施方案中，珠可在溶液中提供。在一些实施方案中，珠可固定在固体支持物上。在一些实施方案中，珠可在溶液中提供，且可以被固定的状态提供在固体支持物上。
在一些优选的实施方案中，固体支持物可包括链霉亲和素。在一些实施方案中，固体支持物为或可包括链霉亲和素涂覆的珠。在一些实施方案中，固体支持物为或可包括链霉亲和素涂覆的磁珠。在固相支持物包括链霉亲和素的一些实施方案中，核酸分子可被生物素化以促进核酸与固体支持物的结合。
在本文公开的方法的一些实施方案中，固相支持物包括反应位点的表面。例如，可处理玻璃侧以使核酸结合在固体支持物上的特定位置处，例如，作为高密度阵列。在一些实施方案中，反应位点可包括孔、凹槽、流通池、反应室或通道的内表面的底部部分。在一些实施方案中，该位点可包括反应室或孔。在一些实施方案中，反应位点可为相似或相同位点的阵列的一部分。例如，固体支持物可为微量滴定板上孔的底部和/或侧面。
在本文公开的方法的一些实施方案中，珠或反应位点在水相中，例如在水性反应缓冲液中。在一些实施方案中，珠或反应位点处于连续水相中。在一些实施方案中，在不将珠或反应位点彼此密封的情况下执行扩增。例如，珠或反应位点可在扩增期间保持彼此流体连通。因此，在本文公开的方法的一些实施方案中，珠或反应位点在扩增期间彼此流体连通。在其他实施方案中，固体支持物或珠可位于彼此分离且不流体连通的离散位置，例如，微量滴定板的孔，或位于微量滴定板的孔中的珠。
在一些实施方案中，本文公开的方法的扩增或标准化反应混合物包括一个或更多个其上附着有扩增或标准化引物的固体支持物。扩增或标准化引物可通过本领域技术人员熟知的方法附接到固体支持物。支持物中的至少一个可包括第一引物的一个或更多个实体(instance)，该第一引物包括第一引物序列。在一些实施方案中，反应混合物中的至少一种多核苷酸模板(例如，核酸样品或核酸文库的成员)包括第一引物结合序列。第一引物结合序列可与第一引物序列完全或基本相同，或者完全或基本互补。在一些实施方案中，至少一个、一些或所有的固体支持物包括多个第一引物，该多个第一引物彼此相同。在一些实施方案中，固体支持物上的所有引物彼此相同，或者全部包括相同的第一引物序列。在一个优选的实施方案中，固体支持物为多个珠，其中多个珠中的每个珠具有附接的多个相同的引物。
在本公开内容的各种实施方案中，在溶液相中提供第二扩增或标准化引物，其可任选地暴露于固定的第一扩增或标准化引物。在一些实施方案中，溶液相中的第二扩增或标准化引物的量大于固定在固相支持物上的第一扩增或标准化引物的量。通过在溶液中提供过量的第二引物，固定在固体支持物上的第一引物的量将决定在固体支持物上生成的扩增产物的量。因此，扩增产生每固定量的固相支持物的基本恒定量的扩增产物。在一些实施方案中，多个第二扩增或标准化引物以在第一扩增或标准化引物的量的数量级内的量提供。在一些实施方案中，多个第二扩增或标准化引物以超过第一扩增或标准化引物的量至少或至少约100％的量提供。在其他实施方案中，第二引物的量超过第一引物的量至少或至少约150％、至少或至少约200％、至少或至少约300％、至少或至少约400％或者至少或至少约1000％、或前述值中的任何两个的范围，例如从约100％至约1000％。
输出扩增/标准化的样品和文库
在一些实施方案中，从每个核酸样品获得的扩增产物的量可在汇集的核酸文库中基本上相同地表示。在一些其他实施方案中，通过从不同的预定量的固体支持物获得扩增产物或者通过汇集不同量的扩增产物，从输入核酸样品获得的扩增产物的量可以不同的预定浓度存在于汇集的文库中。
因此，在一些实施方案中，本文公开的方法允许产生具有标准化量的核酸文库，并且该量跨多个核酸样品和/或文库基本相同。在一些实施方案中，标准化核酸文库中的核酸量变化小于10％、5％、3％、2％或1％。在一些实施方案中，本文公开的方法允许产生汇集的核酸文库，其中不管输入DNA样品的量如何，所得汇集的核酸文库中组成核酸的量为基本上相似的量。在一些实施方案中，汇集的核酸文库中组成核酸的量变化小于10％、5％、3％、2％或1％。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生的核酸文库或汇集的文库可适用于下游分析应用，包括利用诸如下一代测序(NGS)的技术和诸如测序基因分型(GBS)的相关方法的测序应用。
在一些实施方案中，本文公开的核酸扩增方法可为自动化的和/或可以多重格式执行，例如该方法可通过液滴致动器或液体处理机器人执行。
在公开的方法和系统的一些实施方案中，如本文所述的珠可为单克隆的，也就是说，它们可包括彼此相同的扩增或标准化引物的单个群体。
在一些实施方案中，珠可为多克隆的，也就是说，它们可包括多个单克隆珠的汇集物，其中汇集的单克隆珠包括扩增或标准化引物，该扩增或标准化引物包含多于一个与靶核酸的同源区域具有序列相似性的捕获部分。在一些实施方案中，珠可包括单独的多克隆珠，也就是说，它们可包括每个珠包含多于一个捕获部分的扩增或标准化引物。
在一些实施方案中，至少一个固体支持物包括附着于其上的两种或更多种不同的引物。在一些实施方案中，该至少一个支持物可包括具有不同核酸序列的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同的扩增或标准化引物。在一些实施方案中，固体支持物具有多个离散位置，每个位置具有多个具有相同序列的引物。在一些实施方案中，多个位置中的每个位置处的序列为相同的，在其他实施方案中，多个位置中的一个或更多个位置处的序列不同于一个或更多个其他位置处的序列。
在一些实施方案中，本文公开的核酸扩增方法还包括将扩增产物与固体支持物分离的步骤。通常，可使用用于从固体支持物中去除核酸的任何合适方法。在一些实施方案中，通过洗脱将扩增产物与固体支持物分离。在一些实施方案中，扩增产物在加热的缓冲液中洗脱。在链霉亲和素被包括在固相支持物中并且核酸被生物素化以促进核酸与固相支持物的结合的一些实施方案中，核酸扩增产物可经由通过热亲和素-生物素切割与固相支持物分离。
输入核酸样品
在本文公开的方法和系统的一些实施方案中，输入核酸样品包括单链核酸分子。在一些实施方案中，输入核酸样品中的至少一种靶核酸分子为双链的，或者在扩增之前使用适当的程序使其至少部分地成为双链。在一些实施方案中，输入核酸样品包括单链核酸分子和双链核酸分子的混合物。在一些实施方案中，靶核酸分子可为线性的。可选地，靶核酸分子可为环状的，或者包括线性和环状区域的组合。
在一些实施方案中，双链靶核酸分子可包括正向链。在一些实施方案中，双链靶核酸分子可还包括反向链。在所公开方法的一些实施方案中，正向链可包括第一引物结合位点。在所公开方法的一些实施方案中，反向链可包括第二引物结合位点。
在本公开内容的各种实施方案中，输入核酸的量可为从约0.01ng至100ng。在一些实施方案中，输入核酸的量为约0.1ng、0.2ng、0.3ng、0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1ng、1.1ng、1.2ng、1.3ng、1.5ng、2.0ng、2.5ng、3.0ng、3.5ng、4.0ng、4.5ng、5.0ng或在由上述值中的任何两个限定的范围内。在一些实施方案中，输入核酸的量为约5.5ng、6.0ng、6.5ng、7.0ng、7.5ng、8.0ng、8.5ng、9.0ng、9.5ng、10.0ng、11.0ng、11.5ng、12.0ng、12.5ng、13.0ng、13.5ng、14.0ng、15.0ng、15.5ng、16.0ng、16.5ng、17.0ng、18.0ng、18.5ng、19.0ng、19.5ng、20.0ng或在由上述值中的任何两个限定的范围内。在一些实施方案中，输入核酸的量为约21.0ng、22.0ng、22.5ng、23.0ng、23.5ng、24.0ng、24.5ng、25.0ng、26.0ng、27.0ng、28.0ng、29.0ng、30.0ng、32.5ng、35.0ng、37.5ng、40.0ng、42.5ng、45.0ng、47.5ng、50.0ng、52.5ng、55.0ng、60.0ng、65.0ng、70.0ng、75.0ng、80.0ng、85.0ng、90.0ng或在由上述值中的任何两个限定的范围内。在一些实施方案中，输入核酸的量为约0.08ng、0.4ng、2.0ng、10.0ng或50.0ng。
在本文公开的方法的一些实施方案中，在扩增步骤之前，靶核酸分子已经包括第一引物结合位点和/或第二引物结合位点。可选地，靶核酸分子最初不包括引物结合位点，并且所公开的方法任选地包括在扩增之前将引物结合位点附接或引入到靶核酸分子。例如，在一些实施方案中，所公开的方法可任选地包括将含有引物结合位点的衔接子接合或以其他方式引入(例如，通过引物定向扩增，包括PCR)靶核酸分子或进入靶核酸分子中。衔接子可接合或以其他方式引入线性靶核酸分子的末端，或者在线性或环状核酸分子的体内。在一些实施方案中，靶核酸分子可在接合或引入衔接子后被环化。在一些实施方案中，第一衔接子可在线性靶核酸分子的第一末端处接合或引入，并且第二衔接子可在靶核酸分子的第二末端处接合或引入。
在一些实施方案中，第一扩增或标准化引物和第二扩增或标准化引物与靶核酸分子内的具有已知核苷酸序列的结合位点互补。在一些实施方案中，具有已知核苷酸序列的引物结合位点对应于靶核酸分子的第一末端和第二末端。
在本文公开的核酸扩增方法的一些实施方案中，靶核酸分子的第一末端和第二末端包括通用引物区域，例如通用测序尾部衔接子，其已添加至靶核酸分子。
在一些实施方案中，第一扩增或标准化引物和/或第二扩增或标准化引物中的至少一个还包括索引部分。索引部分可用于鉴定靶核酸的来源，例如个体或生物样品，使得如果汇集扩增产物，则可稍后确定靶核酸的来源。可选地，可在标准化步骤之前，例如，当将衔接子或通用引物序列添加至靶核酸时，将索引部分添加至靶核酸。
在一些实施方案中，第一扩增或标准化引物的至少一部分除了靶核酸分子的已知序列之外，还包括与靶核酸分子的同源区域具有序列互补性的捕获部分。例如，如果将衔接子和/或通用引物添加至输入样品的核酸分子中，则衔接子和/或通用引物可构成“已知序列”，而“捕获部分”与文库中核酸的天然序列互补。以这种方式，即使衔接子和/或通用引物存在于文库的大多数或所有核酸上，将仅扩增具有捕获序列的文库的那些部分。在优选的实施方案中，捕获部分的使用允许选择性扩增核酸样品，例如核酸文库中的核酸。使用捕获探针的实施方案在图6至图9中示出，下面更详细地描述。
在一些实施方案中，通过使捕获寡核苷酸与固定在固体支持物上的第一扩增或标准化引物杂交并且延伸固定的扩增或标准化引物以产生与捕获寡核苷酸具有序列互补性的延伸扩增或标准化引物来产生捕获部分。
申请人已经证明，通过使用多个固相支持物，本文公开的方法可有利地应用于单个核酸样品或多个核酸样品。因此，在本文公开的方法的一些实施方案中，扩增步骤对多个核酸文库执行。在一些实施方案中，将来自多个核酸文库的扩增产物合并以形成合并的汇集核酸文库。在一些实施方案中，衍生自多个核酸文库的扩增产物在从固相支持物中去除之后合并。在一些实施方案中，来自多个核酸文库的扩增产物在从固相支持物中去除之前合并。在一些实施方案中，在扩增步骤之前合并多个输入核酸样品。在一些实施方案中，每个输入核酸样品的量未跨多个核酸样品标准化。
在一些实施方案中，该多个输入核酸样品包含至少2、4、8、12、24、48、96、200、384、400、500、100、1500或由上述数字中的任何两个限定的范围内的数目的输入核酸样品。
在一些实施方案中，可在汇集的核酸文库中有利地调节每种组成扩增产物群体的相对表示。如本文所用，“有利地调节”意指可控制或预定汇集的核酸文库中每种组成扩增产物的量。在一些优选的实施方案中，每种组成扩增产物的量在汇集的核酸文库中基本上均匀地表示。可选地，多种组成扩增产物可以不同的预定浓度存在于汇集的核酸文库中。这可通过将不同量的固相支持物与保持附着在其上的扩增产物组装或者通过在从固相支持物中回收后汇集不同量的多种组成扩增产物来实现。换句话说，有利的调节可包括选择性地调节汇集的核酸文库中的组成扩增产物的比例表示和群体数量二者。在又一些进一步的实施方案中，有利的调节可包括除了从固相支持物中回收扩增产物之外，还对组成扩增产物的样品进行至少一个加工步骤。
标准化步骤
在本文公开的方法的一些实施方案中，在基本等温条件下执行核酸扩增。用于扩增的最佳温度变化并且可例如取决于引物特性，诸如序列长度、如本文其他地方所述的解链温度以及聚合酶的选择。在本公开内容的一些实施方案中，扩增温度低于60摄氏度、低于50摄氏度、低于45摄氏度，或低于42摄氏度、38摄氏度、35摄氏度、30摄氏度、25摄氏度或20摄氏度。在一些优选的实施方案中，扩增温度为38摄氏度。
在一个方面，本公开内容的方法包括等温扩增，其可通过使用例如动力学排除扩增(KEA)，也称为排除扩增(Ex-Amp)来执行。在一些实施方案中，本公开内容的方法使用ExAmp标准化反应来使样品量相等并且调节扩增子DNA的浓度以用于后续测序应用。在一些实施方案中，ExAmp文库标准化反应为等温扩增反应，其使用被固定在捕获珠上的第一标准化引物序列(例如，P7引物序列)和溶液中的第二标准化引物序列(例如，P5引物序列)作为用于文库标准化的标准化引物。文库标准化可在大范围的PCR产物(扩增子)输入上(例如，在输入的至少两个数量级的变化上)执行。可选择反应条件(例如，孵育时间、P7和/或P5引物浓度和反应组分)，使得捕获珠上的所有可用引物被延伸到扩增子中，例如，运行反应达到饱和。
因此，本公开内容的扩增/标准化核酸文库可使用一种方法构建，该方法包括使扩增试剂反应以产生多个扩增位点的步骤，每个扩增位点包括来自已经接种该位点的单个靶核酸的基本克隆的扩增子群体。在一些实施方案中，扩增反应继续进行直至产生足够数量的扩增子以填充各自扩增位点的容量。以这种方式将已经接种的位点填充至满负载抑制靶核酸在该位点着陆和扩增，从而在该位点产生克隆的扩增子群体。在一些实施方案中，即使在第二靶核酸到达该位点之前扩增位点未被填充至满负载，也可实现表观的克隆性。在某些条件下，第一靶核酸的扩增可继续进行到制造足够数量的拷贝以有效地超过或压倒从运输到该位点的第二靶核酸产生拷贝的程度。例如，在对直径小于500nm的环状特征(例如珠)使用桥式扩增过程的实施方案中，已经确定在14个循环的第一靶核酸的指数扩增之后，在相同位点处来自第二靶核酸的污染将生成不足以不利地影响Illumina测序平台上的合成测序分析的数量的污染扩增自。
在一些实施方案中，当过程以足够快的速率发生以有效地排除另一事件或过程发生时，可发生动力学排除。以具有通用引物的珠溶液为例，其中珠随机接种有在溶液中的靶核酸，并且在扩增过程中产生靶核酸的拷贝以使每一个珠填充至满负载。根据本公开内容的动力学排除方法，接种和扩增过程可在扩增速率超过接种速率的条件下同时进行。由此，对已经由第一靶核酸接种的特定珠进行拷贝的相对快速的速率将有效地排除第二核酸接种该用于扩增的特定珠。动力学排除扩增方法可如美国申请公布第2013/0338042号的公开内容中详细描述的那样执行，其全部内容通过引用并入本文。
动力学排除可利用用于启动扩增的相对较慢的速率(例如，制备靶核酸的第一拷贝的慢速率)与用于制备靶核酸的后续拷贝(或靶核酸的第一拷贝)的相对较快的速率。在上一段的实例中，由于靶核酸接种的速率相对较慢(例如，相对较慢的扩散或运输)与用核酸种子的拷贝填充该位点(例如，珠或固体基底上的其他位点(例如，反应位点或孔))而发生的扩增速率相对较快，所以发生动力学排除。在另一个示例性实施方案中，由于接种位点的靶核酸的第一拷贝的形成延迟(例如，延迟或缓慢活化)，与制备后续拷贝填充该位点的相对较快的速率，所以可发生动力学排除。在该实施方案中，单个位点可能已经接种几种不同的靶核酸(例如，在扩增之前，每个位点可存在几种靶核酸)。然而，用于任何给定靶核酸的第一拷贝形成可随机激活，使得第一拷贝形成的平均速率与产生后续拷贝的速率相比相对较慢。在这种情况下，尽管单个位点(例如，珠)可能已经接种几种不同的靶核酸，但是动力学排除将仅允许扩增那些靶核酸中的一种。更具体地，一旦第一靶核酸被激活用于扩增，则该位点将迅速用其拷贝填充至满负载，从而防止在该位点制备第二靶核酸的拷贝。
扩增试剂可包括促进扩增子形成并且在一些情况下增加扩增子形成的速率的其他组分。一个实例为重组酶。重组酶可通过允许重复的侵入/延伸来促进扩增子形成。更具体地，重组酶可促进聚合酶对靶核酸的侵入以及聚合酶对引物的延伸，使用靶核酸作为用于扩增子形成的模板。该过程可作为链式反应重复，其中从每轮侵入/延伸生成的扩增子充当下一轮中的模板。该过程可比标准PCR更快地发生，因为不要求变性循环(例如，通过加热或化学变性)。由此，重组酶促进的扩增可以等温进行。通常希望在重组酶促进的扩增试剂中包括ATP或其他核苷酸(或在某些情况下，其不可水解的类似物)以促进扩增。重组酶和单链结合(SSB)蛋白的混合物特别有用，因为SSB可以进一步促进扩增。用于重组酶促进的扩增的示例性制剂包括由TwistDx(Cambridge,UK)作为TwistAmp试剂盒商业销售的那些制剂。重组酶促进的扩增试剂的有用组分和反应条件阐述于US 5,223,414和US 7,399,590中，其中的每一个通过引用并入本文。
可被包括在扩增试剂中以促进扩增子形成并且在一些情况下增加扩增子形成速率的组分的另一个实例为解旋酶。通过允许扩增子形成的链式反应，解旋酶可促进扩增子形成。该过程可比标准PCR更快地发生，因为不要求变性循环(例如，通过加热或化学变性)。因此，解旋酶促进的扩增可等温进行。解旋酶和单链结合(SSB)蛋白的混合物特别有用，因为SSB可进一步促进扩增。用于解旋酶促进的扩增的实例性制剂包括来自Biohelix(Beverly，MA)作为IsoAmp试剂盒商业销售的那些制剂。此外，包括解旋酶蛋白的有用制剂的实例描述于US 7,399,590和US 7,829,284中，其中的每一个通过引用并入本文。
在本文公开的方法的一些实施方案中，本文公开的方法中使用的扩增试剂可还包括一种或更多种起源结合蛋白。不受任何特定理论的束缚，在扩增反应中包含起源结合蛋白促进扩增子形成，并且在一些情况下增加扩增子形成的速率。
在本文公开的方法的一些实施方案中，本文公开的方法中使用的扩增试剂可还包括一种或更多种聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶可为链置换聚合酶，诸如Bst聚合酶、polD聚合酶、9°N聚合酶或phi29聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶为热稳定聚合酶。在一些实施方案中，模板为RNA并且聚合酶可为逆转录酶。
样品表示(representation)(或特异性)的维持对于许多文库制备方法至关重要，因为在若干下游分析应用，诸如下一代测序中使用的文库应满足若干要求。例如，对于许多cDNA文库应用(例如，搜索差异表达的基因)，必须最小化文库中cDNA表达相对于初始mRNA的失真。换句话说，在一些下游应用中，文库中单个cDNA的含量必须与初始RNA的拷贝数成比例。相反，对于一些其他应用，文库中不同的个体cDNA的浓度必须相等。申请人已经证明，通过使用本文所述的方法，可以忠实地保持输入DNA文库的复杂性，包括DNA物质与物质的比率，以及可能的微小等位基因频率调用，其中除了文库被扩增和标准化的量之外没有观察到任何差异。例如，参见下面的实施例13和实施例14。
II.用于多重制备靶向扩增子文库的方法
用于靶向基因扩增和构建用于测序的基因组扩增子文库的工作台上方案可被调整并描述为离散的逐步的基于液滴的方案。在液滴致动器的充油液滴操作间隙内的水性液滴中执行方案步骤。在电极布置(例如，图1的电极布置100)上将样品和测定试剂操纵为离散的液滴。可使用液滴致动器上的液滴操作，根据适当的测定方案分配和/或合并用于进行各种方案步骤的样品液滴和试剂液滴。还可在液滴致动器上执行测定液滴的孵育和洗涤，包括根据需要进行温度调节。
在一些实施方案中，某些方案步骤可在液滴致动器外部进行，并且某些方案步骤可在液滴致动器上进行。例如，在一些实施方案中，可在液滴致动器外部制备样品和试剂并且在液滴致动器上进行合并和孵育。在装载到液滴致动器上之前，还可使用工作台上方案制备试剂制品(例如，缓冲液、PCR主混合溶液和标准化溶液)。在另一个实施方案中，可在与液滴致动器相关联的储存器中制备试剂和/或样品，然后流到不同的操作间隙，和/或在液滴操作间隙中制备。
图6示出根据本公开内容的一些实施方案的方法600的非限制性实例的流程图，该方法600在例如液滴致动器上制备靶向扩增子文库，用于下游分析应用，例如测序。方法600可包括但不限于以下步骤。
在步骤610，提供核酸样品，例如基因组DNA样品(例如，从约1ng至约10ng)，例如通过装载到液滴致动器的样品贮存器中。在一些实施方案中，在液滴致动器上执行的基于珠的方案用于在后续样品处理步骤之前浓缩和纯化基因组DNA样品。在一个实例中，基于珠的方案使用磁响应SPRI珠(例如，固相可逆固定珠、可从Beckman Coulter获得的AgencourtAMPureXP)来浓缩和纯化基因组DNA样品。例如，将基因组DNA固定在磁响应珠(例如SPRI珠)上，并且在后续处理步骤之前使用磁体和一系列洗涤液浓缩和纯化DNA。
在步骤615，使用在感兴趣区域侧翼的靶特异性引物对在多重PCR扩增反应中扩增靶核酸序列。靶特异性引物对包括，例如，(1)包含靶特异性区域和任选地合成测序(SBS)引物序列的正向引物，和(2)包含靶特异性序列和任选地通用序列的反向引物。每个引物对中的正向引物和反向引物位于靶核酸分子中的感兴趣区域的侧翼。通常，可使用任何数量的引物对。在一些实例中，200个引物对以多重扩增格式(例如，200重)使用以靶向200个感兴趣的DNA序列。PCR循环的数量通常可为任何数量的循环，并且可为，例如，从2个至约100个循环、约5个至约60个、约10个至约40个、约15个至约30个PCR循环。在本文公开的方法的一些实例中，PCR循环的数量可为从4个至约10个循环、约6个至约20个、约8个至约15个、约10个至约30个PCR循环。在一些实施方案中，从4个至6个PCR循环可用于扩增靶向DNA序列。
在步骤620，使用通用引物对执行第二扩增反应。通用引物对包括正向引物和任选地反向引物。在一些实施方案中，正向引物包括SBS互补序列，任选地独特的索引序列和引物序列，例如P5引物序列。反向引物包括互补的通用引物序列。PCR循环的数量通常可为任何数量的循环，并且可为，例如，从4个至约10个循环、约6个至约20个、约8个至约15个、约10个至约30个PCR循环。在一个实例中，在第二扩增反应中使用14个PCR循环。
在步骤625，扩增子在基于溶液的杂交反应中与捕获探针杂交。捕获探针包括，例如，靶特异性捕获序列、引物序列(例如，P7引物序列)和生物素标记。靶特异性捕获序列与核酸样品中感兴趣的靶向区域中的序列具有序列互补性。在一个实例中，在杂交反应中使用具有不同捕获序列的200个捕获探针以靶向200个DNA序列。
在步骤630，将捕获珠，例如，磁响应链霉亲和素涂覆的捕获珠(SA捕获珠)添加至杂交反应中，以用于捕获杂交的扩增子\捕获探针双链体。通过形成生物素-链霉亲和素结合复合物，将杂交的扩增子\捕获探针双链体和未杂交的捕获探针固定在SA捕获珠上。
在步骤635，延伸与靶向DNA序列杂交的捕获探针的靶特异性捕获序列，以形成固定的互补DNA链。
在步骤640，将一定量的捕获探针，例如P7-生物素引物捕获到其上具有延伸的扩增子/捕获探针双链体的SA捕获珠上。P7-生物素引物包括P7引物序列和生物素标记。在该实例中，通过形成生物素-链霉亲和素结合复合物将P7-生物素引物固定在SA捕获珠上。其上具有延伸的扩增子/捕获探针双链体的SA捕获珠现在包括一定量的固定的P7-生物素引物。如下所述，在后续排除扩增反应中使用P7-生物素引物，用于在步骤645进行文库标准化。
在步骤645，使用排除扩增(ExAmp)反应对核酸样品进行标准化。执行样品(ExAmp)标准化以使样品量相等并且调节DNA浓度用于后续测序。在一些实施方案中，在致动器上制备用于文库标准化的ExAmp反应溶液的制品。在一些实施方案中，用于文库标准化的ExAmp反应溶液在工作台上制备并且随后装载到液滴致动器的试剂分配贮存器中。ExAmp反应溶液包括反应试剂和标准化引物(例如，P5引物序列)。ExAmp文库标准化反应为等温扩增反应，其使用固定在SA珠上的第一组标准化引物(例如，P7-生物素引物)和溶液中的第二组标准化引物(例如，P5引物)作为用于文库标准化的标准化引物。可选择反应条件(例如，孵育时间、P7和/或P5引物浓度和反应组分)，使得SA珠上的所有P7-引物位点被转化，例如，反应运行达到饱和。
在步骤650，从捕获珠上洗脱文库扩增子用于测序。在一个实例中，如图7B所示，扩增子390从SA珠385洗脱并且通过在95℃加热4分钟而变性。
图7A和图7B以图形方式显示图6的方法600的步骤。即，基因组DNA样品(未显示)包括靶核酸分子310。靶核酸分子310包括捕获区域315。在步骤615，靶核酸分子310在第一富集扩增反应中扩增，该第一富集扩增反应任选地使用靶特异性引物对以多重格式进行。靶特异性引物对包括例如靶特异性正向引物320和靶特异性反向引物325。正向引物320包括靶特异性区域330和任选地通用序列。在一些实施方案中，通用序列包括SBS引物序列335(例如，SBS3)。反向引物325包括靶特异性区域340和任选地通用引物区域345。靶特异性区域330和靶特异性区域340位于靶核酸分子310中的感兴趣区域的侧翼。通常，可使用任何数量的靶特异性引物对。在一些实例中，200个靶特异性引物对可以多重扩增格式(例如，200重)使用以靶向200个感兴趣的DNA序列。PCR循环的数量通常可为任何数量的循环，并且可为，例如，从2个至约100个循环、约5个至约60个、约10个至约40个、约15个至约30个PCR循环。在本文公开的方法的一些实例中，PCR循环的数量可为从4个至约10个循环、约6个至约20个、约8个至约15个、约10个至约30个PCR循环。在一些实施方案中，从4个至6个PCR循环可用于扩增靶向DNA序列。在一些实施方案中，4个PCR循环可用于扩增靶向DNA序列。使用正向引物320和反向引物325合成的扩增子350现在包括SBS引物区域335和通用引物区域345。
在步骤620，使用通用引物对执行任选的第二富集扩增反应(例如，14个PCR循环)。通用引物对包括例如通用正向引物355和通用反向引物345a。在一些实施方案中，在步骤615，通用正向引物355包括与靶特异性正向引物320的通用序列具有序列互补性的区域。在一些实施方案中，通用正向引物355包括与SBS引物区域335互补的SBS互补区域335a。在一些实施方案中，通用正向引物355包括索引区域360和任选地引物区域，例如P5引物区域365。通用反向引物345a包括与上述步骤615中描述的靶特异性反向引物325的通用引物区域345具有序列互补性的序列。通常，可使用任何数量的通用引物对。PCR循环的数量通常可为任何数量的循环，并且可为，例如，从2个至约100个循环、约5个至约60个、约10个至约40个、约15个至约30个PCR循环。在本文公开的方法的一些实例中，PCR循环的数量可为从4个至约10个循环、约6个至约20个、约8个至约15个、约10个至约30个PCR循环。在一些实施方案中，从10个至20个PCR循环可用于扩增靶向DNA序列。在一些实施方案中，14个PCR循环可用于扩增靶向DNA序列。扩增子350现在包括P5引物区域365、索引区域360、SBS引物区域335和通用引物区域345。
在步骤625，扩增子350在基于溶液的杂交反应中与捕获探针370杂交。在一些实施方案中，捕获探针370包括与扩增子350中的捕获区域315互补的捕获互补区域315a。在一些实施方案中，捕获探针370还包括引物区域，例如P7引物区域375，和任选地标记试剂，例如生物素标记380。
在步骤630，将一定量的捕获珠，例如SA捕获珠385添加至杂交反应中，以用于捕获杂交的扩增子350\捕获探针370双链体和任选地未杂交的捕获探针370。通过形成生物素-链霉亲和素结合复合物，将杂交的扩增子\捕获探针双链体和未杂交的捕获探针固定在SA捕获珠上。
在步骤635，捕获探针370的捕获互补区域315a延伸以形成固定的DNA链390。固定在捕获珠385上的DNA链390现在包括生物素标记380、P7引物区域375、SBS引物区域335、索引区域360和P5引物区域365。
在任选的步骤640，将一定量的修饰的捕获探针395添加至SA捕获珠反应中，该修饰的捕获探针395基本上为没有捕获区域315的捕获探针370。在该示例性实施方案中，修饰的捕获探针395包括附接到生物素标记380的P7引物区域375。通过形成生物素-链霉亲和素结合复合物，将修饰的捕获探针395(例如，P7-生物素引物)固定在SA捕获珠385上。其上具有扩增子390/捕获探针370双链体的SA捕获珠385现在包括一定量的固定的P7-生物素引物395。
在步骤645，标准化扩增例如，在等温扩增程序下进行，例如，在反应溶液(未示出)中使用固定的P7-生物素引物395和P5引物作为标准化引物的ExAmp反应中。可选择反应条件(例如，孵育时间、P7和/或P5引物浓度和反应组分)，使得SA珠上的所有P7-引物位点被转化，例如，反应运行达到饱和。固定在固体基底上的P7引物的量用于控制扩增产物的量，从而使最终产物的量跨多个核酸样品或文库标准化。
在任选的步骤650，扩增子390从SA珠385洗脱用于测序。在一个实例中，扩增子390从SA珠385洗脱并且通过在95℃加热4分钟而变性。
另外或可选地，在根据本公开内容的该方面和其他方面的方法的一些实施方案中，捕获探针370与扩增子350的杂交可在固相中进行，例如在捕获珠上进行。如图8和图9A至图9B示出的流程图所示，在步骤830，将一定量的具有固定在其上的捕获探针370的捕获珠385添加至杂交反应中以用于捕获扩增子350。然后进行杂交步骤825，其中固定在捕获珠上的捕获探针与扩增子350杂交，以形成固定在固相，例如捕获珠上的扩增子350\捕获探针370双链体。其余步骤830、步骤835、步骤840、步骤845和步骤850类似于图6和图7A至图7B中描述的替代方法的对应步骤630、步骤635、步骤640、步骤645和步骤650来执行。
III.被配置用于基因组DNA输入到靶向扩增子样品输出的液滴致动器
在一个方面，本文公开的一些实施方案涉及某些液滴致动的分子技术。在一些实施方案中，液滴致动器可例如包括由液滴操作间隙隔开的底部基底和顶部基底。液滴操作间隙含有填料流体，诸如硅油或十六烷填料流体。底部基底可为例如印刷电路板(PCB)，其可包括液滴操作电极(例如，电润湿电极)的布置。顶部基底可为例如塑料或玻璃基底。顶部基底可包括底部基准平面或电极。
在一个实例中，液滴致动器可适用于进行多重靶向扩增子样品制备方案。例如，可选择填料流体的组成以用于特定方案中使用的试剂的性能。还可选择液滴运输电压(例如，电润湿电压)和频率以用于特定方案中使用的试剂的性能。设计参数可变化，例如，致动器上贮存器的数量和放置、独立电极连接的数量、不同贮存器的尺寸(体积)、磁体/珠洗涤区的放置、电极尺寸、电极间间距以及液滴操作间隙的高度(在顶部基底和底部基底之间)。
液滴致动器可设计成装配到仪器平台上，该仪器平台容纳另外的液滴致动器特征，诸如用于固定磁响应珠的一个或更多个磁体和用于控制某些反应区和/或洗涤区内的温度的一个或更多个加热器组装件。
液滴致动器上的液滴的操纵包括液滴操作，诸如分配、运输、融合、孵育、分裂和混合。液滴的大小可根据方案步骤中使用的液滴操作而变化。在一个实例中，单位尺寸的液滴，例如，“液滴单元”(DU)为约0.34μL并且可描述为1×液滴。典型的方案反应使用从约1DU(例如，1×液滴)至约6DU液滴(例如，6×液滴)的一系列液滴尺寸。
图1示出根据本公开内容的一些示例性实施方案，适用于进行多重靶向扩增子文库制备方案的液滴致动器的电极布置100的实例的俯视图。电极布置100经配置用于多重处理多个基因组DNA样品以用于构建一个或更多个靶向扩增子文库。液滴操作在液滴操作表面上的电极布置100顶上进行。在该实例中，电极布置100经配置用于在专用反应区域中并行处理多达8种不同样品，用于构建8种不同的靶向扩增子测序文库。
电极布置100包括用于输入和分配样品溶液(例如，基因组DNA样品)的8个样品贮存器电极110(下文称为样品贮存器电极110a至样品贮存器电极110h)。电极布置100还包括8个PCR/生物化学反应区115(下文称为PCR/生物化学反应区115a至PCR/生物化学反应区115h)，用于执行用于构建每个靶向扩增子文库的某些处理步骤。每个PCR/生物化学反应区115包括用于进行液滴操作的多个电极的簇或布置。处理步骤包括例如PCR扩增、捕获探针杂交、珠捕获、引物延伸、文库标准化和文库洗脱。电极布置100还包括8个索引贮存器电极120(下文称为索引贮存器电极120a至索引贮存器电极120h)，用于分配8种独特的索引寡核苷酸溶液，用于索引每个靶向扩增子文库。电极布置100还包括14个试剂贮存器电极125(下文称为试剂贮存器电极125a至试剂贮存器电极125n)，其经配置用于分配不同的试剂液体(例如，洗涤缓冲液、PCR主混合溶液、磁响应捕获珠、引物延伸试剂、文库标准化试剂和洗脱/变性缓冲溶液)。在一些实施方案中，贮存器电极110和索引贮存器电极120用作废物贮存器。在一些实施方案中，试剂贮存器电极125不用于废物。
通常，样品贮存器电极110、PCR/生物化学区115、索引贮存器电极120和试剂贮存器电极125通过液滴操作电极130的布置，诸如路径或阵列互连。
在电极布置100中，样品贮存器电极110a对应于PCR/生物化学反应区115a，其对应于索引贮存器电极120a；样品贮存器电极110b对应于PCR/生物化学反应区115b，其对应于索引贮存器电极120b；等等，直到样品贮存器电极110h对应于PCR/生物化学反应区115h，其对应于索引贮存器电极120h。对应的样品贮存器电极110、PCR/生物化学反应区115和索引贮存器电极120的8种布置形成8个专用反应通道135(下文称为反应通道135a至反应通道135h)，用于处理每个样品输入。使用样品液滴的专用通道可最小化不同基因组DNA之间的交叉污染。
一个或更多个磁体(未示出)可位于某些液滴操作电极130附近，用于保持一定量的磁响应珠。磁体可为例如永磁体或电磁体。在一个实例中，磁体可为可移动磁体，其可移动到其相应的液滴操作电极130附近和远离其相应的液滴操作电极130。每个磁体以确保在某些处理步骤(例如，珠洗涤、文库捕获、酶促反应和加工的基因组DNA的洗脱/变性后的珠去除)期间核酸附接珠的空间固定的方式定位。
电极布置100可包括一个或更多个温度控制区140。在一个实例中，可使用三个温度控制区140(例如，温度控制区140a、温度控制区140b和温度控制区140c)。温度控制元件(未示出)控制温度控制区140附近的填料流体(未示出)的温度。每个温度控制区140可被独立地控制到足以用于文库构建方案中的不同处理步骤的某一温度。例如，温度控制区140a可被加热至约98℃，这是足以使DNA变性的温度，而温度控制区140b可被加热至约60℃至约72℃，这是适合于退火和延伸反应的温度范围。虽然示出三个温度控制区140，但是任何数量的温度控制区140可与电极布置100相关联。
电极布置100为液滴致动器上的电极布置的实例，其可用于促进根据本公开内容的一些实施方案的方法；即，如本文所述，促进自动液体处理以用于扩增和选择基因组DNA的靶向区域以加工成用于测序的扩增子文库。
IV.用于制备靶向扩增子文库的通用数字微流体方案
在另一个实例中，图2、图4、图6和图8的方法200、方法400、方法600和方法800分别可描述为用于制备靶向扩增子文库的逐步的基于液滴的方案。用于制备靶向扩增子文库的基于液滴的方案的实例包括但不限于以下液滴移动。
在图6的方法600的步骤610的另一个实例中，将包含一定量的磁响应SPRI珠的基因组DNA样品装载到液滴致动器的样品贮存器中。在一个实例中，基因组DNA样品包括约1ng的基因组DNA、DNA结合缓冲溶液和一定量的磁响应SPRI珠(例如，从约20μL至约50μL)。将其中具有SPRI珠的基因组DNA样品孵育足以使DNA结合到珠上的一段时间。使用液滴操作将具有SPRI珠的样品溶液运输到磁体的磁场内的样品贮存器区域。在一些实例中，使用样品的整个体积(20μl至50μl)而不是使用几个DU。其上具有基因组DNA的磁响应SPRI珠通过磁体的磁场固定。在一个实例中，磁体为可移动磁体，其可移动到某个液滴操作电极附近和远离某个液滴操作电极。将上清液从固定的珠中拉回并且使用液滴操作返回到样品贮存器以进行处置(disposal)。在一些实例中，将整个上清液体积(20μl至50μl)拉回。从试剂贮存器中分配2×珠洗涤缓冲液滴，并且使用液滴操作将其运输至其上具有基因组DNA的固定的SPRI珠，以形成2×洗涤缓冲液/SPRI珠液滴。使其上具有基因组DNA的SPRI珠重新悬浮并且使用珠洗涤方案洗涤。将磁体定位于2×洗涤缓冲液/SPRI珠液滴附近，使得磁响应SPRI珠通过磁体的磁场固定。取出2×上清液滴并且使用液滴操作将其运输至样品贮存器以进行处置。将1×洗脱缓冲液滴从试剂贮存器运输到其上具有基因组DNA的固定的磁响应SPRI珠，以形成1×洗脱缓冲液/SPRI珠液滴。将1×洗脱缓冲液/SPRI珠液滴在约55℃孵育约2分钟以从SPRI珠中洗脱DNA。然后磁响应SPRI珠通过磁体的磁场固定，并且使用液滴操作将1×DNA样品液滴从固定的磁响应珠运输到专用的PCR/生物化学反应区。从试剂分配贮存器运输1×珠洗涤缓冲液滴并且与固定的磁响应SPRI珠(现在没有基因组DNA)融合以形成1×SPRI珠/洗涤缓冲液滴。使用液滴操作将1×SPRI珠/洗涤缓冲液滴运输至样品贮存器以进行处置。
在图6的方法600的步骤615的另一个实例中，从试剂分配贮存器中分配1×PCR试剂液滴。1×PCR试剂液滴包括例如缓冲液、聚合酶和dNTP。使用液滴操作将1×PCR试剂液滴与1×DNA样品液滴合并以产生2×扩增液滴。从试剂分配贮存器中分配1×靶特异性引物液滴，并且使用液滴操作与2×扩增液滴合并以产生3×靶特异性扩增液滴。在一个实例中，1×靶特异性引物液滴包括用于200重扩增反应的正向引物(例如，图7A至图7B的正向引物320)和反向引物(图7A至图7B的反向引物325)对。以流通格式执行PCR循环(例如，4个循环)，其中对于每个循环，使用液滴致动器上的不同温度控制区之间的液滴操作循环运输3×靶特异性扩增液滴。在一个实例中，扩增反应是在98℃初始孵育2分钟，然后按以下顺序进行4个PCR循环：98℃孵育20秒、70℃孵育20秒、56℃孵育60秒、72℃孵育75秒；随后在72℃最终孵育60秒。
在图6的方法600的步骤620的另一个实例中，从试剂分配贮存器中分配2×索引引物液滴(例如，图7A至图7B的正向引物355)和1×PCR试剂液滴，并且使用液滴操作将其合并以产生3×通用引物液滴。1×PCR试剂液滴包括例如缓冲液、聚合酶、dNTP和通用反向引物(例如，图7A的反向引物345a)。在一个实例中，通用反向引物为2×索引引物液滴的一部分。使用液滴操作分裂3×通用引物液滴以产生两个1.5×通用引物液滴。使用液滴操作将一个1.5×通用引物液滴与3×靶特异性扩增液滴合并以产生4.5×通用扩增液滴。使用液滴操作将第二个1.5×通用引物液滴运输到废物收集贮存器。在一个实例中，废物收集贮存器为在工作流程的这一点用作废物的样品端口。以流通格式执行PCR循环(例如，14个循环)，其中对于每个循环，使用液滴致动器上的不同温度控制区之间的液滴操作循环运输4.5×通用扩增液滴。在一个实例中，扩增反应是在98℃初始孵育30秒，然后按以下顺序进行14个PCR循环：98℃孵育20秒、70℃孵育20秒、60℃孵育60秒、72℃孵育60秒；然后在72℃最终孵育120秒。
在图6的方法600的步骤625的另一个实例中，从试剂分配贮存器中分配1×捕获探针液滴(例如，图7A至图7B的多个不同捕获探针370)和两个捕获缓冲液滴(例如，包含20xSSC的2×捕获缓冲液滴和1×捕获缓冲液滴)，并且使用液滴操作将其合并以产生4×捕获探针液滴。使用液滴操作将4×捕获探针液滴分裂成两个2×捕获探针液滴。使用液滴操作将一个2×捕获探针液滴与4.5×通用扩增反应液滴合并以产生6.5×扩增子/捕获探针液滴。使用液滴操作将第二个2×捕获探针液滴运输到废物收集贮存器。在一个实例中，通过将扩增子/捕获探针杂交液滴在98℃孵育3分钟，然后在75℃孵育30秒，然后在60℃孵育10分钟，并且然后在40℃孵育5分钟来执行捕获探针杂交。
在图6的方法600的步骤630的另一个实例中，制备链霉亲和素(SA)涂覆的磁响应珠以用于捕获杂交的扩增子/探针双链体。例如，从试剂分配贮存器中分配1×SA珠液滴，并且使用液滴操作将其运输到磁体的磁场内的某个液滴操作电极。1×SA珠液滴内的磁响应珠通过磁体的磁场固定，并且1×上清液滴被分裂出来并使用液滴操作将其运输到废物贮存器。从试剂贮存器中分配2×PR2洗涤缓冲液滴，并且使用液滴操作将其运输至固定的SA珠以形成2×SA珠PR2洗涤液滴。使珠重新悬浮并且使用珠洗涤方案在室温洗涤约1分钟。将磁体定位于2×SA珠PR2洗涤液滴附近，使得磁响应SA珠通过磁体的磁场固定。取出2×上清液滴并且使用液滴操作将其运输到废物贮存器以进行处置。使用2×HT1洗涤缓冲液滴重复珠洗涤方案一次。在珠洗涤方案结束时，分配1×HT1再悬浮液滴并且使用液滴操作将其运输至固定的SA珠，并且使珠重新悬浮以形成1×洗涤的SA珠液滴。使用液滴操作运输1×洗涤的SA珠液滴，并且与6.5×扩增子/捕获探针液滴融合以产生7.5×文库捕获液滴。将7.5×文库捕获液滴在室温孵育约6分钟，以用于经由形成生物素-链霉亲和素结合复合物将扩增子/捕获探针双链体捕获到SA珠上。在孵育期结束时，其上具有扩增子/捕获探针双链体的磁响应SA珠通过磁体的磁场固定，并且使用液滴操作将7.5×上清液滴从磁场运输至废物收集贮存器。从试剂贮存器中分配2×PR2洗涤缓冲液滴，并且使用液滴操作将其运输至其上具有扩增子/捕获探针双链体的固定的SA珠，以形成2×珠/扩增子洗涤液滴。使珠重新悬浮并且使用珠洗涤方案在室温洗涤约1分钟。在孵育期结束时，其上具有扩增子/捕获探针双链体的磁响应SA珠通过磁体的磁场固定，并且使用液滴操作将2×上清液滴从磁场运输至废物收集贮存器。
在图6的方法600的步骤635的另一个实例中，从试剂分配贮存器中分配两个2×延伸缓冲液滴，并且使用液滴操作将其运输至其上具有扩增子/捕获探针双链体的固定的SA珠，以形成4×延伸反应液滴。延伸缓冲液包括例如用于合成互补DNA链的缓冲液、聚合酶和dNTP。将4×延伸反应液滴在约60℃孵育约5分钟，以延伸与靶向DNA序列杂交的捕获探针的靶特异性捕获序列。在孵育期结束时，其上具有延伸的扩增子/捕获探针双链体的磁响应SA珠通过磁体的磁场固定，并且使用液滴操作将4×上清液滴从磁场运输至废物收集贮存器。从试剂贮存器中分配2×PR2洗涤缓冲液滴，并且使用液滴操作将其运输至其上具有延伸的扩增子/捕获探针双链体的固定的SA珠，以形成2×珠/扩增子洗涤液滴。使珠重新悬浮并且使用珠洗涤方案在室温洗涤约1分钟。在孵育期结束时，其上具有延伸的扩增子/捕获探针双链体的磁响应SA珠通过磁体的磁场固定，并且使用液滴操作将2×上清液滴从磁场运输到废物收集贮存器。
在图6的方法600的步骤640的另一个实例中，从试剂分配贮存器中分配2×P7-生物素引物液滴，并且使用液滴操作将其运输至其上具有延伸的扩增子/捕获探针双链体的固定的SA珠，以形成2×文库标准化液滴。使其上具有延伸的扩增子/捕获探针双链体的SA珠重新悬浮并且在室温孵育约6分钟，以用于将P7-生物素引物捕获到SA捕获珠上。在孵育期结束时，其上具有延伸的扩增子/捕获探针双链体和P7-生物素引物的磁响应SA珠通过磁体的磁场固定，并且使用液滴操作将2×上清液滴从磁场运输到废物收集贮存器。
在图6的方法600的步骤645的另一个实例中，使用排除扩增(ExAmp)反应对文库进行标准化。为了制备ExAmp反应溶液，从试剂分配贮存器中分配两个2×ExAmp1试剂液滴、一个1×ExAmp2试剂液滴、两个2×ExAmp3-P5试剂液滴和一个ExAmp3-P5试剂液滴，并且使用液滴操作将其合并以产生10x ExAmp反应溶液液滴。使用液滴操作将10x ExAmp反应溶液液滴分裂成五个2×ExAmp反应溶液液滴。使用液滴操作将三个2×ExAmp反应溶液液滴运输到废物收集贮存器。使用液滴操作将两个2×ExAmp反应溶液液滴运输至其上具有延伸的扩增子/捕获探针双链体和P7-生物素引物的固定的SA珠，以形成4×标准化反应液滴。将4×标准化反应液滴在38℃孵育约20分钟。在孵育期结束时，其上具有标准化扩增子文库的磁响应SA珠通过磁体的磁场固定，并且使用液滴操作将4×上清液滴从磁场运输到废物收集贮存器。
在图6的方法600的步骤650的另一个实例中，从试剂分配贮存器中分配两个2×洗脱缓冲液滴(例如，TE缓冲液滴)，并且使用液滴操作将其运输到其上具有文库扩增子的固定的SA珠，以形成4×文库洗脱液滴。将4×文库洗脱液滴在约95℃孵育约4分钟，以用于来自SA珠的扩增子的洗脱和变性。在孵育期结束时，SA珠通过磁体的磁场固定，并且使用液滴操作运输4×扩增子文库液滴远离固定的磁响应SA珠以用于收集和后续测序。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入的程度。
不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。对参考文献的论述陈述其作者的主张，并且申请人保留质疑所引用文献的准确度和相关性的权利。将清楚地理解，虽然本文引用许多信息来源，包括科学期刊文章、专利文献和教科书，但是该引用并不构成承认这些文献中的任何形成本领域公知常识的一部分。
本文给出的一般方法的论述仅用于说明目的。本领域技术人员在阅读本公开内容后，其他替代方法和替代方案将是明显的，并且将包括在本申请的精神和范围内。
实施例
在以下实施例中进一步详细公开另外的实施方案，这些实施例不以任何方式旨在限制本公开内容或权利要求的范围。
实施例1
反应效率与文库均匀性
为了评估使用图6的方法600制备的扩增子的反应效率和均匀性，制备三种不同的靶向扩增子文库。第一靶向扩增子文库使用工作台上扩增方案制备，其中靶特异性引物对和通用引物对在单个PCR反应(例如，一阶段式反应)中合并。第二靶向扩增子文库使用一阶段式数字流体方案在液滴致动器上制备，其中靶特异性引物对和通用引物对在单个PCR反应中合并。第三靶向扩增子文库使用图6的方法600的两阶段式扩增(例如，步骤615和步骤620)在液滴致动器上制备。对于每个文库，使用1ng基因组DNA和161重靶特异性引物汇集物制备扩增子。
图10显示根据本公开内容的一些实施方案，使用三种不同方案制备的三种靶向扩增子文库中的片段大小分布的绘图1000。即，使用一阶段式工作台上扩增反应制备的一个靶向扩增子文库，使用一阶段式致动器上扩增反应制备的另一个靶向扩增子文库，以及使用图6的方法600的两阶段式致动器上扩增反应制备的另一个靶向扩增子文库。绘图1000显示(1)使用一阶段式PCR反应在工作台上制备的扩增子文库中的片段大小分布的线1010，(2)使用一阶段式PCR反应在致动器上制备的扩增子文库中的片段大小分布的线1015，以及(3)使用图6的两阶段式扩增方法600在致动器上制备的扩增子文库中的片段大小分布的线1020。图10中呈现的数据显示，在所有三个扩增子文库(线1010、线1015和线1020)中，存在所需PCR产物的双峰分布(由箭头指示)和不需要的副产物的峰(例如，引物二聚体)。在使用一阶段式PCR反应制备的工作台上扩增子文库(线1010)中，引物二聚体(反应副产物)存在显著峰，并且所需产物的产量相对较低。在使用致动器上一阶段式PCR反应制备的扩增子文库(线1015)中，引物二聚体的量显著减少，并且所需PCR产物的量增加；也就是说，副产物与产物的比率朝向所需产物转移，并且副产物(例如，引物二聚体)的形成被最小化。最后，在使用图6的方法600的两阶段式致动器上扩增反应(线1020)制备的扩增子文库中，基本上消除引物二聚体的形成，并且进一步增加所需PCR产物的量。此外，两阶段式致动器上扩增反应通常在第二阶段中提供更快的循环(其节省时间)和更模块化的系统(其更好地开发)。
图11A和图11B分别显示示出每个循环的PCR效率的条形图1100和示出图10的每个文库中扩增子的均匀性的条形图1110。现在参见图11A，数据显示相比于在液滴致动器上执行的一阶段式扩增反应(“DF 1阶段”)的效率(每个PCR循环约85％)，使用图6的方法600的两阶段式扩增反应(“DF 2阶段”)显著提高在致动器上执行的PCR反应的效率(每个PCR循环约92％)。关于标记为“数字化1阶段”和“数字化2阶段”的两个样品，术语“数字化”是指其中反应在工作台上进行但是在“模拟”DF的条件下进行的一种类型的实验。这些条件被设计用于尽可能接近地匹配不同的DF方面，但使用常规实验室器材。在下面描述的图11A以及图11B所示的具体实验中，PCR反应以与对应的DF反应例如，“DF 1阶段”和“DF 2阶段”相同的试剂比率执行(这些数字化条件不同于“原始工作台”条件)，并且在DF油下以模拟DF条件。然而，这些数字化反应在常规热循环仪中执行。
现在参考图11B，数据显示相比于使用在液滴致动器上执行的一阶段式扩增反应(“DF 1阶段”)产生的文库内的扩增子的均匀性(约83％)，使用图6的方法600的两阶段式扩增反应(“DF 2阶段”)产生的文库内的扩增子的分布(或可变性)(约89.5％)实质上是改进的。均匀性定义为文库中扩增子的分布/可变性。更高的均匀性意指文库中扩增子的更均匀分布，并且在测序中提供更有效的文库覆盖。
下面的表1显示使工作台上靶向扩增方案适应数字流体格式而进行的变化的实施例的概述。
表1
实施例2
基于溶液的杂交和文库均匀性
该实施例总结了评价基于溶液的杂交反应(图6的方法600的步骤625)对均匀性的影响而执行的实验的结果。为此，制备三个不同的文库。一个文库在本文称为“基于珠的杂交文库”，其使用传统程序在工作台上制备，其中文库捕获探针首先通过生物素链霉亲和素相互作用被固定在链霉亲和素涂覆的磁珠上，并且然后PCR扩增子与捕获探针杂交。在本文称为“基于溶液的杂交文库并在工作台上生成”的另一个文库中，PCR扩增子首先在溶液中与生物素化的捕获探针杂交，并且然后通过生物素链霉亲和素相互作用被固定在链霉亲和素涂覆的磁珠上。最后，在本文称为“基于溶液的杂交DF文库”的第三个文库使用与基于溶液的杂交文库相同的步骤顺序但是在致动器上执行来制备。
下表2显示通过这三种不同方案制备的文库的均匀性。在一些实验中，基于在致动器上执行的基于珠的杂交(DF)制备第四个文库。观察到基于溶液的杂交文库的均匀性比传统的基于珠的杂交文库显著改进。发现在致动器上制备的DF文库中基于溶液的杂交的均匀性甚至进一步改进。
表2
实施例3
用于预测文库输出的数学模型
该实施例总结了示出液滴致动器装置的灵活性和可编程性提供对构建靶向扩增子文库期间执行的各种生物化学反应的精细控制的实验结果。由于对液滴致动器上执行的生物化学反应的精确控制，数学模型可用于预测某些过程结果。例如，扩增子杂交和捕获探针延伸的产物产量可使用以下等式从图6的方法600的杂交和延伸步骤中使用的PCR产物输入(扩增子输入)和捕获探针输入来预测：
Log(产量[pM])＝-0.703+0.846*log(探针浓度[pM每个]÷0.741*log(输入浓度[pM每个])
图12A显示杂交和延伸产物产量的三维图1200。图12B显示基于PCR产物和捕获探针输入的预测产量与实际产量的绘图1210。现在参考图12A，数据显示杂交和延伸产物产量对捕获探针和PCR扩增子输入浓度的依赖性。现在参考图12B，该图显示实际产量(Y轴)与通过上述数学等式预测的产量之间的相关性。如图12B所示，两种产量之间的良好相关性代表了数学模型的良好质量，并且指示所涉及的生物化学过程的可预测性质和可再现性质。
实施例4
文库(ExAmp)标准化
该实施例总结了示出通过使用合适的扩增程序，诸如动力学排除扩增(KEA)(也称为排除扩增(Ex-Amp))，可对大范围的PCR产物(扩增子)输入执行文库标准化过程(图6的方法600的步骤645)的实验结果。在该实施例中，使用ExAmp标准化反应以使样品量基本上相等并且调节PCR产物(扩增子)输入的浓度以用于后续测序应用。
图13显示在使用图6的方法600制备的文库中根据PCR产物输入变化的相对文库输出的绘图1300。数据显示相比于PCR产物输入的变化，文库输出的变化相对较小，例如，在广泛的PCR产物输入浓度范围(例如，PCR产物输入的约128倍的变化)内，文库输出存在约2倍的变化。数据还显示，即使超过PCR产物输入的128倍变化，相对于PCR产物输入的变化，文库输出的减少相对较小(例如，在PCR产物输入稀释约100,000倍时，文库输出减少约10倍)。
图14A和图14B分别显示在使用图6的方法600制备的文库中，根据PCR产物输入(输入稀释)变化的文库均匀性和倍数扩增的绘图1400以及扩增偏差的绘图1410。参考图14A的绘图1400，数据显示随着PCR产物输入减少，文库均匀性略有降低(条形图)。数据还显示，随着倍数扩增(线)增加，文库均匀性降低。通过最小化文库标准化期间的倍数扩增(例如，靶向从约10倍至约20倍扩增)，可基本上避免对文库均匀性的影响。
参考图14B的绘图1410，数据显示两种不同DNA输入量的文库成员覆盖的相关性。偏离对角线相关性的几个文库成员以虚线椭圆突出显示。这显示在这些特定文库成员未被有效扩增的情况下存在扩增偏差。重叠扩增子GC含量信息被定义为由dG或dC碱基组成的扩增子DNA序列的部分并且示为点阴影，其显示具有扩增偏差的所有突出显示的文库成员具有高扩增子GC含量。
图15A和图15B显示根据P5引物和P7-生物素引物浓度变化的ExAmp产量的三维图1500以及预测ExAmp产量与实际ExAmp产量的绘图1510。参考图15A，绘图1500显示ExAmp扩增产物产量对P5和生物素-P7引物浓度的依赖性。数据显示，通过改变P5和生物素-P7浓度两者可调节产量。
参见图15B，绘图1510显示实际ExAmp标准化产量和由从绘图1500上的数据导出的数学公式预测的产量之间的相关性。预测的ExAmp标准化产量可通过以下等式根据P5和P7-生物素引物浓度的变化被描述：
log(产量[pM])＝3.7974+1.0340*log(P5浓度[μM])+1.0014*log(P7-生物素浓度[μM])。
实施例5
文库洗脱效率
下表3显示缓冲液组成、温度和孵育时间对从链霉亲和素珠的文库洗脱效率的影响(图6的方法600的步骤650)。使用TE+Tween洗脱缓冲液在95℃的温度和3分钟的孵育时间实现最高的洗脱效率。表3中呈现的数据还显示，洗脱对于短于3分钟的时间和低于95℃的温度都为稳健的。
表3
图16显示使用液滴致动器上的热变性从链霉亲和素珠洗脱的文库获得的每靶文库(library-per-target)覆盖与随后通过标准NaOH处理变性的相同文库之间的相关性的绘图1600。绘图1600显示出良好的相关性，证明不需要后续NaOH变性，并且该文库通过致动器上头部完全且有效地变性。
实施例6
文库均匀性与基因组输入
为了评估根据基因组DNA输入变化的文库均匀性，使用图6的方法600和5种不同的基因组DNA样品制备5个文库。
图17显示针对根据本公开内容的一些实施方案制备的5种不同文库，根据基因组DNA输入变化的文库均匀性的绘图1700。使用0.2ng、1ng和10ng的5种不同的基因组DNA样品(HD200、HD701、HD729、NA12878和NA20Mix基因组DNA样品)和MJ191-plex靶特异性引物汇集物制备文库。通常，1ng的基因组DNA样品输入对应于约300个基因组，0.2ng对应于约60个基因组，且10ng对应于约3000个基因组。图17呈现的数据显示所有基因组DNA样品和检测的输入范围的良好均匀性(对于大多数文库＞90％)。所有基因组DNA样品的特异性＞95％。在该实验中，特异性定义为对应于预期靶标的过滤读段的百分比。
实施例7
变体调用准确度
为了评估使用图6的方法600制备的文库中变体调用的准确度，确定图17的NA20mix和HD200文库的某些等位基因的预期和观察到的变体频率之间的相关性。
图18A和图18B分别示出图17中描述的NA20mix文库中TP(真阳性)变体调用准确度的绘图1800和图17中描述的HD200文库中TP变体调用准确度的绘图1810。数据显示，例如，对于1ng(例如，约300个基因组当量)输入，在NA20mix和HD200文库二者中TP变体调用的预期变体频率和观察到的变体频率之间存在良好的相关性。参考图18A和图18B，对于1nggDNA输入，加框区域代表约少于30个基因组拷贝(例如，少于30个拷贝的那些特定变体/突变)。加框变体中的一些对应于每1ng gDNA输入低至7个或3个基因组拷贝，并且证明数字流体系统和方法对使用相对低的基因组DNA输入进行准确变体调用的灵敏度。图18A中的圆圈区域对应于以高于预期的频率检测到的特定变体。这归因于该特定靶标上的低读段覆盖率导致噪声增加。
图19A显示在使用工作台上方案和使用图6的方法600的致动器上方案制备的基因组文库中，根据染色体和位置变化的TP和FP(假阳性)变体频率的绘图1900。使用1ng输入NA12878基因组DNA和MJ191-plex靶特异性引物汇集物制备文库(例如，19个数字流体(致动器上)样品和9个工作台上样品)。在NA12878基因组中，存在7个真正的阳性变体。数据显示，所有TP变体均在工作台上和致动器上的样品中准确调用。数据还显示随机和持续(由星号表示)FP变体的频率，这些变体在所有工作台上或所有致动器上的样品中都被调用。FP变体调用的频率显著低于TP变体调用的频率。另外，相对于指示测序噪声的TP变体，FP变体的测序碱基质量通常但不总是显著更低。例如，在分析期间通过使用这两个标准进行过滤，可去除FP变体。很明显，致动器上方法比工作台上方法产生更少的FP变体。
图19B显示图19A的绘图1900的工作台上样品和致动器上样品中的FP变体调用的平均数量的绘图1910。数据显示平均而言，在工作台上样品中调用约12种FP变体，而在致动器上样品中调用约2种FP变体。与在工作台上制备的样品相比，在致动器上制备的样品中的较低FP变体调用率可能部分是由于文库制备方案的PCR步骤中的差异。例如，工作台上文库制备方案使用约30个循环的组合靶特异性和通用PCR反应以用于扩增输入基因组DNA。致动器上文库制备方案使用约4个至约6个循环的第一靶特异性扩增(图6的方法600的步骤615)和约14个循环的第二通用扩增(图6的方法600的步骤620)以用于扩增输入基因组DNA(例如，约20个循环或更少的总PCR)。由于改进的PCR和生物化学效率，可以在致动器上方案中实现较低的PCR循环总数。
实施例8
扩增子可扩展性
为了评估根据靶特异性引物汇集物的复杂性变化的文库均匀性，使用图6的方法600和5个不同的多重引物汇集物制备靶向扩增子文库。使用1ng和5ng的NA12878和NA20Mix基因组DNA和192-plex引物汇集物(汇集物1；192个靶标)，或第二个192-plex引物汇集物(池汇集物；192个靶标)，或196-plex引物汇集物(汇集物3；193个靶标)，或384-plex合并的引物汇集物(1至2的汇集物混合物；384个靶标)，或580-plex合并的引物汇集物(1至3的汇集物混合物；580个靶标)制备文库。
图20显示根据基因组DNA和引物汇集物复杂性变化的文库均匀性的绘图2000。在绘图2000中，数据显示基因组DNA样品和输入量两者的良好均匀性(大多数文库＞90％)。数据还显示，随着引物汇集物的复杂性从较低的复杂性(例如，192-plex或196-plex)增加到较高的复杂性(例如，384-plex或580-plex)，均匀性的变化相对较小。
对于1至3的汇集物混合物，在工作台上制备的样品的均匀性(数据未显示)为约70％。相比于工作台上均匀性(约70％)，在致动器上制备的文库中的均匀性(约90％)在测序中提供更有效的文库覆盖(例如，将测序深度减少约一个数量级)。所有基因组DNA样品和引物汇集物的特异性为约95％。
图21A、图21B和图21C显示在图20的绘图2000中描述的192-plex汇集物1文库中的目标覆盖的绘图2100、384-plex汇集物混合物1-2文库中192-plex汇集物1目标覆盖的绘图2110以及580-plex汇集物混合物1-3文库中的192-plex汇集物1目标覆盖的绘图2120。
数据显示当文库的复杂性增加时(例如，在汇集物混合物1-2文库和汇集物混合物1-3文库中增加的靶特异性引物对和基因组靶标)，对192-plex汇集物1文库目标的覆盖影响相对较小。
实施例9
系统
图22示出微流体系统2200的实例的功能框图，微流体系统2200包括液滴致动器2205，其为流体盒的一个实例。数字微流体技术通过电子控制其表面张力(电润湿)对液滴致动器，诸如液滴致动器2205中的离散液滴进行液滴操作。液滴可夹在液滴致动器2205的两个基底之间，由液滴操作间隙隔开的底部基底和顶部基底之间。底部基底可包括电可寻址电极的布置。顶部基底可包括例如由导电墨水或氧化铟锡(ITO)制成的参考电极平面。底部基底和顶部基底可涂覆有疏水材料。液滴操作在液滴操作间隙中进行。液滴周围的空间(例如，底部基底和顶部基底之间的间隙)可填充有不混溶的惰性流体，诸如硅油，以防止液滴蒸发并促进它们在装置内的运输。可通过改变电压激活的模式来实现其他液滴操作；实例包括液滴的融合、分裂、混合和分配。
液滴致动器2205可设计成装配到微流体系统2200的仪器平台(未示出)上。仪器平台可保持液滴致动器2205并容纳其他液滴致动器特征，诸如但不限于一个或更多个磁体和一个或更多个加热装置。例如，仪器平台可容纳一个或更多个磁体2210，磁体2210可为永磁体。任选地，仪器平台可容纳一个或更多个电磁体2215。磁体2210和/或电磁体2215相对于液滴致动器2205定位以用于固定磁响应珠。任选地，磁体2210和/或电磁体2215的位置可由马达2220控制。另外，仪器平台可容纳一个或更多个加热装置2225，用于控制例如液滴致动器2205的某些反应和/或洗涤区内的温度。在一个实例中，加热装置2225可为相对于液滴致动器2205定位的加热棒以用于提供其热控制。
微流体系统2200的控制器2230电耦合到本文所述设备的各种硬件组件，诸如液滴致动器2205、电磁体2215、马达2220和加热装置2225，以及检测器2235、阻抗感测系统1640和任何其他输入和/或输出装置(未示出)。控制器2230控制微流体系统2200的整体操作。控制器2230可为例如通用计算机、专用计算机、个人计算机或其他可编程数据处理设备。控制器2230有助于提供处理能力，诸如存储、解释和/或执行软件指令，以及控制系统的整体操作。控制器2230可经配置和编程以控制这些装置的数据和/或功率方面。例如，在一个方面，关于液滴致动器2205，控制器2230通过激活/停用电极来控制液滴操纵。
在一个实例中，检测器2235可为相对于液滴致动器2205定位的成像系统。在一个实例中，成像系统可包括一个或更多个发光二极管(LED)(例如，照明源)和数字图像捕获装置，诸如电荷耦合装置(CCD)相机。可使用适合于使用中的特定试剂或标签的设备进行检测。例如，诸如荧光检测器、吸光度检测器、发光检测器等的光学检测器可用于检测适当的光学标记。专为基于阵列的检测而设计的系统特别有用。例如，与本文阐述的方法一起使用的光学系统可构造成包括如下所述的各种组件和组装件：Banerjee等人，于2012年8月14日发布的题为“Systems and Devices for Sequence by Synthesis Analysis”的美国专利第8,241,573号；Feng等人，于2008年2月12日授权的题为“Confocal Imaging Methods andApparatus”的美国专利第7,329,860号；Feng等人，于2011年10月18日授权的题为“Compensator for Multiple Surface Imaging”的美国专利第8,039,817号；Feng等人，于2009年11月5日公布的题为“Compensator for Multiple Surface Imaging”的美国专利公布第20090272914号；和Reed等人，于2012年10月25日公布的题为“Systems,Methods,andApparatuses to Image a Sample for Biological or Chemical Analysis”的美国专利公布第20120270305号，其全部公开内容通过引用并入本文。此类检测系统对核酸测序实施方案特别有用。
阻抗感测系统2240可为用于检测液滴致动器2205的特定电极处的阻抗的任何电路。在一个实例中，阻抗感测系统2240可为阻抗谱仪。阻抗感测系统2240可用于监测其上具有或不具有液滴的任何电极，诸如任何液滴操作电极的电容性负载。关于合适的电容检测技术的实例，参见Sturmer等人，于2009年12月30日公布的题为“Capacitance Detectionin a Droplet Actuator”的国际专利公布第WO/2008/101194号；和Kale等人，于2004年2月26日公布的题为“System and Method for Dispensing Liquids”的国际专利公布第WO/2002/080822号，其全部公开内容通过引用并入本文。
液滴致动器2205可包括破碎装置2245。破碎装置2245可包括促进液滴致动器中的材料，诸如组织、细胞和孢子破碎(裂解)的任何装置。破碎装置2245可为例如超声处理机构、加热机构、机械剪切机构、珠打浆机构、并入液滴致动器2205中的物理特征、电场产生机构、armal循环机构及其任何组合。破碎装置2245可由控制器2230控制。
应当理解，本公开内容的各个方面可体现为方法、系统、计算机可读介质和/或计算机程序产品。本公开内容的各方面可采取硬件实施方案、软件实施方案(包括固件、常驻软件、微代码等)或组合软件和硬件方面的实施方案的形式，这些实施方案在本文中通常可都称为“电路”、“模块”或“系统”。此外，本公开内容的方法可采用计算机可用存储介质上的计算机程序产品的形式，该计算机可用存储介质具有在介质中体现的计算机可用程序代码。
任何合适的计算机可用介质可用于本公开内容的软件方面。计算机可用或计算机可读介质可为例如但不限于电子、磁、光、电磁、红外或半导体系统、设备、装置或传播介质。计算机可读介质可包括暂时的实施方案。计算机可读介质的更具体实例(非详尽列表)将包括以下中的一些或全部：具有一条或更多条电线的电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪存)、光纤、便携式光盘只读存储器(CD-ROM)、光存储装置、诸如那些支持互联网或内联网的传输介质，或者磁存储装置。注意，计算机可用或计算机可读介质甚至可为纸张或在其上打印程序的另一合适的介质，因为程序可经由例如光学扫描纸张或其他介质被电子捕获，然后被编译、解释或以适当的方式另外处理，如果需要的话，然后存储在计算机存储器中。在本文件的上下文中，计算机可用或计算机可读介质可为能够含有、存储、通信、传播或运输程序以供指令执行系统、设备或装置使用或与指令执行系统、设备或装置结合使用的任何介质。
用于执行本文阐述的方法和设备的操作的程序代码可用面向对象的编程语言编写，诸如Java、Smalltalk、C++等。然而，用于执行本文阐述的方法和设备的操作的程序代码也可用常规的过程编程语言编写，诸如“C”编程语言或类似的编程语言。程序代码可由处理器、专用集成电路(ASIC)或执行程序代码的其他组件执行。程序代码可简称为存储在存储器(诸如本文所论述的计算机可读介质)中的软件应用程序。程序代码可使处理器(或任何处理器控制的装置)产生图形用户界面(“GUI”)。可在显示装置上可视地生成图形用户界面，但是图形用户界面也可具有可听特征。然而，程序代码可在任何处理器控制的装置中操作，诸如计算机、服务器、个人数字助理、电话、电视或利用处理器和/或数字信号处理器的任何处理器控制的装置。
程序代码可在本地和/或远程执行。例如，程序代码可完全或部分地存储在处理器控制的装置的本地存储器中。然而，程序代码也可至少部分地远程存储、访问和下载到处理器控制的装置。例如，用户的计算机可完全执行程序代码或仅部分地执行程序代码。程序代码可为独立的软件包，其至少部分地在用户的计算机上和/或部分地在远程计算机上或者完全在远程计算机或服务器上执行。在后一种情况下，远程计算机可通过通信网络连接到用户的计算机。
无论网络环境如何，都可应用本文阐述的方法和设备。通信网络可为在射频域和/或互联网协议(IP)域中操作的有线网络。然而，通信网络还可包括分布式计算网络，诸如因特网(有时也称为“万维网”)、内联网、局域网(LAN)和/或广域网(WAN)。通信网络可包括同轴电缆、铜线、光纤线路和/或混合同轴线。通信网络甚至可包括利用电磁谱的任何部分和任何信令标准(诸如IEEE 802标准族、GSM/CDMA/TDMA或任何蜂窝标准和/或ISM频带)的无线部分。通信网络甚至可包括电力线部分，其中信号经由电气布线传送。无论物理元件部分、物理配置或通信标准如何，本文阐述的方法和设备可应用于任何无线/有线通信网络。
参考各种方法和方法步骤描述本公开内容的某些方面。应该理解，每个方法步骤可由程序代码和/或机器指令实施。程序代码和/或机器指令可创建用于实施方法中指定的功能/动作的工具。
程序代码还可存储在计算机可读存储器中，该计算机可读存储器可指导处理器、计算机或其他可编程数据处理设备以特定方式运行，使得存储在计算机可读存储器中的程序代码生成或者转换包括实施方法步骤的各个方面的指令工具的制品。
程序代码还可加载到计算机或其他可编程数据处理设备上，以使得执行一系列操作步骤以生成处理器/计算机实施的过程，使得程序代码提供用于实施本公开内容的方法中指定的各种功能/动作的步骤。
实施例10
索引文库制备
用OTMI缓冲液(Illumina Part#15059758)、161-plex SBS3-GS-F引物(基因特异性正向)和GS-R引物(基因特异性反向)混合甜菜碱、具有不同索引的通用正向引物(UF-4)、通用反向引物(UR)和人类基因组DNA执行索引多重PCR。使用的引物浓度在最终PCR反应中各自为10nM的GS-F和GS-R、300nM的UF-4和200nM的UR引物。Coriell NA12878基因组DNA以0.02ng/μL的终值作为用于PCR的输入。使用的DNA聚合酶为0.04U/μl的Phusion HSII DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)。该实验中使用的热循环参数如表4所示。
表4：热循环反应中使用的参数
98℃ 2分钟
98℃ 20"
30个循环 70℃ 30"
60℃……..60"(从70℃渐变至60℃,0.2℃/sec)
72℃……...75"(从60℃渐变至72℃,0.2℃/sec)
72℃ 2分钟
10℃ 保持
所得到PCR产物在末端具有与下文实施例12中使用的P7引物和P5引物互补的衔接子。
实施例11
用于Ex-Amp标准化的捕获珠的制备
用含有5mM Tris-HCl pH 7.5、500nM EDTA和1M NaCl的缓冲液(BW缓冲液)洗涤链霉亲和素珠(Illumina部件#11118442)，并且重新悬浮于BW-缓冲液中的75μl生物素-P7-Index-SBS491'中，最终浓度为10μM。将珠在室温涡旋15分钟，在1×BW缓冲液中洗涤并重新悬浮于HT1缓冲液中37.5μL或0.25nM各捕获探针模板寡核苷酸中(如MiSeq V3 150循环试剂盒；Illumina目录#MS-102-3001)。将珠在60℃孵育5分钟，随后在40℃孵育5分钟，然后洗涤并且重新悬浮于AMS-6缓冲液中(如用于cBot的HiSeq PE Cluster Kit V4(Illumina目录#PE-401-4001)中)。在40℃孵育5分钟后，将珠重新悬浮在100μL的0.1N NaOH中，并且在室温再孵育5分钟。然后将珠在100μL HT1缓冲液中洗涤至少一次并且重新悬浮于150μLHT1缓冲液中。所得珠含有结合的生物素-P7扩增或标准化引物。
实施例12
珠上延伸和Ex-Amp标准化
在1×HT1缓冲液中制备实施例10的索引PCR产物的10倍系列稀释液，并且通过在98℃加热3分钟在20×SSC中变性，然后保持在冰上。将等体积的实施例11的捕获珠加入到变性的PCR产物中并在75℃孵育30秒，然后在65℃孵育10分钟，然后在40℃孵育5分钟，随后在PR2缓冲液中洗涤(在MiSeq V3150循环试剂盒中，Illumina目录#MS-102-3001)。
珠上Ex-Amp标准化如下执行。简言之，将每种样品在室温用1μL的100μM P5引物、4μL的H2O和5μL的0.1N NaOH孵育8分钟。遵循制造商的推荐(Illumina PN 15067046)制备EPX混合物，并将35μL EPX混合物加入15μL的变性P5引物中。从珠(在磁体上)去除PR2缓冲液，并将50μL的EPX+P5混合物加入到珠中，然后重新悬浮并在38℃孵育20分钟，随后去除上清液。将文库用0.1N NaOH变性，洗涤并重新悬浮于PR2缓冲液中。
使用SYBR Green qPCR文库定量试剂盒(KAPA Biosystems，部件号KK4824)对文库进行定量。如图29A所示，无论输入样品浓度如何不同，输出文库产量都被标准化。
实施例13
高通量测序(HiSeq)
基于报道的qPCR产量将来自实施例12的样品标准化。使用的总文库浓度为10pM。在该实施例中，遵循按照制造商的推荐的标准单索引设定，使用HiSeq V4化学在Illumina的HiSeq2000(Illumina目录号：PE-401-4001、FC-401-4002和FC-401-4003)上对来自实施例12的标准化样品进行测序。顶级测序度量如表5所示。
表5：如实施例12中所述，其DNA浓度已经标准化的单个核酸样品的测序度量的概述。
如表5所示，观察到即使输入PCR产物被强烈稀释，文库特异性仍然很高(>0.98)。随着文库的进一步稀释，均匀性如预期的那样下降，但是即使在1000倍稀释的PCR产物输入，均匀性仍处于可接受的水平(>0.80)。因此，如表5中所示，由本公开内容中描述的方法得到的实施例12的文库的测序度量与标准文库制备方法相当。
实施例14
珠上延伸和Ex-Amp标准化
在另一个实验中，除了使用的模板DNA是来自福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品(HorizonDX HD751)的基因组DNA之外，遵循以上实施例12中概述的实验程序。按照制造商的推荐或使用本公开内容中描述的方法，使用利用TrueSeq文库制备试剂盒(Illumina FC-121-4001)的标准文库制备方案，测试含有50ng、10ng、2ng、0.4ng和0.08ng基因组DNA的输入样品。使用KAPA文库定量试剂盒定量文库产量。图29B中所示的数据通过使用标准文库制备方法产生，其中对于输入DNA范围50ng、10ng、2ng、0.4ng和0.08ng，输出文库产量分别为大约659pM、216pM、67pM、18pM和5.3pM。相比之下，使用本公开内容中描述的方法，输出文库产量跨输入范围为一致的，分别产生大约51500pM、46250pM、47628pM、45220pM和43238pM，如图29C所示。
实施例15
珠上延伸和Ex-Amp标准化
在该实施例中，基于报道的qPCR产量对样品进行标准化。使用0.4ng和0.08ng的DNA来自标准文库制品(下表中的样品S05和样品S06)的产量太低而无法标准化。总标准化文库浓度为20pM。遵循标准的双索引设定，使用MiSeq V3 150循环试剂盒(Illumina目录#MS-102-3001)，在Illumina的MiSeq测序仪上对文库进行测序。顶级测序度量在表6中给出。样品S02至样品S06为图29B中所示的标准文库制品，而S08至S012为来自图29C的样品。样品S01和样品S07为对照。
表6：其DNA浓度已经如实施例14中所述标准化的单个核酸样品的测序度量的概述。
如表6中所示，由本公开内容中描述的扩增和标准化方法(S08至S12)得到的文库的测序度量与标准文库制备方法(S02至S06)相当。
因此，如图29A和图29C证明，本文公开的扩增和标准化方法提供一种跨大范围浓度的输入DNA样品提供标准化量的输出DNA文库的简单方法，其中在汇集文库用于后续测序之前不需要进一步稀释或浓缩所得的输出文库。特别地，表5和表6中呈现的实验数据显示，跨广泛的输入DNA浓度，扩增产物的质量与现有文库制备方法相当。
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Claims (108)

1.一种用于核酸扩增的方法，包括：
a)提供包含靶核酸分子的输入核酸样品；
b)使所述核酸样品与包含固相和液相的反应混合物接触，其中：
i.所述固相包含固定在固体支持物上的多个第一扩增引物，所述第一扩增引物能够与所述靶核酸分子的第一序列特异性杂交，并且
ii.所述液相包含溶液中的多个第二扩增引物，所述多个第二引物能够与所述靶核酸分子的第二序列特异性杂交；
c)在等温条件下扩增所述靶核酸分子，使得基本上所有的所述第一扩增引物被掺入扩增产物中，其中
所述多个第一扩增引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，以及
所述多个第二扩增引物以超过所述第一扩增引物的量的量提供。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括将所述扩增产物与所述固体支持物分离。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含多个珠。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含选自以下的珠：磁珠、顺磁珠、塑料珠、聚苯乙烯珠、玻璃珠、琼脂糖珠、流式细胞术微珠、聚苯乙烯微米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒、功能化聚苯乙烯微米颗粒、功能化聚苯乙烯纳米颗粒、涂覆的聚苯乙烯微米颗粒、涂覆的聚苯乙烯纳米颗粒、二氧化硅微珠、荧光微米球、荧光纳米球、功能化荧光微米球、功能化荧光纳米球、涂覆的荧光微米球、涂覆的荧光纳米球、着色微米颗粒、着色纳米颗粒、磁微米颗粒、磁纳米颗粒、超顺磁微米颗粒、超顺磁纳米颗粒及其组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述珠在水性反应缓冲液中。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述珠彼此流体连通。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述珠包含链霉亲和素珠，所述第一扩增引物通过缀合的生物素附着在所述链霉亲和素珠上。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述珠为单克隆的。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述珠为多克隆的。
10.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述固体支持物为反应位点的表面。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述反应位点的表面包括孔、凹槽、流通池、反应室或通道的内表面的底部部分。
12.根据权利要求1至45中任一项的方法，其中所述核酸样品包含单链核酸分子。
13.根据权利要求1至45中任一项的方法，其中所述核酸样品包含双链核酸分子。
14.根据权利要求1至47中任一项的方法，其中所述第一扩增引物和所述第二扩增引物包含与所述靶核酸分子内的已知核苷酸序列互补的序列。
15.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，所述已知核苷酸序列对应于所述靶核酸分子的第一末端和第二末端。
16.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子的所述第一末端和所述第二末端包含已添加至所述靶核酸分子的通用测序尾部衔接子。
17.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述第一扩增引物和/或所述第二扩增引物的每一个还包含索引部分。
18.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中所述第一扩增引物的至少一部分除了所述靶核酸分子的已知序列之外，还包含与所述靶核酸分子的同源区域具有序列互补性的捕获部分。
19.根据权利要求1至54中任一项的方法，其中所述捕获部分通过使捕获寡核苷酸与固定在所述固体支持物上的第一扩增引物杂交并且延伸所固定的扩增引物以产生与所述捕获寡核苷酸具有序列互补性的延伸的扩增引物来产生。
20.根据权利要求1至55中任一项的方法，其中对多个核酸样品执行扩增步骤(c)。
21.根据权利要求56所述的方法，其中每个输入核酸样品的量未被跨所述多个核酸样品标准化。
22.根据权利要求56至57中任一项所述的方法，其中所述多个输入核酸样品在所述扩增步骤之前合并。
23.根据权利要求56至57中任一项所述的方法，其中将来自所述多个核酸样品的扩增产物合并以形成汇集的核酸文库。
24.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中将来自所述多个核酸样品的扩增产物在与各自的固体支持物分离之前进行合并。
25.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中将来自所述多个核酸样品的扩增产物在与各自的固体支持物分离之后进行合并。
26.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，还包括获得所述扩增产物的核苷酸序列。
27.一种用于核酸扩增的方法，包括：
a)提供包含靶核酸分子的输入核酸样品；
b)使所述核酸样品与包含固相和液相的反应混合物接触，其中：
i.所述固相包含固定在固体支持物上的多个第一扩增引物，所述第一扩增引物能够与所述靶核酸分子的第一序列特异性杂交，并且
ii.所述液相包含溶液中的多个第二扩增引物，所述多个第二引物能够与所述靶核酸分子的第二序列特异性杂交；
c)在等温条件下扩增所述靶核酸分子，使得基本上所有的所述第一扩增引物中的被掺入扩增产物中，其中：
所述多个第一扩增引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，
所述第一扩增引物中的至少一部分除了所述靶核酸分子的已知序列之外，还包含与所述靶核酸分子的区域具有序列互补性的捕获部分，且所述捕获部分通过使捕获寡核苷酸与固定在所述固体支持物上的第一扩增引物杂交并且延伸所固定的扩增引物以产生与所述捕获寡核苷酸具有序列互补性的延伸的扩增引物来产生。
28.根据权利要求64所述的方法，其中所述多个第二扩增引物以超过所述第一扩增引物的量的量提供。
29.根据权利要求1至65中任一项所述的方法，其中所述多个第二扩增引物以在所述第一扩增引物的所述量的数量级内的量提供。
30.根据权利要求1至65中任一项的方法，其中所述多个第二扩增引物以超过所述第一扩增引物的量至少100％的量提供。
31.根据权利要求1至66中任一项的方法，其中所述反应混合物还包含重组酶、单链DNA结合蛋白、解旋酶和链置换聚合酶中的一种或更多种。
32.一种组合物，包含通过根据前述权利要求中任一项的方法生成的扩增产物。
33.一种用于核酸扩增的方法，包括：
a)提供包含靶核酸分子的输入核酸样品；
b)使所述输入核酸样品与包含多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的反应混合物接触，其中：
i.所述多个第一标准化引物固定在固体支持物上，所述第一标准化引物能够与所述靶核酸分子的第一序列特异性杂交，并且
ii.所述多个第二标准化引物在溶液中，所述多个第二引物能够与所述靶核酸分子的第二序列特异性杂交；
c)在等温条件下扩增所述靶核酸分子，使得基本上所有的所述第一标准化引物中被掺入扩增产物中，其中
所述多个第一标准化引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，以及
所述多个第二标准化引物以超过所述第一标准化引物的量的量提供。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述多个第一标准化引物在固定在所述固体支持物上之前与所述靶核酸分子杂交。
35.根据权利要求33所述的序列，其中所述多个第一标准化引物在与所述靶核酸分子杂交之前被固定在所述固体支持物上。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，还包括将所述扩增产物与所述固体支持物分离。
37.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含多个珠。
38.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含选自以下的珠：磁珠、顺磁珠、磁响应珠、塑料珠、聚苯乙烯珠、玻璃珠、琼脂糖珠及其组合。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含选自以下的珠：磁珠、顺磁珠、塑料珠、聚苯乙烯珠、玻璃珠、琼脂糖珠、流式细胞术微珠、聚苯乙烯微米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒、功能化聚苯乙烯微米颗粒、功能化聚苯乙烯纳米颗粒、涂覆的聚苯乙烯微米颗粒、涂覆的聚苯乙烯纳米颗粒、二氧化硅微珠、荧光微米球、荧光纳米球、功能化荧光微米球、功能化荧光纳米球、涂覆的荧光微米球、涂覆的荧光纳米球、着色微米颗粒、着色纳米颗粒、磁微米颗粒、磁纳米颗粒、超顺磁微米颗粒、超顺磁纳米颗粒及其组合。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述珠在水性反应缓冲液中。
41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中所述珠彼此流体连通。
42.根据权利要求33至41中任一项所述的方法，其中所述珠包含链霉亲和素珠，所述第一标准化引物通过缀合的生物素附着在所述链霉亲和素珠上。
43.根据权利要求33至42中任一项所述的方法，其中所述珠为单克隆的。
44.根据权利要求33至42中任一项所述的方法，其中所述珠为多克隆的。
45.根据权利要求33至44中任一项所述的方法，其中所述固体支持物为反应位点的表面。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述反应位点的表面包括孔、凹槽、流通池、反应室或通道的内表面的底部部分。
47.根据权利要求33至46中任一项所述的方法，其中所述输入核酸样品包含单链核酸分子。
48.根据权利要求33至46中任一项所述的方法，其中所述输入核酸样品包含双链核酸分子。
49.根据权利要求33至48中任一项所述的方法，其中所述第一标准化引物和/或所述第二标准化引物中的至少一个包含与所述靶核酸分子内的已知核苷酸序列具有序列互补性的区域。
50.根据权利要求33至49中任一项所述的方法，所述已知核苷酸序列对应于所述靶核酸分子的第一末端和第二末端。
51.根据权利要求33至50中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子的所述第一末端和所述第二末端包含已添加至所述靶核酸分子的通用引物区域。
52.根据权利要求33至51中任一项所述的方法，其中所述通用引物区域包含合成测序(SBS)引物序列。
53.根据权利要求33至52中任一项所述的方法，其中所述第一标准化引物和/或所述第二标准化引物中的至少一个还包含索引部分。
54.根据权利要求33至53中任一项所述的方法，其中所述第一标准化引物和/或所述第二标准化引物中的至少一个还包含与添加至所述靶核酸分子的所述通用引物区域具有序列互补性的区域。
55.根据权利要求33至54中任一项所述的方法，其中所述第一标准化引物的至少一部分除了所述靶核酸分子的已知序列之外，还包含与所述靶核酸分子的同源区域具有序列互补性的捕获部分。
56.根据权利要求33至55中任一项所述的方法，其中所述捕获部分通过使捕获寡核苷酸与第一标准化引物杂交并且延伸所述第一标准化引物以产生与所述捕获寡核苷酸具有序列互补性的延伸的标准化引物来产生。
57.根据权利要求33至56中任一项所述的方法，其中对多个输入核酸样品执行所述扩增步骤。
58.根据权利要求33至57中任一项所述的方法，其中每个输入核酸样品的量跨所述多个输入核酸样品不相等。
59.根据权利要求57至58中任一项所述的方法，其中所述多个输入核酸样品在所述扩增步骤之前合并。
60.根据权利要求57至58中任一项所述的方法，其中将来自所述多个输入核酸样品的扩增产物合并以形成汇集的核酸文库。
61.根据权利要求57至60中任一项所述的方法，其中将来自所述多个输入核酸样品的扩增产物在与各自的固体支持物分离之前进行合并。
62.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，其中将来自所述多个输入核酸样品的扩增产物在与各自的固体支持物分离之后进行合并。
63.根据权利要求33至62中任一项所述的方法，还包括获得所述扩增产物的核苷酸序列。
64.一种用于核酸扩增的方法，包括：
a)提供包含靶核酸分子的输入核酸样品；
b)使所述输入核酸样品与包含多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的反应混合物接触，其中：
i.所述多个第一标准化引物固定在固体支持物上，所述第一标准化引物能够与所述靶核酸分子的第一序列特异性杂交；并且
ii.所述多个第二标准化引物在溶液中，所述多个第二引物能够与所述靶核酸分子的第二序列特异性杂交；
c)在等温条件下扩增所述靶核酸分子，使得基本上所有的所述第一标准化引物被掺入扩增产物中，其中所述多个第一标准化引物以将扩增产物的产量限制在预定量的量提供，所述第一标准化引物中的至少一部分除了所述靶核酸分子的已知序列之外，还包含与所述靶核酸分子的区域具有序列互补性的捕获部分，并且所述捕获部分通过使捕获寡核苷酸与第一标准化引物杂交并且延伸所述第一标准化引物以产生与所述捕获寡核苷酸具有序列互补性的延伸的标准化引物来产生。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述多个第二标准化引物以超过所述第一标准化引物的所述量的量提供。
66.根据权利要求33至65中任一项所述的方法，其中所述多个第二标准化引物以在第一标准化引物的所述量的数量级内的量提供。
67.根据权利要求33至65中任一项所述的方法，其中所述多个第二标准化引物以超过所述第一标准化引物的量至少100％的量提供。
68.根据权利要求33至67中任一项所述的方法，其中所述反应混合物还包含重组酶、单链DNA结合蛋白、解旋酶和链置换聚合酶中的一种或更多种。
69.根据权利要求33至68中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，对所述输入核酸样品中的所述靶核酸分子进行包含第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的第一富集扩增反应。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述第一靶特异性引物和/或所述第二靶特异性引物的每一个包含与所述靶核酸分子的已知序列具有序列互补性的区域。
71.根据权利要求69至70中任一项的方法，其中所述第一靶特异性引物和/或所述第二靶特异性引物的每一个还包含通用引物区域。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述第一靶特异性引物的所述通用引物区域包含合成测序(SBS)引物序列。
73.根据权利要求69至71中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，对所述输入核酸样品中的所述靶核酸分子进行包含第一通用引物和第二通用引物的第二富集扩增反应，其中：
a)所述第一通用引物包含与所述第一靶特异性引物的所述通用引物区域具有序列互补性的区域；以及
b)所述第二通用引物包含与所述第二靶特异性引物的所述通用引物区域具有序列互补性的区域。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述第一通用引物和/或所述第二通用引物中的至少一个还包含索引部分。
75.根据权利要求33至74中任一项所述的方法，其中所述方法使用液滴致动器以多重格式执行。
76.一种用于在液滴致动器上多重扩增核酸样品的方法，包括：
a)提供包含靶核酸分子的多个输入核酸样品；
b)将所述多个输入核酸样品装载到所述液滴致动器的液滴操作表面上，所述液滴操作表面在其上布置有液滴操作电极；
c)分配包含多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的标准化试剂液滴，其中：
i.所述多个第一标准化引物固定在固体支持物上，所述第一标准化引物能够与所述靶核酸分子的第一序列特异性杂交；并且
ii.所述多个第二标准化引物在溶液中，所述多个第二引物能够与所述靶核酸分子的第二序列特异性杂交；
d)在等温条件下扩增所述靶核酸分子，使得基本上所有的所述第一标准化引物被掺入扩增产物中。
77.根据权利要求76所述的方法，其中在步骤(c)之前还包括：
将第一富集PCR试剂液滴分配到所述液滴致动器的液滴操作表面上，其中所述第一富集PCR试剂液滴包含第一靶特异性引物和第二靶特异性引物；以及
使所述多个输入核酸样品中的所述靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。
78.根据权利要求76至77中任一项所述的方法，其中所述第一靶特异性引物和/或所述第二靶特异性引物的每一个包含与所述靶核酸分子的已知序列具有序列互补性的区域。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述第一靶特异性引物和/或所述第二靶特异性引物的每一个还包含通用引物区域。
80.根据权利要求0所述的方法，其中所述第一靶特异性引物的所述通用引物区域包含合成测序(SBS)引物序列。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的方法，其中所述第一靶特异性引物和/或所述第二靶特异性引物中的至少一个还包含索引部分。
82.根据权利要求76所述的方法，其中在步骤(c)之前还包括：
将第二富集PCR试剂液滴分配到所述液滴致动器的液滴操作表面上，其中所述第二富集PCR试剂液滴包含第一通用引物和第二通用引物；以及
使所述多个输入核酸样品中的所述靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述第一通用引物和/或所述第二通用引物中的至少一个还包含引物序列区域。
84.根据权利要求82至83中任一项所述的方法，其中所述第一通用引物和/或所述第二通用引物中的至少一个还包含索引部分。
85.根据权利要求76所述的方法，其中在步骤(c)之前还包括：
将第一富集PCR试剂液滴分配到所述液滴致动器的液滴操作表面上，其中所述第一富集PCR试剂液滴包含第一靶特异性引物和第二靶特异性引物；
将第二富集PCR试剂液滴分配到所述液滴致动器的液滴操作表面上，其中所述第二富集PCR试剂液滴包含第一通用引物和第二通用引物；
使用液滴操作将所述第二富集PCR试剂液滴与所述第一富集PCR试剂液滴合并以形成合并的富集PCR试剂液滴；以及
使所述多个输入核酸样品中的所述靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。
86.一种微流体系统，用于在液滴致动器上执行核酸样品的多重扩增，所述微流体系统包括用于执行代码的处理器、通信地耦合到所述处理器的存储器以及存储在所述存储器中的程序代码，所述程序代码使得所述处理器执行核酸样品的多重扩增的方法，所述方法包括：
a)将多个输入核酸样品装载到所述液滴致动器的液滴操作表面上，所述液滴操作表面在其上布置有液滴操作电极，所述多个输入核酸样品的每一个包含靶核酸分子；
b)分配包含多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的标准化试剂液滴，其中：
i.所述多个第一标准化引物固定在固体支持物上，所述第一标准化引物能够与所述靶核酸分子的第一序列特异性杂交；并且
ii.所述多个第二标准化引物在溶液中，所述多个第二引物能够与所述靶核酸分子的第二序列特异性杂交；
c)在等温条件下扩增所述靶核酸分子，使得基本上所有的所述第一标准化引物被掺入扩增产物中。
87.根据权利要求86所述的微流体系统，还包括以下组件中的一个或更多个：
a)加热装置；
b)液滴致动器，所述液滴制动器热耦合到所述加热装置；
c)检测器，所述检测器光学耦合到所述液滴致动器；
d)阻抗感测模块；
e)破碎装置，所述破碎装置用于裂解包含核酸的生物材料；以及
f)控制器，所述控制器电子耦合到(a)至(d)的所述组件中的一个或更多个。
88.根据权利要求86至87中任一项所述的微流体系统，其中所述控制器包括程序代码、用于执行所述程序代码的处理器以及与所述处理器通信的本地存储器，其中所述程序代码使得所述处理器执行核酸样品的多重扩增的方法，所述方法包括：
a)将多个输入核酸样品装载到所述液滴致动器的液滴操作表面上，所述液滴操作表面在其上布置有液滴操作电极，所述多个输入核酸样品的每一个包含靶核酸分子；
b)分配包含多个第一标准化引物和多个第二扩增引物的标准化试剂液滴，其中：
i.所述多个第一标准化引物固定在固体支持物上，所述第一标准化引物能够与所述靶核酸分子的第一序列特异性杂交；并且
ii.所述多个第二标准化引物在溶液中，所述多个第二引物能够与所述靶核酸分子的第二序列特异性杂交；
c)在等温条件下扩增所述靶核酸分子，使得基本上所有的所述第一标准化引物被掺入扩增产物中。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的微流体系统，其中所述核酸样品的多重扩增的方法还包括在步骤(a)之前：
将第一富集PCR试剂液滴分配到所述液滴致动器的液滴操作表面上，其中所述第一富集PCR试剂液滴包含第一靶特异性引物和第二靶特异性引物；以及
使所述多个输入核酸样品中的所述靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。
90.根据权利要求86至88中任一项所述的微流体系统，其中所述核酸样品的多重扩增的方法还包括在步骤(a)之前：
将第二富集PCR试剂液滴分配到所述液滴致动器的液滴操作表面上，其中所述第二富集PCR试剂液滴包含第一通用引物和第二通用引物；以及
使所述多个输入核酸样品中的所述靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。
91.根据权利要求86至88中任一项所述的微流体系统，其中所述核酸样品的多重扩增的方法还包括在步骤(a)之前：
将第一富集PCR试剂液滴分配到所述液滴致动器的液滴操作表面上，其中所述第一富集PCR试剂液滴包含第一靶特异性引物和第二靶特异性引物；
将第二富集PCR试剂液滴分配到所述液滴致动器的液滴操作表面上，其中所述第二富集PCR试剂液滴包含第一通用引物和第二通用引物；
使用液滴操作将所述第二富集PCR试剂液滴与所述第一富集PCR试剂液滴合并以形成合并的富集PCR试剂液滴；以及
使所述多个输入核酸样品中的所述靶核酸分子热循环以形成富集的核酸样品。
92.根据权利要求86至91中任一项所述的微流体系统，还包括一个或更多个磁体，所述一个或更多个磁体能够远离和接近一个或更多个所述流体贮存器移动，其中所述磁体的位置任选地由马达控制。
93.根据权利要求86至92中任一项所述的微流体系统，还包括一个或更多个加热装置以提供其热控制。
94.根据权利要求86至93中任一项所述的微流体系统，其中所述程序代码部分或全部存储在所述控制器的本地存储器中或远程计算装置上。
95.根据权利要求86至94中任一项所述的微流体系统，其中所述程序代码在本地执行和/或远程执行。
96.根据权利要求86至95中任一项所述的微流体系统，其中所述液滴致动器包括：
a)底部基底和顶部基底，被液滴操作间隙隔开，其中所述底部基底和所述顶部基底中的任一个或两个包括经配置用于在所述间隙中进行液滴操作的电极；
b)电极布置，所述电极布置包括路径、反应道和液滴操作电极阵列中的一个或更多个；
c)多个流体贮存器，所述多个流体贮存器通过经配置用于沿着所述电极分配分离的流体的所述电极布置互连；以及
d)多个温度控制区。
97.根据权利要求96所述的微流体系统，其中所述液滴操作间隙填充有填料流体或填料气体。
98.根据权利要求97所述的微流体系统，其中所述填料流体选自由硅油、十六烷填料流体、卤化油、氟化油和全氟化油组成的组。
99.根据权利要求96至98中任一项所述的微流体系统，其中所述多个流体贮存器包括一个或更多个试剂贮存器、一个或更多个样品贮存器、一个或更多个索引贮存器、一个或更多个废物贮存器或其组合。
100.根据权利要求96至99中任一项所述的微流体系统，其中所述液滴致动器还包括一个或更多个生物化学反应区，用于对每个核酸扩增反应执行某些处理步骤。
101.根据权利要求96至100中任一项所述的微流体系统，其中所述流体贮存器中的至少一个包括用于在其中装载流体的输入端口。
102.根据权利要求96至101中任一项所述的微流体系统，所述液滴致动器还包括一个或更多个磁体，所述一个或更多个磁体能够远离和接近一个或更多个所述液滴操作电极移动。
103.根据权利要求96至102中任一项所述的微流体系统，其中所述磁体为永磁体或电磁体。
104.根据权利要求96至103中任一项所述的微流体系统，其中所述温度控制区包括彼此不同的温度。
105.根据权利要求96至104中任一项所述的微流体系统，其中所述温度控制区包括基本相同的温度。
106.根据权利要求96至105中任一项所述的微流体系统，其中所述电极布置包括分配操作电极、运输操作电极、融合操作电极、孵育操作电极、分裂操作电极、混合操作电极或其组合中的一种或更多种。
107.一种计算机可读介质，所述计算机可读介质存储用于在液滴致动器上执行多重核酸扩增的方法的处理器可执行指令，所述方法包括：
a)将多个输入核酸样品装载到所述液滴致动器的液滴操作表面上，所述液滴操作表面在其上布置有液滴操作电极，所述多个输入核酸样品的每一个包含靶核酸分子；
b)分配包含多个第一标准化引物和多个第二标准化引物的标准化试剂液滴，其中：
i.所述多个第一标准化引物固定在固体支持物上，所述第一标准化引物能够与所述靶核酸分子的第一序列特异性杂交；以及
ii.所述多个第二标准化引物在溶液中，所述多个第二引物能够与所述靶核酸分子的第二序列特异性杂交；
c)在等温条件下扩增所述靶核酸分子，使得基本上所有的所述第一标准化引物被掺入扩增产物中。
108.一种组合物，包含通过前述权利要求中任一项的方法或系统生成的扩增产物。
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